PLoS ONE: Карнозин подавляет пролиферацию рака желудка человека SGC-7901 клеток через оба митохондриальную Дыхательный и гликолиза Pathways

Абстрактный
<р> карнозина, в природе дипептида, было недавно продемонстрировано, обладают противоопухолевым Мероприятия. Тем не менее, его основной механизм остается неясным. В данном исследовании мы исследовали влияние и механизм карнозина на жизнеспособность клеток и пролиферации культивируемых человеческого рака желудка SGC-7901 клеток. Лечение Карнозин не индуцирует апоптоз клеток или некроз, но уменьшил пролиферативную способность SGC-7901 клеток. Seahorse анализ показал SGC-7901-клетки, культивируемые с пирувата имеют активную митохондрии, и зависят от митохондриального окислительного фосфорилирования более гликолизного пути для генерации АТФ. Карнозин заметно уменьшилось абсолютное значение митохондриального АТФ-сшитый дыхания, а также снижение максимального потребления кислорода и запасной дыхательной способности, что может уменьшить митохондриальную функцию коррелирует с пролиферативным потенциалом. Одновременно, карнозин также уменьшил внеклеточный скорость подкисления и гликолиза SGC-7901 клеток. Наши результаты свидетельствуют о том, что карнозин является потенциальным регулятором энергетического метаболизма SGC-7901 клеток как в анаэробных и аэробных путей, и при условии, ключ для доклинической и клинической оценке карнозина для терапии рака желудка

Цитирование:. Shen Y, Ян J, Li J, Ши X, Оуян L, Tian Y, и др. (2014) Карнозин подавляет пролиферацию рака желудка человека SGC-7901 клеток через Оба митохондриального дыхания и гликолиза Пути. PLoS ONE 9 (8): e104632. DOI: 10.1371 /journal.pone.0104632
<р> Редактор: Сальваторе В. Пиццо, Duke University Medical Center, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 14 февраля 2014 года; Принято: 15 Июля, 2014 года; Опубликовано: 12 августа 2014
<р> Copyright: © 2014 Shen и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Этот проект Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (81102427), а частично при поддержке провинции Чжэцзян научно-исследовательских фондов (Y2110322), программа для Zhejiang Ведущей Группы S &Amp; T Innovation (2010R50048) и город Вэньчжоу науки и техники проект (2010S0094 ). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является одним из наиболее распространенных злокачественных заболеваний в мире. В экономически развивающихся странах, рак желудка является второй причиной, связанной с раком смерти [1], [2]. Несмотря на улучшение в хирургической и мультимодального терапии, общий показатель 5-летней выживаемости остается низким (15% до 35%) из-за высокой частоты рецидивов, инвазии и метастазирования [3]. Таким образом, в настоящее время, чтобы обнаружить более эффективные противоопухолевые препараты с меньшим количеством побочных эффектов необходима
. <Р> L-карнозин (β-аланил-L-гистидин) является естественным дипептида, который синтезируется эндогенный карнозина синтетазы. Он широко распространен в головном мозге млекопитающих, скелетных мышцах, желудка, почек, сердца и кожи [4], [5]. До сих пор не так много известно о его физиологической функции, но несколько предполагаемых ролей рассматривались, такие как нейротрансмиттер, противовоспалительное средство, ловушки свободных радикалов, подвижных органических рН-буфера и хелатор металла [6], [7]. Сообщалось, что карнозин является потенциальным терапевтическим средством для лечения болезни Альцгеймера, инсульта, диабета и других заболеваний органов чувств [8], [9]. Совсем недавно было показано, что карнозин может также иметь анти-онкогенными эффекты. Например, карнозин, как сообщалось, обладают способностью ингибировать рост злокачественных глиом [10], и этот эффект может быть опосредован влиянием на гликолитического энергетического метаболизма, наиболее хорошо охарактеризованных метаболического фенотипа, наблюдаемого в опухолевых клетках, известных как эффект Варбурга [11 ], [12].

