Plos ONE: Karnozin zavira proliferacijo človeške želodčne Rak SGC-7901 celic skozi Oba v mitohondrije Dihanje in Glikoliza Pathways

Povzetek

karnozinom, naravno dipeptid, je nedavno pokazala, da imajo anti-tumor dejavnost. Vendar pa je njegova osnovni mehanizem ni jasen. V tej študiji smo raziskali vpliv in mehanizem karnozinom na sposobnost preživetja celic in proliferacijo kultivirani raka človeške želodčne SGC-7901 celice. Zdravljenje karnozin ni povzročil apoptozo celic ali nekroza, vendar zmanjšala proliferativni zmogljivosti SGC-7901 celic. Seahorse analiza je pokazala, SGC-7901 celice kultivirani s piruvat imajo aktivno mitohondrije, in je odvisen od mitohondrijske oksidativne fosforilacije več kot glikolize poti za pridobivanje ATP. Karnozin izrazito zmanjšalo absolutno vrednost mitohondrijev-ATP povezano dihanje in zmanjša maksimalno porabo kisika in prostih dihalno kapaciteto, ki lahko zmanjša delovanje mitohondrijev v korelaciji z proliferativni potencial. Hkrati karnozin zmanjšala tudi zunajcelični stopnjo zakisljevanja in glikolize v SGC-7901 celic. Naši rezultati kažejo, da je karnozin potencialni regulator energetskega metabolizma SGC-7901 celic tako v anaerobnih in aerobnih poti, in če je namig za predklinične in klinične vrednotenje karnozinom za terapijo raka želodca

Navedba sklicevanja. Shen Y, Yang J Li J Shi X Ouyang L, Tian Y, et al. (2014) Karnozin zavira proliferacijo človeške želodčne Rak SGC-7901 celic skozi Oba mitohondrijske dihanje in glikolize Poti. PLoS ONE 9 (8): e104632. doi: 10,1371 /journal.pone.0104632

Urednik: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Združene države Amerike

Prejeto: 14. februar 2014; Sprejeto: 15. julij 2014; Objavljeno: 12. avg 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta projekt je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske (81102427), in province Zhejiang Znanstveno raziskovalne ustanovah (Y2110322), program za Zhejiang Glavno ekipa s &delno podprta; T inovacij (2010R50048) in Wenzhou mesta, znanost in tehnologijo Project (2010S0094 ). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je eden izmed najpogostejših malignih sprememb v svetu. V državah ekonomsko razvoju, želodčni rak je drugi vzrok smrti zaradi raka [1], [2]. Kljub izboljšanju kirurške in multimodalnega zdravljenja, splošno 5-letno preživetje je še vedno nizka (15% do 35%) zaradi visokih stopenj ponovitve, invazija in metastaze [3]. Zato je v tem trenutku, da odkrijete več učinkovitih anti-tumorske drog z je potrebno manj stranskih učinkov.

L-Karnozin (β-alanil-L-histidin) je naravno dipeptid, ki se sintetizira endogeno karnozinom sintetaze. To je zelo razširjen v možganih sesalcev, skeletnih mišicah, želodca, ledvic, srca in kože [4], [5]. Doslej ni veliko znanega o njegovem fiziološke funkcije pa več domnevne vloge so bile upoštevane, kot nevrotransmiter, protivnetno sredstvo, prostih radikalov lovilec, mobilni organske pufra in kovinskega kelatorja [6] [7]. Ugotovljeno je bilo, da je karnozin potencialno terapevtsko sredstvo za zdravljenje Alzheimerjeve bolezni, kapi, diabetesa in drugih bolezni čutil [8], [9]. Nedavno je bilo dokazano, da imajo lahko karnozin tudi anti-tumorogene učinke. Na primer, je bilo karnozin poročali, da imajo sposobnost, da inhibira maligne rasti gliomov [10], in ta učinek lahko posreduje vplivom na glikolitski energetski metabolizem, najboljši označen metabolni fenotip opazili pri tumorskih celicah, znanih kot Warburg učinek [11 ], [12].

v zadnjem času se je pomen mitohondrijev so kisika senzorji, kot tudi proizvajalci ATP postal osrednja točka raziskav raka, in študije so pokazale, pomemben pojav, ki mitohondrijski metabolizem, predvsem citronska kislina dejavnost ciklus je pomembno za hitro razraščanje več vrst rakavih celic [13], [14]. Vendar pa v primeru človeške želodčne rakavih celic, malo informacij je na voljo v kolikšni meri glikoliza in mitohondrijsko oksidativna fosforilacija (OXPHOS) prispevajo k proizvodnji celične energije in hitro širjenje. Ali karnozin lahko inhibira tudi rast človeških rakavih celic želodčnih ostaja neznan. In ali je inhibitive učinek karnozinom na rast tumorskih celic tudi v zvezi z njegovim delovanjem na mitohondrijsko dihanje in OXPHOS ostaja nejasna.

