PLoS ONE: Karnosiini estää proliferaatiota of Human mahasyövän SGC-7901 solut kautta Molemmat mitokondrio hengitys ja Glykolyysi Pathways

tiivistelmä

karnosiini, luonnossa esiintyvä dipeptidi, on äskettäin osoitettu olevan anti-kasvain aktiivisuutta. Kuitenkin sen taustalla mekanismi on epäselvä. Tässä tutkimuksessa tutkimme vaikutus ja mekanismi karnosiinin solujen elävyys ja leviämisen viljeltyjen ihmisen mahasyövän SGC-7901-soluissa. Karnosiini hoito ei aiheuttanut solun apoptoosin tai nekroosin, mutta vähensi proliferatiivista kapasiteettia SGC-7901-soluissa. Seahorse analyysi osoitti SGC-7901-soluissa viljelty pyruvaatin ovat aktiivisia mitokondrioita, ja riippuvat mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaation yli Glykolyysivaiheen koulutusjakson sukupolven ATP. Karnosiinin huomattavasti vähentynyt itseisarvo mitokondrioiden ATP-sidottu hengitystä, ja vähensi maksimaalinen hapenkulutus ja vara hengityselinten kapasiteettia, mikä voi vähentää mitokondrioiden toimintaan korreloi proliferaatiopotentiaali. Samalla karnosiini vähensi myös solunulkoisen happamoitumisen nopeus ja glykolyysi SGC-7901-soluissa. Tuloksemme ehdotti, että karnosiini on potentiaalinen säätelijänä energia aineenvaihdunnan SGC-7901-soluissa sekä anaerobiset ja aerobiset polkuja, ja tarjosi vihjeen prekliininen ja kliininen arviointi karnosiinia mahasyövän hoidossa.

Citation: Shen Y, Yang J, Li J, Shi X, Ouyang L, Tian Y, et ai. (2014) Karnosiini estää proliferaatiota of Human mahasyövän SGC-7901 solut kautta Molemmat mitokondrio hengitys ja Glykolyysi Pathways. PLoS ONE 9 (8): e104632. doi: 10,1371 /journal.pone.0104632

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 helmikuu 2014; Hyväksytty: 15 heinäkuu 2014; Julkaistu: 12 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat National Natural Science Foundation of China (81102427), ja osittain tukee Zhejiangin maakunnan Scientific Research Foundations (Y2110322), Program for Zhejiang johtava Team S & T Innovation (2010R50048) ja Wenzhoun kaupungin Science and Technology Project (2010S0094 ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten maailmassa. Taloudellisesti kehitysmaissa, mahalaukun syöpä on toiseksi syy syövän liittyvän kuoleman [1], [2]. Huolimatta paraneminen kirurgisten ja multimodaalinen hoito, yleinen 5 vuoden pysyvyys on edelleen alhainen (15%: sta 35%), koska korkea uusiutuminen, invaasio ja etäpesäkkeiden [3]. Näin ollen, esillä olevassa, löytää tehokkaampia anti-kasvain lääkkeitä, joilla on vähemmän sivuvaikutuksia tarvitaan.

L-karnosiini (β-alanyyli-L-histidiini) on luonnollisesti esiintyvä dipeptidi, joka on syntetisoitu endogeeninen karnosiini syntetaasin. Se jakautuu laajalle nisäkkään aivoissa, luurankolihasten, vatsa, munuaiset, sydän ja iho [4], [5]. Toistaiseksi ei tiedetä paljoakaan sen fysiologinen mutta useat otaksuttu roolit on harkittu, kuten välittäjäaine, tulehduslääke, vapaa radikaalinpoistajaa mobiili orgaaninen pH: n puskuri ja metallikelaattorin [6], [7]. On raportoitu, että karnosiini on potentiaalinen terapeuttinen aine hoitoa varten Alzheimerin taudin, aivohalvauksen, diabeteksen, ja muiden sairauksien aistien [8], [9]. Aivan äskettäin on osoitettu, että karnosiini voi olla myös antituumorigeenisiä vaikutuksia. Esimerkiksi, karnosiini on raportoitu olevan kyky estää pahanlaatuisten glioomien kasvua [10], ja tämä vaikutus voi välittyä vaikutusta glykolyyttiset energia-aineenvaihduntaan, parhaiten karakterisoitu metabolisen havaittu fenotyyppi tuumorisoluissa, tunnettu Warburg vaikutus [11 ], [12].