в последнее время значение митохондрий как датчики кислорода, а также производителей СПС стал координационным центром исследований рака, и исследования показали важное явление, что митохондриальный метаболизм, в частности, лимонная кислота цикл деятельности имеет важное значение для быстрого распространения различных типов раковых клеток [13], [14]. Тем не менее, в случае клеток рака желудка человека, мало информации, в какой степени гликолиза и митохондриального окислительного фосфорилирования (OXPHOS) способствуют выработке клеточной энергии и быстрой пролиферации. Является ли карнозин может также ингибировать рост клеток рака желудка человека остается неизвестным. И является ли ингибирующие действие карнозина на рост опухолевых клеток также связана с его действием на митохондриального дыхания и OXPHOS остается неясным.

В последнее время конек Bioscience XF96 внеклеточной Flux Analyzer используется одновременно и непрерывно контролировать как аэробных и гликолитических компоненты клеточных биоэнергетики [15]. Таким образом, в настоящем исследовании, мы исследовали влияние карнозина на рост клеток рака желудка человека и дополнительно характеризовать биоэнергетического профиль культивированных человеческих клеток желудка SGC-7901 и роли карнозина в SGC-7901 клетки энергетического обмена с конька Bioscience XF96 внеклеточной Flux Analyzer и других связанных с ними технологий.

материалы и методы

Реактивы
<р> L-карнозин, пируват натрия, ротенон, карбонилцианид р-трифторметоксифенил-гидразон (FCCP), антимицина А, 3- [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-diphenyltetra-zolium бромида (МТТ), метанол, молочной кислоты от фирмы Sigma (Сент-Луис, штат Миссури, США). Пенициллина, стрептомицина, L-глутамин, трипсин, среда Дульбекко, модифицированную Eagle (DMEM) фетальной бычьей сыворотки от GIBCO-BRL (Grand Island, NY, США). Аннексина V-FITC /PI Комплект обнаружения апоптоза, BCA Protein Assay Kit и АТФ набора для анализа были приобретены у Beyotime института биотехнологии ((Нанкин, Китай). Анализ XF средних и раствор калибрующего XF были куплены у конек Bioscience.

культура клеток
<р> желудка человека линии клеток рака SGC-7901 (SGC-7901), печени человека печеночно-клеточная линия карциномы (HepG2) и линия глиомы С6 клеток крысы (C6) были приобретены у банка Шанхайский институт клеток, Китайской академии наук (оригинальный источник американской коллекции типовых культур, АТСС, Manassas, VA, США). Клетки культивировали в DMEM среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 100 ед /мл пенициллина G и 100 мкг /мл стрептомицина, и выдерживают при температуре 37 ° с и 5% CO <суб> 2 в увлажненном инкубаторе. клетки обрабатывали трипсином в соотношении 1:3 после слияния с использованием 0,25% трипсина. пересевают клетки высевали на 96-, 24- или 6-луночные планшеты при плотности 2 × 10 3, 5 × 10 4, 2 × 10 5 или 1 × 10 6 клеток /лунку, соответственно.

снижение МТТ
<р> Cell метаболическая активность контролировали с помощью колориметрического анализа МТТ, как описано ранее [16]. В кратком изложении, клетки культивировали на 96-луночных планшетах и ​​были 6 лунок в каждой группе. В конце экспериментов клетки инкубировали с 0,5 мг /мл МТТ в течение 4 ч при 37 ° С. Затем надосадочную жидкость слой удаляли, и 100 мкл диметилсульфоксида добавляли в каждую лунку. МТТ метаболизм количественно определяли спектрофотометрически при 570 нм в ридере для микропланшетов Biorad. Результаты выражали как процент уменьшения МТТ, принимая оптическую плотность контрольных клеток, как 100%.

Колонии Анализ образования
<р> Клетки высевали в шесть-луночные планшеты при плотности 100-200 клеток на лунку, а затем обрабатывали карнозина (20 мм). Клоны оставляли расти в течение 14 дней в культуральной среде DMEM, дополненной 10% ФБС, 100 ед /мл пенициллина G и 100 мкг /мл стрептомицина. Затем клетки фиксировали 70% -ным этанолом и окрашивали кумасси бриллиантовым синим для анализа образования колоний, как описано ранее [17].

