Abstract
Carnosine, een van nature voorkomende dipeptide, is onlangs aangetoond dat anti-tumor bezitten activiteit. Echter, de onderliggende mechanisme is onduidelijk. In deze studie hebben we het effect en het mechanisme van carnosine op de levensvatbaarheid van de cellen en de proliferatie van gekweekte menselijke maagkanker SGC-7901 cellen. Carnosine behandeling heeft apoptose of necrose opwekken, maar verminderde de proliferatieve capaciteit van SGC-7901-cellen. Seahorse analyse toonde SGC-7901 cellen gekweekt met pyruvaat hebben actieve mitochondria, en afhankelijk van mitochondriale oxidatieve fosforylering meer dan glycolyse route voor het genereren van ATP. Carnosine sterk verminderde de absolute waarde van mitochondriale ATP-gebonden ademhaling, verkleinde maximale zuurstofopname en reservecapaciteit ademhalingscapaciteit die mitochondriale functie gecorreleerd met proliferatieve potentieel kan verminderen. Tegelijkertijd carnosine verminderde ook het extracellulaire verzuring snelheid en glycolyse van SGC-7901-cellen. Onze resultaten suggereren dat carnosine is een potentiële regulator van de energiestofwisseling van SGC-7901 cellen, zowel in de anaerobe en aerobe paden, en op voorwaarde dat een aanwijzing voor preklinische en klinische evaluatie van carnosine voor maagkanker therapie
Visum:. Shen Y, Yang J, Li J, Shi X, L Ouyang, Tian Y, et al. (2014) Carnosine remt de proliferatie van menselijke maagkanker SGC-7901 cellen door Zowel van de Mitochondriale Ademhaling en glycolyse Pathways. PLoS ONE 9 (8): e104632. doi: 10.1371 /journal.pone.0104632
Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika
Ontvangen: 14 februari 2014; Aanvaard: 15 juli 2014; Gepubliceerd: 12 augustus 2014
Copyright: © 2014 Shen et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd
Financiering:. Dit project werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81102427), en deels ondersteund door de provincie Zhejiang Wetenschappelijk Onderzoek Foundations (Y2110322), het Programma voor Zhejiang leidende team van S & T Innovatie (2010R50048) en de stad Wenzhou Science and Technology Project (2010S0094 ). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript
Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan
Introductie
Maagkanker is een van de meest voorkomende kwaadaardige ziekten in de wereld. In de economisch ontwikkelingslanden, maagkanker is de tweede oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte [1], [2]. Ondanks de vooruitgang in chirurgische en multimodale therapie, de totale 5-jaars overleving blijft laag (15% tot 35%) vanwege de hoge recidieven, invasie en metastase [3]. Daarom is in de onderhavige, meer effectieve anti-tumor geneesmiddelen te ontdekken met minder bijwerkingen noodzakelijk.
L-carnosine (β-alanyl-L-histidine) is een natuurlijk voorkomend dipeptide dat wordt gesynthetiseerd door endogene carnosine synthetase. Het is wijd verspreid in zoogdierlijke hersenen, skeletspier, maag, nieren, hart en huid [4], [5]. Tot nu toe weinig bekend over de fysiologische functie maar verschillende vermeende rollen zijn beschouwd, zoals neurotransmitter, anti-ontstekingsmiddel, vrije radicalen, mobiele organische pH-buffer en metaal chelator [6], [7]. Vermeld is dat carnosine een potentieel therapeutisch middel voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer, beroerte, diabetes en andere ziekten van de zintuigen [8], [9]. Onlangs werd aangetoond dat carnosine kan ook een anti-tumorigene effecten. Zo is carnosine gerapporteerd dat de mogelijkheid om maligne gliomen groei [10] remmen bezitten, en dit effect kan worden gemedieerd door beïnvloedt glycolytische stofwisseling, de best gekarakteriseerde metabole fenotype waargenomen in tumorcellen, zogenaamde Warburgeffect [11 ], [12].
Onlangs heeft het belang van de mitochondriën als zuurstof sensoren evenals de producenten van ATP is uitgegroeid tot een brandpunt van het onderzoek naar kanker, en studies hebben een belangrijk fenomeen bleek dat mitochondriale metabolisme, in het bijzonder citroenzuur cyclus belangrijk is voor de snelle verspreiding van verschillende typen kankercellen [13], [14]. In het geval van menselijke maagkanker cellen, weinig informatie beschikbaar hoeverre glycolyse en mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) bijdragen tot de cellulaire energieproductie en snelle verspreiding. Of carnosine kunnen ook de groei van menselijke maagkanker inhiberen blijft onbekend. En of het remmende effect van carnosine op tumorcellen groei ook is gerelateerd aan haar optreden op de mitochondriale ademhaling en OXPHOS blijft onduidelijk.
