PLoS ONE: Karnozinas Slopina žmogaus skrandžio vėžio SGC-7901 ląstelių proliferaciją per abi Mitochondrijų kvėpavimo ir Glikolizė Pathways

Anotacija

Karnozinas, natūraliai pasitaikančio dipeptido, neseniai buvo įrodyta, kad turėti priešnavikinis veikla. Tačiau jos pagrindinis mechanizmas yra neaiškus. Šiame tyrime mes ištirti poveikį ir mechanizmą karnozino apie ląstelių gyvybingumui ir platinimu kultivuoti žmogaus skrandžio vėžio SGC-7901 ląstelių. Karnozinas gydymas nesukėlė ląstelių apoptozę arba nekrozė, tačiau sumažino dauginimosi pajėgumą SGC-7901 ląstelių. Jūrų arkliukas analizė parodė, SGC-7901 ląstelių išauginti su piruvato aktyvią mitochondrijas, ir priklauso nuo mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo daugiau nei glikolizės keliu generuoti ATP. Karnozinas ženkliai sumažėjo absoliučią vertę mitochondrijų ATF susijęs kvėpavimo ir sumažino maksimalų deguonies suvartojimą ir atsarginės kvėpavimo pajėgumas, o tai gali sumažinti mitochondrijų funkciją koreliuojantį su proliferacijos potencialą. Tuo pačiu metu, Karnozinas taip pat sumažino ekstraląsteliną rūgštėjimo norma ir glikolizės iš SGC-7901 ląstelių. Mūsų rezultatai rodo, kad Karnozinas yra potencialus reguliatorius energijos apykaitoje SGC-7901 ląstelių tiek anaerobinio ir aerobinių kelius, ir su sąlyga, clue už Ikiklinikinių ir klinikinių vertinimo karnozino skrandžio vėžio gydymo

Citation:. Shen Y, Yang J, Li J, Shi X, Ouyang L, Tian Y, ir kt. (2014) Karnozinas slopina žmogaus skrandžio vėžio SGC-7901 ląstelių proliferaciją per abi mitochondrijų kvėpavimą ir glikolizės kelius. PLoS ONE 9 (8): e104632. Doi: 10,1371 /journal.pone.0104632

redaktorius Salvatore V. Pizzo, Duke universiteto medicinos centras, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Vasario 14, 2014 m Priėmė: Lie 15, 2014 m Paskelbta rugpjūčio 12, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Shen et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis projektas parėmė Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (81102427), ir iš dalies remia Zhejiang provincijos Moksliniai tyrimai fondų (Y2110322), dėl Zhejiang "komanda S &programa; T inovacijų (2010R50048) ir Wenzhou miestą mokslo ir technologijų projektas (2010S0094 ). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių piktybinių navikų pasaulyje. Į ekonomiškai besivystančių šalių, skrandžio vėžys yra antra priežastis, dėl vėžio susijusių mirties [1], [2]. Nepaisant to, kad chirurginės ir multimodalinio terapijos tobulinimui, bendras 5 metų išgyvenamumas yra vis dar maža (nuo 15% iki 35%), nes iš aukštų pasikartojimo normas, invazija ir metastazės [3]. Todėl, dabartyje, po daugiau veiksmingas antinavikinį narkotikų su mažiau šalutinių poveikių yra būtina.

L-Karnozinas (β-alanil-L-histidinas) yra natūraliai dipeptido, kad yra sintetinamas endogeninio karnozino sintetazės. Ji yra plačiai pasiskirsto žinduolių smegenų, skeleto raumenų, skrandžio, inkstų, širdies ir odos [4], [5]. Iki šiol, o ne daug yra žinoma apie jo fiziologiniu funkcinė grupė, tačiau kelių tariamų vaidmenį buvo laikomas, pavyzdžiui, neuromediatorių, priešuždegiminis agentas, laisvųjų radikalų neutralizavimo, mobiliojo organinės pH buferio ir metalo chelatoriaus [6], [7]. , Buvo pastebėta, kad Karnozinas yra potencialus terapinis agentas, skirtas Alzheimerio ligos, insulto, diabeto gydymui, ir kitų ligų, jutimo organais [8], [9]. Visai neseniai buvo įrodyta, kad Karnozinas taip pat gali turėti anti-tumorogeninį poveikį. Pavyzdžiui, Karnozinas buvo pranešta, kad turi sugebėjimą slopinti piktybine glioma augimą [10], ir šis poveikis gali būti susijęs su jo įtaką glikolizinių energijos apykaita, geriausias būdinga medžiagų apykaitos fenotipo stebimas naviko ląstelių, vadinamų Warburg poveikio [11 ], [12].