проточной цитометрии анализа смерти клеток
<р> Гибель клеток количественно аннексином V-FITC-ПИ (пропидий йодид) двойное окрашивание, с использованием набора для детекции апоптоза аннексина V-FITC в соответствии с предложением производителя. Вкратце, клетки были высеяны в 6-луночные планшеты в DMEM среде. Клетки обрабатывали 20 мМ карнозина в течение 48 ч, а затем собирают и промывают дважды в охлажденном льдом PBS, ресуспендировали в буфере для связывания при плотности 1 × 10 6 клеток /мл. Клетки инкубировали одновременно с флуоресцеин-меченого аннексина V и PI в течение 20 мин и анализировали с помощью проточной цитометрии. Аннексина V-FITC, сформированные сигналы были обнаружены с помощью детектора ФИТЦ сигнала (FL1, 525 нм). PI сигналы контролировались с помощью детектора, зарезервированный для эмиссии фикоэритрин (FL2, 575 нм). Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения Cell Quest из BD.

внеклеточного Flux технологии
<р> Для измерения скорости потребления кислорода (OCR) и внеклеточный скорости подкисления (РВЦА) клеток в различных условиях, морским коньком XF96 был использован внеклеточной Flux анализатор (конек Bioscience, Billerica, MA, USA). Этот прибор позволяет чувствительного измерения гликолиза и нескольких параметров митохондриальной функции, включая базальной OCR, запасной дыхательной емкости, максимального оптического распознавания текста, АТФ-связанного дыхания и протона утечки из прилипших неповрежденных культивируемых клеток. После базовых измерений, OCR и РВЦА измеряли после последовательного добавления в каждую лунку по 20 мкл олигомицином, FCCP и ротенону, чтобы достичь рабочие концентрации 1 мкг /мл, 1 мкМ и 1 мкМ, соответственно. Все анализы проводили с использованием плотности посева 10000 клеток /лунку в 200 мкл DMEM в культуре клеток микропланшет XF96 (конек Bioscience). Клетки переводили на небуферизованном DMEM, дополненной 2 мМ пирувата натрия и 20 мМ карнозин за 1 ч до начала анализа и выдерживали при 37 ° С. OCR сообщается в единицах пикомолей в минуту и ​​РВЦА сообщается в единицах милли-рН (миль /ч) в минуту.

Определение АТФ
<р> Анализ АТФ проводили в соответствии с заводом-изготовителем инструкция. Если коротко, то заготовленные культивированные клетки лизируют с использованием буфера для лизиса, с последующим центрифугированием при 10000 • g в течение 2 мин, при температуре 4 ° С. И, наконец, в 6-луночные планшеты, уровень АТФ определяли путем смешивания 20 мкл надосадочной жидкости с помощью 100 мкл реагента люциферазы, который катализирует свет производства АТФ и люциферин. Освещенность измеряли с помощью монохроматора читателя микропланшетов. Стандартную кривую также генерироваться и концентрацию белка в каждой группе была определена с использованием набора ВСА Protein Assay. Общие уровни АТФ были выражены как нмоль /мг белка.

ВЭЖХ анализ внеклеточной
молочной кислоты <р> Концентрация молочной кислоты в бесклеточной надосадочной жидкости измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ ) в сочетании с детектором ультрафиолетового с использованием методики, как описано выше. Короче говоря, подготовленные analysates были разделены на ЭКОСИЛ C-18 колонке с обращенной (3 мкм, 250 мм × 4,6 мм), с использованием растворителя А и растворитель В [0,1 моль /л NH <суб> 4H <суб> 2PO <суб> 4 ( рН 3,4), разбавленный объем /объем в метаноле 97:3] при скорости потока 0,5 мл /мин. Температуру колонки поддерживали на уровне 25 ° С, и длина волны УФ-детектированием была установлена ​​на уровне 210 нм.

митохондриальной мембраны потенциал
оценка <р> Изменения в относительной митохондриального мембранного потенциала (Δ Ψ
м) оценивали с использованием липофильный катионный зонд JC-1 5,5 ', 6,6'-тетрахлор-1,1', 3,3'-тетраэтилсвинец-benzamid йодида azolocarbocyanine (JC-1; Molecular Probes). Краситель JC-1 претерпевает обратимое изменение флуоресценции от зеленого до зеленовато-оранжевого цвета, как А Ф
м увеличивается. Клетки с высоким уровнем Д Ψ
м вида JC-1 агрегатов и флуоресцирует красный; с низкой А Ψ
м содержат мономерные JC-1 и флуоресцирует зеленым. После обработки карнозина в течение 48 ч культуральную среду удаляли и клетки, выращенные на покровных стеклах, инкубировали в темноте с JC-1 при конечной концентрации 2 мкМ в течение 20 мин. Клетки промывали PBS дважды и возбуждаются на длине волны 488 нм с Olympus BX-51 флуоресцентного микроскопа.