Onlangs heeft de Seahorse Bioscience XF96 extracellulaire Flux Analyzer is gebruikt om gelijktijdig en voortdurend toezicht op zowel de aërobe en glycolytische componenten van cellulaire bio-energetica [15]. Daarom is in deze studie hebben we de effecten van carnosine op de groei van menselijke maagkanker cellen en de bio-energetische profiel van gekweekte menselijke maagkanker cel SGC-7901 en de rollen van carnosine in SGC-7901 cellen energiemetabolisme verdere karakteriseren de Seahorse Bioscience XF96 extracellulaire Flux Analyzer en andere aanverwante technologieën.
Materialen en methoden
reagentia
L-Carnosine, natriumpyruvaat, rotenon, carbonyl cyanide p-trifluormethoxyfenyl-hydrazon (FCCP), antimycin A, 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetra-zolium bromide (MTT), methanol, melkzuur waren van Sigma (St. Louis, MO, USA). Penicilline, streptomycine, L-glutamine, trypsine, Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), foetaal runderserum waren van GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA). Annexine V-FITC /PI apoptose detectie kit, BCA Protein Assay Kit en ATP Assay Kit werden gekocht van Beyotime Instituut voor Biotechnologie ((Nanjing, China). XF testmedium en XF kalibratieoplossing werden gekocht van Seahorse Bioscience.
Human maagkanker cellijn SGC-7901 (SGC-7901), menselijke lever hepatocellulaire carcinoom cellijn (HepG2) en rat C6 glioma cellijn (C6) werden aangekocht van het Shanghai Institute celbank, chinese Academy of Science (de oorspronkelijke bron is American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA). de cellen werden gekweekt in DMEM medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U /ml penicilline G en 100 ug /ml streptomycine, en gehandhaafd op 37 ° C en 5% CO 2 in een bevochtigde incubator. cellen werden getrypsiniseerd bij een verhouding van 1:03 na confluentie behulp 0,25% trypsine. subkweek werden cellen gezaaid op 96-, 24- of 6-well platen met dichtheden van 2 x 10 3, 5 x 10 4, 2 x 10 5 of 1 x 10 6 cellen /well, respectievelijk. reductie van MTT assay Cell metabole activiteit werd gevolgd door de colorimetrische MTT-bepaling zoals eerder [16] beschreven. In het kort werden cellen gekweekt op 96-well platen en er werden 6 putjes in elke groep. Eind experimenten werden de cellen geïncubeerd met 0,5 mg /ml MTT gedurende 4 uur bij 37 ° C. Vervolgens werd de bovenstaande laag verwijderd en 100 ul dimethylsulfoxide werd toegevoegd aan elk putje. MTT metabolisme werd spectrofotometrisch gekwantificeerd bij 570 nm in een microplaat reader Biorad. Resultaten werden uitgedrukt als het percentage reductie van MTT, waarbij de absorptie van controlecellen als 100%. De cellen werden uitgeplaat in platen met zes putjes bij een densiteit van 100-200 cellen per waren goed, en vervolgens behandeld met carnosine (20 mm). Klonen liet men groeien gedurende 14 dagen in DMEM kweekmedium aangevuld met 10% FBS, 100 U /ml penicilline G en 100 ug /ml streptomycine. De cellen werden vervolgens met 70% ethanol gefixeerd en gekleurd met Coomassie Brilliant Blue voor de analyse van kolonievorming zoals eerder beschreven [17]. De celdood werd gekwantificeerd door Annexine V-FITC-PI (propidiumjodide) dubbele kleuring met een FITC-Annexine V apoptose detectiekit volgens de suggestie van de fabrikant. Kort samengevat werden cellen geënt in 6-wells platen in DMEM medium. Cellen werden behandeld met 20 mM carnosine gedurende 48 uur en daarna verzameld en tweemaal in ijskoude PBS gewassen, opnieuw gesuspendeerd in bindingsbuffer met een dichtheid van 1 x 10 6 cellen /ml. Cellen werden gelijktijdig geïncubeerd met fluoresceïne gemerkt annexine V en PI voor 20 min en geanalyseerd door flowcytometrie. Annexine V-FITC gegenereerde signalen werden gedetecteerd met een FITC-signaaldetector (FL1, 525 nm). PI signalen werden geanalyseerd met een detector bestemd voor