Äskettäin merkitys mitokondrioiden niin happiantureissa kuin tuottajien ATP on tullut keskipiste syöpätutkimukseen ja tutkimukset ovat osoittaneet tärkeän ilmiö, joka mitokondrion aineenvaihduntaa, erityisesti sitruunahappo syklin toiminta on tärkeää nopea lisääntyminen useiden syöpäsolutyyppien [13], [14]. Kuitenkin kun kyseessä on ihmisen mahalaukun syöpäsoluja, vähän tietoa on saatavilla missä määrin Glykolyysivaiheen ja mitokondrioiden oksidatiivisen fosforylaation (OXPHOS) edistää solujen energian tuotantoon ja nopeaan lisääntymiseen. Onko karnosiini voi myös estää kasvua ihmisen mahalaukun syövän solut on edelleen tuntematon. Ja onko inhibitive vaikutus karnosiinin tuumorisoluihin kasvuun liittyy myös toimintansa mitokondrion hengitystä ja OXPHOS jää epäselväksi.

Äskettäin Seahorse Bioscience XF96 Solunulkoisilla Flux Analyzer on käytetty samanaikaisesti ja jatkuvasti seurata sekä aerobinen ja glykolyyttiset komponenttien solujen bioenergetics [15]. Siksi tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutuksia karnosiinin kasvuun ihmisen mahasyövän solujen ja edelleen luonnehtia bioenergetic profiilia viljellyissä ihmisen mahalaukun syöpäsolu SGC-7901 ja roolit karnosiinin in SGC-7901-solujen energia-aineenvaihduntaa kanssa Seahorse Bioscience XF96 Solunulkoisilla Flux Analyzer ja muita siihen liittyviä teknologioita.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

L-karnosiini, natriumpyruvaattia, rotenonin, karbonyyli syanidi p-trifluorimetoksifenyyli-hydratsoni (FCCP), antimysiini A, 3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5-diphenyltetra-zolium bromidia (MTT), metanoli, maitohappo olivat Sigma (St. Louis, MO, USA). Penisilliini, streptomysiini, L-glutamiinia, trypsiini, Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), naudan sikiön seerumia olivat GIBCO-BRL: ltä (Grand Island, NY, USA). Anneksiini V-FITC /PI apoptoosin havaitseminen pakki, BCA Protein Assay Kit ja ATP Assay Kit ostettiin Beyotime Biotekniikan instituutti ((Nanjing, Kiina). XF analyysiväliaineella ja XF kalibrointiaineella ratkaisu ostettiin Seahorse Bioscience.

Soluviljely

ihmisen mahalaukun syövän solulinja SGC-7901 (SGC-7901), ihmisen maksan hepatosellulaarista masolulinjassa (HepG2) ja rotan C6 glioomasolulinjaa (C6) ostettiin Shanghai Institute solupankki Kiinan Academy of Science (alkuperäinen lähde on American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA). Solut viljeltiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiiniä, ja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO _{2: ssa kostutetussa inkubaattorissa. solut trypsinoitiin suhteessa 01:03, kun yhtymäkohta käyttämällä 0,25% trypsiiniä. jatkoviljeltiin-solut ympättiin 96-, 24- tai 6-kuoppaisille levyille tiheyksillä 2 x 10 ^{3, 5 x 10 4, 2 x 10 5 tai 1 x 10 6 solua /kuoppa, vastaavasti.}}

MTT väheneminen määrityksessä

Solun metabolista aktiivisuutta tarkkailtiin kolorimetrisellä MTT-analyysi, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Lyhyesti, soluja viljeltiin 96-kuoppaisille levyille ja oli 6 kaivoa kussakin ryhmässä. Lopussa kokeissa soluja inkuboitiin 0,5 mg /ml MTT: 4 tuntia 37 ° C: ssa. Sitten supernatantti kerros poistettiin, ja 100 ui dimetyylisulfoksidia lisättiin kuhunkin kuoppaan. MTT aineenvaihdunta kvantitoitiin spektrofotometrisesti 570 nm: ssä Biorad mikrolevylukijalla. Tulokset ilmaistiin prosentteina MTT vähentäminen, kun absorbanssi kontrollisolujen 100%.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Solut kuuden kuopan levyille tiheydellä 100-200 solujen kuoppaa kohti, ja sitten käsiteltiin karnosiini (20 mM). Kloonit annettiin kasvaa 14 päivää DMEM-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Solut fiksattiin 70% etanolilla ja värjättiin Coomassie Brilliant Blue analyysiä varten pesäkkeiden muodostumisen kuten aiemmin on kuvattu [17].