Pred kratkim je Seahorse Biološka znanost XF96 zunajcelično Flux Analyzer je bila uporabljena za sočasno in nenehno spremlja tako aerobne in glikoliticna sestavine celičnih bioenergetikov [15]. Zato je v tej študiji smo raziskali učinke karnozinom na rast človeške želodčne rakavih celic in za nadaljnjo karakterizacijo bioenergijske profil kultiviranega človeške želodčne rakave celice SGC-7901 in vloge karnozinom v SGC-7901 metabolizem celic z energijo z Seahorse Bioscience XF96 zunajcelično Flux Analyzer in druge s tem povezane tehnologije.

materiali in metode

Reagenti

L-Karnozin, natrijev piruvat, rotenon, karbon cianid p-trifluorometoksifenil hidrazon (FCCP) antimycin A so bile 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-diphenyltetra-zolium bromid (MTT), metanola, mlečna kislina iz Sigma (St. Louis, MO, ZDA). Penicilin, streptomicin, L-glutamin, tripsin, Dulbeccovem modificiranem Eaglov medij (DMEM), fetalni goveji serum bili iz GIBCO BRL-(Grand Island, NY, ZDA). Aneksin V-FITC /PI komplet za odkrivanje apoptoza, BCA Protein Analiza Kit in ATP Test Kit so kupili od Beyotime Inštituta za biotehnologijo ((Nanjing, Kitajska). XF test srednje in XF rešitev Kalibratorji so kupili od Seahorse Bioscience.

celične kulture

Human rak celične linije želodčni SGC-7901 (SGC-7901), humani jeter hepatocelularni karcinom linija (HepG2) in podganji C6 glioma celična linija (C6) so bili kupljeni iz celične banke Shanghai Institute, kitajski Academy of Science (prvotni izvor je ameriški tip Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA). Celice smo kultivirali v DMEM mediju, dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (FBS), 100 U /ml penicilina G in 100 mikrogramov /ml streptomicina, ter vzdržujemo pri 37 ° C in 5% CO _{2 v navlaženem inkubatorju. celice tripsiniziramo pri razmerju 1:3 po izliva pomočjo 0,25% tripsina. kultivirajo celice smo zasejali 96-, 24- ali 6-jamicami na gostoto 2 × 10 ^{3, 5 × 10 4, 2 x 10 5 ali 1 × 10 6 celic /dobro oz.}}

zmanjšanje MTT test

Cell presnovno aktivnost spremlja kolorimetrično MTT testom, prej [16] opisano. Na kratko, so bile celice kultiviramo v 96-vdolbinami pa je bilo 6 jamice v vsaki skupini. Na koncu eksperimentov, smo celice inkubirali z 0,5 mg /ml MTT 4 h pri 37 ° C. Nato supernatant plast odstranimo in 100 u.l dimetilsulfoksida smo dodali v vsako jamico. Presnova MTT je kvantificiramo spektrofotometrično pri 570 nm v BioRad mikroploščnem čitalniku. Rezultate smo izrazili kot odstotek zmanjšanja MTT, pri čemer absorbanco kontrolnih celicah kot 100%.

kolonija tvorba vsebnosti

Celice smo nanesli v šestih vdolbinami na gostoto 100-200 celic na dobro, nato pa so bili zdravljeni z karnozinom (20 mm). Klone pustimo, da raste pri 14 dneh v DMEM mediju kulture, dopolnjenih z 10% FBS, 100 E /ml penicilina G in 100 ug /ml streptomicina. Celice so bile nato določen z 70% etanola in obarvali s Coomassie Brilliant Blue za analizo tvorbe kolonij, kot je prej opisano [17].