Neseniai mitochondrijas kaip deguonies jutiklių, taip pat gamintojų ATP svarba tapo centru vėžio mokslinių tyrimų ir tyrimai parodė svarbų reiškinį, kad mitochondrijų apykaitą, ypač citrinų rūgštis ciklas veikla yra svarbi spartaus plitimo keliais vėžio ląstelių [13], [14] tipams. Tačiau žmogaus skrandžio vėžio ląstelių atveju mažai informacijos, kiek glikolizės ir mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo (OXPHOS) prisideda prie ląstelių energijos gamyboje ir greitai dauginasi. Nesvarbu Karnozinas taip pat gali slopinti žmogaus skrandžio vėžio ląstelių augimą lieka nežinoma. Ir ar stabdantis poveikis karnozino naviko ląstelių augimą, taip pat susiję su jo veiksmų mitochondrijų kvėpavimo ir OXPHOS lieka neaiškus.

Neseniai Seahorse biologijos XF96 Ekstraceliulinis srauto analizatorius buvo naudojamas vienu metu ir nuolat stebėti tiek aerobikos ir glikolitinių komponentai korinio bioenergetikos [15]. Todėl šiame tyrime mes ištirti karnozino poveikį žmogaus skrandžio vėžio ląstelių augimą ir papildomai apibūdinti bioenergetinį profilį kultūringo žmogaus skrandžio vėžio ląstelių SGC-7901 ir karnozino vaidmenis SGC-7901 ląstelių energijos apykaitos su Seahorse biologijos XF96 Ekstraceliulinis srauto analizatorius ir kitas susijusias technologijas.

medžiagos ir metodai

Reagentai

L Karnozinas, natrio piruvato, rotenono, karbonilo cianidas p trifluormetoksifenilas-hidrazono (FCCP), antimycin A, 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-diphenyltetra-zolium bromidas (MTT), metanolis, pieno rūgštis buvo iš Sigma (St. Louis, MO, JAV). Penicilino, streptomicino, L-glutaminas, tripsino, Dulbecco modifikuota Eagle vidutinės (DMEM), vaisiaus jaučio serumo buvo iš GIBCO-BRL (Grand Island, NY, JAV). Aneksinu-FITC /PI apoptozė aptikimo komplektas, BCA Baltymai Analizės komplektas ir ATF Analizės komplektas buvo pirktas Beyotime Biotechnologijos institutas ((Nanjing, Kinija). XF analizė ir vidutinės XF Kalibratorių sprendimas buvo pirktas Seahorse biologijos mokslų.

Mobilusis kultūra

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linija SGC-7901 (SGC-7901), žmogaus kepenų ląstelių karcinoma ląstelių linija (HepG2) ir žiurkės gliomos C6 ląstelių linija (C6) buvo nupirkta iš Šanchajus instituto ląstelių banke, Kinijos mokslų akademija (originalas šaltinis yra Amerikos tipas kultūra rinkimas, ATCC, Manasasas, V., JAV). Ląstelės buvo auginamos DMEM terpėje papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS), 100 V /ml penicilino G ir 100 mikrogramų /ml streptomicino, ir palaikoma 37 ° C temperatūroje ir 5% CO _{2 drėgmėje, inkubatoriuje. ląstelės buvo tripsinizuojamos esant 1:3 santykis po santakos naudojant 0,25% tripsino. persėjamos ląstelės buvo pasėjamos ant 96-, 24- arba 6-taip plokšteles tankių 2 × 10 ^{3, 5 × 10 4, 2 × 10 5 arba 1 × 10 6 ląstelių /gerai, atitinkamai.}}

MTT sumažinimas tyrimas

Mobilusis metabolinis aktyvumas buvo stebimas kolorimetrinę MTT kaip aprašyta anksčiau [16]. Trumpai, ląstelės buvo auginamos ant 96-duobučių lėkštelėse ir ten buvo 6 gręžinių kiekvienai grupei. Tuo eksperimentų pabaigoje, ląstelės buvo inkubuojamos su 0,5 mg /ml MTT 4 h, esant 37 ° C temperatūroje. Tada, paviršinio sluoksnio buvo pašalintas, ir 100 pL dimetilsulfoksido buvo pridėta į kiekvieną šulinėlį. MTT metabolizmas buvo kiekybiškai spektrofotometru prie 570 nm A Biorad mikroplokštelės skaitytuvą. Rezultatai buvo išreikštas MTT sumažinimo procentinį dydį, atsižvelgiant į kontrolinių ląstelių absorbciją kaip 100%.

kolonija formavimas tyrimas

Ląstelės buvo padengtas iš šešių duobučių lėkštelėse ne tankis 100-200 ląstelių už gerai, ir tada buvo gydomi karnozino (20 mM). Klonai buvo leidžiama augti 14 dienų DMEM mitybinės terpės papildyti su 10% FBS, 100 V /ml penicilino G, ir 100 mikrogramų /ml streptomicino. Vėliau ląstelės buvo nustatyta su 70% etanolio ir tamsintas su Coomassie briliantinis mėlynasis analizei kolonijos formavimas, kaip aprašyta anksčiau [17].