МтДНК копия измерения номер
<р> Абсолютное число копий мтДНК измеряли путем сравнения ПЦР-амплификации в митохондриях ампликона [человек, NADH-убихинон оксидоредуктазы цепь 4 (ND4)] с ядерным ампликона (человека, β-актина) из ДНК, выделенной с помощью набора Qiagen ДНК мини. Последовательности праймеров, являются следующие: человеческого β-актина (вперед: 5'-ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 '; обратный: 5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3'); человек ND4 (вперед: 5'-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 '; обратный: 5'-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3'). ДНК-матриц, были сделаны из областей, охватывающих каждую ампликона с помощью ПЦР-амплификации. Разведения от 1 × 10 8 до 1 × 10 2 копии выделенной ДНК были использованы для получения стандартной кривой для количественной оценки. Условия ПЦР-езда на велосипеде состоял из стадии активации при 95 ° С в течение 30 сек, затем 40 циклов в течение 5 сек при 95 ° С и 30 с при 58 ° C. Все ДЗП были выполнены на системе Bio-Rad CFX Manager, ПЦР в реальном времени (Applied Biosciences).

Статистический анализ
<р> Все данные представляют собой три или более независимых экспериментов. Данные выражали в виде среднего значения ± SD. Статистический анализ был проведен SPSS 11.5 для Windows. Одностороннее ANOVA (дисперсионный анализ) с последующим LSD (наименее значимый разница) или Даннетта T3 ретроспективном
тест (где равные дисперсии не предполагались) применялся для множественных сравнений, в то время как Т-тест Стьюдента используется для сравнения между двумя группами. P
&л; 0,05 считалось статистически значимым

Результаты

Влияние карнозина на SGC-7901 жизнеспособность клеток

Для того, чтобы определить влияние карнозина на. желудка жизнеспособность рак SGC-7901-клеток человека, был использован анализ сокращения МТТ. Результаты показали, что лечение карнозин значительно снижается жизнеспособность клеток в затрат времени и зависимости от концентрации. Карнозин в концентрации 5 и 20 мМ заметно снижается жизнеспособность клеток до 84,0% и 57,9% от контроля за 24 ч, и до 73,5% и 45,9% от контроля за 48 ч, соответственно (рис. 1А). Тем не менее, карнозин при концентрации 1 мМ не влияет на СГК-7901 на жизнеспособность клеток на 24 или 48 часов. Кроме того, мы использовали проточной цитометрии для анализа, может ли карнозин вызвать SGC-7901 некроз клеток или апоптоз. Удивительно, но результаты показали, что лечение карнозин в течение 48 ч не вызывала некротический или апоптотической гибели клеток в SGC-7901 клеток (рис. 1, б). Поскольку сокращение МТТ также интерпретируется как показатель клеточной метаболической активности, а значение МТТ клеточной популяции определяется как количество жизнеспособных клеток, присутствующих и их относительные скорости метаболизма, так что мы рядом, чтобы вычислить число клеток в параллельном эксперименте с одинаково обработанных клеток SGC-7901 с использованием подсчета клеток пластины. Мы обнаружили, что число клеток в карнозина обрабатывали в течение 48 ч группа была аналогична в контрольной группе (рис. 1C), что свидетельствует о том, что снижение выживаемости клеток, индуцированное обработкой карнозина в течение 48 ч в СГК-7901 клеток из-за метаболических изменений но не из-за гибели клеток или пролиферации клеток.
<р> чтобы проверить, действительно ли существуют эти действия карнозина в других раковых клеток использовали HepG2 и клеток С6. Результаты показали, что 20 мМ карнозин лечение в течение 48 ч не вызывал гибели клеток (табл. S1) или пролиферацию, но и заметно пониженную MTT восстановительную активность как в HepG2 и С6 клетках (рис. S1).

Choronic лечение с карнозин ингибирует образование SGC-7901-клетки колоний
<р> чтобы проверить ли choronic воздействие карнозина может повлиять на пролиферативную способность SGC-7901 клеток, клетки высевали при низкой плотности (100-200 клеток /лунку) и разрешено образовывать колонии в течение 14 дней в DMEM, дополненной 20 мМ карнозина. Как показано на рис. 2, choronic подверженность образованию карнозина снижается колонии до 39,9% от контроля.