Virtaussytometrinen määritys solukuoleman

Solukuolema kvantitoitiin anneksiini V-FITC-PI (propidiumjodidin) kaksinkertainen värjäys käyttäen anneksiini V-FITC apoptoosin havaitseminen pakki mukaan valmistajan ehdotusta. Lyhyesti, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille DMEM. Soluja käsiteltiin 20 mM karnosiini 48 tuntia, ja sitten otettiin talteen ja pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä, suspendoitiin uudelleen sitomispuskuriin tiheydellä 1 x 10 ^{6 solua /ml. Soluja inkuboitiin samanaikaisesti fluoreseiinileimatulla anneksiini V: n ja PI 20 min ja analysoitiin virtaussytometrialla. Anneksiini V-FITC syntyy signaaleja havaittiin FITC signaalitunnistimen (FL1, 525 nm). PI signaaleja seurattiin käyttäen ilmaisinta varattu fykoerytriini- päästöjen (FL2, 575 nm). Tiedot analysoitiin käyttäen Cell Quest ohjelmistoa BD.}

Solunulkoisilla Flux Technology

mittaamiseksi hapenkulutuksen (OCR) ja solunulkoisen happamoitumista rate (ECAR) solujen erilaisissa olosuhteissa, eli Seahorse XF96 ekstrasellulaarinen Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA) käytettiin. Tämä väline mahdollistaa tarkka mittaus Glykolyysivaiheen ja useiden parametrien mitokondrioiden toimintaa, kuten pohjapinta OCR, vara hengityselinten kapasiteettia, maksimaalinen OCR, ATP-sidottu hengitystä ja protoni vuotaa kiinnittyneet ehjät soluviljelmässä. Perustason mittaukset, OCR ja ECAR mitattiin sen jälkeen, kun peräkkäin lisäämällä kuhunkin kuoppaan 20 ui oligomysiini, FCCP ja rotenoni, saavuttaa työskentely pitoisuuksien 1 ng /ml, 1 uM ja 1 uM. Kaikki määritykset suoritettiin käyttäen istutustiheyteen 10000 solua /kuoppa 200 ul: aan DMEM on XF96 soluviljelmässä mikrolevyn (Seahorse Bioscience). Solut vaihdetaan puskuroimaton DMEM, jossa on 2 mM natriumpyruvaattia ja 20 mM karnosiini 1 h ennen alkua määrityksen ja pidettiin 37 ° C: ssa. OCR raportoidaan yksikössä pikomoolia minuutissa ja ECAR raportoidaan milli-pH-yksikköä (mph) minuutissa.

määritys ATP Production

ATP määritys suoritettiin valmistajan ohje. Lyhyesti, otettiin talteen viljellyistä soluista lyysattiin lyysipuskurissa, mitä seurasi sentrifugointi 10,000 x g: ssa 2 min, 4 ° C: ssa. Lopuksi 6-kuoppalevyillä, taso ATP määritettiin sekoittamalla 20 ui supernatanttia 100 ul lusiferaasin reagenssia, joka katalysoi valon tuotannon ATP ja lusiferiini. Luminanssi mitattiin monokromaattorin mikrolevylukijalla. Standardikäyrä tuotettiin myös ja proteiinin konsentraatio kussakin ryhmässä määritettiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä kit. Yhteensä ATP-tasot ilmaistaan ​​nmol /mg proteiinia.

HPLC-analyysi solunulkoisen maitohapon

maitohapon konsentraatio solussa supernatantti mitattiin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC ) yhdistettynä UV-detektori käyttäen tekniikkaa, kuten aikaisemmin on kuvattu. Lyhyesti, valmis analysates erotettiin Ecosil C-18-käänteisfaasi-kolonnia (3 um, 250 mm x 4,6 mm) käyttäen liuotinta A ja liuotin B [0,1 mol /l NH _{4H 2PO 4 ( pH 3,4) laimennettiin v /v metanolia 97:3] virtausnopeudella 0,5 ml /min. Lämpötila kolonnin pidettiin 25 ° C: ssa, ja aallonpituus UV-detektio oli asetettu 210 nm: ssä.}

Mitokondrioiden kalvojännite arviointi

muutoksia suhteellisissa mitokondrion kalvon potentiaali (Δ Ψ
m) arvioitiin käyttäen lipofiilinen kationinen koetin JC-1 5,5 ', 6,6'-tetrakloori-1,1', 3,3'-tetraetyyli-benzamid azolocarbocyanine jodidia (JC-1; Molecular Probes). Väriaine JC-1 läpikäy palautuvan muutoksen fluoresenssiemissiossa vihreästä vihertävän oranssin Δ Ψ
m kasvaa. Solut, joilla on korkea Δ Ψ
m muotoa JC-1 aggregaatteja ja fluoresoivat punaista; heikosti Δ Ψ
m sisältävät monomeerisen JC-1 ja fluoresoivat vihreää. Hoidon jälkeen karnosiini 48 tuntia, elatusaine poistettiin ja soluja, kasvatettu peitinlaseilla, inkuboitiin pimeässä JC-1, jonka lopullinen konsentraatio 2 uM 20 min. Solut huuhdeltiin PBS: llä kaksi kertaa, ja viritetään 488 nm: ssä Olympus BX-51 fluoresenssimikroskoopilla.