tėkmės citometrijos Analizės ląstelių mirties

Mobilusis mirtis buvo įvertintas aneksino V-FITC VšĮ (propidiumo jodidas) dvigubo dažymo, naudojant aneksinu-FITC apoptozė aptikimo rinkinį pagal gamintojo pasiūlymą. Trumpai, ląstelės buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse DMEM terpėje. Ląstelės buvo gydomi 20 mM karnozino 48 h, ir tada buvo surinkti ir plaunamas du kartus ledinio PBS, sumaišymo susieja buferyje 1 × 10 ^{6 ląstelių /ml tankio. Ląstelės buvo inkubuotos tuo pačiu metu su fluoresceino žymėto aneksino V ir PI 20 min ir analizuojami tėkmės citometrijos metodą. Aneksinu-FITC generuojami signalai buvo aptikti su FITC signalo detektoriaus (FL1, 525 nm). PI signalai buvo stebimi naudojant detektorius skirtą Fikoeritrino emisijos (FL2, 575 nm). Duomenys buvo analizuojami naudojant Mobilusis Quest programinę įrangą iš BD.}

tarpląstelinio Flux technologijos

Jei išmatuoti deguonies sunaudojimo norma (OCR) ir ekstraceliuliniu rūgštėjimo greitis (ECAR) ląstelių įvairiose sąlygomis Seahorse XF96 buvo naudojamas ekstraceliulinis srauto analizatorius (Seahorse biologijos, Billerica, MA, JAV). Ši priemonė leidžia jautriai matavimo glikolizės ir kelių parametrų mitochondrijų funkcijoms, įskaitant bazinio OCR, atsarginiu kvėpavimo pajėgumas, maksimaliai OCR, ATP, susijusių kvėpavimo ir protonų ištekėti iš lipnių nesugadintų kultivuojamų ląsteles. Po pradinių matavimų OCR ir ECAR buvo matuojamas po nuosekliai pridedant į kiekvieną šulinėlį 20 įxL oligomycin, FCCP ir rotenono, kad pasiektų darbo koncentracijas 1 mikrogramai /ml, 1 m ir 1 mkm, atitinkamai. Visi tyrimai buvo atliekami naudojant sėjimo tankumas 10000 ląstelių /gerai 200 įxL DMEM A XF96 ląstelių kultūros mikroplokštelę (Seahorse biologijos mokslų). Ląstelės buvo įjungtas į nebuferintas DMEM, papildytoje 2 mM natrio piruvato ir 20 mM Karnozinas 1 h, prieš prasidedant ir tyrimo metodo pradžioje ir palaikoma 37 ° C temperatūroje. OCR pranešta apie picomoles per minutę ir ECAR vieneto pranešė mili-pH vienetais (mph) per minutę.

nustatymas ATP gamybą

ATF tyrimas buvo atliekamas pagal gamintojo instrukcija. Trumpai, nuimami išauginti ląstelės buvo lizuojamos lizės buferio, po to centrifuguojant 10000 × g 2 min, esant 4 ° C temperatūroje. Galiausiai, 6-duobučių lėkštelėse, ATP lygis buvo nustatomas pagal maišymo 20 pL supernatanto su 100 pL liuciferazės reagentu, kuris katalizuoja šviesos gamybą iš ATP ir luciferin. Skaisčio buvo matuojamas monochromatorius mikroplokštelės skaitytuvą. Standartinė kreivė taip pat buvo sukurtas ir baltymo koncentracija iš kiekvienos grupės buvo nustatoma naudojant BCA baltymų reagentq rinkini. Iš viso ATP koncentracija buvo išreikštas nmol /mg baltymo.

HPLC analizė ekstraląstelinio pieno rūgšties

pieno rūgšties ląstelių be supernatanto koncentracija buvo nustatoma didelio slėgio skysčių chromatografija (HPLC ) kartu su ultravioletine detektoriumi, naudojant šį metodą, kaip aprašyta anksčiau. Trumpai tariant, paruošti analysates buvo atskirti nuo Ecosil C-18 atstatomi kolonėlė (3 mikronų, 250 mm × 4,6 mm), naudojant tirpiklio A ir tirpiklis B [0,1 mol /l koncentracijos NH _{4H 2PO 4 ( pH 3,4) praskiestas v /v metanolyje 97:3] su srauto greičiui esant maždaug 0,5 ml /min. Kolonėlės temperatūra buvo palaikoma 25 ° C temperatūroje, ir iš UV detektoriumi bangos ilgis buvo nustatytas 210 nm bangos ilgiui.}

Mitochondrijų membrana galimybių įvertinimas

santykinio mitochondrijų membranos pokyčiai potencialūs (Δ , Ψ
m), buvo įvertintas naudojant lipofilinį katijonini zondą JC-1 5,5 ", 6,6'-tetrachloro-1,1", 3,3'-tetraetilšvinui-benzamid azolocarbocyanine jodido (JC-1; molekuliniai zondai). Dažų JC-1 patiria grįžtamas pokytį fluorescencijos emisijos iš žalios į žalsvai apelsinų kaip Δ Ψ
m didėja. Ląstelės su dideliu Δ Ψ
M formą JC-1 agregatų ir švyti raudona; gaunantiems mažas Δ , Ψ
m yra monomerinis JC-1 ir švyti žalia spalva. Po gydymo su karnozino 48 h, kultūrinė terpė buvo pašalintas ir ląstelės, auginamos coverslips, buvo inkubuojamos tamsoje su JC-1, kurio galutinė koncentracija būtų 2 mikromolių 20 min. Ląstelės buvo skalaujami PBS du kartus ir džiaugiamės tuo 488 nm su "Olympus BX-51 fluorescencijos mikroskopu.