Tok citometrijo Analiza celične smrti

celične smrti smo kvantificirali z vezave aneksin v-FITC-PI (propidijevim jodid) dvojno obarvanje, z uporabo kompleta za odkrivanje apoptoza aneksin v-FITC v skladu s predlogom proizvajalca. Na kratko smo celice zasejali v 6 vdolbinami v DMEM mediju. Celice smo obdelali z 20 mM karnozinom 48 h, nato zberemo in dvakrat speremo v ledeno mrzlo PBS, resuspendirali v vezavnem pufru z gostoto 1 x 10 ^{6 celic /ml. Celice smo istočasno inkubirali s-fluorescein označene aneksinom V in PI za 20 minut in analiziramo s citometrije toka. Aneksin V-FITC ustvarila signali so bile odkrite z detektorjem FITC signala (FL1, 525 nm). PI signali so spremlja detektor rezerviran za ficoeritrin emisije (FL2, 575 nm). Podatke smo analizirali z Cell Quest programsko opremo iz BD.}

zunajcelični Flux Technology

Za merjenje hitrosti porabe kisika (OCR) in zunajcelični stopnjo zakisljevanja (ECAR) celic v različnih pogojih lahko Seahorse XF96 je bila uporabljena zunajcelični Flux Analyzer (Seahorse Biološka znanost, Billerica, MA, ZDA). Ta instrument omogoča občutljivo merjenje glikolize in več parametrov delovanje mitohondrijev, vključno bazalnih OCR, rezervnim dihal zmogljivosti, maksimalna OCR, ATP-povezano dihanje in protonov uhajanja iz oprijetih nepoškodovane gojenih celic. Po osnovnih meritev, so OCR in ECAR merijo po zaporedno tako, da vsak tudi 20 ul v oligomycin, FCCP in rotenona, da dosežejo delovne koncentracijo 1 g /ml, 1 um in 1 um, v tem zaporedju. Vse teste smo izvedli ob uporabi gostoto sejanje 10000 celic /vdolbino v 200 p.L DMEM v celični kulturi mikroplošče XF96 (Seahorse Bioscience). Celice smo prešli na nevmesniški DMEM z dodatkom 2 mM natrijevega piruvata in 20 mM karnozin 1 uro pred začetkom testa in vzdržujemo pri 37 ° C. OCR poročajo v enoti picomoles na minuto in ECAR se poroča v mili-pH enot (mph) na minuto.

Določanje ATP proizvodnje

Preizkus ATP je bila izvedena v skladu s proizvajalčevim navodilo. Na kratko smo obrane kultivirane celice lizirali z liznega pufra, ki mu sledi s centrifugiranjem pri 10000 x g 2 min pri 4 ° C. Končno, v 6 vdolbinami, raven ATP smo določili z mešanjem 20 xl supernatanta s 100 ul za luciferazno reagenta, ki katalizira svetlobe proizvodnjo iz ATP in luciferin. Svetilnost je bila merjena s bralnik monokromatorja mikroploščnem. Standardna krivulja je bila tudi generira in koncentracijo proteina vsake skupine je bila določena z uporabo kompleta BCA protein testu. Skupne vsebnosti ATP smo izrazili kot nmol /mg proteina.

HPLC analiza ekstraceličnega mlečne kisline

koncentracija mlečne kisline v supernatantu brez celic smo izmerili z visokotlačno tekočinsko kromatografijo (HPLC ) v kombinaciji z ultravijoličnim detektorjem z uporabo tehnike, kot smo že prej opisali. Na kratko, so bili pripravljeni analysates loči na Ecosil C-18 obrnil stolpec (3 um, 250 mm x 4,6 mm), z uporabo topila A in B topil [0,1 mol /l NH _{4H 2PO 4 ( pH 3,4) razredčimo v /v metanolu 97:3] s pretokom 0.5 ml /min. Temperatura kolone se je ohranila pri 25 ° C, in valovna dolžina UV-detektorjem je bil določen pri 210 nm.}

mitohondrije membranski potencial ocena

Spremembe v relativnem mitohondrijske membrane potencialne (Δ Ψ
m) so bili ocenjeni s pomočjo lipofilne kationski sonde JC-1 5,5 na ', 6,6'--tetrakloro-1,1', 3,3'-tetra-metil-Diflubenzuron azolocarbocyanine jodid (JC-1; molekularne sonde). Barvilo JC-1 opravi reverzibilno spremembo emisije fluorescence od zelene do zeleno oranžno kot Í Ψ
m povečuje. Celice z visoko Í Ψ
m obrazca JC-1 agregatov in fluorescirajo rdeče; tiste z nizkimi Í Ψ
m vsebujejo monomerni JC-1 in fluorescirajo zeleno. Po obdelavi z karnozinom 48 urah smo gojišče odstranili in celice, gojene na coverslips, inkubiramo v temi pri JC-1 pri končni koncentraciji od 2 um 20 minut. Celice so bile speremo s PBS dvakrat in navdušeni nad 488 nm z Olympus BX-51 fluorescenčnim mikroskopom.