mtdna kopioluvun mittaus

Absolute mtdna kopioida useita mitattiin vertaamalla PCR-monistamalla mitokondrioita amplikonin [ihmisen, NADH-ubikinonia oksidoreduktaasi ketju 4 (ND4)], jossa on ydin- amplikonin (ihmisen, β-aktiini) DNA eristettiin käyttäen Qiagen DNA mini kit. Alukesekvenssit ovat seuraavat: ihmisen β-aktiini (eteenpäin: 5'-ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 '; taaksepäin: 5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3'); ihmisen ND4 (eteenpäin: 5'-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 '; taaksepäin: 5'-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3'). DNA malleja tehtiin alueiden ulottuen kunkin amplikonin PCR-monistuksella. Laimennokset 1 x 10 ^{8 alas 1 × 10 2 kopiota eristetty DNA käytettiin standardikäyrän muodostamiseksi kvantifiointiin. PCR-syklien koostui aktivoinnin vaihe 95 ° C 30 sekuntia, jota seurasi 40 sykliä 5 sekuntia 95 ° C: ssa ja 30 sekuntia 58 ° C: ssa. Kaikki PCR: t suoritettiin Bio-Rad CFX Manager Real-Time PCR System (Applied Biosciences).}

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot edustavat kolmen tai useamman itsenäisen kokeen. Data ilmaistiin keskiarvona ± SD. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 11.5 for Windows. Yksisuuntainen ANOVA (varianssianalyysi) seurasi LSD (vähiten merkitsevä ero) tai Dunnettin T3 post-hoc
testi (jossa yhtäläiset ristiriitaisuutta ei oletettu) levitettiin monimuuttujille, kun taas Studentin t-testi oli käytetään vertailuissa kahden ryhmän välillä. P
< 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

vaikutus karnosiinin SGC-7901-solujen elinkelpoisuus

vaikutuksen määrittämiseksi karnosiinin ihmisen mahasyöpä SGC-7901-solujen elinkelpoisuus, MTT vähentäminen määritystä käytettiin. Tulokset osoittivat, että karnosiini hoito vähensi merkittävästi solujen elinkelpoisuuden ajasta ja pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Karnosiini pitoisuuksina 5 ja 20 mM merkittävästi vähentää solujen elinkelpoisuuden 84,0% ja 57,9% valvonnan 24 h, ja 73,5% ja 45,9% valvonnan 48 h, vastaavasti (Fig. 1A). Kuitenkin karnosiini pitoisuus on 1 mM ei vaikuttanut SGC-7901-solujen elinkelpoisuus 24 tai 48 tuntia. Olemme edelleen käyttää virtaussytometrialla määrittämään onko karnosiini voi aiheuttaa SGC-7901 solunekroosi tai apoptoosin. Yllättäen tulokset osoittivat, että karnosiini hoito 48 h ei aiheuttanut nekroottiset tai apoptoottista solukuolemaa SGC-7901-soluissa (kuvio. 1 B). Koska MTT vähentäminen on myös tulkitaan osoittavan solun metabolinen aktiivisuus, ja MTT-arvo solupopulaation määräytyy sekä elävien solujen lukumäärä läsnä ja niiden suhteelliset aineenvaihduntaan, joten seuraavaksi laskemaan solujen lukumäärän Rinnakkaisessa kokeessa kanssa identtisesti käsitelty SGC-7901-soluissa käyttäen solulaskennan levy. Huomasimme, että solujen lukumäärän karnosiini käsiteltiin 48 h ryhmässä oli samanlainen kuin kontrolliryhmässä (Fig. 1 C), mikä osoittaa, että vähennetään solun elinkelpoisuuden aiheuttama karnosiini hoito 48 h SGC-7901-soluissa, koska aineenvaihdunnan muutoksista mutta ei johdu solukuolemaa tai solujen lisääntymistä.

Voit tarkistaa, ovatko nämä toimet karnosiinin myös muissa syöpäsoluissa, HepG2 ja C6 soluja käytettiin. Tulokset osoittivat, että 20 mM karnosiini hoitoa 48 tuntia ei aiheuttanut solukuolemaa (taulukko. S1) ja jakaantumista, mutta pieneni huomattavasti MTT vähentää aktiivisuutta sekä HepG2 ja C6-soluissa (kuvio. S1).

choronic hoito jossa karnosiinin esti SGC-7901-solujen pesäkkeiden muodostumista

sen tutkimiseksi, onko choronic altistuminen karnosiini voi vaikuttaa proliferatiivista kapasiteettia SGC-7901, solut ympättiin alhainen tiheys (100-200 solua /kuoppa) ja annettiin muodostua pesäkkeitä varten 14 päivää DMEM: ssä, jota oli täydennetty 20 mM karnosiinin. Kuten on esitetty kuviossa. 2, choronic altistuminen karnosiini vähensi pesäkkeiden muodostumista 39,9% valvonnan.

