PLOS ONE: Carnosine hämmar proliferationen av humana magcancer SGC-7901 celler genom båda Mitochondrial respiration och Glycolysis Pathways

Abstrakt

Karnosin, en naturligt förekommande dipeptid, har nyligen visat sig ha anti-tumör aktivitet. Dock är den underliggande mekanismen oklar. I denna studie undersökte vi effekten och mekanismen av karnosin på cellviabiliteten och proliferationen av odlade humana magcancer SGC-7901-celler. Karnosin behandling inte inducera cell apoptos eller nekros, men minskade fortplantningsförmågan hos SGC-7901 celler. Seahorse analys visade SGC-7901 celler odlade med pyruvat har aktiva mitokondrier, och beror på mitokondriell oxidativ fosforylering mer än glykolys väg för generering av ATP. Karnosin minskade markant det absoluta värdet av mitokondriell ATP-kopplade andning, och minskade maximal syreförbrukning och reservlungkapacitet, vilket kan minska mitokondriefunktion korrelerad med proliferativ potential. Samtidigt karnosin reducerade också den extracellulära försurning hastigheten och glykolys av SGC-7901 celler. Våra resultat tyder på att karnosin är en potentiell regulator av energimetabolism SGC-7901 celler både i den anaeroba och aeroba vägar, och gav en ledtråd för preklinisk och klinisk utvärdering av karnosin för magcancer terapi

Citation. Shen Y, Yang J, Li J, Shi X, Ouyang L, Tian Y, et al. (2014) Karnosin Hämmar spridning av Human magcancer SGC-7901 celler genom båda Mitochondrial respiration och glykolys Pathways. PLoS ONE 9 (8): e104632. doi: 10.1371 /journal.pone.0104632

Redaktör: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

emottagen: 14 februari 2014; Accepteras: 15 juli 2014; Publicerad: 12 augusti 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta projekt stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (81102427), och delvis med stöd av Zhejiang Provincial Scientific Research Foundations (Y2110322), programmet för Zhejiang ledande team S & T Innovation (2010R50048) och Wenzhou City vetenskap och teknik Project (2010S0094 ). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer är en av de vanligaste maligniteter i världen. I ekonomiskt utvecklingsländer, är magcancer den näst största orsaken till cancerrelaterad död [1], [2]. Trots förbättringen i kirurgisk och multimodal terapi, är den totala 5-års överlevnad fortfarande låg (15% till 35%) på grund av de höga återfallsfrekvens, invasion och metastas [3]. Därför i detta, för att upptäcka mer effektiva anti-tumörläkemedel med färre biverkningar behövs.

L-Karnosin (β-alanyl-L-histidin) är en naturligt förekommande dipeptid som syntetiseras av endogena karnosin syntetas. Det är allmänt fördelade i däggdjurshjärnan, skelettmuskel, mage, njurar, hjärta och hud [4], [5]. Hittills har inte mycket är känt om dess fysiologiska funktion men flera förmodade roller har övervägts, såsom signalsubstans, anti-inflammatoriskt medel, fria radikaler, mobil organiska pH-buffert och metallkelator [6], [7]. Det har rapporterats, att karnosin är ett potentiellt terapeutiskt medel för behandling av Alzheimers sjukdom, stroke, diabetes, och andra sjukdomar i sinnesorganen [8], [9]. Alldeles nyligen visades det att karnosin också kan ha en anti-tumörframkallande effekter. Till exempel har karnosin rapporterats ha förmåga att inhibera malign gliom tillväxt [10], och denna effekt kan förmedlas genom en påverkan på glykolytiska energimetabolism, den bäst karakteriserade metabola fenotyp observerades i tumörceller, så kallade Warburg effekt [11 ], [12].

på senare tid har betydelsen av mitokondrier som syresensorer samt producenter av ATP bli en brännpunkt cancerforskning, och studier har visat en viktig företeelse som mitokondriell metabolism, särskilt citronsyra cykelaktivitet är viktig för den snabba spridningen av flera cancercelltyper [13], [14]. Men i fallet med humana gastriska cancerceller, är tillgängligt i vilken utsträckning glykolys och mitokondrisk oxidativ fosforylering (OXPHOS) bidrar till den cellulära energiproduktionen och snabb proliferation lite information. Om karnosin kan också hämma tillväxten av mänskliga gastric cancerceller är fortfarande okänd. Och om den hämmande effekten av karnosin på tumörcelltillväxt är också relaterad till dess verkan på mitokondriell andning och OXPHOS är fortfarande oklart.