mtDNA kopijų skaičiaus matavimas

Absoliutus MtDNA kopijos numeris buvo matuojamas lyginant PGR amplifikacija iš mitochondrijų amplikono [žmogaus, NADH-ubichinonas oksidoreduktazė grandinė 4 (ND4)] su branduolinės amplikono (žmogiškųjų, β-aktino) nuo DNR izoliuoti naudojant Qiagen DNR mini rinkinys. Gruntas sekos yra šios: žmogaus β-aktino (pirmyn: 5'-ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 "; Reversas: 5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3"); žmogaus ND4 (pirmyn: 5'-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 "; Reversas: 5'-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3"). DNR šablonai buvo pagaminti iš regionų, apimanti kiekvieną amplikono PGR amplifikacijos. Skiedinius iš 1 × 10 ^{8 iki 1 × 10 2 kopijos izoliuotos DNR buvo naudojami generuoti standartinę kreivę kiekybiškai. PGR dviračių sąlygos sudarė aktyvacijos žingsnio ne mažesnis nei 95 ° C temperatūroje 30 sek, po 95 ° C temperatūroje ir 30 s esant 58 ° C temperatūroje, naudojant 40 ciklų 5 sek. Visi PGR reakcijų buvo atlikta Bio-Rad CFX Manager Realaus laiko PGR sistema (Applied Biosciences).}

Statistinė analizė

Visi duomenys yra tris ar daugiau nepriklausomų eksperimentų. Duomenys buvo pateikti kaip vidurkis ± SD. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant "SPSS 11.5 for Windows. ANOVA (dispersinė analizė), po LSD (mažiausiai svarbus skirtumas) arba Dunnett anketa T3 , post-hoc
testas (kur lygios dispersijos buvo neprisiėmė) buvo taikoma daugeliui lyginimų, o Stjudento t-testas buvo naudojamas palyginimus tarp dviejų grupių. P
< 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas

Rezultatai

poveikis karnozino ant SGC-7901 ląstelių gyvybingumo

Norėdami nustatyti karnozino poveikį. žmogaus skrandžio vėžys SGC-7901 ląstelių gyvybingumas, buvo naudojamas MTT mažinimo testą. Rezultatai parodė, kad Karnozinas gydymas žymiai sumažino ląstelių gyvybingumą laiko ir koncentracijos priklausomu būdu. Karnozinas koncentracija 5 ir 20 mm ženkliai sumažinti ląstelių gyvybingumą 84,0% ir 57,9% kontrolinės grupės po 24 h ir 73,5% ir 45,9% nuo kontrolės 48 h, atitinkamai (pav. 1A). Tačiau Karnozinas ne koncentracijos 1 mM nepaveikė SGC-7901 ląstelių gyvybingumą ne 24 ar 48 val. Mes taip pat naudojamas srauto citometrijos į bandinys ar Karnozinas gali sukelti SGC-7901 ląstelių nekrozę arba apoptozę. Keista, rezultatai parodė, kad Karnozinas gydymas 48 h nesukėlė nekrotinį ar Apoptozė ląstelių žūtį SGC-7901 ląstelių (1b pav.). Kadangi MTT sumažinimas taip pat aiškinama, kad rodo ląstelių medžiagų apykaitos veiklą, o MTT vertė ląstelių populiacijos lemia tiek gyvybingų ląstelių skaičių buvimo ir jų santykinius medžiagų apykaitos lygis, todėl šalia apskaičiuoti ląstelių skaičius lygiagrečiai eksperimentas su identiškai gydytų SGC-7901 elementuose naudojamos ląstelių skaičiavimo lentelę. Mes nustatėme, kad ląstelių skaičius karnozino gydyti 48 h grupės buvo panašus į tą, kontrolinės grupės (1C pav.), Taip parodant, kad sumažintas ląstelių gyvybingumas sukeltas karnozino gydymo 48 h į SGC-7901 ląstelių buvo dėl medžiagų apykaitos pokyčių bet ne dėl ląstelių žūties arba ląstelių proliferaciją.

Jei norite patikrinti, ar šie karnozino veiksmai pat egzistuoja kitose vėžinių ląstelių, buvo naudojami HepG2 ir C6 ląstelių. Rezultatai parodė, kad 20 mm Karnozinas gydymas 48 h nesukėlė ląstelių mirtį (S1 lentelė.) Arba platinimu, bet žymiai mažesnį MTT sumažinti veiklą tiek HepG2 ir C6 ląstelių (pav. S1).

