PLoS ONE: Co-toimitus doksorubisiinin ja SATB1 shRNA mukaan Lämpöherkkä magneettinen kationisia liposomeja mahasyövän Therapy

tiivistelmä

Aikaisemmissa tutkimuksessa, olimme kehittäneet uuden lämpöherkkä magneettinen jakelujärjestelmä perustuu liposomeihin. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida, kuinka tehokkaasti tämän järjestelmän yhteistyössä toimituksen sekä huumeita geenit samaan soluun ja sen anti-kasvain vaikutuksia syöpään. Doksorubisiini (DOX) ja SATB1 shRNA vektori ladattiin co-jakelujärjestelmä, ja in vitro DOX lämpöherkässä julkaisu toimintaa, kohdegeenin hiljentäminen tehokkuus, kohdennettu solun sisäänoton, in vitro sytotoksisuutta, sekä in vivo antituumorivaikutuksen määritettiin. Tulokset osoittivat, että tämä yhteistyö jakelujärjestelmä oli toivottava täsmäannostelujärjestelmiä tehoa, DOX lämpöherkkä vapautuminen ja SATB1 geenien. Lisäksi yhteistyössä toimituksen DOX ja SATB1 shRNA osoittivat parannettu inhiboida mahan syöpäsolun kasvua in vitro ja in vivo, verrattuna yhden toimituksen. Johtopäätöksenä romaani lämpöherkkä magneettinen huumeiden ja geeni yhteistyössä jakelujärjestelmä on lupaava sovellus yhdistetään kemoterapiaa ja geeniterapian mahasyövän.

Citation: Peng Z, Wang C, Fang E, Lu X, Wang G, Tong Q (2014) Co-toimitus doksorubisiinin ja SATB1 shRNA mukaan Lämpöherkkä magneettinen kationisia liposomeja mahasyövän Therapy. PLoS ONE 9 (3): e92924. doi: 10,1371 /journal.pone.0092924

Editor: Elena A. Rozhkova, Argonne National Laboratory, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 joulukuu 2013; Hyväksytty: 26 helmikuu 2014; Julkaistu: 27 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Peng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81172186). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljäs yhteinen syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Vuonna 2008 oli noin 989000 uutta tapausta mahasyövän ja 738000 kuoleman maailmassa joka pääasiassa tapahtui idässä, Etelä-ja Keski-Aasiassa; Keski- ja Itä-Euroopassa; ja Etelä-Amerikka [2], [3]. Kiinassa, mahasyöpä on kolmanneksi yleisin syöpä arvioitu 380000 uutta tapausta ja korkein kuolleisuus noin 26,3 prosenttia väestöstä 100000 vuosittain [4], [5]. Kirurginen resektio on yhteinen parantava vaihtoehto, mutta se ei sovellu useimmille potilaille, jotka ovat myöhäisessä vaiheessa syöpään. Muita hoitomuotoja, kuten sädehoidon ja kemoterapia näyttää jonkin verran tehoa, mutta ovat usein epätyydyttäviä [4], [6]. Lisäksi systeeminen kemoterapian aiheuttaa haittavaikutuksia [7], [8].

Koska lääkeresistenssin kehittymisen kemoterapiaa, perinteinen kemoterapia on myös esillä rajoitettu antituumoriteholla [9]. Näin ollen, multi-aine co-jakelujärjestelmä on saanut enemmän huomiota viime aikoina, koska se voi antaa erilaisia ​​aineita samalla kasvainsolujen sitten synergistisiä antituumorivaikutuksia. Esimerkiksi kaksi erilaista kemiallisia aineita voidaan yhdistää tai kemiallinen aine voidaan yhdistää Sirna (siRNA) vastaan ​​onkogeeni. Lisäksi täsmäannostelujärjestelmiä ja lääkeaineiden annostelemiseksi voidaan edelleen parantaa antituumorivaikutuksia ja vähentää haitallisia vaikutuksia.