phycoerythrine emissie (FL2, 575 nm). De gegevens werden geanalyseerd met behulp van Cell Quest software van BD. Om het zuurstofverbruik rate (OCR) en extracellulaire verzuring rate (ECAR) van cellen in verschillende omstandigheden te meten, een Seahorse XF96 extracellulaire Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA) werd gebruikt. Dit instrument maakt het mogelijk om gevoelige meting van de glycolyse en meerdere parameters van mitochondriale functie, met inbegrip van basale OCR, reserveonderdelen respiratoire capaciteit, maximale OCR, ATP-linked ademhaling en proton lek van hechtende intacte gekweekte cellen. Nadat basislijn metingen OCR en ECAR werden gemeten na achtereenvolgens toevoegen aan elk putje 20 pl oligomycin, FCCP en rotenon, be- concentraties van 1 ug /ml, 1 uM en 1 uM, respectievelijk bereikt. Alle tests werden uitgevoerd met een zaaidichtheid van 10.000 cellen /putje in 200 pl DMEM in een XF96 celkweek microplaat (Seahorse Bioscience). De cellen werden overgezet op gebufferd DMEM aangevuld met 2 mM natriumpyruvaat en 20 mM carnosine 1 uur voor het begin van de test en gehandhaafd op 37 ° C. OCR wordt in de eenheid picomol per minuut en ECAR wordt gerapporteerd in milli-pH-eenheden (mijl) per minuut. De ATP-bepaling werd uitgevoerd volgens de fabrikant instructie. In het kort werden geoogste gekweekte cellen gelyseerd met lysis buffer, gevolgd door centrifugatie bij 10.000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C. Tenslotte wordt in 6-well platen, de hoeveelheid ATP werd bepaald door mengen van 20 ul van het supernatant met 100 pl luciferase reagens, waarbij de lichtproductie uit ATP en luciferine gekatalyseerd. Luminantie werd gemeten door een monochromator microplaat reader. Standaardkromme werd gegenereerd en de eiwitconcentratie van elke fractie werd bepaald met de BCA eiwit assay kit. Totaal ATP niveaus werden uitgedrukt als nmol /mg eiwit. De concentratie melkzuur in de celvrije supernatant werd gemeten door hoge-prestatie vloeistofchromatografie (HPLC ) in combinatie met een UV detector met de techniek zoals hiervoor beschreven. In het kort werden de bereide analysates gescheiden op ECOSIL C-18 omgekeerde kolom (3 urn, 250 mm x 4,6 mm) met behulp van oplosmiddel A en oplosmiddel B [0,1 mol /l NH 4 H 2PO 4 ( pH 3,4) verdund v /v in methanol 97:3] met een stroomsnelheid van 0,5 ml /min. De temperatuur van de kolom werd op 25 ° C, en de golflengte UV detectie werd ingesteld op 210 nm. De relatieve veranderingen in mitochondriale membraanpotentiaal (Δ Ψ absolute mtDNA kopieaantal werd gemeten door PCR amplificatie van een mitochondria amplicon [mens, NADH-ubiquinone oxidoreductase keten 4 (ND4)] met een nucleaire amplicon (mens, β-actine) uit DNA geïsoleerd met behulp van een Qiagen DNA mini kit. Primersequenties zijn als volgt: menselijk β-actine (voorwaarts: 5'- ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 ', reverse: 5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3'); human ND4 (forward: 5'-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 '; reverse: 5'-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3'). DNA-matrijzen werden regio overspant elke amplicon door PCR amplificatie. Verdunningen van 1 x 10 8 tot 1 x 10 2 exemplaren van het geïsoleerde DNA werden gebruikt om een standaardcurve voor de kwantificering genereren. De PCR cycling-omstandigheden bestonden uit een activeringsstap bij 95 ° C gedurende 30 seconden, gevolgd door 40 cycli van 5 seconden bij 95 ° C en 30 sec bij 58 ° C. Alle PCR's werden uitgevoerd op een Bio-Rad CFX Manager Real-Time PCR System (Applied Biosciences). Alle gegevens vertegenwoordigen drie of meer onafhankelijke experimenten. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Statistische analyses werden uitgevoerd door SPSS 11.5 voor Windows. One-way ANOVA (variantie-analyse), gevolgd door LSD (minst significante verschil) of Dunnett T3 post-hoc Electronics Test (waar gelijk varianties niet werden aangenomen) werd toegepast voor meerdere vergelijkingen, terwijl t-toets was gebruikt voor vergelijkingen tussen twee groepen. P Restaurant < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant Resultaten Effect van carnosine op SGC-7901 cellen levensvatbaarheid Om het effect van carnosine op te bepalen. menselijke maagkanker SGC-7901 cellulaire levensvatbaarheid werd reductie van MTT-assay toegepast. De resultaten toonden aan dat carnosine verminderde significant cellevensvatbaarheid in een tijd- en concentratieafhankelijke wijze. Carnosine bij concentraties van 5 en 20 mM duidelijk verminderde cellevensvatbaarheid met 84,0% en 57,9% van de controle na 24 uur, en 73,5% en 45,9% van de controle na 48 uur (Fig. 1A). Echter, carnosine in een concentratie van 1 mM had geen effect SGC-7901 cellulaire levensvatbaarheid op 24 of 48 uur. We verder gebruikt flowcytometrie te testen of carnosine SGC-7901 cel necrose of apoptose kunnen veroorzaken. Verrassenderwijze toonden de resultaten dat carnosine behandeling van 48 uur geen necrotische of apoptotische celdood in SGC-7901-cellen (Fig. 1B) induceerde. Omdat de reductie van MTT ook geïnterpreteerd indicatie van cellulaire metabole activiteit te zijn, en de MTT waarde van een celpopulatie wordt bepaald door zowel het aantal levensvatbare cellen aanwezig en hun relatieve stofwisseling, dus naast het aantal cellen in een parallel experiment berekenen met identiek behandeld SGC-7901-cellen met behulp van mobiele tellen plaat. We vonden dat het aantal cellen in carnosine behandeld gedurende 48 uur groep was vergelijkbaar met die in de controlegroep (Fig. 1C), hetgeen aangeeft dat de verminderde cellevensvatbaarheid geïnduceerd door carnosine behandeling van 48 uur in SGC-7901 cellen werd door metabole veranderingen maar niet te wijten aan celdood of celproliferatie. om te controleren of deze acties van carnosine ook voorkomen in andere kankercellen, HepG2 en C6-cellen werden gebruikt. De resultaten toonden aan dat 20 mM carnosine behandeling van 48 uur geen celdood (tabel. S1) of proliferatie, maar duidelijk verminderde MTT reducerende activiteit induceerde zowel HepG2 en C6-cellen (Fig. S1). om te onderzoeken of blootstelling aan choronic carnosine kunnen hebben voor de proliferatieve capaciteit van SGC-7901 cellen, werden de cellen gezaaid met een lage dichtheid (100-200 cellen /putje) en liet kolonies 14 dagen in DMEM gesupplementeerd met 20 mM carnosine vormen. Zoals getoond in Fig. 2, choronic blootstelling aan carnosine verminderde kolonies vorming tot 39,9% van de controle. We onderzochten de OCRs en ECAR in gekweekte SGC-7901-cellen met behulp van een Seahorse XF-96 extracellulaire flux analyse, zoals eerder beschreven [18]. Basale cellulaire OCR en ECAR bleken 161,02 ± 29,58 pmol /min per zijn 10 × 10 3-cellen (initiële celgetal) en 39.31 ± 4.29 mph /min per 10 x 10 respectievelijk 3-cellen (Fig. 3A). De ATP-gekoppelde ademhaling (de totale basale minus de tarieven van oligomycin, waarbij oligomycin een remmer van ATP-synthese) was 96,15 ± 18,34 pmol /min per 10 x 10 3 cellen, wat aangeeft dat -60% van cellulaire zuurstof de consumptie was gerelateerd aan de ATP-synthese. Tegelijkertijd ECAR verhoogd tot -250% van de uitgangswaarde aanbiedingen in aanwezigheid van maximaal effectieve dosis oligomycin (1 ug /ml), wat aangeeft dat de cellen verschoven mitochondriale respiratie glycolyse. Rotenon (1 uM) teruggebracht OCR tot 55,78 ± 8,86 pmol /min per 10 × 10 3-cellen (~35% van de basislijn tarieven). De rotenon-resistente percentage weerspiegelt de niet-mitochondriale ademhaling tarief, dat substraat oxidatie en celoppervlak zuurstofverbruik [19] omvat. Aldus non-mitochondriale ademhaling goed voor ~35%, terwijl mitochondriale respiratie goed voor -65% van de totale cellulaire ademhaling. Dus