Биоэнергетический характеристика культивируемых SGC-7901 клеток
<р> Мы исследовали OCRs и РВЦА в культуре SGC-7901 клеток с помощью Seahorse XF-96 внеклеточный анализатор потока, как было описано ранее [18]. были найдены Базальный сотовой связи OCR и РВЦА быть 161,02 ± 29,58 пмоль /мин на 10 × 10 3 клетки (начальный подсчет клеток) и 39,31 ± 4,29 миль /ч /мин на 10 × 10 3 клеток соответственно (рис. 3A). АТФ-сшитый дыхания (общая базальная скорость минус скорость с олигомицином, где олигомицином является ингибитором синтеза АТФ) был 96,15 ± 18,34 пмоль /мин на 10 × 10 3 клеток, что указывает на ~ 60% клеточного кислорода потребление было связано с синтеза АТФ. Одновременно РВЦА была увеличена до ~ 250% от исходного уровня ставок в присутствии максимально эффективной дозы олигомицином (1 мкг /мл), что свидетельствует о том, что клетки сдвинуты дыхание митохондрий на гликолиз. Ротенон (1 мкМ) сводится к OCR 55,78 ± 8,86 пмоль /мин на 10 × 10 3 клеток (~ 35% от базовых ставок). Ротенон устойчивый курс отражает не-митохондриальную частоту дыхания, которая включает в себя окисление субстрата и клеточной поверхности потребление кислорода [19]. Таким образом, не митохондриального дыхания составляли ~ 35%, в то время как дыхание митохондрий приходится ~ 65% от общего клеточного дыхания. Таким образом, в культуре SGC-7901 клеток ~92% (60% /65%) митохондриального дыхания был связан с синтезом АТФ и ~ 8% митохондриального дыхания приходилось на долю протонов утечки (рис. 3б). В присутствии максимально эффективной дозы FCCP (1 мкМ, разобщающего агента, который позволяет максимальный перенос электронов,), наблюдалось сопутствующее увеличение оптического распознавания символов, и она была увеличена до 204 ± 30,24 пмоль /мин на 10 × 10 3 клетки.

Мы также оценили относительный вклад гликолиза и OXPHOS в АТР скорости производства в SGC-7901 клеток. Абсолютные количественными обоих гликолитическом скорости и олигомицином чувствительных к скорости потребления кислорода измеряли в SGC-7901 клеток. Внеклеточного скорость подкисления в основном за счет лактата и бикарбоната производства и, при калибровке по скорости производства протонов, указывает гликолитическую скорость [15]. Таким образом, мы использовали оксамата для ингибирования лактатдегидрогеназы, преобразующий пирувата в лактат во время последней стадии гликолиза, чтобы вычислить скорость производства протонов (рис. 3C). Существует связь один-к-одному между скоростью производства лактата и АТФ дебита от гликолиза. Олигомицином чувствительный потребление кислорода превращали в ATP дебита с использованием коэффициента P /O 2,3 [20]. Результаты показали, что СГК-7901 клетки, культивируемые в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы () с добавлением 2 мМ пирувата из, по меньшей мере 93% от их АТФ с использованием OXPHOS (рис. 3D).