Special AT-rikas sitova proteiini (SATB1) on maailmanlaajuinen chromatin järjestäjä, joka säätelee geenien ilmentymistä ja osallistuu modulaatio pahanlaatuisten biologista käyttäytymistä syöpä [10]. Poikkeava ekspressio SATB1 on osoitettu edistää rintasyövän, keuhkosyövän ja lymfooma [11] - [13]. Meidän aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että SATB1 on tärkeä rooli mahasyövän, ja se voi olla riippumaton prognoosimarkkerina mahasyövän [14], [15]. Ilmentymisen estämiseksi SATB1 toimittamalla siRNA tai plasmidi, joka koodaa tiettyä häiritsevän lyhyt HARPIN RNA (shRNA) vastaan ​​SATB1 voi estää proliferaatiota ja invaasio, ja edistää kasvainsolujen apoptoosin [16], [17]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että SATB1 on potentiaalinen terapeuttinen kohde mahasyövässä.

spekuloida, että yhdistelmä geeniterapian ja kemoterapia voitaisiin parantaa huomattavasti terapeuttista tehoa vastaan ​​mahasyövässä. Aiemmissa tutkimuksessa kehitimme kohdennettuja lämpöherkkä yhteistyössä jakelujärjestelmä perustuu lämpöherkän magneettinen kationisia liposomeja (TSMCL). By calcein vapautumisen määrityksellä, olimme optimoitu lämpöherkän liposomiformulaatiota, ja sitten mitataan magneettiset ominaisuudet ja geenikuljettimia tehokkuutta TSMCL. Tässä tutkimuksessa olemme ladattu doksorubisiinin ja SATB1-shRNA vektori tämän järjestelmän yhdistelmä geeniterapian ja kemoterapia, ja arvioitiin niiden synergistinen antituumorivaikutuksen vastaan ​​mahasyövän in vitro ja in vivo.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Kolesteroli, 1,2-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-fosfokoliinia (DPPC), ja 3β- [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) karbamoyyli] kolesteroli (DC-Chol) hankittiin Avanti Polar Lipids (USA). Dimetyylidioktadekyyliammoniumbromidi (DOAB) saatiin Sigma-Aldrich (USA). Magnetic Fluid Fe _{3 O 4 syntetisoitiin Galaxy Nanotech (Kiina). FAM merkitty siRNA ja plasmidi pGFP-SATB1 shRNA toimittivat GenePharma (Shanghai, Kiina). Doksorubisiini ostettiin Hisun Pharmaceutical (Zhejiang Kiina). Naudan sikiön seerumia (FBS), kulttuuri media, penisilliiniä /streptomysiiniä (PEST) ja trypsiini toimitettiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). SATB1 kani monoklonaalinen vasta-aine oli peräisin Epitomics (Abcam, UK). Kaikki muut kemikaalit olivat kaupallisia analyysilaatua ja käytettiin ilman lisäpuhdistusta.}

valmistus co-jakelujärjestelmä

Tämä yhteistyö jakelujärjestelmä perustui lämpöherkän kationisia liposomeja, jotka on laadittu lämpöherkällä kationiset muotoilussa DPPC, DC-kolesteroli, DOAB ja kolesteroli moolisuhteessa on 80:5:5:10 optimoida alustavien kokeiden. Liposomit (TsCI), valmistettiin ohut kalvo nesteytys menetelmällä, jota seuraa ekstruusiolla [18]. Ammoniumsulfaatti gradienttia menetelmää käytettiin lataamaan DOX osaksi TsCl (TsCI-DOX). Valmistella magneettinen liposomien (TSMCL), magneettista nestettä Fe _{3 O 4 käytettiin ydin ja yhteistyössä kapseloitu ammoniumsulfaatilla puskurilla liposomeihin. Muodostamisen jälkeen ohuen kalvon pyöreäpohjaisessa pullossa, yksi millilitra keskeyttäminen raudan ja ammoniumsulfaattia lisättiin hydraatti elokuva, ja ekstrudoitiin sitten polykarbonaatti suodattimien ja täynnä DOX (TSMCL-DOX), jonka ammoniumsulfaattigradientilla menetelmä . Lopuksi tuotteet geelisuodatuksella sentrifugoitiin 1000 g: ssä 15 min poistamiseksi kapseloimattoman Fe 3O 4.}