in gekweekte SGC-7901 cellen ~92% (60% /65%) van mitochondriale respiratie werd gekoppeld aan ATP synthese en -8% mitochondriale respiratie werd verklaard door proton lekkage (fig. 3B). In aanwezigheid van maximaal effectieve dosis FCCP (1 uM, een ontkoppeling middel dat maximale elektronentransport toelaat), tot een toename van OCR waargenomen en werd verhoogd tot 204 ± 30,24 pmol /min per 10 x 10 3 cellen. We hebben ook een evaluatie van de relatieve bijdrage van de glycolyse en OXPHOS in ATP productie tarief in SGC-7901-cellen. Absolute kwantificering van zowel de glycolytische rate en oligomycin-gevoelige zuurstof verbruik werden gemeten in SGC-7901-cellen. Het extracellulaire verzuring prijs is vooral te wijten aan lactaat en bicarbonaat productie en, indien gekalibreerd als het proton productiesnelheid, geeft glycolytische tarief [15]. Derhalve gebruikten we oxamaat om lactaat dehydrogenase, welke pyruvaat converteert naar lactaat in de laatste stap van de glycolyse te remmen, om de proton productiesnelheid (Fig. 3C) te berekenen. Er is een één-op-één relatie tussen de lactaat productie snelheid en de ATP-productie snelheid van de glycolyse. De oligomycin gevoelige zuurstofverbruik werd omgezet in het ATP productiesnelheid met een P /O verhouding van 2,3 [20]. De resultaten toonden aan dat SGC-7901-cellen gekweekt in DMEM (hoog glucose) aangevuld met 2 mM pyruvaat die ten minste 93% van de ATP middels OXPHOS (fig. 3D). We onderzochten de effecten van carnosine op het zuurstofverbruik snelheid en extracellulaire verzuring tarief in gekweekte SGC-7901-cellen. De resultaten in Fig. 4 toonde aan dat de behandeling met 20 mM carnosine gedurende 48 uur verminderde de basale OCR en ECAR naar 141,13 ± 27,06 pmol /min per 10 × 10 3-cellen (~87% van de controle) en 11.32 ± 2.49 mph /min per 10 x 10 3 cellen (~27% van controle) (Fig. 4A, B). De ATP-gekoppelde ademhaling, proton lek, en niet-mitochondriale ademhaling was 81,03 ± 17,97, 7,15 ± 3,6 en 52,96 ± 8,40 pmol /min per 10 x 10 3 cellen (Fig. 4C, D, E ). Dus in carnosine behandeld SGC-7901 cellen, mitochondriale respiratie goed voor ~62% van de totale cellulaire ademhaling en ~92% (57% /62%) van mitochondriale respiratie werd gekoppeld aan ATP synthese en -8% mitochondriale respiratie was voor rekening van proton lek. Daarom carnosine behandeling verminderde de absolute waarde van de ATP-linked ademhaling, maar het had geen invloed op de relatieve bijdrage tarief van ATP-linked ademhaling, proton lek, en non-mitochondriale ademhaling totale cellulaire ademhaling. Verder vonden we ook dat carnosine behandeling aanzienlijk verminderd de maximale OCR en reserveonderdelen respiratoire capaciteit om 161,60 ± 28,46 pmol /min per 10 × 10 3-cellen (~79% van de controle) en 20.47 ± 6.92 pmol /min per 10 × 10 3 cellen (~47% of control) (figuur 4F, G.). HepG2 en C6-cellen werden ook gebruikt om de effecten van carnosine op kankercellen energiemetabolisme verder te verifiëren. De resultaten toonden aan dat 20 mM carnosine behandeling van 48 uur duidelijk verminderd de basale OCR en ECAR van de HepG2 en C6-cellen. Carnosine aanvulling ook verminderd ATP-gebonden ademhaling in C6-cellen, maar niet in HepG2-cellen (Fig. S2). Echter, 20 mM carnosine duidelijk verminderd de cellulaire ATP-gehalte zowel HepG2 en C6-cellen, wat aangeeft dat remming glycolyse betrokken was bij carnosine actie, althans in HepG2-cellen (Fig. S2J). Omdat carnosine is een mobiele organische pH-buffer, de extracellulaire verzuring tarief getest in het heden van carnosine met behulp van de Seahorse XF96 extracellulaire Flux Analyzer kan geen afspiegeling van de werkelijke glycolyse tarief. Dus ook de extracellulaire HPLC melkzuurspiegel het effect van carnosine op glycolyse in SGC-7901 cellen verifiëren testen. Onze resultaten toonden dat carnosine behandeling duidelijk verminderd de extracellulaire