mtDNK copy meritev število

Absolute mtDNA copy številka je bila izmerjena s primerjavo PCR pomnoževanja iz mitohondrijev pomnožkov [človek, NADH-ubikinon Oksidoreduktaza verige 4 (ND4)] z jedrskim AMPLICON (človeških, β-aktina) iz DNA, izolirane s pomočjo Qiagen DNA mini komplet. Primer zaporedja so: človeški β-aktin (naprej: 5'-ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 '; obratno: 5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3'); človeški ND4 (naprej: 5'-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 '; obratno: 5'-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3'). DNA predloge so bile narejene iz regij, ki segajo vsak amplikona s PCR. Razredčitve od 1 × 10 ^{8, vse do 1 × 10 2 kopiji izolirano DNA so bile uporabljene za ustvarjanje standardne krivulje za kvantifikacijo. Kolesarske pogoji PCR sestavljena iz aktivacijskega koraka pri 95 ° C za 30 sekund, čemur sledi 40 ciklov za 5 sekund pri 95 ° C in 30 sekund pri 58 ° C. Vse PCRs so bile izvedene na Bio-Rad CFX Manager v realnem času PCR System (Applied bioznanosti).}

Statistična analiza

Vsi podatki, ki predstavljajo tri ali več neodvisnih poskusov. Podatki so bili izraženi kot povprečje ± SD. Statistične analize so bile za Windows vodila SPSS 11.5. Enosmerna ANOVA (analiza variance), nato pa LSD (najmanj pomembna razlika) ali Dunnettov T3 post-hoc
preizkus (kjer enakih varianc ni bila domneva), je bila uporabljena za multiple primerjave, medtem ko je t-test uporabiti za primerjavo med obema skupinama. P
< 0.05 smo imeli statistično značilno

Rezultati

Vpliv karnozinom na SGC-7901 celice upravičenosti

Da bi ugotovili učinek karnozinom naprej. človeški želodčni rak SGC-7901 celice preživetja, je bila uporabljena MTT test znižanje. Rezultati so pokazali, da je zdravljenje karnozin bistveno zmanjša sposobnost preživetja celic v časovnem in koncentracije odvisno način. Karnozin pri koncentracijah 5 in 20 mM močno zmanjšana sposobnost preživetja celic do 84,0% in 57,9% kontrole pri 24 h in 73,5% in 45,9% nadzora na 48 ur, v tem zaporedju (sl. 1A). Vendar karnozin pri koncentraciji 1 mM ni vplival SGC-7901 celice sposobnost preživetja na 24 ali 48 ur. nadalje smo uporabili tok citometrijo za testom, ali bi karnozin povzroči SGC-7901 celic nekrozo ali apoptozo. Presenetljivo je, da so rezultati pokazali, da karnozin zdravljenje 48 ur ni povzročila nekrotično ali apoptotske celične smrti v SGC-7901 celic (sl. 1B). Ker je MTT znižanje razlaga prav tako pokazatelj celičnega metabolične aktivnosti in MTT vrednost celične populacije se določi tako število živih celic sedanje in njihove relativne presnovne stopnje, da smo poleg izračunali število celic v vzporednem poskusu z enako obdelanih SGC-7901 celic, ki uporabljajo mobilni štetja ploščo. Ugotovili smo, da je število celic v karnozinom obdelamo 48 h skupino podoben tistemu pri kontrolni skupini (sl. 1C), kar kaže, da se zmanjša viabilnost celic z obdelavo karnozinom povzročene za 48 ur v SGC-7901 celic smo zaradi metabolnih sprememb vendar ne zaradi celične smrti ali celične proliferacije.

da bi preverili, ali obstajajo tudi ti ukrepi karnozinom v drugih rakavih celic, so bile uporabljene HepG2 in C6 celice. Rezultati so pokazali, da 20 mM karnozin zdravljenje 48 ur ne inducira celično smrt (tabela. S1) ali proliferacijo, vendar bistveno zmanjšano MTT zmanjšuje aktivnost tako v HepG2 in C6 celic (sl. S1).

Choronic zdravljenje z karnozin zaviral SGC-7901 celic kolonije nastanek

da bi preverili, ali bi choronic izpostavljenost karnozinom vplivajo na proliferativni zmogljivosti SGC-7901 celic, smo celice zasejali z nizko gostoto (100-200 celic /jamico) in dovoljeno, da tvorijo kolonije za 14 dni v DMEM dopolnjene z 20 mM karnozinom. Kot je prikazano na sliki. 2, choronic izpostavljenost karnozinom zmanjša kolonije tvorbe na 39,9% nadzor.