pGFP-SATB1-shRNA (shSATB1) vektori inkuboitiin eri liposomien seerumivapaassa huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan, valmistamiseksi TsCI-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1, TSMCL-shSATB1 ja TSMCL-DOX-shSATB1, vastaavasti.

määritys zeta-potentiaalilla, hiukkaskoko, ja polydispersiteetti

keskimääräinen hiukkaskoko ja polydispersiivisyys partikkelikokojakauma liposomien määritettiin 25 ° C: dynaamisella valonsironta käyttäen ZetaPALS hiukkasen koon väline (Brookhaven Instruments Corporation, USA). Zeta-potentiaali liposomaalisen dispersioiden mitattiin samalla laitteella 25 ° C: ssa, jonka elektroforeettinen liikkuvuus.

määritys doksorubisiinia tehokkuuden

DOX konsentraatio liposomeissa mitattiin fluorimetriä ( Perkin Elmer, USA) 485 nm: n virityksellä ja 590 nm: n emissio suodattimia laimennussarjaan vapaa DOX kuin vakio. DOX ladattu tehokkuus laskettiin DOX pitoisuus.

Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria (DSC) B

DSC suoritettiin arvioimaan thermosensitivity liposomien määrittämällä faasimuutoslämpötilan (Tm). Tm arvioitiin käyttäen nano DSC (TA Instruments, USA) kuumennusnopeudella 20 ° C /h, 20 mg /ml fosfolipidiä.

In vitro lämpöherkän DOX vapautumisen määrityksellä

20 ui DOX liposomit inkuboitiin 1 ml: ssa PBS: ää ja PBS: ään 50% naudan sikiön seerumia (FBS), joka jäljittelee in vivo ympäristössä erikseen Eppendorf-putkiin. Näytteitä kuumennettiin vesihauteessa 37 ° C: ssa ja 42 ° C: ssa 1 h, vastaavasti. Sitten fluoresenssin voimakkuus DOX mitattiin fluorometrillä (Perkin Elmer, USA) käyttäen 485 nm: n virityksellä ja 590 nm emissio suodattimia. 100% vapautuminen, näytteitä inkuboitiin 1 ml: ssa PBS: ää, 1% Triton X-100 1 min. DOX julkaisu prosentit laskettiin seurasi: missä F _{s oli fluoresenssi näytteiden lämmityksen jälkeen, F 0 on alkuperäisen fluoresenssi näytteiden ennen kuumennusta, ja F 100 oli fluoresenssi käsitellyt näytteet Triton X-100.}

Soluviljely

Ihmisen mahalaukun adenokarsinoomaa MKN-28-solulinja hankittiin Keygen Biotech (Nanjing, Kiina) ja viljeltiin korkean glukoosin DMEM täydennetty 10% FBS, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO _{2 37 ° C: ssa.}

in vitro transfektion

MKN-28-solut ympättiin 12-kuoppaisille levyille tiheydellä 4 x 10 ^{5 solua /kuoppa ja kasvatettiin yön yli noin 80% konfluenssin. Seuraavana päivänä solut pestiin kahdesti esilämmitetyllä PBS: llä, sitten TsCI-shSATB1 ja TSMCL-shSATB1 lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 6 tuntia. Soluja inkuboitiin TSMCL-shSATB1 oli sijoitettu 12-hyvin magneettisen levyn ensimmäisten 30 min tarjota magneettikenttä. Seuraavaksi inkuboinnin väliaine korvattiin DMEM: llä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, ja soluja inkuboitiin 24 tuntia. GFP: n ilmentymisen taso arvioitiin alla fluoresenssimikroskoopilla (Nikon 80i) ja -virtaussytometrissä (BD FACS Canto II).}

Reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) B

Kokonais-RNA eristettiin mistä MKN-28-soluissa käyttämällä TRIzol valtionhoitaja (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden, ja cDNA syntetisoitiin käyttämällä PrimeScript RT Master MIX (Takara, Dalian). PCR suoritettiin käyttäen SYBR Esisekoite Ex Taq II (Takara, Dalian) on StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). Sekvenssit alukkeet olivat seuraavat: SATB1 sense 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 ', ja antisense 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3' GADPH sense 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 ', ja antisense 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3'. SATB1 mRNA-tasolla on normalisoitu GAPDH.

Western blot-analyysi

MKN-28-solut kerättiin ja lyysattiin RIPA-puskurissa. Supernatantit kerättiin sen jälkeen sentrifugoimalla 10000 g 10 minuutin ajan. Proteiinipitoisuus supernatantissa määritettiin käyttäen BCA Protein Assay Kit. Sitten 40 ug näytteet ajettiin 15% SDS-PAGE: lla ja proteiinit siirrettiin PVDF-membraaneille. Seuraavaksi membraaneja inkuboitiin 5% rasvatonta maitoa 1 h estää ei-spesifinen sitoutuminen, ja sitten niitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa SATB1 tai β-aktiini-vasta-aine (1:500 laimennus). Sitten membraanit tutkittiin HRP-konjugoitua vuohen anti-kani sekundääristä vasta-ainetta 30 minuutin ajan. Lopuksi kalvot visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi-järjestelmä (ECL, Pierce) ja valotettiin röntgenfilmille.

arviointi in vitro soluunottoa

arvioimiseksi solunsisäisen sijainnin toimitetaan DOX ja pGFP-SATB1 shRNA ja parannettu tunkeutuminen liposomit mahalaukun syövän solujen magneettinen kohdistettuja, FAM leimattua siRNA (vihreä fluoresenssi) käytettiin jäljitellä pGFP-SATB1 shRNA, ja DOX yksinään hallussaan instinct punaisen fluoresenssin seuraamiseksi soluunottokokeissa . MKN-28-soluja ympättiin 12-kuoppaiseen levyyn 4 x 10 ^{5 solua /kuoppa ja kasvatettiin yön yli. Sitten soluja inkuboitiin free siRNA, TsCI-siRNA, TSMCL-siRNA, TsCI-DOX, TSMCL-DOX, TsCI-DOX-siRNA tai TSMCL-DOX-siRNA: ssa 6 tuntia. Magneettisten liposomit, maljat, joka on sijoitettu 12-kuoppaiselle magneettisen levyn ensimmäisen tunnin aikana inkuboinnin jälkeen. Solut visualisoitiin fluoresenssin mikroskoopilla paikantaa fluoresoivat leimat DOX ja siRNA. Tumat värjättiin DAPI (sininen fluoresenssi).}

MTT-määritystä

MKN-28-solut ympättiin tiheydellä 2 x 10 ^{4 solua /kuoppa 96-kuoppalevyille ja kasvatettiin yön yli. Sitten soluja inkuboitiin eri liposomien 37 ° C: ssa 2 h CO _{2-inkubaattorissa. Magneettisten liposomit, levyt asetettiin 96-kuoppaiselle magneettisen levyn ensimmäisen 1 h inkuboinnin jälkeen. Seuraavaksi solut pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin 46 h tuoretta väliainetta. Sen jälkeen solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT-määrityksellä. Väliaine kussakin kuopassa korvataan 20 ui MTT-liuosta (Sigma-Aldrich, USA) ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa, sitten supernatantit heitettiin pois ja formatsaanikiteet liuotettiin 200 ui DMSO: ta. Levyt mitattiin 490 nm: ssä mikrolevylukijalla, ja solujen elinkyky laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti:}}

Virtaussytometria

Apoptoosi detektoitiin käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (eBioscience, USA). MKN-28-solut ympättiin 12-kuoppalevyille ja käsitelty edellä kuvatulla tavalla. 24 tunnin kuluttua solut kerättiin, pestiin kahdesti PBS: llä ja suspendoitiin 500 ui sitomispuskuria. Seuraavaksi solut kaksinkertainen värjättiin anneksiini V-FITC ja propidiumjodidilla (PI). Solut alkuvaiheen apoptoosin värjättiin anneksiini V-FITC mutta ei värjättiin PI kvantitoitiin virtausta cytometery.