melkzuurspiegel tot 84% van de controle (fig. 5), wat aangeeft dat carnosine heeft een potentieel remmend effect op glycolyse in gekweekte SGC-7901 cellen. We kenmerk ook het effect van carnosine op de veranderingen van ATP-gehalte en de relatieve bijdrage van glycolyse en OXPHOS ATP lading in SGC-7901-cellen gekweekt in DMEM weinig pyruvaat. We maten cellulaire ATP-concentratie in cellen blootgesteld gedurende 45 minuten tot zes voorwaarden: voertuig, de glycolyse inhibitor 2-DG, FCCP, rotenon, FCCP plus rotenon en 2-DG plus FCCP plus rotenon. We vonden dat carnosine behandeling van 48 uur aanzienlijk verminderd ATP-gehalte tot 62% van de controle. 2-DG behandeling aanzienlijk verminderd ATP-gehalte met 48% en 34% in carnosine afwezig en carnosine aanwezige groepen in vergelijking met hun eigen voertuig groepen, respectievelijk. FCCP en FCCP plus rotenon ieder ook significant afgenomen ATP-gehalte met 15% en 18% in carnosine afwezig groep. Echter, deze medicijnen geen effect op ATP-gehalte in carnosine huidige groep. Rotenon had geen invloed op ATP-gehalte zowel in carnosine afwezig of aanwezig groepen. 2-DG in combinatie met FCCP en rotenon hoofdzaak geëlimineerd ATP productie In die twee groepen (fig. 6). Dus 2-DG afgenomen ATP kosten meer dan FCCP of rotenon deed zowel in carnosine afwezig en aanwezig groepen. Deze gegevens tonen aan dat ATP generatie verschuift van OXPHOS tot glycolyse wanneer mitochondriale functie wordt aangetast. ATP lading niet volledig gehandhaafd na remming van hetzij glycolyse of mitochondriale functie in carnosine afwezig groep, terwijl ATP heffing wordt gehandhaafd na remming van mitochondriale functie in carnosine huidige groep. Zo carnosine behandeling veranderde de relatieve bijdrage van OXPHOS en glycolyse in ATP productie tarief in SGC-7901-cellen. om te onderzoeken of het verhogen van het pyruvaat het remmende effect van carnosine op de mitochondriale respiratie van SGC-7901 cellen kan omkeren, werden de cellen blootgesteld aan verschillende concentraties pyruvaat. Zoals getoond in Tabel. 1, het verhogen van het niveau van pyruvaat kon niet het remmende effect van carnosine op de SGC-7901 cellen mitochondriale ademhaling te keren. Bovendien, de MTT-bepaling toonde ook aan dat het verhogen van het pyruvaat kan de carnosine actie SGC-7901 cellen niet achteruit mitochondriaal metabolisme (fig. 7). mitochondriale membraanpotentiaal (Δ Ψ Om het adres schijnbaar verlaagd mitochondriale respiratie geïnduceerd door carnosine, wij gekwantificeerd ook de absolute mitochondriaal DNA (mtDNA) nummer, die strak is geregeld voor het handhaven van cellulaire energie eisen [22]. Tot onze verbazing, de resultaten bleek dat in vergelijking met controle cellen, de absolute mtDNA kopiëren aantallen-carnosine behandelde 7901 cellen werden duidelijk verhoogd, en de gemiddelde absolute mtDNA kopiëren nummers waren 141,49 ± 7.42 in de controle cellen en 360,0 ± 59,84 in de carnosine behandelde cellen (Fig. 8B). Discussie Voor zover ons bekend, is dit het eerste verslag van de bio-energetische profiel van gekweekte SGC-7901 cellen behandeld met en zonder carnosine. De voornaamste bevindingen zijn als volgt. Ten eerste, carnosine verminderde de proliferatieve capaciteit van SGC-7901-cellen. Ten tweede, de cellen gekweekt in DMEM (hoog glucose) aangevuld met 2 mM pyruvaat gemaakt ~93% van de ATP middels OXPHOS. Ten derde, carnosine oefende het remmend effect op SGC-7901 celproliferatie tot remming glycolyse, OXPHOS en mitochondriale ademhaling van de cellen en deze acties van carnosine werden ook gevonden in HepG2 en C6-cellen. Daarom moet carnosine worden overwogen, alsook de toenemende bewapening van verbindingen in verschillende ontwikkelingsfasen die tumormetabolisme, een van de belangrijkste kenmerken van de tumor [23] targeten. Door de brede werkingsspectrum, carnosine kan considerded als therapeutische