bioenergetic luonnehdinta viljeltyjen SGC-7901-solujen

tutkineet OCRs ja ECAR viljellyissä SGC-7901-soluissa käyttäen Seahorse XF-96 solunulkoisen flux analysaattori, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Basal solu OCR ja ECAR todettiin olevan 161,02 ± 29,58 pmol /min per 10 × 10 ^{3-solut (alustava solumäärä), ja 39,31 ± 4,29 mph /min per 10 × 10 3-soluissa (kuvio. 3A). ATP-sidottu hengitystä (koko basaalin vähennettynä nopeuden kanssa oligomysiini, jossa oligomysiini on estäjä ATP synteesi) oli 96,15 ± 18,34 pmol /min per 10 × 10 3-soluissa, mikä osoittaa, että -60% huokoista happea kulutus liittyi ATP synteesi. Samalla ECAR nostettiin ~250% perustasosta hinnat läsnä ollessa maksimaalisesti tehokas annos oligomysiini (1 ug /ml), osoittaen, että solut siirretään mitokondriaalisen hengityksen glykolyysistä. Rotenone (1 uM) vähensi OCR 55,78 ± 8,86 pmol /min per 10 × 10 3-solut (~35%: n lähtötasosta laskettuna). Rotenone kestävä kuvastaa ei-mitokondrioiden hengitystiheys, johon kuuluu substraatti hapettumista ja solun pinnan hapenkulutus [19]. Näin ollen, ei-mitokondrion hengitystä osuus ~35%, kun taas mitokondrio hengityksen osuus ~65% koko soluhengityksen. Siten viljellyissä SGC-7901-soluja ~92% (60% /65%) mitokondriaalisen hengityksen kytkettiin ATP-synteesin, ja ~8% mitokondrioiden hengityksen osuus oli protoni-vuoto (Fig. 3B). Kun läsnä on korkeintaan tehokas annos FCCP (1 uM, joka on irrotus aine, joka mahdollistaa maksimaalisen elektronin kuljetus,), joka on samanaikainen kasvu OCR havaittu, ja se nostettiin 204 ± 30,24 pmol /min per 10 x 10 3-soluissa.}

arvioi myös suhteellinen osuus Glykolyysivaiheen ja OXPHOS ATP tuotannon korko SGC-7901-soluissa. Absoluuttinen kvantitatiivinen molempien glykolyyttisellä korko ja oligomysiini herkän hapenkulutuksen mitattiin SGC-7901-soluissa. Solunulkoista happamoituminen nopeus johtuu pääasiassa laktaatin ja bikarbonaatin tuotantoa ja kun kalibroitu protoni tuotantonopeus, kertoo glykolyyttisissä rate [15]. Siten käytimme -oksamaattia estämään laktaattidehydrogenaasi, joka muuntaa pyruvaatin laktaatti viimeisen vaiheen aikana Glykolyysivaiheen, laskea protoni tuotantonopeus (kuvio. 3C). On yksi-yhteen suhde laktaatin ja ATP tuotantonopeus alkaen Glykolyysivaiheen. Oligomysiini herkkä hapen kulutusta muutettiin ATP tuotantonopeus käyttämällä P /O-suhde on 2,3 [20]. Tulokset osoittivat, että SGC-7901-soluja viljeltiin DMEM: ssä (korkea glukoosi), jota oli täydennetty 2 mM pyruvaattia tehdään vähintään 93% niiden ATP OXPHOS (Fig. 3d).

karnosiini muuttunut bioenergetic luonnehdinta SGC- 7901 solua

Tässä tutkimuksessa selvitettiin vaikutuksia karnosiinin hapenkulutuksen ja solunulkoisen happamoitumisen korko viljellyissä SGC-7901-soluissa. Tulokset on esitetty. 4 osoitti, että hoito 20 mM karnosiini 48 h vähensi pohjapinta OCR ja ECAR on 141,13 ± 27,06 pmol /min per 10 × 10 ^{3-solut (~87% kontrollista), ja 11,32 ± 2,49 mph /min per 10 x 10 3-soluja (~27% kontrollista), vastaavasti (Fig. 4A, B). ATP-sidottu hengitystä, protoni vuotaa, ja ei-mitokondrioiden hengitystiheys oli 81,03 ± 17,97, 7,15 ± 3,6, ja 52,96 ± 8,40 pmol /min per 10 × 10 3-soluissa, vastaavasti (Fig. 4C, D, E ). Siten karnosiini käsiteltiin SGC-7901-solujen mitokondrioiden hengityksen osuus ~62% koko soluhengityksessä, ja ~92% (57% /62%) mitokondriaalisen hengityksen kytkettiin ATP-synteesin, ja ~8% mitokondrion hengitystä oli osuus protoni vuotaa. Siksi karnosiini hoito pienensi itseisarvo ATP-sidottu hengitystä, mutta se ei vaikuttanut suhteellinen maksuosuus ATP-sidottu hengitystä, protoni vuotaa, ja ei-mitokondrioiden hengitystä täydelliseen Soluhengitys. Lisäksi olemme havainneet, että karnosiini hoito lyhensi merkittävästi maksimaalisen OCR ja vara hengityselinten kapasiteettia 161,60 ± 28,46 pmol /min per 10 × 10 3-solut (~79% kontrollista) ja 20,47 ± 6,92 pmol /min per 10 × 10 3-soluja (~47% kontrollista) (Fig. 4F, G).}