карнозин изменили биоэнергетического характеристику SGC- 7901 клетки
<р> Мы исследовали влияние карнозина на скорости потребления кислорода и внеклеточной скорости подкисления в культуре SGC-7901 клеток. Результаты на рис. 4 показано, что лечение с помощью 20 мМ карнозина в течение 48 ч уменьшил базальной OCR и РВЦА до 141.13 ± 27.06 пмоль /мин на 10 × 10 3 клетки (~87% от контроля) и 11,32 ± 2,49 миль /ч /мин на 10 × 10 3 клетки (~ 27% от контрол), соответственно (рис. 4А, в). АТФ-сшитый дыхание, утечка протона, и не митохондриальная частоты дыхания были 81.03 ± 17,97, 7,15 ± 3,6 и 52,96 ± 8,40 пмоль /мин на 10 × 10 3 клетки, соответственно (рис. 4C, D, E ). Таким образом, в карнозина лечение СГК-7901 клетки, митохондриального дыхания составляли ~62% от общего клеточного дыхания и ~92% (57% /62%) митохондриального дыхания соединяли с синтезом АТФ, и ~ 8% от митохондриального дыхания было приходится на утечки протонов. Таким образом, лечение карнозин снизилось абсолютное значение АТФ-связанного дыхания, но это не влияет на относительную скорость вклада АТФ-связанного дыхания, утечки протонов и не-митохондриального дыхания к общему клеточного дыхания. Кроме того, мы также обнаружили, что лечение карнозин заметно снижается максимальное оптического распознавания текста и запасной дыхательной способности к 161,60 ± 28,46 пмоль /мин на 10 × 10 3 клетки (~79% от контроля) и 20,47 ± 6,92 пмоль /мин на 10 × 10 3 клетки (~47% от контроля) (рис. 4F, G).
<р> HepG2 и C6 клетки также были использованы для дополнительной проверки влияния карнозина на раковые клетки энергетического метаболизма. Результаты показали, что 20 мМ карнозин лечение в течение 48 ч заметно снижается базальный OCR и РВЦА клеток HepG2 и С6, соответственно. Карнозин дополнение также уменьшается АТФ-связанного дыхания в клетках С6, но не в клетках HepG2 (рис. S2). Тем не менее, 20 мМ карнозина заметно снижается клеточное содержание АТФ как в HepG2 и клеток С6, что указывает на ингибирование гликолиза был вовлечен в карнозина действия, по крайней мере, в клетках HepG2 (рис. S2J).

карнозин пониженной внеклеточной продуцирующих молочную кислоту уровень в культивируют SGC-7901 клетки
<р> Поскольку карнозин представляет собой мобильный органический буфер рН, внеклеточный скорость подкисления анализировали в настоящее время карнозина с помощью Seahorse XF96 внеклеточного Flux Analyzer не может отражать реальную скорость гликолиза. Таким образом, мы также использовали ВЭЖХ для анализа внеклеточный уровень молочной кислоты, чтобы проверить эффект карнозина на гликолиз в СГК-7901 клеток. Наши результаты показали, что лечение карнозина заметно снижается внеклеточный уровень молочной кислоты до 84% от контрольной группы (рис. 5), что свидетельствует о том, что карнозин оказывает потенциальное ингибирующее действие на гликолиз в культивируемых СГК-7901 клеток.

карнозин изменил относительный вклад гликолиза и OXPHOS к СПС заряда в SGC-7901-клеток, культивируемых в DMEM отсутствие пирувата
<р> Мы также характеризовал эффект карнозина на изменения содержания АТФ и относительный вклад гликолиза и OXPHOS до заряда ATP в SGC-7901-клеток, культивируемых в DMEM отсутствие пирувата. Мы измеряли клеточную концентрацию АТФ в клетках, подвергнутых в течение 45 мин до шести условий: Транспортное средство, ингибитор гликолиза 2-DG, FCCP, Ротенон, FCCP плюс ротенон и 2-DG плюс FCCP плюс ротенон. Мы обнаружили, что карнозин лечение в течение 48 ч существенно снижается содержание АТФ до 62% от контроля. Лечение 2-DG заметно снижается содержание АТФ на 48% и 34% в карнозина отсутствует и карнозин, присутствующих групп по сравнению со своими собственными группами транспортных средств, соответственно. FCCP и FCCP плюс ротенон каждый из них также значительно снижается содержание АТФ на 15% и 18% в группе карнозина отсутствующего. Тем не менее, эти препараты не влияют на содержание АТФ в карнозина данной группы. Ротенон не влияет на содержание АТФ как в карнозина отсутствуют или имеются группы. 2-DG в сочетании с FCCP и ротенону по существу устранено производство АТФ как в этих двух группах (рис. 6). Таким образом, 2-DG уменьшилось АТФ заряда больше, чем FCCP или ротенону делали оба в карнозина отсутствуют и представить группы. Эти данные указывают на то, что АТФ сдвиги поколения от OXPHOS к гликолиза при митохондриальная функция нарушается. АТФ заряд не полностью сохраняется после ингибирования либо гликолиза или митохондриальной функции в карнозиновые отсутствующего группе, в то время как АТФ заряд сохраняется после ингибирования митохондриальной функции в карнозиновые данной группы. Таким образом, лечение карнозин изменили относительный вклад OXPHOS и гликолиза в скорости производства АТФ в SGC-7901 клеток.