factor in de behandeling van vele ziekten. Zo is zink carnosine gebruikt voor maag en darm gezondheid reparatie [24]. Onlangs toonden studies getransformeerde cellen niet groeien in MEM met hoge concentraties carnosine en carnosine kan worden toegediend als een geneesmiddel in vivo de groei van kwaadaardige cellen [25] remmen. Toch moest de vraag of carnosine de groei van humane gastrische tumorcellen naast de kwaadaardige cellen die eerder gemeld kan voorkomen. In deze studie hebben we vastgesteld dat carnosine is ook in staat de groei van gekweekte SGC-7901 cellen te remmen in een tijd- en concentratieafhankelijke wijze, en dit effect werd niet vergezeld door apoptose of necrose, maar kan eerder veroorzaakt door een verminderde proliferatie. Echter, de gedetailleerde mechanismen die ten grondslag liggen aan het remmende effect van carnosine op de SGC-7901-cellen proliferatie zijn nog onduidelijk. Het is algemeen aanvaard dat de metabole veranderingen zijn een van de kenmerken van kanker. Otto Warburg eerst beschreven de toename van het gebruik van anaerobe metabolisme in de aanwezigheid van voldoende zuurstof kankercellen in vergelijking met hun normale tegenhangers: de zogeheten 'Warburgeffect "[26]. Echter, onlangs, het is erop gewezen dat de moleculaire targeting van OXPHOS werkzaamheid voor geavanceerde melanoom die verhoogde niveaus van OXPHOS [14] kan hebben. Aldus verschillende typen tumoren op hun verschillende ontwikkelingsstadia hun eigen metabole eigenschappen. Daarom is de therapeutische strategieën en mechanismen van verschillende tumoren behandeling op grond van energetische metabolisme verschillend. In de onderhavige studie hebben we eerst gebruikt een nieuwe extracellulaire flux technologie vele parameters van mitochondriale functie en extracellulaire verzuringssnelheid parallel aan ATP concentratiebepaling voorgesteld om de bio-energetische karakterisering van menselijke maagkanker SGC-7901 cellen verkennen. Onze Seahorse analyse toonde SGC-7901 cellen actieve mitochondria, en afhankelijk van mitochondriale OXPHOS meer dan glycolyse routes voor het genereren van ATP in de kweekomstandigheid hoge glucose en pyruvaat, suggereert dat mitochondriale ademhaling een mogelijk therapeutisch doelwit menselijke maagkanker kan zijn. echter, wanneer de cellen werden gekweekt in DMEM weinig pyruvaat, ze afhankelijk glycolyse meer dan gekweekt in DMEM met 2 mM pyruvaat toegevoerd omdat remming van de glycolyse door 2-DG leidt tot een daling van -48 % cellulaire ATP-gehalte. Bovendien is deze gegevens ook aangeven dat SGC-7901 cellen waarschijnlijk missen plasticiteit in het overschakelen van de glycolyse tot mitochondriale ademhaling wanneer glycolytische ATP productie in de cultuur conditie gebrek aan energie stoffen wordt afgeschaft. Anderzijds, Wu et al Onlangs werd aangetoond dat carnosine verminderde proliferatie van maligne glioom door beïnvloedt glycolytische en ATP synthese [27]. In onze studie vonden we ook dat behandeling met carnosine kon verlagen van de extracellulaire verzuringssnelheid en melkzuur, wat wijst dat carnosine heeft een remmend effect op glycolyse in SGC-7901 cellen. Echter, carnosine niet volledig, maar gedeeltelijk geremd glycolyse capaciteit van de cellen, omdat farmacologische remming van mitochondriale respiratie door rotenon, of afgekoppeld het mitochondriale proton gradiënt van ATP productie door FCCP, of behandeld met rotenon en FCCP tegelijkertijd, de cellen nog steeds in staat glycolyse upregulate ter compensatie ATP depletie (fig. 6). Interessant, vonden we dat carnosine bezit ook een nieuwe rol als regulator van mitochondriale ademhaling. Carnosine onderdrukte basale niveaus van mitochondriale ademhaling, en dit was vooral te wijten aan de verminderde ATP-linked ademhaling, wat aangeeft dat het mitochondriale ATP productie afneemt in de carnosine-behandelde SGC-7901-cellen.