Nyligen Seahorse Bioscience XF96 Extracellulär Flux Analyzer har använts för att samtidigt och kontinuerligt övervaka både aeroba och glykolytiska komponenter av cellulära bioenergetik [15]. Därför, i denna studie, vi undersökt effekterna av karnosin på tillväxten av humana gastric cancerceller och att ytterligare karakterisera bioenergetiska profil odlade humana magcancer cell SGC-7901 och roller karnosin i SGC-7901 celler energiomsättning med Sjöhäst Bioscience XF96 Extracellulär Flux Analyzer och andra relaterade teknologier.

Material och metoder

Reagens

L-Karnosin, natriumpyruvat, rotenon, karbonyl cyanid p-trifluormetoxifenyl-hydrazon (FCCP), antimycin A, var 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetra-zolium-bromid (MTT), metanol, mjölksyra från Sigma (St. Louis, MO, USA). Penicillin, streptomycin, L-glutamin, trypsin, Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), fetalt bovint serum var från GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA). Annexin V-FITC /PI apoptos upptäckt kit, BCA Protein Assay Kit och ATP Assay Kit köptes från Beyotime Institutet för bioteknik ((Nanjing, Kina). XF analysmedium och XF kalibreringslösning köptes från Seahorse Bioscience.

Cellodlings

human magcancer-cellinjen SGC-7901 (SGC-7901), human lever hepatocellulärt karcinom-cellinjen (HepG2) och rått-C6 gliom cellinje (C6) köptes från cellbanken Shanghai Institute, Chinese Academy of Science (den ursprungliga källan är American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA). Celler odlades i DMEM-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin G, och 100 | j, g /ml streptomycin, och hölls vid 37 ° C och 5% CO _{2 i en fuktad inkubator. cellerna trypsinbehandlades vid ett förhållande av 1:03 efter konfluens med användning av 0,25% trypsin. subodlades celler såddes på 96-, 24- eller 6-brunnsplattor vid densiteter av 2 x 10 ^{3, 5 × 10 4, 2 x 10 5 eller 1 × 10 6-celler /brunn, respektive.}}

MTT-minskning assay

Cell metabolisk aktivitet övervakades genom den kolorimetriska MTT-analys såsom beskrivits tidigare [16]. I korthet odlades celler på 96-brunnars plattor och det fanns 6 brunnar i varje grupp. Vid slutet av experimenten, inkuberades cellerna med 0,5 mg /ml MTT i 4 h vid 37 ° C. Sedan tillsattes det översta skiktet avlägsnades, och 100 mikroliter av dimetylsulfoxid tillsattes till varje brunn. MTT metabolism kvantifierades spektrofotometriskt vid 570 nm i en Biorad mikroläsare. Resultaten uttrycktes som den procentandel av MTT-reduktion, med absorbansen hos kontrollceller som 100%.

kolonibildningsanalys

Celler ströks ut i sex-brunnars plattor med densitet av 100-200 celler per brunn, och sedan behandlades med karnosin (20 mM). Kloner fick växa under 14 dagar i DMEM-odlingsmedium kompletterat med 10% FBS, 100 U /ml penicillin G och 100 | ig /ml streptomycin. Cellerna därefter fixerades med 70% etanol och färgades med Coomassie Brilliant Blue för analys av kolonibildning såsom beskrivits tidigare [17].