Choronic gydymas su Karnozinas slopinamas SGC-7901 ląstelių kolonijų susidarymą

Jei išnagrinėti, ar choronic poveikis karnozino gali paveikti dauginimosi pajėgumą SGC-7901 ląstelių, ląstelės buvo pasėtos ne mažo tankio (100-200 ląstelių /gerai) ir leidžiama sudaryti kolonijas 14 dienų DMEM papildytas 20 mm karnozino. Kaip parodyta Fig. 2, choronic poveikis karnozino sumažinti kolonijų susidarymo iki 39,9% kontrolę.

bioenergetinį apibūdinimas išaugintų SGC-7901 ląstelių

tyrė OCRs ir ECAR kultūroje SGC-7901 ląstelių naudojant Seahorse XF-96 ekstraląstelinis srautas analizatorius, kaip aprašyta anksčiau [18]. Bazinių ląstelių OCR ir ECAR buvo nustatyta, kad 161,02 ± 29,58 pmol /min už 10 × 10 ^{3 ląstelių (pradinis ląstelių skaičius), ir 39,31 ± 4,29 mph /min už 10 × 10 3 ląstelės atitinkamai (pav. 3A). ATP susieti kvėpavimo (bendras bazinio norma minus norma oligomycin, kur oligomycin yra ATF sintezės inhibitorių) buvo 96,15 ± 18,34 pmol /min už 10 × 10 3 ląstelių, nurodant, kad ~60% Ląstelinės deguonies vartojimas buvo susijęs su ATP sintezei. Tuo pačiu metu ECAR buvo padidintas iki ~250% pradinio kiekio dažnius bei maksimaliai veiksmingą dozę oligomycin (1 g /ml) buvimą, nurodant, kad ląstelės perėjo mitochondrijų kvėpavimą į glikolizės. Rotenono (1 mkm) sumažėjo OCR 55,78 ± 8,86 pmol /min už 10 × 10 3 ląstelių (~35% pagrindinių normų). Rotenono atsparus norma atspindi ne mitochondrijų kvėpavimo greitį, kuris apima substrato oksidacijos ir ląstelių paviršiuje deguonies suvartojimą [19]. Tokiu būdu, ne-mitochondrijų kvėpavimo sudarė ~35%, kadangi mitochondrijų kvėpavimo sudarė ~65% visos ląstelių kvėpavimą. Tokiu būdu, kultūroje SGC-7901 ląstelių ~92% (60% /65%) mitochondrijų kvėpavimo buvo sujungtas su ATP sintezės būdu, taip ~8% mitochondrijų kvėpavimo buvo sudarė protonų nuotėkio (3B pav.). Atsižvelgiant į maksimaliai efektyviai dozę FCCP (1 mkm, yra atsietas agentas, kuris leidžia maksimaliai elektronų transportą,) buvimą, buvo pastebėtas kartu padidėjimas OCR, ir ji buvo padidinta iki 204 ± 30,24 pmol /min už 10 × 10 3 ląstelės.}

Mes taip pat įvertino santykinę įnašas glikolizės ir OXPHOS ATP gamybos lygis SGC-7901 ląstelių. Absoliučios kiekybinių iš tiek glikolizinių norma ir oligomycin jautrus deguonies sunaudojimo norma buvo matuojamas SGC-7901 ląstelių. Ekstraląstelinė rūgštėjimas norma yra daugiausia dėl to, laktato ir hidrokarbonato gamybos ir, kai kalibruojami kaip protonų gamybos normą, rodo glikolizinių norma [15]. Taigi, mes naudojome oxamate slopina laktato dehidrogenazės, kuri konvertuoja piruvato į laktatą per pastarąjį žingsnį glikolizės, apskaičiuoti protonų gamybos norma (pav. 3c). Yra vienas prie vieno santykiai tarp laktato gamybos normos ir ATP gamybos tarifą nuo glikolizės. Oligomycin jautrus deguonies suvartojimas buvo paverstas ATP gamybos normą, naudojant P /O santykis 2.3 [20]. Rezultatai parodė, kad SGC-7901 ląstelių išauginti DMEM (didelio gliukozės) papildyti 2 mM piruvato pagamintas mažiausiai 93% jų ATP naudojant OXPHOS (pav. 3d).