HepG2 ja C6-soluja käytettiin myös edelleen todentamiseksi vaikutuksia karnosiinin syöpäsolujen energia-aineenvaihduntaan. Tulokset osoittivat, että 20 mM karnosiini hoito 48 h vähensi huomattavasti pohjapinta OCR ja ECAR HepG2 ja C6-soluissa, vastaavasti. Karnosiini lisäksi myös vähentää ATP-sidottu hengityksen C6-soluissa, mutta ei HepG2-soluissa (kuvio. S2). Kuitenkin 20 mM karnosiini vähensi huomattavasti solujen ATP-pitoisuus sekä HepG2 ja C6-soluissa, mikä osoittaa, että glykolyysi inhibitio oli mukana karnosiinin toimia ainakin HepG2-soluissa (kuvio. S2J).

karnosiini laski solunulkoisen maitohappoa taso viljellyissä SGC-7901-solujen

Koska karnosiini on mobiili orgaaninen pH puskuri, solunulkoinen happamoituminen korko määritetään esillä karnosiinia käyttäen Seahorse XF96 Solunulkoisilla Flux Analyzer voi heijastaa todellista Glykolyysivaiheen korko. Joten me myös käyttää HPLC määrittämään solunulkoiseen laktaattipitoisuus tarkistaa vaikutusta karnosiinin glykolyysin SGC-7901-soluissa. Tuloksemme osoittivat, että karnosiini hoito vähensi huomattavasti solunulkoisen maitohapon tasolla 84% kontrolli (Fig. 5), mikä osoittaa, että karnosiini on mahdollinen inhibitive vaikutus glykolyysin viljellyissä SGC-7901-soluissa.

karnosiini muuttunut suhteellinen vaikutus Glykolyysivaiheen ja OXPHOS ATP maksua SGC-7901-solua DMEM puute pyruvaatti

myös tunnettu vaikutus karnosiinin muutoksista ATP sisältöä ja suhteellinen osuus Glykolyysivaiheen ja OXPHOS ATP maksu in SGC-7901-solua DMEM puute pyruvaattia. Mittasimme solujen ATP: n pitoisuudet soluissa altistettiin 45 min kuuden olosuhteet: ajoneuvo, glykolyysijärjestelmän estäjä 2-DG, FCCP, rotenonin, FCCP plus rotenonin, ja 2-DG plus FCCP plus rotenone. Huomasimme, että karnosiini hoitoa 48 tuntia merkittävästi vähentää ATP pitoisuus 62% valvonnan. 2-DG hoito lyhensi ATP pitoisuus 48% ja 34% vuonna karnosiini poissa ja karnosiini läsnä ryhmissä verrattuna omia ajoneuvon ryhmiä, vastaavasti. FCCP ja FCCP plus rotenone jokainen vähensi merkitsevästi myös ATP pitoisuus 15% ja 18% karnosiinista poissa ryhmässä. Nämä lääkkeet eivät vaikuttaneet ATP sisältöä karnosiinista läsnä ryhmässä. Rotenone ei vaikuttanut ATP sisältöä sekä karnosiini poissa tai läsnä ryhmiä. 2-DG yhdistettynä FCCP ja rotenone olennaisesti eliminoitu ATP tuotantoa sekä näiden ryhmien (Fig. 6). Siten 2-DG väheni ATP veloittaa enemmän kuin FCCP tai rotenone teki niin karnosiini poissa ja läsnä ryhmiä. Nämä tulokset osoittavat, että ATP sukupolvi siirtyy OXPHOS glykolyysistä kun mitokondrioiden toiminta on heikentynyt. ATP maksua ei täysin yllä jälkeen estäminen joko Glykolyysivaiheen tai mitokondrioiden toimin- karnosiinin poissa ryhmässä, kun taas ATP maksu säilyy jälkeen eston mitokondrioiden toimintaa vuonna karnosiinista läsnä ryhmässä. Siten karnosiini hoito muuttanut suhteellinen osuus OXPHOS ja glykolyysin ATP tuotannon korko SGC-7901-soluissa.