Flödescytometriska Analys av celldöd

Celldöd kvantifierades genom Annexin V-FITC-PI (propidiumjodid) dubbel färgning, med användning av en Annexin V-FITC apoptos detektionskit enligt tillverkarens förslag. I korthet såddes celler i 6-brunnsplattor i DMEM-medium. Celler behandlades med 20 mM karnosin under 48 h, och sedan samlades upp och tvättades två gånger i iskall PBS, resuspenderades i bindningsbuffert vid en densitet av 1 x 10 ^{6 celler /ml. Celler inkuberades samtidigt med fluoresceinmärkt Annexin V och PI under 20 min och analyserades med flödescytometri. Annexin V-FITC genererade signaler detekterades med en FITC signaldetektor (FL1, 525 nm). PI signaler övervakades med hjälp av en detektor som reserverats för fykoerytrin utsläpp (FL2, 575 nm). Data analyserades med hjälp av Cell Quest mjukvara från BD.}

Extracellulär Flux Technology

För att mäta syreförbrukningen (OCR) och extracellulära försurning hastighet (ECAR) av celler i olika förhållanden, en Seahorse XF96 extracellulär Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA) användes. Detta instrument gör det möjligt för den känsliga mätning av glykolys och flera parametrar för mitokondriefunktion, inklusive basal OCR, reservlungkapacitet, maximal OCR, ATP-kopplade andning och proton läcka från vidhäftande intakta odlade celler. Efter baslinjemätningar blev OCR och ECAR mättes efter att i sekvens till varje brunn 20 | il av oligomycin, FCCP och rotenon, för att nå arbets koncentrationer av 1 | ig /ml, 1 | iM och 1 | iM, respektive. Alla analyser utfördes med användning av en såddtäthet av 10000 celler /brunn i 200 mikroliter av DMEM i en XF96 cellodlingsmikroplatta (Seahorse Bioscience). Cellerna bytte till obuffrad DMEM kompletterat med 2 mM natriumpyruvat och 20 mM karnosin 1 h före början av analysen och hölls vid 37 ° C. OCR redovisas i enheten av pikomol per minut och ECAR rapporteras i milli-pH-enheter (mph) per minut.

Bestämning av ATP-produktion

ATP-analys utfördes i enlighet med tillverkarens instruktion. I korthet skördades odlade celler lyserades med en lyseringsbuffert, följt av centrifugering vid 10.000 x g under 2 min, vid 4 ° C. Slutligen, i sex-brunnars plattor, var nivån av ATP bestäms genom att blanda 20 | il av supernatanten med 100 pl av luciferas-reagens, som katalyseras ljusproduktion från ATP och luciferin. Luminansen mättes genom en monokromator mikroplattläsare. Standardkurva fram också genereras och proteinkoncentrationen i varje grupp bestämdes med användning av BCA-proteinanalyskitet. Totala ATP-halter uttrycktes som nmol /mg protein.

HPLC-analys av extracellulär mjölksyra

Koncentrationen av mjölksyra i den cellfria supernatanten mättes genom HPLC (HPLC ) i kombination med en ultraviolett-detektor med användning av tekniken som beskrivits tidigare. I korthet var de beredda analysates separeras på Ecosil C-18 omvänd kolonn (3 pm, 250 mm x 4,6 mm) användning av lösningsmedel A och lösningsmedel B [0,1 mol /l NH _{4H 2PO 4 ( pH 3,4) utspädd volym /volym i metanol 97:3] med en flödeshastighet av 0,5 ml /min. Temperaturen för kolonnen hölls vid 25 ° C, och våglängden för UV-detektion var satt till 210 nm.}

mitokondriell membranpotential
bedömning

förändringar i relativ mitokondriell membranpotential (Δ Ψ
m) bedömdes med hjälp av lipofila katjoniska sonden JC-1 5,5 ', 6,6'-tetraklor-1,1', 3,3'-tetra-benzamid azolocarbocyanine jodid (JC-1; Molecular Probes). Färgämnet JC-1 undergår en reversibel förändring i fluorescensemission från grönt till grönaktig orange Δ ¥
m ökar. Celler med hög Δ Ψ
m formulär JC-1 aggregat och fluorescerar rött; de med låg Δ Ψ
m innehåller mono JC-1 och fluorescerar grönt. Efter behandling med karnosin under 48 timmar avlägsnades odlingsmediet avlägsnades och cellerna, som odlas på täckglas, inkuberades i mörker med JC-1 vid en slutlig koncentration av 2 | iM under 20 min. Cellerna sköljdes med PBS två gånger och upphetsad vid 488 nm med en Olympus BX-51 fluorescensmikroskop.