Vieraslajisiirteen hiirimallissa

Viisi kuuden viikon ikäisiä Balb /c nude-hiirissä olivat antamat Center for Animal Experiments Tongji Medical College. Kukin hiiri ympättiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen 5 x 10 ^{6 MKN-28 soluihin. Useita viikkoja tuumorin istuttamisen jälkeen, 36 kasvaimen kantavaa hiirtä jaettiin satunnaisesti kuuteen ryhmään (n = 6). Hiiriin injektoitiin häntälaskimoon vapaa DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1, TSMCL-DOX-shSATB1 tai normaalia suolaliuosta kontrollina. Annoksen DOX oli 2,5 mg /kg ja että pGFP-SATB1 shRNA oli 10 ug hiirtä kohti. Hoito annettiin kerran joka 3 päivä ja tuumorin koko mitattiin kautta calipering ja sitten kasvaimen tilavuus voidaan laskea seuraavalla kaavalla: tilavuus = (D _{Min) 2 x D max /2, jossa D Max oli pisin kasvaimen halkaisija ja D Min oli lyhin. Sillä TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 ja TSMCL-DOX-shSATB1, magneettinen kohdentaminen saatiin aikaan käyttämällä jatkuvaa ulkoista magneettikenttää 5000 Gauss 30 min keskittyen kasvaimeen lääkkeen antamisen jälkeen. Kaikki kokeet hyväksynyt eettinen komitea Tongji Medical College ja kaikki eläimet käsiteltiin inhimillisesti mukaan Institutional Animal Care ja Käytä komitean ohjeiden.}}

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (SD). Tilastollista merkitsevyyttä eri ryhmien välillä arvioitiin Studentin t-testiä ja yhden tekijän varianssianalyysi (ANOVA). Sillä elinaika eläinten, Kaplan-Meier -käyrät kunkin ryhmän perustettiin ja log rank testi suoritettiin vertaamaan eloonjäämisaste. p < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

karakterisointi liposomien

Kuten on esitetty taulukossa 1, halkaisija TsCI oli 83,6 ± 5,7 nm, kun taas TsCl -DOX nostettiin 118,5 ± 7,9 nm johtuen kapselointi DOX. Samaan aikaan halkaisijat TsCI-shSATB1 ja TsCI-DOX-shSATB1 lisättiin merkittävästi 161,1 ± 11,8 nm ja 238,1 ± 20,6 nm, vastaavasti, koska tartunta- ja fuusio plasmidi-DNA liposomeihin. Magneettisten liposomit, hiukkaskoot TSMCL, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 ja TSMCL-DOX-shSATB1 olivat 135,0 ± 11,6 nm, 157,2 ± 14,3 nm, 221,3 ± 15,7 nm ja 319,4 ± 20,1 nm, vastaavasti, merkittävästi suurempi kuin TsCliää, TsCI-DOX, TsCI-shSATB1 ja TsCI-DOX-shSATB1 takia loukkuun magneettisen nanohiukkasia. Lisäksi koko TSMCL-shSATB1 ja TSMCL-DOX-shSATB1 oli merkittävästi suurempi kuin TSMCL ja TSMCL-DOX, vastaavasti (p < 0,05). Kaikki liposomit oli kapea kokojakauma, koska niiden Polydispersiivisyys ei ollut enempää kuin 0,3.