Karnozinas pakeitė bioenergetinį apibūdinimą SGC- 7901 ląstelių

Mes tyrėme karnozino poveikį deguonies suvartojimo norma ir tarpląstelinio rūgštėjimo norma išaugintų SGC-7901 ląstelių. Į pav rezultatai. 4 parodė, kad gydymas 20 mm karnozino 48 h sumažino bazinę OCR ir ECAR į 141.13 ± 27.06 pmol /min už 10 × 10 ^{3 ląstelės (~87% kontrolės) ir 11,32 ± 2,49 mph /min už 10 (B pav. 4A) × 10 3 ląstelių (~27% kontrolės), atitinkamai. ATP susietų kvėpavimas, protonų nuotėkio, ir ne mitochondrijų kvėpavimo intensyvumas buvo 81.03 ± 17.97, 7.15 ± 3.6, ir 52.96 ± 8.40 pmol /min už 10 × 10 3 ląstelių, atitinkamai (pav. 4C, D, E ). Taigi karnozino apdorojimo SGC-7901 ląstelių, mitochondrijų kvėpavimo sudarė ~62% visos ląstelių kvėpavimą, ir ~92% (57% /62%) mitochondrinio kvėpavimo buvo sujungtas su ATP sintezės būdu, taip ~8% mitochondrijų kvėpavimo buvo sudarė protonų nuotėkio. Todėl Karnozinas gydymas sumažėjo absoliučią vertę ATP susijęs kvėpavimo, bet tai neturėjo įtakos santykinė įmokos tarifas ATP susijęs kvėpavimo, protonų nuotėkio, ir ne mitochondrijų kvėpavimą į bendrą ląstelių kvėpavimui. Be to, mes taip pat nustatė, kad Karnozinas gydymas ženkliai sumažino maksimalų OCR ir atsarginės kvėpavimo gebėjimą 161,60 ± 28,46 pmol /min už 10 × 10 3 ląstelių (~79% kontrolės) ir 20,47 ± 6,92 pmol /min per 10 × 10 3 ląstelių (~47% kontrolės) (4F, G pav.).}

HepG2 ir C6 ląstelių, taip pat buvo naudojamas dar kartą patikrinti karnozino poveikį vėžio ląstelių energijos apykaitai. Rezultatai parodė, kad 20 mm Karnozinas gydymas 48 h ženkliai sumažino bazinę OCR ir ECAR iš HepG2 ir C6 ląstelių, atitinkamai. Karnozinas papildymas taip pat sumažino ATP-patalpintas kvėpavimą C6 ląstelių, bet ne HepG2 ląstelėse (S2 pav.). Tačiau 20 mM Karnozinas ženkliai sumažino ląstelių ATP turinį tiek HepG2 ir C6 ląstelių, nurodant, kad glikolizės slopinimas dalyvavo karnozino veiksmų, bent jau HepG2 ląstelių (S2J pav.).

Karnozinas sumažėjo tarpląstelinio pieno rūgšties lygis kultūringas SGC-7901 ląstelių

Kadangi Karnozinas yra mobili organinis pH buferis, ekstraląstelinė rūgštėjimas norma tiriami į karnozino metu naudojant Seahorse XF96 tarpląstelinio Flux Analyzer negali atspindėti realią glikolizės norma. Taigi mes taip pat naudojamas HPLC į bandinys ekstratąsteiinę pieno rūgšties lygį patikrinti karnozino poveikį glikolizės į SGC-7901 ląstelių. Mūsų rezultatai parodė, kad Karnozinas gydymas ženkliai sumažintas ekstratąsteiinę pieno rūgšties lygį iki 84% kontrolės (5 pav.) Rodo, kad Karnozinas turi potencialų antagonistinis poveikis glikolizės kultūroje SGC-7901 ląstelių.

Karnozinas pasikeitė santykinis indėlis glikolizės ir OXPHOS ATP mokestį į SGC-7901 ląstelių išauginti iš piruvato
DMEM trūksta

Mes taip pat pasižymi karnozino poveikį ATP kiekio pokyčių ir santykinis indėlis glikolizės ir OXPHOS ATP nemokamai į SGC-7901 ląstelių išauginti iš piruvato DMEM trūkumo. Mes matuojamas ląstelių ATP koncentracija ląstelių veikiami 45 min šešių sąlygomis: transporto priemonė, glikolizės inhibitorių 2-GD, FCCP, rotenono, FCCP plius rotenono ir 2-GD plius FCCP plius rotenono. Mes nustatėme, kad Karnozinas gydymas 48 h žymiai sumažino ATP turinį iki 62% kontrolės. gydymas 2-GD gerokai sumažintas ATP turinį 48% ir 34% karnozino nėra ir Karnozinas dabartinių grupių, lyginant su jų pačių transporto priemonių grupių, atitinkamai. FCCP ir FCCP plius rotenono kiekvienas taip pat žymiai sumažino ATP turinį 15% ir 18% karnozino nedalyvaujančio grupės. Tačiau, šie vaistai neturėjo įtakos ATP turinį karnozino šioje grupėje. Rotenono nepaveikė ATP turinį tiek karnozino nebūtų ar jos grupių. 2-DG kartu su FCCP ir rotenono iš esmės pašalinti ATP gamybą tiek šiose dviejose grupėse (6 pav.). Taigi 2-GD sumažėjo ATF imti daugiau nei FCCP ar rotenono padaręs karnozino nėra ir dabartiniai grupes. Šie duomenys rodo, kad ATP kartos pamainomis nuo OXPHOS į glikolizės kai mitochondrijų funkcija sutrikusi. ATP mokestis nėra visiškai išlaikoma po slopinimo arba glikolizės ar mitochondrijų funkcijos karnozino nedalyvaujančio grupės, o ATF mokestis išlaikomas po slopinimo mitochondrijų funkcijos karnozino šiuo grupei. Taigi, Karnozinas gydymas pakeisti santykinį indėlį OXPHOS ir glikolizės ATP gamybos normos SGC-7901 ląstelių.