MtDNA kopietal mätning

Absolute mtDNA kopietalet mättes genom att jämföra PCR-förstärkning av en mitokondrier amplikon [människa, NADH-ubikinon oxidoreduktas kedja 4 (ND4)] med en nukleär amplikon (human, β-aktin) från DNA isolerat med hjälp av en Qiagen DNA mini kit. Primersekvenser är följande: human β-aktin (framåt: 5'-ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 ', omvänd: 5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3'); humant ND4 (framåt: 5'-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 ', omvänd: 5'-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3'). DNA-mallar gjordes i regioner som spänner över varje amplikon genom PCR-amplifiering. Utspädningar från 1 × 10 ^{8 ner till en × 10 2 kopior av den isolerade DNA användes för att generera en standardkurva för kvantifiering. PCR-cykelbetingelser bestod av ett aktiveringssteg vid 95 ° C under 30 sekunder, följt av 40 cykler för 5 sek vid 95 ° C och 30 sekunder vid 58 ° C. Alla PCR utfördes på en Bio-Rad CFX chef realtids-PCR System (Applied Biosciences).}

Statistisk analys

Alla data representerar tre eller flera oberoende experiment. Data uttrycktes som medelvärde ± SD. Statistiska analyser genomfördes av SPSS 11,5 för Windows. Envägs ANOVA (variansanalys) följt av LSD (minsta signifikanta differens) eller Dunnetts T3 post-hoc
test (där lika varianser inte förutsattes) applicerades för multipla jämförelser, medan Students t-test var används för jämförelser mellan två grupper. P Hotel < 0,05 ansågs statistiskt signifikant

Resultat

Effekt av karnosin på SGC-7901 celler livskraft

För att bestämma effekten av karnosin på. human magcancer SGC-7901 celler livskraft, var MTT minskning analys används. Resultaten visade att karnosin behandling signifikant reducerad cellviabilitet på ett tids- och koncentrationsberoende sätt. Karnosin vid koncentrationer av 5 och 20 mM markant reducerad cellviabilitet till 84,0% och 57,9% av kontrollen vid 24 timmar, och till 73,5% och 45,9% av kontrollen vid 48 h, respektive (Fig. 1 A). Men karnosin vid en koncentration av 1 mM inte påverka SGC-7901 celler livskraft på 24 eller 48 timmar. Vi använde ytterligare flödescytometri för att analysera om karnosin kan orsaka SGC-7901 cell nekros eller apoptos. Överraskande, visade resultaten att karnosin behandling i 48 h inte inducerade nekrotisk eller apoptotisk celldöd i SGC-7901-celler (Fig. 1B). Eftersom MTT-minskning är också tolkas att vara ett tecken på cellulär metabolisk aktivitet, och den MTT-värdet av en cellpopulation bestäms av både antalet livskraftiga celler närvarande och deras relativa metabolic hastigheter, så vi bredvid beräkna antalet celler i ett parallellt experiment med identiskt behandlade SGC-7901 celler med hjälp av cellräkning platta. Vi fann att cellantalet i karnosin behandlades under 48 h gruppen var liknande den i kontrollgruppen (Fig. 1 C), vilket sålunda indikerar att den reducerade cellviabiliteten som inducerats av karnosin behandling under 48 h i SGC-7901-celler på grund av metabola förändringar men inte på grund av celldöd eller celltillväxt.

för att kontrollera huruvida dessa åtgärder av karnosin finns även i andra cancerceller, HepG2 och C6-celler användes. Resultaten visade att 20 mM karnosin behandling under 48 timmar inte inducera celldöd (tabell. S1) eller spridning, men markant reducerad MTT reducerande aktivitet både i HepG2 och C6-celler (Fig. S1).

choronic behandling med karnosin inhiberas SGC-7901 celler kolonier bildande

för att undersöka huruvida choronic exponering för karnosin kan påverka fortplantningsförmågan hos SGC-7901-celler, såddes cellerna vid en låg densitet (100-200 celler /brunn) och tilläts bilda kolonier i 14 dagar i DMEM kompletterat med 20 mM karnosin. Såsom visas i fig. 2, choronic exponering för karnosin reducerade kolonier formation till 39,9% av kontroll.