Bioenergijski karakterizacija kultiviranih SGC-7901 celic

smo raziskovali OCRs in ECAR v kultiviranih SGC-7901 celic z uporabo Konjic XF-96 zunajcelični tok analizator, kot je opisano predhodno [18]. Bazalno celični OCR in ECAR je bilo ugotovljeno, da je 161,02 ± 29,58 pmol /min na 10 x 10 ^{3 celice (Število začetna celica) in 39.31 ± 4.29 mph /min na 10 x 10 3 celice oz (sl. 3A). ATP povezane dihanje (skupna bazalna stopnja minus stopnja z oligomycin, kjer je oligomycin zaviralec sinteze ATP) je bila 96,15 ± 18,34 pmol /min na 10 x 10 3 celic, kar kaže, da ~60% celične kisika poraba je bila povezana s ATP sinteze. Istočasno je ECAR povečala na ~250% izhodiščnih stopenj v prisotnosti maksimalno učinkovit odmerek oligomycin (1 mg /ml), kar kaže, da so celice premaknilo mitohondrijske dihanja do glikolize. Rotenon (1 uM) zmanjša OCR 55,78 ± 8,86 pmol /min na 10 × 10 3 celic (~35% od osnovne stopnje). Stopnja rotenon odpornim odraža non-mitohondrijsko manj dihanje, ki vključuje substrat oksidacijo in porabo kisika celični površinski [19]. Tako, non-mitohondrijsko dihanje predstavljali ~35%, medtem ko mitohondrijsko dihanje predstavljal ~65% celotnega celičnega dihanja. Tako, v kultiviranih SGC-7901 celic ~92% (60% /65%) mitohondrijev dihanja smo spojili na sintezo ATP in ~8% mitohondrijev dihanja je predstavljal proton uhajanja (sl. 3B). V prisotnosti maksimalno učinkovit odmerek FCCP (1 um, za odklapljanje sredstvo, ki omogoča maksimalno transport elektronov,), so opazili sočasno povečanje OCR, in se je povečala na 204 ± 30,24 pmol /min na 10 x 10 3 celice.}

prav tako smo ocenili relativni prispevek glikoliza in OXPHOS na ATP stopnji proizvodnje v SGC-7901 celic. Absolutne kvantifikacije od obeh glikolitski stopnjo in hitrost porabe kisika oligomycin občutljiv bile izmerjene v SGC-7901 celic. Zunajcelične stopnja zakisljevanje predvsem zaradi laktata in bikarbonata proizvodnje in, ko je kalibriran v stopnji proizvodnje protonov, kaže glikoliticna mero [15]. Tako smo uporabili oxamate da inhibira laktat dehidrogenazo, ki pretvarja piruvat s laktata v zadnji stopnji glikolize, za izračun hitrosti proizvodnje protonov (sl. 3C). Obstaja ena-na-ena povezava med stopnjo laktata proizvodnje in ATP stopnjo proizvodnje iz glikolize. poraba kisika, oligomycin občutljiv pretvorimo v ATP stopnji proizvodnje z uporabo P /O razmerje od 2.3 [20]. Rezultati so pokazali, da SGC-7901 celice gojene v DMEM (visoka glukoza) dopolni z 2 mM piruvata, ki vsaj 93% svojega ATP uporabo OXPHOS (sl. 3D).

Karnozin spremenila bioenergijske opredelitev SGC- 7901 celice

raziskovali smo učinke karnozinom na hitrost porabe kisika in zunajcelični stopnjo zakisanja v kultiviranih SGC-7901 celic. Rezultati na sliki. 4 je pokazala, da je zdravljenje s 20 mM karnozinom 48 h zmanjša bazalno OCR in ECAR za 141.13 ± 27.06 pmol /min na 10 x 10 ^{3 celice (~87% kontrole), in 11,32 ± 2,49 mph /min na 10 × 10 3 celice (~27% kontrole), oziroma (sl. 4A, B). ATP povezane dihanje, proton uhajanja, in ne mitohondrijsko dihanje je bilo 81.03 ± 17.97, 7.15 ± 3.6 in 52.96 ± 8,40 pmol /min na 10 x 10 3 celice, v tem zaporedju (slika. 4C, D, E ). Tako v karnozinom obdelamo SGC-7901 celic, mitohondrijsko dihanje predstavljali ~62% celotnega celičnega dihanja in ~92% (57% /62%) mitohondrijske dihanje je vezano na sintezo ATP in ~8% mitohondrijev dihanja bil odpade na proton uhajanja. Zato je treba zdravljenje karnozin zmanjšala absolutne vrednosti ATP-povezanega dihanja, vendar to ni vplivalo na relativno prispevno stopnjo ATP-povezanega dihanja, proton uhajanja, in ne mitohondrijske dihanje za celotno celično dihanje. Poleg tega smo tudi ugotovili, da zdravljenje karnozin izrazito znižal maksimalno OCR in rezervni dihalno kapaciteto do 161,60 ± 28,46 pmol /min na 10 x 10 3 celice (~79% kontrole) in 20,47 ± 6,92 pmol /min na 10 × 10 3 celice (~47% nadzora) (sl. 4F, G).}