poveikis piruvato dėl stabdantis veiksmų karnozino apie SGC-7901 ląstelių mitochondrijų funkcija

ištirti, ar didinant piruvato lygį gali pakeisti antagonistinis poveikis karnozino mitochondrijų kvėpavimo parametrams SGC-7901 ląstelių, ląstelės buvo veikiamos į skirtingų koncentracijų piruvato. Kaip parodyta lentelėje. 1, didinant piruvato lygį negalėjo pakeisti stabdantis poveikis karnozino apie SGC-7901 ląstelių mitochondrijų kvėpavimą. Be to, MTT taip pat parodė, kad didinant piruvato lygį negalėjo pakeisti karnozino veiksmų SGC-7901 ląstelių mitochondrijų metabolizmas (7 pav.).

Efektai karnozino mitochondrijų DNR turinį ir mitochondrijų membranos potencialą į SGC-7901 ląstelių

Mitochondrijų membrana potencialas (Δ , Ψ
m) sudaro už protonų varomąją jėgą, naudojamomis mokymui vairuoti ATP sintezę dauguma ir todėl turi didelį vaidmenį maksimaliai ATP -generating talpa [21]. Todėl mes taip pat naudojamas lipofilinį katijonini zondą JC-1 ištirti, ar Karnozinas slopina OXPHOS per slopinimo mitochondrijų membranos potencialą (Δ , Ψ
m). Rezultatai parodė, kad Karnozinas gydymas 48 h negalėjo sukelti akivaizdų iš Δ Ψ
m išaugintų SGC-7901 ląstelių (pav. 8a) kaita.

Jei spręsti, matyt, sumažėjo mitochondrijų kvėpavimą sukeltas karnozino, mes taip pat kiekybiškai absoliučią mitochondrijų DNR (mtDNA) numerį, kuris yra griežtai reguliuojamas, siekiant išlaikyti ląstelių energijos poreikius [22]. Mūsų nuostabai, rezultatai parodė, kad, lyginant su kontrolinės ląstelių absoliutūs MtDNA kopijuoti numeriai karnozino gydytų 7901 ląstelių buvo ženkliai padidėjo, o vidutinė absoliuti MtDNA kopijuoti numeriai buvo 141.49 ± 7.42 į kontrolinių ląstelių ir 360,0 ± 59.84 į karnozino gydomiems ląstelės (8b pav.).

Diskusijos

mūsų žiniomis, tai pirmas pranešimas bioenergetinį profilį išaugintų SGC-7901 ląstelių gydytų su ir be karnozino. Mūsų pagrindinės išvados yra taip. Pirma, Karnozinas sumažino dauginimosi pajėgumą SGC-7901 ląstelių. Antra, ląstelės išauginti DMEM (aukštas gliukozės), papildyti 2 mM piruvato padarė ~93% savo ATP naudojant OXPHOS. Trečia, Karnozinas darė savo antagonistinis poveikis SGC-7901 ląstelių proliferaciją per slopina glikolizės, OXPHOS ir mitochondrijų kvėpavimą ląstelių, ir šie karnozino veiksmai taip pat buvo rasta HepG2 ir C6 ląstelių. Taigi, Karnozinas turėtų būti laikomi kartu su augančia ginkluotės junginių įvairiuose etapuose vaistų kūrimo, kurie skirti auglio medžiagų apykaitą, vienas iš svarbiausių prabos naviko [23].

Dėl savo plataus spektro veikla, karnozino gali būti considerded kaip terapinė veiksnys daugelio ligų gydymui. Pavyzdžiui, cinko Karnozinas buvo naudojamas už skrandžio sveikatai ir dėl žarnų remonto [24]. Neseniai, tyrimai parodė, kad transformuotos ląstelės neišaugo MEM, kurių sudėtyje yra didelės koncentracijos karnozino, ir Karnozinas gali būti vartojamas kaip vaistas in vivo slopina piktybinių ląstelių [25] augimą. Tačiau, ji turėjo klausimas, ar Karnozinas gali užkirsti kelią žmogaus skrandžio naviko ląstelių augimą Be piktybinių ląstelių, kurios turi būti pranešama anksčiau. Šioje studijoje, mes nustatėme, kad Karnozinas taip pat gali slopinti išaugintų SGC-7901 ląstelių augimą nuo laiko ir koncentracijos susijusių būdu, o šis poveikis nebuvo lydi apoptozės ar nekrozė, tačiau gali būti, o sukelia sumažintas proliferacija. Tačiau išsamios mechanizmus, sukeliančius stabdantis poveikis karnozino ant SGC-7901 ląstelių proliferaciją vis dar neaišku.