bioenergetiska karakterisering av odlade SGC-7901 celler

Vi undersökte OCRs och ECAR i odlade SGC-7901 celler med hjälp av en Seahorse XF-96 extracellulära flux analysator, som beskrivits tidigare [18]. Basala cellulära OCR och ECAR befanns vara 161,02 ± 29,58 pmol /min per 10 × 10 ^{3-celler (initial cellräkning), och 39,31 ± 4,29 mph /min per 10 × 10 3-celler (Fig. 3A). ATP-kopplade andning (den totala basaldos minus den med oligomycinkänslig, där oligomycin är en hämmare av ATP-syntes) var 96,15 ± 18,34 pmol /min per 10 × 10 3 celler, vilket tyder på att ~ 60% av cellulär syre konsumtion i samband med ATP-syntes. Samtidigt ECAR ökades till ~250% av baslinjen hastigheter i närvaro av maximalt effektiv dos av oligomycin (1 | ig /ml), vilket indikerar att cellerna skiftade mitokondriell andning till glykolys. Rotenon (1 M) minskas OCR till 55,78 ± 8,86 pmol /min per 10 × 10 3-celler (-35% av utgångspriser). Den rotenon resistenta ränta återspeglar den icke-mitokondriella andningsfrekvens, som omfattar substrat oxidation och cellytan syreförbrukning [19]. Således utgjorde icke-mitokondriell andning för -35%, medan mitokondriell andning utgjorde ~65% av den totala cellandningen. Således, i odlade SGC-7901 celler ~92% (60% /65%) av mitokondriell andning kopplades till ATP-syntes, och ~ 8% av mitokondriell andning utgjordes av proton läcka (fig. 3B). I närvaro av maximalt effektiv dos av FCCP (1 ^ M, en frånkoppling medel som tillåter maximal elektrontransport,), var en samtidig ökning av OCR undersöktes, och det höjdes till 204 ± 30,24 pmol /min per 10 × 10 3 celler.}

Vi bedömde också den relativa betydelsen av glykolys och OXPHOS i ATP produktionstakt i SGC-7901 celler. Absoluta kvantifieringar av både den glykolytiska takt och oligomycinkänslig känsliga syreförbrukningshastigheten uppmättes i SGC-7901 celler. Den extracellulära försurningshastigheten beror främst på laktat och bikarbonat produktion och, när kalibreras så protonproduktionshastigheten, indikerar glykolytiska hastighet [15]. Således använde vi oxamat för att inhibera laktatdehydrogenas, som omvandlar pyruvat till laktat under det sista steget av glykolys, för att beräkna den protonproduktionshastigheten (fig. 3C). Det finns en ett-till-ett förhållande mellan laktat produktionshastigheten och ATP produktionshastigheten från glykolys. Den oligomycin känsliga syreförbrukningen omvandlades till ATP produktionshastigheten med användning av ett P /O-förhållande av 2,3 [20]. Resultaten visade att SGC-7901 celler odlade i DMEM (högt glukos) kompletterat med 2 mM pyruvat gjort minst 93% av sin ATP med användning OXPHOS (fig. 3D).