Vaikutus pyruvaatin on inhibitive toiminnan karnosiinin SGC-7901-solujen mitokondrioiden toimintaan

sen tutkimiseksi, onko tason nostaminen pyruvaatti voidaan kääntää inhibitive vaikutus karnosiinin mitokondrion hengitystä SGC-7901, solut altistettiin eri pitoisuuksia pyruvaattia. Kuten on esitetty taulukossa. 1, tason nostaminen pyruvaatin ei kumonnut inhibitive vaikutuksen karnosiinin SGC-7901-solujen mitokondrioiden hengitystä. Lisäksi MTT-määritystä osoitti myös, että tason nostaminen pyruvaatin ei kumonnut karnosiinin toiminta SGC-7901-solujen mitokondrioiden aineenvaihduntaan (Fig. 7).

Effects of karnosiinin mitokondrion DNA-pitoisuutta ja mitokondrion kalvon potentiaalia in SGC-7901-solujen

Mitokondrioiden kalvon potentiaali (Δ Ψ
m) muodostaa suurimman protonin-motiivi voimaa käytetään ajo ATP synteesiä ja sen vuoksi on merkittävä rooli maksimaalinen ATP -generating kapasiteetti [21]. Siksi olemme käyttäneet myös lipofiilinen kationisia koetin JC-1 tutkia onko karnosiini estää OXPHOS kautta tukahduttaminen mitokondrion kalvon potentiaali (Δ Ψ
m). Tulokset osoittivat, että karnosiini hoitoa 48 tuntia ei indusoi selvää muutosta Δ Ψ
m viljellyissä SGC-7901-soluissa (kuvio. 8A).

Vastatakseen ilmeisesti väheni mitokondriaalisen hengityksen aiheuttama karnosiinin, myös määrällisesti absoluuttinen mitokondriaalisen DNA (mtDNA) numero, joka on tarkoin säädeltyä ylläpitämiseksi solujen energiantarve [22]. Yllätykseksemme tulokset osoittivat, että verrattuna ohjaus solujen absoluuttinen mtDNA kopioi numerot karnosiinin käsiteltyjen 7901 solut merkittävästi lisääntynyt, ja keskimääräinen absoluuttinen mtDNA kopioida luvut olivat 141,49 ± 7,42 kontrolliryhmässä soluissa ja 360,0 ± 59,84 vuonna karnosiini -käsitellyssä solut (Fig. 8B).

keskustelu

Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti bioenergetic profiilin viljeltyjen SGC-7901-solujen käsitelty ja ilman karnosiinista. Tärkeimpänä havainnot ovat seuraavat. Ensinnäkin, karnosiini vähensi proliferatiivista kapasiteettia SGC-7901-soluissa. Toiseksi soluja viljeltiin DMEM: ssä (korkea glukoosi), jota oli täydennetty 2 mM pyruvaattia valmistettu ~93% niiden ATP OXPHOS. Kolmanneksi karnosiini kohdistama sen inhibitive vaikutus SGC-7901-solujen lisääntymistä estämällä Glykolyysivaiheen, OXPHOS ja mitokondrioiden hengitykseen, solujen ja nämä toimet karnosiinin löydettiin myös HepG2 ja C6-soluissa. Siten karnosiini olisi harkittava yhdessä kasvava aseistus yhdisteiden eri vaiheissa lääkekehityksen että tavoite kasvain aineenvaihdunta, yksi tärkeimmistä tunnusmerkeistä kasvaimen [23].

Koska sen laaja toiminta, karnosiinin voidaan considerded terapeuttisena tekijänä hoidossa monia sairauksia. Esimerkiksi sinkki Carnosine on käytetty mahalaukun terveyden ja suolen korjaamiseen [24]. Viime aikoina tutkimukset osoittivat, transformoidut solut eivät kasva MEM, joka sisältää suuria pitoisuuksia karnosiinin, ja karnosiini voidaan antaa lääkkeen in vivo kasvun estämiseksi pahanlaatuisten solujen [25]. Kuitenkin oli kysytään karnosiini voi estää kasvua ihmisen mahalaukun kasvainsolujen lisäksi pahanlaatuisia soluja, jotka on raportoitu aiemmin. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että karnosiini voi myös estää kasvun viljeltiin SGC-7901-soluissa on ajasta ja pitoisuudesta liittyviä tavalla, ja tämä vaikutus ei ole liitetty apoptoosin tai nekroosi, mutta sitä voidaan mieluummin supistumisen aiheuttamia leviämisen. Kuitenkin yksityiskohtainen mekanismeista inhibitive vaikutus karnosiinin SGC-7901-solujen lisääntymistä ovat vielä epäselviä.