smo uporabili tudi HepG2 in C6 celice za nadaljnje preverjanje učinkov karnozinom na presnovo raka celice z energijo. Rezultati so pokazali, da 20 mM karnozin zdravljenje 48 ur močno zmanjša bazalno OCR in ECAR celic HepG2 in C6 oz. Karnozin dodatek zmanjšala tudi ATP povezano dihanje v C6 celicah, vendar ne v HepG2 celicah (sl. S2). Vendar, 20 mM karnozin občutno zmanjša celičnega ATP vsebnost tako v HepG2 in C6 celicah, kar kaže, da je zaviranje glikoliza vpleten v akciji karnozinom, vsaj v HepG2 celicah (sl. S2J).

Karnozin zmanjšala zunajcelični mlečna kislina ravni v kultivirani SGC-7901 celice

Ker karnozin je mobilni ekološki pH pufer je zunajcelični stopnja zakisljevanje testirali v sedanjosti karnozinom pomočjo SEAHORSE XF96 zunajcelični Flux Analyzer ne odražajo realno stopnjo glikolize. Tako smo tudi HPLC testom zunajcelični raven mlečne kisline, da preveri učinek karnozinom na glikolize v SGC-7901 celic. Naši rezultati so pokazali, da je zdravljenje karnozin izrazito zmanjšalo zunajcelični raven mlečne kisline za 84% nadzora (sl. 5), kar pomeni, da ima karnozin potencialno inhibitive učinek na glikolize v kultiviranih SGC-7901 celic.

Karnozin spremenila relativni prispevek glikoliza in OXPHOS za brezplačno ATP v SGC-7901 celice, gojene v DMEM pomanjkanje piruvat

prav tako značilen učinek karnozinom na spremembe vsebnosti ATP in relativni prispevek glikolize in OXPHOS na brezplačno ATP v SGC-7901 celice, gojene v DMEM pomanjkanja piruvata. Izmerili smo celično koncentracijo ATP v celicah izpostavljenih 45 min do šest pogojev: vozilo, glikoliza zaviralec 2-DG, FCCP, rotenon, FCCP plus rotenon in 2-GD plus FCCP plus rotenon. Ugotovili smo, da je zdravljenje karnozin 48 h bistveno zmanjša vsebnost ATP 62% nadzora. 2-DG zdravljenje bistveno zmanjša vsebnost ATP za 48% in 34%, v karnozinom odsotnih in karnozin sedanjih skupin v primerjavi s svojimi skupinami vozil, oz. FCCP in FCCP plus rotenon vsak tudi bistveno zmanjša vsebnost ATP za 15% in 18% v karnozinom odsotnega skupini. Vendar pa ta zdravila niso vplivale ATP vsebine karnozinom tej skupini. Rotenon ni vplival na ATP vsebine tako v karnozinom odsotnosti ali sedanjih skupin. 2-GD v kombinaciji z FCCP in rotenona bistvu odpravijo ATP proizvodnje v teh dveh skupinah (sl. 6). Tako 2-DG zmanjšala ATP zaračunajo več kot FCCP ali rotenona storil tako v karnozinom odsotni in predstavitev skupine. Ti podatki kažejo, da ATP generacije premiki iz OXPHOS do glikolize, ko je mitohondrijska funkcija oslabljena. ATP naboj ni v celoti ohrani po inhibicijo bodisi glikolize ali delovanje mitohondrijev v karnozinom odsotnega skupini, medtem ko se ATP naboj ohrani po inhibicijo delovanje mitohondrijev v karnozinom tej skupini. Tako zdravljenje karnozin spremeni relativni prispevek OXPHOS in glikolize v stopnji proizvodnje ATP v SGC-7901 celic.