Влияние пирувата на тормозящее действие карнозина на СГК-7901 клетках митохондриальной функции
<р> Для того, чтобы исследовать вопрос о том повышения уровня пирувата может изменить тормозящее действие карнозина на митохондриального дыхания SGC-7901 клеток, клетки подвергали воздействию различных концентраций пирувата. Как показано в табл. 1, повышение уровня пирувата не может отменить тормозящее действие карнозина на СГК-7901 клеток митохондриального дыхания. Кроме того, анализ МТТ также показали, что повышение уровня пирувата не может отменить действие карнозина на СГК-7901 клеток митохондриального метаболизма (рис. 7).

Эффекты карнозина на митохондриальной ДНК и содержание митохондриального мембранного потенциала в SGC-7901 клетки
<р> Митохондриальная мембранного потенциала (Δ Ψ
м) составляет для большинства протон-движущей силы, используемой для приведения в движение синтез АТФ и, следовательно, играет существенную роль в максимальной АТФ -generating емкость [21]. Таким образом, мы также использовали липофильный катионный зонд JC-1 для изучения подавляет ли карнозин OXPHOS путем подавления мембранного потенциала митохондрий (Д Ψ
м). Результаты исследования показали, что лечение карнозин в течение 48 часов не может вызвать очевидное изменение Д Ψ
м в культуре SGC-7901 клеток (рис. 8а).
<Р> Чтобы устранить кажущийся уменьшилось дыхание митохондрий индуцированный карнозина, мы также количественно абсолютную митохондриальной ДНК (мтДНК) номер, который жестко регулируется для поддержания требований клеточной энергии [22]. К нашему удивлению, результаты показали, что по сравнению с контрольными клетками, абсолютные мтДНК скопировать числа карнозина обработанных 7901 клеток заметно возросла, а средние абсолютные мтДНК копировать числа были 141.49 ± 7,42 в контрольных клетках и 360,0 ± 59,84 в карнозином -обработанной клетки (рис. 8б).

Обсуждение
<р> Насколько нам известно, это первый доклад биоэнергетической профиля культивируемых SGC-7901 клеток, обработанных и без карнозина. Наши основные выводы заключаются в следующем. Во-первых, карнозин уменьшил пролиферативную способность SGC-7901 клеток. Во-вторых, клетки, культивируемые в среде DMEM (с высоким содержанием глюкозы) с добавлением 2 мМ пирувата из ~93% их АТФ с использованием OXPHOS. В-третьих, карнозин оказывал свое тормозящее влияние на СГК-7901 пролиферации клеток путем ингибирования гликолиза, OXPHOS и дыхание митохондрий клеток, и эти действия карнозина были также найдены в HepG2 и С6 клеток. Таким образом, карнозин следует рассматривать наряду с растущим вооружением соединений в различных стадиях разработки лекарственных средств, нацеленных на метаболизм раковых опухолей, один из ключевых признаков опухоли [23].