Zeta potentiaali TsCliää, TsCI-DOX, TsCI-shSATB1 ja TsCI-DOX-shSATB1 oli 52,0 ± 7,3 mV, 50,1 ± 7,7 mV, 31,3 ± 5,2 mV ja 26,7 ± 4,5 mV, tässä järjestyksessä. Inkuboinnin jälkeen pGFP-SATB1- shRNA, pintavarausten väheni merkittävästi (p < 0,05), koska sähköstaattisen vuorovaikutuksen kationisten lipidien ja plasmidi-DNA. Kuitenkin loukkuun magneettisten nanohiukkasten ei johtanut merkittävää laskua Zeta potentiaalia magneettinen liposomeihin.

DOX ladattu tehokkuus, DOX kapseloidaan oli 89 ± 3% ja 78 ± 8% (n = 3) ja TsCI-DOX ja TSMCL-DOX, vastaavasti, ja se oli 85 ± 7% ja 73 ± 9% (n = 3) ja TsCl: a-DOX-shSATB1 ja TSMCL-DOX-shSATB1, vastaavasti. Nämä tiedot osoittavat, että vuorovaikutus liposomit ja plasmidi ei aiheuttanut DOX vuotoa.

Euroopan thermosensitivity liposomien

differentiaalisella pyyhkäisykalorimetrialla suoritettiin määrittämään faasinmuutoslämpötila TsCI. Kuten on esitetty kuviossa. 1, TsCI koostuu DPPC, DC-kolesteroli, DOAB ja kolesteroli moolisuhteessa of 80:5:5:10 oli Tm 40,8 ° C: ssa suhteellisen laajempi siirtyminen huippu, joka voi olla fuusio siirtymisen huippu DPPC ja DOAB .

in vitro lämpöherkkä DOX vapautumisen liposomeista

Kuten kuviossa. 2, DOX vapautumisnopeus TsCI-DOX ja TSMCL-DOX oli vain 12% ja 16% inkuboinnin jälkeen PBS: llä 37 ° C: ssa, ja nousi 20% ja 19% sen jälkeen, kun oli inkuboitu 50% FBS: ää, vastaavasti. Sillä TsCI-DOX-shSATB1 ja TSMCL-DOX-shSATB1, DOX vapautumisnopeus oli 12% ja 15% inkuboinnin jälkeen PBS: llä 37 ° C: ssa, ja oli sekä 16% sen jälkeen, kun oli inkuboitu 50% FBS: ää, mikä osoittaa, että sisällyttäminen plasmidi oli ole merkittävää vaikutusta vakauteen liposomien (p > 0,05).

DOX vapautumisnopeus TsClrää-DOX ja TSMCL-DOX nostettiin 37% inkuboinnin jälkeen PBS: llä 42 ° C: ssa, ja nousi 45% ja 49% sen jälkeen, kun oli inkuboitu 50% FBS: ää, vastaavasti. Sillä TsCI-DOX-shSATB1 ja TSMCL-DOX-shSATB1, DOX vapautumisnopeus oli 35% ja 43% inkuboinnin jälkeen PBS: llä ja FBS: llä 42 ° C: ssa, vastaavasti, sekä merkittävästi korkeampi kuin 37 ° C (p < 0,05). Nämä tulokset osoittavat, että TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCI-DOX-shSATB1 ja TSMCL-DOX-shSATB1 on toivottavaa thermosensitivity, ja voitaisiin käyttää hypertermian laukaisi kontrolloitua vapautumista DOX.

hiljentäminen of SATB1 ilmentymisen MKN-28-soluja, jotka on transfektoitu liposomien

Seuraavaksi arvioitiin tehokkuuden liposomien toimittaa shSATB1 vektori MNK-28-soluissa. Tyypillisiä fluoresenssi kuvia transfektoitujen solujen TsCI-shSATB1 ja TSMCL-shSATB1 oli kuviossa. 3A. Virtaussytometrillä analyysi osoitti, että transfektion tehokkuus TsCI-shSATB1 oli vain 15,4 ± 0,15%. Sen jälkeen, kun sovellus magneettikentän ohjauksen, transfektiotehokkuus TSMCL-shSATB1 oli 34,3 ± 0,93%, huomattavasti suurempi kuin TsCl-shSATB1 (Fig. 3B).