Karnosin förändrat bioenergetiska karakterisering av SGC- 7901 celler

Vi undersökte effekterna av karnosin på syreförbrukningshastigheten och extracellulär försurning hastighet i odlade SGC-7901-celler. Resultaten i fig. 4 visade att behandling med 20 mM karnosin under 48 h reducerade den basala OCR och ECAR till 141,13 ± 27,06 pmol /min per 10 × 10 ^{3-celler (~87% av kontroll), och 11,32 ± 2,49 mph /min per 10 × 10 3-celler (~27% av kontroll), respektive (Fig. 4A, B). ATP-bundna andning, proton läcka, och icke-mitokondrierespirationshastigheten var 81,03 ± 17,97, 7,15 ± 3,6, och 52,96 ± 8,40 pmol /min per 10 × 10 3-celler, respektive (Fig. 4C, D, E ). Sålunda i karnosin behandlade SGC-7901-celler, utgjorde mitokondriell andning för ~62% av det totala cellandning, och ~92% (57% /62%) av mitokondriell andning kopplades till ATP-syntes, och ~ 8% av mitokondriell andning var svarade för genom proton läcka. Därför karnosin behandling minskade det absoluta värdet av ATP-kopplade andning, men det påverkade inte den relativa avgift på ATP-kopplade andning, proton läcka, och icke-mitokondriella andning till total cellandningen. Dessutom fann vi också att karnosin behandling markant reducerade maximal OCR och reservlungkapacitet till 161,60 ± 28,46 pmol /min per 10 × 10 3-celler (~79% av kontroll) och 20,47 ± 6,92 pmol /min per 10 × 10 3-celler (~47% av kontroll) (Fig. 4F, G).}

HepG2 och C6-celler användes också för att ytterligare kontrollera effekterna av karnosin på cancerceller energiomsättning. Resultaten visade att 20 mM karnosin behandling under 48 h markant reducerade den basala OCR och ECAR av HepG2 och C6-celler, respektive. Karnosin Dessutom minskade också ATP bunden andning i C6-celler, men inte i HepG2-celler (Fig. S2). Emellertid 20 mM karnosin markant reducerade den cellulära ATP-innehållet i både HepG2 och C6-celler, vilket indikerar att glykolys hämningen var inblandad i karnosin handling, åtminstone i HepG2-celler (Fig. S2J).

Karnosin minskade extracellulär mjölksyra nivå i odlade SGC-7901 celler

Eftersom karnosin är en mobil organisk pH-buffert, den extracellulära försurning hastigheten analyseras i närvaro av karnosin använder Seahorse XF96 extracellulär Flux Analyzer kan inte speglar den verkliga glykolys hastigheten. Vi har också använt HPLC för att analysera den extracellulära mjölksyranivå för att kontrollera effekten av karnosin på glykolysen i SGC-7901 celler. Våra resultat visade att karnosin behandling markant reducerade den extracellulära mjölksyranivån till 84% av kontrollen (Fig. 5), vilket indikerar att karnosin har en potential inhiberande effekt på glykolysen i odlade SGC-7901-celler.

Karnosin förändrat relativa bidraget av glykolys och OXPHOS till ATP laddning i SGC-7901 celler odlade i DMEM brist på pyruvat

Vi kännetecknas också effekten av karnosin på förändringarna i ATP-innehåll och den relativa betydelsen av glykolys och OXPHOS till ATP avgift i SGC-7901-celler odlade i DMEM brist på pyruvat. Vi mätte cellulär ATP-koncentration i celler som exponeras för 45 min till sex villkor: fordon, glykolysen inhibitor 2-DG, FCCP, rotenon, FCCP plus rotenon, och 2-DG plus FCCP plus rotenon. Vi fann att karnosin behandling under 48 timmar minskade signifikant ATP-innehållet till 62% av kontrollen. 2-DG behandling markant reducerad ATP-innehåll med 48% och 34% i karnosin frånvarande och karnosin nuvarande grupper jämfört med egna fordonsgrupper, respektive. FCCP och FCCP plus rotenon varje också signifikant reducerad ATP-innehåll med 15% och 18% i karnosin frånvarande grupp. Men dessa läkemedel inte påverkar ATP-innehållet i karnosin nuvarande grupp. Rotenon påverkade inte ATP-innehållet i både karnosin frånvarande eller närvarande grupper. 2-DG i kombination med FCCP och rotenon i huvudsak elimineras ATP-produktion både i dessa två grupper (Fig. 6). Således två-DG minskade ATP ut mer än FCCP eller rotenon gjorde både i karnosin frånvarande och nuvarande grupper. Dessa data visar att ATP generationsskiften från OXPHOS till glykolys när mitokondriefunktionen är nedsatt. ATP avgiften inte fullständigt underhållna efter hämning av antingen glykolys eller mitokondriefunktion i karnosin frånvarande grupp, medan ATP laddning bibehålls efter hämning av mitokondriefunktion i karnosin nuvarande grupp. Således, karnosin behandling förändrade relativa bidrag OXPHOS och glykolys i ATP produktionshastighet i SGC-7901 celler.