Из-за своего широкого спектра активности, карнозина может быть considerded в качестве лечебного фактора при лечении многих заболеваний. Например, цинк Карнозин был использован для здоровья желудка и кишечника, ремонт [24]. В последнее время исследования показали, трансформированные клетки не растут в среде MEM, содержащей высокие концентрации карнозина, и карнозин может быть введен в качестве лекарственного средства в естественных условиях для ингибирования роста злокачественных клеток [25]. Тем не менее, оно должно было быть предложено, может ли карнозин предотвратить рост человека желудка опухолевых клеток помимо злокачественных клеток, которые были представлены ранее. В настоящем исследовании мы обнаружили, что карнозин также способен ингибировать рост культивированных СГК-7901 клеток в концентрации от времени и связанных с образом, и этот эффект не сопровождался апоптоза или некроза, но может быть вызвано скорее уменьшенный пролиферации. Тем не менее, детальные механизмы, лежащие в основе тормозящее влияние карнозина на СГК-7901 пролиферации клеток до сих пор неясно.
<Р> Широко распространено мнение, что метаболические изменения являются одним из признаков рака. Отто Варбург впервые описал увеличение использования анаэробного метаболизма в присутствии достаточного количества кислорода раковыми клетками по сравнению с их нормальными аналогами: называется «эффект Варбурга» [26]. Тем не менее, в последнее время, было отмечено, что молекулярная нацеливание OXPHOS может иметь эффективность для продвинутых меланомы, которые имеют повышенные уровни OXPHOS [14]. Таким образом, различные типы опухолей на разных стадиях их развития имеют свои метаболические характеристики. Таким образом, терапевтические стратегии и механизмы различного лечения опухолей на основе энергетического метаболизма различны. В настоящем исследовании мы впервые использовали новую технологию внеклеточный потока для оценки множества параметров митохондриальной функции и внеклеточной скорости подкисления параллельно с определением концентрации АТФ для изучения биоэнергетической характеристику рака желудка SGC-7901-клеток человека. Наш конек анализ показал SGC-7901 клетки имеют активную митохондрии, и зависят от митохондриальных OXPHOS более чем гликолиза пути для генерации АТФ в условиях культивирования с высоким содержанием глюкозы и пирувата, предполагая, что митохондриальная дыхание может быть потенциальной терапевтической мишенью при раке желудка человека.
<р> Тем не менее, когда клетки культивировали в среде DMEM отсутствие пирувата, они зависят от гликолиза более чем культивировали в среде DMEM, поставляемой с 2 ​​мМ пирувата, так как ингибирование гликолиза с помощью 2-DG приводит к падению ~48 % клеточного содержание АТФ. Кроме того, эти данные также показывают, что SGC-7901-клетки, вероятно, не хватает пластичности при переходе от гликолиза к митохондриального дыхания, когда гликолитическая производство АТФ отменена в условиях культивирования отсутствие энергетических веществ. С другой стороны, Ву <ЕМ> и др
. сообщили, что существует эффективное компенсаторное усиление активности гликолиза после введения олигомицином блокировать окислительного фосфорилирования, и этот ответ был в состоянии поддерживать уровень АТФ в человеческих немелкоклеточного линий клеток карциномы клеток H460 и A549 [15]. Наши результаты также показали, что SGC-7901 клетки обладают способностью повышать гликолиза при митохондриальной функции блокируется олигомицином. Кроме того, когда функции митохондрий была подавлена ​​ротенону, эффективное компенсаторное усиление активности гликолиза был accurred, и этот ответ был в состоянии поддерживать уровень ATФ при СГК-7901 клеток. Тем не менее, клетки не могли апрегулируются достаточную емкость гликолиза для поддержания уровня АТФ при расцеплении дыхание митохондрий от синтеза АТФ, индуцированного FCCP, (рис. 6). Таким образом, СГК-7901 клетки обладают существенной гликолиза и митохондриального потенциала respartion, и это делает клетки растут в разных условиях.
<Р> Совсем недавно было показано, что карнозин уменьшается пролиферацию злокачественных глиом путем воздействия на гликолитических и АТФ синтеза [27]. В нашем настоящем исследовании мы также обнаружили, что лечение с помощью карнозин способен уменьшая внеклеточную скорость подкисления и уровень молочной кислоты, что свидетельствует о том, что карнозин оказывает ингибирующее действие на гликолиз в СГК-7901 клеток. Тем не менее, карнозин не сделал полностью, но частично ингибируется гликолиз способность клеток, потому что фармакологическое ингибирование митохондриального дыхания путем ротенону или отсоединенном митохондриальную протонный градиент от производства АТФ путем FCCP, или обрабатывают ротенону и FCCP одновременно, клетки были все еще в состоянии к апрегулируются гликолиза, чтобы компенсировать АТФ истощения (рис. 6). Интересно, что мы обнаружили, что карнозин обладает также новую роль в качестве регулятора митохондриального дыхания. Карнозин подавлено базальные уровни митохондриального дыхания, и это в основном из-за снижения АТФ-связанного дыхания, что свидетельствует о том, что митохондриальные АТФ выход уменьшается в карнозина обработанных SGC-7901 клеток.

• PLoS ONE: хеликобактер пилори от рака желудка и двенадцатиперстной кишки Show же филогеографического происхождени…
• PLoS ONE: Оценка эффективности Итого и Всего гастрэктомий в роботизированной хирургии рака желудка по сравнению…