Jis yra plačiai pripažįstama, kad metaboliniai pokyčiai yra vienas iš vėžio požymiai. Otto Warburg pirmasis aprašė padidėjusį panaudojimą anaerobinio metabolizmo tinkamos deguonies vėžio ląstelių, lyginant su jų normaliais kolegomis akivaizdoje vadinama "Warburg poveikį" [26]. Tačiau pastaruoju metu, tai buvo priminta, kad molekulinė nukreipimas iš OXPHOS gali turėti veiksmingumą pažangiosios melanomos, kurie Padidėjęs OXPHOS [14]. Taigi, skirtingų tipų auglių ant jų įvairių vystymosi stadijų turi savų medžiagų apykaitos savybes. Todėl, terapinės strategijos ir mechanizmai skirtingų auglių gydymui remiantis energetinio metabolizmo yra skirtingi. Šiame tyrime mes pirmą kartą panaudotas naujoviškas ekstratąsteiinę srauto technologiją įvertinti kelis parametrus mitochondrijų funkcijos ir tarpląstelinio rūgštėjimo norma lygiagrečiai su ATF koncentracijos nustatymo ištirti bioenergetinį apibūdinimą žmogaus skrandžio vėžio SGC-7901 ląstelių. Mūsų Seahorse analizė parodė, SGC-7901 ląstelės turi aktyviai mitochondrijas, ir priklauso nuo mitochondrijų OXPHOS daugiau nei glikolizės kelius kartos ATP Kultūra būklės, su dideliu gliukozės ir piruvato, tai rodo, kad mitochondrijų kvėpavimo gali būti potencialus terapinis taikinys žmogaus skrandžio vėžio.

Tačiau, kai ląstelės buvo auginamos piruvato DMEM stokos, jie priklauso nuo glikolizės daugiau nei, kad kultivuojamos pateikta su 2 mM piruvato DMEM, nes slopinimas glikolizės 2-DG, dėl kurių susidaro ~48 kritimo % ląstelių ATP turinį. Be to, šie duomenys taip pat rodo, kad SGC-7901 ląstelių tikriausiai trūksta plastiškumo pereinant iš glikolizės į mitochondrijų kvėpavimą, kai glikolitinės ATF gamyba panaikinta kultūros būklė energetikos medžiagų trūkumo. Kita vertus, Wu ir kt
. , pranešė, kad ten yra veiksminga kompensacinė ląstelę glikolizės po to, kai oligomycin blokuoti oksidacinis fosforilinimas vartojimu, ir tai atsakas buvo galima išlaikyti ATP lygį žmogaus nesmulkiųjų ląstelių karcinomai ląstelių linijų H460 ir A549 [15]. Mūsų rezultatai taip pat parodė, kad SGC-7901 ląstelės turi galimybę padidinti glikolizės kai mitochondrijų funkcijos yra užblokuotas oligomycin. Be to, kai mitochondrijų funkcija slopinama rotenono, veiksminga kompensacinė ląstelę glikolizės buvo accurred, o tai atsakymas buvo galima išlaikyti ATP lygį SGC-7901 ląstelių. Tačiau, ląstelės negali upregulate pakankamai glikolizę gebėjimą išlaikyti ATP lygį, kai atkabinimą mitochondrijų kvėpavimą nuo ATP sintezės sukeltos FCCP, (6 pav.). Todėl, Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelės turi didelę glikolizės ir mitochondrijų respartion pajėgumus, ir tai daro ląstelės augti įvairiomis sąlygomis.

Visai neseniai buvo įrodyta, kad Karnozinas sumažintas proliferaciją piktybine glioma kurį įtaka glikolitinės ir ATP sintezė [27]. Mūsų Šiame tyrime taip pat nustatyta, kad gydymas karnozino galėjo mažėja ekstratąsteiinę rūgštėjimo norma ir pieno rūgšties lygį, nurodant, kad Karnozinas turi antagonistinis poveikis glikolizės į SGC-7901 ląstelių. Tačiau Karnozinas padarė ne visiškai, bet iš dalies slopina glikolizės talpa ląstelių, nes farmakologinis slopinimas mitochondrijų kvėpavimą rotenono arba atkabinta mitochondrijų protonų gradientas nuo ATP gamybai FCCP arba gydomi rotenono ir FCCP vienu metu, ląstelės buvo dar galėtų į upregulate glikolizę kompensuoti ATP trūkumas (6 pav.). Įdomu tai, mes nustatėme, kad Karnozinas taip pat turi naujovišką vaidmenį kaip mitochondrijų kvėpavimo reguliatorius. Karnozinas slopino bazinių lygių mitochondrijų kvėpavimą, ir tai daugiausia lėmė sumažėjęs ATP susijęs kvėpavimo, nurodant, kad mitochondrijų ATP išvesties sumažėjęs karnozino gydytų SGC-7901 ląstelių.

• PLoS ONE: Helicobacter pylori nuo skrandžio vėžio ir dvylikapirštės žarnos opa Rodyti Tas filogeografinėse kilmės Andų regiono Kolumbijoje
• PLoS ONE: Veiksmingumas vertinimas Tarpinė suma ir bendra Gastrectomies į Robotų chirurgija skrandžio vėžiu, palyginti su atvirose ir laparoskopinės rezekcijos: metaanalizė