Sen määrittämiseksi, onko toimitetun shSATB1 vektori voisi välittää vaiennettu SATB1 ilmentymisen MKN-28-solut, suoritimme reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR ja Western blot-analyysi. Tulokset osoittivat, että sekä SATB1 mRNA: ta ja proteiinia alenivat transfektoiduissa soluissa TsCI-shSATB1 ja TSMCL-shSATB1 verrattuna kontrollisoluihin. Lisäksi TSMCL-shSATB1 avulla magneettikenttä oli voimakkaampi kuin TsClrää-shSATB1 estävän SATB1 ilmentymisen MKN-28-soluissa (kuvio. 3C, D).

Magneettinen kohdennettua in vitro soluunottokokeissa

verrata läpivientien soluihin välillä ei-magneettinen ja magneettiset liposomien soveltamisesta magneettisen erityistä ohjausta, sekä solunsisäinen sijainti toimitetaan DOX ja shSATB1, FAM-leimattua siRNA käytettiin indikaattorina. Koska vihreän fluoresenssin käsitellyissä soluissa Vapaa siRNA osoitti, että se ei voi tunkeutua soluihin (tietoja ei ole esitetty). Havaitsimme, että enemmän soluja käsiteltiin TSMCL-siRNA näytteillä vihreän fluoresenssin kuin soluja käsiteltiin TsCl-siRNA (Fig. 4A). Lisäksi enemmän soluja käsiteltiin TSMCL-DOX osoitti punaisen fluoresenssin kuin soluja käsiteltiin TsCl-DOX (Fig. 4B). Soluissa käsitelty TSMCL-DOX-siRNA, korkean fluoresenssin intensiteetti havaittiin, ja solut näyttivät vaaleanpunainen johtuen sulauttaminen sininen, punainen ja vihreä väri (Fig. 4C). Nämä havainnot viittaavat siihen, että TSMCL on voimakkaampi toimittamisessa siRNA ja DOX soluihin kuin TsCl, soveltamisen jälkeen magneettikentän.

Lisäksi tutkimme solunsisäistä sijainti toimitettujen DOX ja siRNA. Punainen fluoresenssi havaittiin sekä tumaan ja sytoplasmaan, mikä osoittaa, että toimitettu DOX sijaitsevat sekä tumaan ja sytoplasmaan. Sen sijaan, vihreän fluoresenssin pääasiassa esiintyi sytoplasmassa, mikä viittaa siihen, että siRNA: t jaettiin sytoplasmaan (Fig. 4D). Yhdistäminen punaista ja vihreää ilmestyi keltainen sytoplasmassa, ja yhdistäminen sininen ja punainen ilmestyi laventeli tumissa. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että sekä TsCI ja TSMCL voi tunkeutua mahasyövän soluihin ja antaa niiden sisällön sytoplasmaan (DOX ja siRNA) ja ytimet (DOX).

In vitro anti-kasvain vaikutukset liposomit

arvioitiin in vitro antituumorivaikutuksia tämän yhteistyön jakelujärjestelmä sytotoksisuuden ja apoptoosin induktio toimintaa. Sytotoksisuuden liposomien arvioitiin MTT-määrityksellä. Vaikutusten määrittämiseksi DOX ja plasmidi-pitoisuuksien vaikutusta sytotoksisuuteen liposomien, tutkimme liposomit ladattiin eri pitoisuuksia DOX ja eri määriä SATB1 shRNA. Kun lisäys DOX pitoisuuden, sytotoksisuus liposomien lisättiin (Fig. 5A). Kuitenkin lisäämällä SATB1 shRNA keskittyminen ei johtanut lisääntyneeseen sytotoksisuuteen, ja siellä oli vain lisätä hieman sytotoksisuuden kun SATB1 shRNA pitoisuus oli noin 4 ug (Fig. 5B). Siten käytimme 25 uM DOX ja 4 ug SATB1 shRNA verrata sytotoksisuuden joukossa Free DOX, vapaa shRNA, TsCI, TSMCL, TsCI-DOX, TSMCL-DOX, TsCI-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1 ja TSMCL- DOX-shSATB1.