kolonievorming assay
Flow cytometrische test van celdood
extracellulaire Flux Technologie
Bepaling van ATP productie
HPLC analyse van extracellulaire melkzuur
mitochondriale membraanpotentiaal beoordeling
m) werden beoordeeld met behulp van de lipofiele kationische sonde JC-1 5,5 ', 6,6'-tetrachloordibenzodioxine 1,1', 3,3'-tetra-benzamid azolocarbocyanine jodide (JC-1; Molecular Probes). De kleurstof JC-1 ondergaat een omkeerbare verandering in de fluorescentie-emissie van groen naar oranje groenachtig als Δ Ψ
m toeneemt. Cellen met een hoge Δ Ψ
m formulier JC-1 aggregaten en fluoresceren rood; mensen met een laag Δ Ψ
m bevatten monomeer JC-1 en fluoresceren groen. Na behandeling met carnosine gedurende 48 uur werd het kweekmedium verwijderd en de cellen gekweekt op dekglaasjes werden geïncubeerd in het donker met JC-1 in een eindconcentratie van 2 uM gedurende 20 min. De cellen werden gespoeld met PBS en tweemaal geëxciteerd bij 488 nm met een Olympus BX-51 fluorescentiemicroscoop.
MtDNA kopieaantal meting
Statistische analyse
choronic behandeling met carnosine remde SGC-7901 cellen kolonies vorming
Bioenergetic karakterisering van gekweekte SGC-7901 cellen
carnosine veranderde de bio-energetische karakterisering van SGC- 7901 cellen
carnosine verminderde extracellulaire melkzuur niveau in gekweekte SGC-7901 cellen
carnosine veranderd relatieve bijdrage van glycolyse en OXPHOS ATP inbegrepen SGC-7901-cellen gekweekt in DMEM weinig pyruvaat
Effect van pyruvaat op de remmende werking van carnosine op SGC-7901 cellen mitochondriale functie
Effecten van carnosine op de mitochondriale DNA-inhoud en mitochondriale membraanpotentiaal in SGC-7901 cellen
m) waarmee het grootste gedeelte van het proton drijvende kracht voor het besturen ATP synthese en heeft derhalve een belangrijke rol bij de maximale ATP -generating capaciteit [21]. Daarom hebben we ook gebruik van de lipofiele kationische sonde JC-1 te onderzoeken of carnosine onderdrukt OXPHOS via onderdrukking van de mitochondriale membraanpotentiaal (Δ Ψ
m). De resultaten toonden aan dat carnosine behandeling van 48 uur een duidelijke verandering van Δ Ψ
m in gekweekte SGC-7901-cellen (Fig. 8A) kon induceren.
. hebben gerapporteerd dat er een doeltreffende vervangende opregulatie van glycolyse na toediening van oligomycin oxidatieve fosforylering blokkeren en deze reactie kon ATP niveau houden in de menselijke niet-kleincellige carcinoma cellijnen H460 en A549 [15]. Onze resultaten toonden ook aan dat SGC-7901-cellen hebben het vermogen om glycolyse te verhogen wanneer mitochondriale functie geblokkeerd door oligomycin. Bovendien, als de mitochondriale functie werd onderdrukt door rotenon, een doeltreffende vervangende opregulatie van glycolyse werd accurred en deze reactie kon ATP niveau houden in SGC-7901 cellen. Echter, de cellen niet genoeg opreguleren glycolyse vermogen om ATP niveau houden bij het afkoppelen mitochondriale respiratie van ATP synthese geïnduceerd door FCCP, (fig. 6). Daarom SGC-7901 cellen bezitten aanzienlijke glycolyse en mitochondriale respartion capaciteit, en het maakt de cellen groeien onder verschillende omstandigheden.
Wetenschappelijk symposium op LABVOLUTION richt zich op kernthema's in de levenswetenschappen
Plantaardige diëten verbeteren de gezondheid van het hart via het darmmicrobioom
Gasdetecterende elektronische pil voor diagnose van gastro-intestinale aandoeningen
Onderzoek met een tweeling toont aan dat COVID-19-symptomen een genetische bijdrage hebben
Waarom heb ik een colonoscopie nodig?
Bacteriën in het geboortekanaal gekoppeld aan een lager risico op eierstokkanker
Fastfood kan een hoofdschuldige zijn bij tienerdepressie
Waarom is depressie zon groeiend probleem onder tieners in Amerika? Een antwoord is het soort voedsel dat ze eten, volgens een nieuwe studie door onderzoekers van de Universiteit van Alabama in Birmin
Darm- en orale microbiomen voorspellen de ernst van COVID-19
Een vraag die tijdens de aanhoudende pandemie van de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) onbeantwoord blijft, is waarom er een kenmerkend wisselvallig patroon is als het gaat om ernstige ziekten? Een in
Genetica kan de samenstelling van het microbioom meer beïnvloeden dan omgevingsfactoren
Onderzoekers die muizen bestuderen aan het Technion-Israel Institute of Technology hebben ontdekt dat het microbioom veel meer wordt beïnvloed door genetica dan door de geboorteomgeving van de moeder.