Vpliv piruvata na inhibitive delovanja karnozinom na SGC-7901 celic mitohondrijsko funkcijo

da bi raziskali, ali je mogoče povečati stopnjo piruvata obrne inhibitive učinek karnozinom na mitohondrijev dihanju SGC-7901 celice so celice izpostavljene različnim koncentracijam piruvat. Kot je prikazano v tabeli. 1, povečanje ravni piruvata ni moglo spremeniti inhibitive učinek karnozinom na SGC-7901 celic mitohondrijske respiracije. Poleg tega je MTT test je tudi pokazala, da povečanje stopnje piruvata ni moglo spremeniti ukrepe karnozinom na SGC-7901 celic mitohondrijsko metabolizem (sl. 7).

Učinki karnozinom na mitohondrijske vsebine DNK in membranskega potenciala mitohondrijev v SGC-7901 celice

mitohondrije membranski potencial (Δ Ψ
m) predstavlja večino protonske gonilne sile, ki se uporablja za pogon sinteze ATP in ima zato pomembno vlogo pri maksimalni ATP -generating zmogljivost [21]. Zato smo uporabili tudi lipofilne sondo kationski JC-1, da razišče, ali karnozin zavira OXPHOS prek zatiranja membranskega potenciala mitohondrijev (Í Ψ
m). Rezultati so pokazali, da je karnozin zdravljenje za 48 ur ni, lahko pride do očitne spremembe Í Ψ
m kultiviranih SGC-7901 celic (sl. 8a).

Za rešitev navidezno zmanjšal mitohondrijske dihanje s karnozinom povzroča, smo tudi izmeriti število absolutno mitohondrijsko DNA (mtDNA), ki je dobro urejeno za ohranjanje celičnih potreb po energiji [22]. Na naše presenečenje, rezultati so pokazali, da v primerjavi s kontrolnimi celicami, absolutne mtDNA kopirati številke 7901 celic karnozin obdelani so bili izrazito povečala, in povprečne absolutne mtDNA kopirati številke so bile 141.49 ± 7.42 v kontrolnih celicah in 360,0 ± 59.84 v karnozinom zdravljene celice (sl. 8B).

Pogovor

Kolikor nam je znano, je to prvo poročilo o bioenergetskega profila kultiviranih SGC-7901 celic, ki so se zdravili z in brez karnozinom. Naši Glavne ugotovitve so, kot sledi. Najprej karnozin zmanjšala proliferativni sposobnost SGC-7901 celic. Drugič, celice kultivirani v DMEM (visoka raven glukoze) dopolni z 2 mM piruvata iz ~93% svojega ATP uporabo OXPHOS. Tretjič, karnozin zavzela inhibitive učinek na SGC-7901 celic orožja skozi inhibicijo glikolize, OXPHOS in mitohondrijske dihanje celic, in so bile ugotovljene tudi ti ukrepi karnozinom v HepG2 in C6 celic. Tako naj bi karnozin treba obravnavati skupaj z naraščajočo oborožitve spojin v različnih fazah razvoja zdravil, ki ciljajo na presnovo tumor, ki je eden od ključnih odlikujeta tumorja [23].

Zaradi širokega spektra delovanja, karnozinom lahko considerded kot terapevtsko dejavnik pri zdravljenju številnih bolezni. Na primer, cink Karnozin je bil uporabljen za zdravje želodca in črevesja popravilo [24]. Nedavno so študije pokazale transformirane celice niso rastle v MEM, ki vsebuje visoke koncentracije karnozinom in karnozin lahko dajemo kot zdravilo in vivo, da zavirajo rast rakavih celic [25]. Vendar pa je bilo vprašanje, ali lahko karnozin preprečuje rast človeških želodčnih tumorskih celic poleg malignih celic, ki so bile že poročali. V tej študiji smo ugotovili, da je karnozin tudi možnost, da zavirajo rast gojenih SGC-7901 celic v časovnem in koncentracijo povezano način, in ta učinek ni bil priložen apoptozo ali nekroza, lahko pa jih zmanjša precej povzročil širjenje. Vendar se podrobna mehanizmi, s katerimi se inhibitive učinek karnozinom na SGC-7901 celic orožja so še vedno nejasna.