On yleisesti hyväksyttyä, että aineenvaihdunnan muutokset ovat yksi tunnusmerkkejä syövän. Otto Warburg ensin kuvattu käytön lisääminen anaerobisesti läsnäollessa riittävän hapen syöpäsolujen verrattuna normaaliin kollegansa: kutsuttiin "Warburg vaikutus" [26]. Kuitenkin viime aikoina, se on todettu, että molekyyli kohdentaminen OXPHOS voi olla tehoa pitkälle melanooma, jotka ovat kohonneet OXPHOS [14]. Siten eri tyyppisten kasvainten niiden eri kehitysvaiheissa on omat aineenvaihdunnan ominaisuudet. Siksi hoitostrategioita ja mekanismit eri kasvainten hoito perustuu energinen aineenvaihduntaan ovat erilaiset. Tässä tutkimuksessa, ensin käytetään uutta solunulkoista vuon tekniikkaa arvioimaan useita parametreja mitokondrioiden toimintaa ja solunulkoisen happamoitumisen kurssi rinnalla ATP pitoisuus määrätietoisesti tutkimaan bioenergetic luonnehdinta ihmisen mahasyövän SGC-7901-soluissa. Meidän Seahorse analyysi osoitti SGC-7901 solut ovat aktiivisia mitokondrioita, ja riippuvat mitokondrioiden OXPHOS yli Glykolyysivaiheen väylät sukupolven ATP kulttuurin kunnossa runsaasti glukoosia ja pyruvaatti, mikä viittaa siihen, että mitokondrio hengitys voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde ihmisen mahasyövän.

kuitenkin, kun soluja viljeltiin DMEM: ssä, ei ole pyruvaattia, ne riippuvat glykolyysin enemmän kuin viljeltiin DMEM mukana 2 mM pyruvaattia, koska esto glykolyysin 2-DG johtaa lasku ~48 % solun ATP sisältöä. Lisäksi tämä data osoittavat myös, että SGC-7901-solujen luultavasti puuttuu plastisuus siirtymiseen glykolyysistä mitokondrion hengitystä kun glykolyyttisissä ATP tuotanto lakkautetaan kulttuurin kunnossa energian puute aineita. Toisaalta, Wu et al
. ovat raportoineet, että oli olemassa tehokkaita korvaavia säätelyä Glykolyysivaiheen annon jälkeen oligomysiini estää oksidatiivinen fosforylaatio, ja tämä vastaus pystyi ylläpitämään ATP tasolle ihmisen ei-pienisoluisen sinoomasolulinjoja H460- ja A549 [15]. Tuloksemme osoittivat myös, että SGC-7901-solujen on kyky lisätä Glykolyysivaiheen kun mitokondrioiden toimintaan on estetty oligomysiini. Lisäksi kun mitokondrioiden toimintaan tukahdutettiin rotenonin tehokas korvaavia säätelyä Glykolyysivaiheen oli accurred, ja tämä vastaus pystyi ylläpitämään ATP tasolle SGC-7901-soluissa. Kuitenkin solut voinut upregulate tarpeeksi Glykolyysivaiheen kykyä ylläpitää ATP-tason irrotuksen mitokondriaalisen hengityksen ATP synteesi aiheuttama FCCP, (Fig. 6). Siksi SGC-7901 solut tarvitsevat lisäresursseja Glykolyysivaiheen ja mitokondrioiden respartion kapasiteettia, ja se tekee solut kasvavat eri olosuhteissa.

Äskettäin osoitettiin, että karnosiini vähensi leviämisen pahanlaatuinen gliooma jonka vaikutusta glykolyyttisiä ja ATP synteesi [27]. Meidän Esillä olevassa tutkimuksessa havaittiin myös, että hoidon karnosiini kykeni alenevassa solunulkoisen happamoituminen korko ja maitohapon taso, joka osoittaa, että karnosiini on inhibitive vaikutus glykolyysin SGC-7901-soluissa. Kuitenkin, karnosiini ei täysin, mutta inhiboivat osittain glykolyysin kapasiteetti soluja, koska farmakologinen inhibitio mitokondrion hengitystä, jonka rotenoni, tai irrotettuna mitokondriaalisen protonigradienttia ATP tuotannon FCCP, tai käsiteltiin rotenone ja FCCP samanaikaisesti, solut olivat silti upregulate Glykolyysivaiheen kompensoimaan ATP ehtyminen (Fig. 6). Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että karnosiini myös hallussaan uudenlainen rooli säätelijänä mitokondrion hengitystä. Karnosiini tukahdutti pohjapinta tasoilla mitokondrion hengitystä, ja tämä johtui lähinnä pienentyneestä ATP-sidottu hengitystä, mikä osoittaa, että mitokondrioiden ATP lähtö pienennyksen karnosiinin saaneilla SGC-7901-soluissa.

• PLoS ONE: Helicobacter pylori mahalaukun syövän ja pohjukaissuolihaava Näytä Sama Phylogeographic Alkuperä Andien alueella Kolumbia
• PLoS ONE: teho arviointi Yhteensä ja Total Gastrectomies in Robotic Surgery mahasyövän Verrattuna että Open ja Laparoskooppinen asemointia: Meta-analyysi