Effekt av pyruvat på hämmande verkan av karnosin på SGC-7901 celler mitokondriefunktion

för att undersöka huruvida att öka nivån av pyruvat kan vända den hämmande effekten av karnosin på mitokondriell andning av SGC-7901-celler, exponerades cellerna för olika koncentrationer av pyruvat. Såsom visas i tabell. 1, vilket ökar graden av pyruvat inte kunde vända hämmande effekten av karnosin på SGC-7901 celler mitokondriell andning. Dessutom MTT-analysen visade också att höja nivån på pyruvat inte kunde vända karnosin verkan på SGC-7901 celler mitokondriemetabolism (Fig. 7).

Effekter av karnosin på mitokondrie-DNA innehåll och mitokondriell membranpotential i SGC-7901 celler

mitokondriell membranpotential (Δ Ψ
m) står för huvuddelen av proton-drivkraft används för att driva syntes av ATP och har därför en viktig roll i den maximala ATP -generating kapacitet [21]. Därför använde vi också lipofila katjoniska sonden JC-1 att undersöka om karnosin dämpar OXPHOS via undertryckande av mitokondriell membranpotential (Δ Ψ
m). Resultaten visade att karnosin behandling under 48 timmar inte kunde framkalla en tydlig förändring av Δ Ψ
m odlade SGC-7901-celler (Fig. 8A).

För att lösa den till synes minskade mitokondrie andning inducerad av karnosin, kvantifieras vi också den absoluta mitokondrie-DNA (mtDNA) antal, som är tätt regleras för att upprätthålla cellulära energibehov [22]. Till vår förvåning, visade resultaten att jämfört med kontrollceller, de absoluta mtDNA kopiera nummer av karnosin behandlade 7901 celler markant, och den genomsnittliga absoluta mtDNA kopiera nummer var 141,49 ± 7,42 i kontrollcellerna och 360,0 ± 59,84 i karnosin -behandlade celler (Fig. 8B).

Diskussion

Så vitt vi vet är detta den första rapporten från bioenergetiska profil odlade SGC-7901-celler som behandlats med och utan karnosin. Våra viktigaste resultaten är följande. Först reducerade karnosin i fortplantningsförmågan hos SGC-7901 celler. För det andra, de celler som odlats i DMEM (högt glukos) kompletterat med 2 mM pyruvat gjord ~93% av sin ATP med användning OXPHOS. För det tredje, karnosin utövade sin hämmande effekt på SGC-7901 celler spridning genom att hämma glykolys, OXPHOS och mitokondrie andning av cellerna, och dessa åtgärder karnosin hittades också i HepG2 och C6-celler. Därför bör karnosin övervägas tillsammans med den växande beväpning av föreningar i olika stadier av läkemedelsutveckling som riktar tumörmetabolism, en av de viktigaste kännetecknen för tumörer [23].

Tack vare sitt breda spektrum av aktivitet, karnosin kan considerded som en terapeutisk faktor vid behandling av många sjukdomar. Till exempel, har Zink Carnosine använts för gastric hälsa och för gut reparation [24]. Nyligen, studier visade transformerade celler växte inte i MEM innehållande höga koncentrationer av karnosin, och karnosin skulle kunna administreras som ett läkemedel in vivo för att inhibera tillväxten av maligna celler [25]. Det hade dock ställas om karnosin kan förhindra tillväxten av humana gastriska tumörceller förutom de maligna celler som tidigare har rapporterats. I den aktuella studien fann vi att karnosin är också förmåga att hämma tillväxten av odlade SGC-7901 celler i en tids- och koncentrationsrelaterad sätt, och denna effekt inte åtföljdes av apoptos eller nekros, men kan i stället orsakas av minskad spridning. Men de detaljerade mekanismerna bakom hämmande effekten av karnosin på SGC-7901 celler spridning är fortfarande oklart.