To je splošno znano, da so presnovne spremembe ena od značilnosti raka. Otto Warburg je prvi opisal povečano uporabo anaerobne presnove v prisotnosti ustreznega kisika v celicah raka v primerjavi s svojimi običajnimi kolegi: imenuje "Warburg učinek" [26]. Vendar pa je v zadnjem času, je bilo poudarjeno, da ima lahko molekularna ciljanje OXPHOS učinkovitost za napredno melanoma, ki imajo povišano raven OXPHOS [14]. Tako, različne vrste tumorjev na svojih različnih razvojnih fazah imajo svoje presnovne značilnosti. Zato, terapevtske strategije in mehanizme različnih tumorjev obravnava na podlagi energijske presnove so različni. V tej študiji smo prvič uporabili novo zunajcelični tok tehnologijo za oceno več parametrov delovanje mitohondrijev in zunajcelični stopnjo zakisanja vzporedno z določitvijo koncentracije ATP raziskati bioenergijske opredelitev človeškega raka želodca SGC-7901 celic. Naša Seahorse analiza je pokazala, SGC-7901 celice imajo aktivno mitohondrije, in je odvisen od mitohondrijskih OXPHOS več kot glikolize poti za proizvodnjo ATP v stanju kulture z visoko glukozo in piruvata, kar kaže, da je lahko mitohondrijsko dihanje potencialna terapevtska tarča raka človeške želodčne.

Vendar, ko so celice gojimo v DMEM pomanjkanja piruvata, so odvisni od glikolize več, da gojimo v DMEM dobili z 2 mM piruvata, ker zaviranje glikoliza z 2-GD vodi k padcu ~48 % celičnega ATP vsebine. Poleg tega ti podatki tudi kažejo, da SGC-7901 celice verjetno nimajo plastičnost pri prehodu iz glikolize do mitohondrijev dihanje, ko je glikolitičen proizvodnja ATP odpravijo v kulturi stanja pomanjkanja v energetskih snovi. Po drugi strani, Wu sod
. so poročali, da je bil učinkovit nadomestni Povecanje od glikoliza po uporabi oligomycin da blokira oksidativna fosforilacija, in ta odgovor je lahko vzdrževati nivo ATP v človeka brez majhnih celičnih linijah karcinomom H460 in A549 [15]. Naši rezultati tudi pokazali, da imajo SGC-7901 celic možnost za povečanje glikolize, ko je mitohondrijska funkcija blokira oligomycin. Poleg tega, ko je bila mitohondrijsko funkcijo zatreti z rotenona, je accurred učinkovit nadomestni Povecanje od glikolize, in ta odgovor je lahko vzdrževati nivo ATP v SGC-7901 celic. Vendar pa se celice ne bi upregulate dovolj glikolize zmogljivosti za ohranitev ravni ATP pri odklopu mitohondrijske dihanje s sintezo ATP, ki ga FCCP inducirano, (sl. 6). Zato SGC-7901 celice imajo bistveno glikolize in mitohondrijske respartion zmogljivosti, in to naredi celice rastejo v različnih pogojih.

Pred kratkim se je pokazalo, da karnozin zmanjša širjenje malignega glioma z vplivom na glikolitičen in ATP sinteza [27]. V naši tej raziskavi smo tudi ugotovili, da je bilo zdravljenje z karnozinom lahko zmanjšuje zunajcelični stopnjo zakisljevanja in nivo mlečne kisline, kar pomeni, da ima karnozin je inhibitive učinek na glikolize v SGC-7901 celic. Vendar karnozin se ni popolnoma, ampak deloma zaviral glikoliza sposobnost celic, zaradi farmakološko inhibicijo mitohondrijske dihanje z rotenona, ali nima priključenega na mitohondrijske protonske gradient od proizvodnje ATP z FCCP, ali obdelamo z rotenona in FCCP hkrati so bile celice še vedno sposoben da upregulate glikolize nadomestilo za izčrpanja ATP (sl. 6). Zanimivo je, da smo ugotovili, da karnozin ima tudi novo vlogo regulatorja mitohondrijske dihanje. Karnozin zatreti bazalni ravni mitohondrijev dihanja, in to je bilo predvsem zaradi zmanjšanja ATP-povezano dihanje, kar pomeni, da se mitohondrijski ATP poraba zmanjša v SGC-7901 celic-karnozin zdraviti.

• Plos ONE: Helicobacter pylori iz želodca raka in dvanajstnika Show Same filogeografska izvora v andski regiji v Kolumbiji
• Plos ONE: Učinkovitost Vrednotenje Vmesni seštevek in Skupaj Gastrectomies v robotske kirurgije za želodca raka primerjavi s tisto v odprtih in laparoskopske resekcije: metaanalizi