Det är allmänt accepterat att metabola förändringar är ett av kännetecknen för cancer. Otto Warburg beskrev först den ökade användningen av anaerob metabolism i närvaro av tillräckligt syre av cancerceller jämfört med deras normala motsvarigheter: kallas "Warburg effekten" [26]. Men nyligen, det har påpekats att molekylär målinriktning av OXPHOS kan ha effekt för framskridet melanom, som har förhöjda nivåer av OXPHOS [14]. Således, olika typer av tumörer på deras olika utvecklingsstadier har sina egna metaboliska egenskaper. Därför terapeutiska strategier och mekanismer för olika tumörer behandling baserad på energisk metabolism är olika. I den aktuella studien, först använde vi en ny extracellulära flödesteknik för att bedöma flera parametrar av mitokondriefunktion och extracellulära försurning takt parallellt med ATP-koncentration beslutsamhet att utforska bioenergetiska karakterisering av humana magcancer SGC-7901 celler. Vår Seahorse analys visade SGC-7901 celler har aktiva mitokondrier, och beror på mitokondriella OXPHOS mer än glykolys vägar för generering av ATP i odlingsbetingelser med hög glukos och pyruvat, vilket tyder på att mitokondriell andning kan vara ett potentiellt terapeutiskt mål i human magcancer.

när emellertid cellerna odlades i DMEM brist på pyruvat, de är beroende av glykolys mer än så odlades i DMEM som medföljer 2 mM pyruvat, eftersom hämning av glykolys av 2-DG vilket leder till en minskning med ~48 % cellulär ATP-innehåll. Dessutom har denna data indikerar också att SGC-7901 celler saknar förmodligen plasticitet att byta från glykolys till mitokondrie andning när glykolytiska ATP-produktion avskaffas i odlingsbetingelser brist på energi ämnen. Å andra sidan, Wu et al
. har rapporterat att det fanns en effektiv kompensations uppreglering av glykolys efter administrering av oligomycinkänslig att blockera oxidativa fosforyleringen, och detta svar kunde upprätthålla ATP-nivån i människans icke-småcellig cancer cellinjer de H460 och A549 [15]. Våra resultat visade också att SGC-7901 celler har förmågan att öka glykolys när mitokondriell funktion blockeras av oligomycin. Dessutom, när den mitokondriella funktionen undertrycktes genom rotenon, var en effektiv kompensations uppreglering av glykolys accurred, och detta svar var kunna upprätthålla ATP-nivå i SGC-7901-celler. Men kunde cellerna inte uppreglerar tillräckligt glykolys förmåga att upprätthålla ATP-nivå när frånkoppling mitokondrie andning från ATP-syntes inducerad av FCCP, (Fig. 6). Därför SGC-7901 celler besitter betydande glykolys och mitokondriell respartion kapacitet, och det gör att cellerna växer under olika förhållanden.

Nyligen visades det att karnosin reducerade spridning av malignt gliom med en påverkan på glykolytiska och ATP syntes [27]. I vår aktuella studien fann vi också att behandling med karnosin kunde minska den extracellulära försurning hastigheten och mjölksyra nivå, vilket tyder på att karnosin har en hämmande effekt på glykolysen i SGC-7901 celler. Emellertid gjorde karnosin inte helt, men partiellt inhiberade glykolys kapacitet av cellerna, eftersom farmakologisk inhibering av mitokondriell andning genom rotenon, eller icke-kopplade den mitokondriella protongradient från ATP-produktion genom FCCP, eller behandlas med rotenon och FCCP samtidigt, cellerna kunde ändå att uppreglera glykolys för att kompensera för ATP utarmning (Fig. 6). Intressant nog fann vi att karnosin besitter också en ny roll som en regulator av mitokondriell andning. Karnosin tryckt basala nivåer av mitokondrie andning, och detta berodde huvudsakligen på minskad ATP-kopplade andning, vilket tyder på att de mitokondriella ATP produktionen minskar i karnosin behandlade SGC-7901 celler.

• PLOS ONE: Helicobacter pylori från Gastric Cancer och duodenalsår Visa Samma Phylogeographic ursprung i den andinska regionen i Colombia
• PLOS ONE: Effektivitet utvärdering av delresultat och Total Gastrectomies i Robotic Surgery för Gastric cancer jämfört med i öppen och laparoskopisk fria stationer: en metaanalys