Kuten kuviossa. 5C, vapaa shRNA, TsCI ja TSMCL oli vähän sytotoksisuutta. Solujen elinkelpoisuus oli 40,3 ± 3,4%, 73,6 ± 3,5% ja 51,3 ± 4,5% ilmaiseksi DOX, TsCI-DOX ja TSMCL-DOX, vastaavasti, mikä viittaa siihen, että sytotoksisuus TSMCL-DOX oli suurempi kuin TsCl-DOX, mutta pienempi kuin vapaa DOX . Solujen elinkelpoisuus oli 79,2 ± 6,9% ja 71,6 ± 4,7% TsClrää-shSATB1 ja TSMCL-shSATB1 vastaavasti ilman pienintäkään tilastollinen merkitystä (p > 0,05). Huumeiden ja geenin co-toimitus, solujen elinkelpoisuus oli vain 35,0 ± 3,2% ja 22,3 ± 3,4% TsCI-DOX-shRNA ja TSMCL-DOX-shRNA, vastaavasti, merkittävästi pienempi kuin vapaa DOX, TsCI-DOX, TSMCL- DOX ja SATB1shRNA ladatut liposomit (p < 0,05). Lisäksi, solujen elinkelpoisuuden TSMCL-DOX-shRNA oli merkittävästi alhaisempi kuin TsCI-DOX-shRNA (p < 0,05). Nämä tulokset viittaavat siihen, että synergistinen sytotoksisuus vaikutus saavutetaan yhdessä tuottaa DOX ja SATB1 shRNA. Lisäksi soveltamisessa magneettisen kohdennettujen, joka on entisestään sytotoksisuus voidaan saavuttaa.

Voit selvittää muita kasvaimen vastaisen mekanismi lisäksi sytotoksisuus yhteistyössä jakelujärjestelmä, tutkimme apoptoosin määrä MKN-28 solut, joita käsiteltiin Vapaa DOX, TsCI-DOX, TSMCL-DOX, TsCI-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1 ja TSMCL-DOX-shSATB1 virtaussytometrialla. Kuten osoitti kuvassa. 5D, apoptoosin oli 22,3% soluissa käsitelty vapaa DOX, oli 8,9% soluissa, joita käsiteltiin TsCl-DOX, mutta nousi 13,4% soluissa, joita käsiteltiin TSMCL-DOX ja magneettikenttä. Samoin apoptoosin oli 9,4% soluissa, joita käsiteltiin TsCl-shSATB1, mutta nousi 17,4% käsitellyissä soluissa TSMCL-shSATB1 ja magneettikenttä. Sen sijaan apoptoosi oli 27,7% käsitellyissä soluissa TsCI-DOX-shSATB1, korkeampi kuin soluissa, joita käsiteltiin TsCI ladattu DOX tai shSATB1 yksin. Apoptoosi oli 32,4% käsitellyissä soluissa TSMCL-DOX-shSATB1, korkein kaikissa ryhmissä. Nämä tulokset osoittavat, että co-tuottaa DOX ja SATB1 shRNA johtaa yhdistetyt vaikutukset apoptoosin. Sanalla sanoen, tämä yhteistyö jakelujärjestelmä esittelee vahva antituumorivaikutuksia in vitro.

In vivo antituumorivaikutuksen liposomien

Sen määrittämiseksi in vivo antituumorivaikutus on co-jakelujärjestelmä, loimme MKN-28 hiiren ksenograftimalleja ja pistetään vapaa DOX, TSMCL-DOX, TSCML-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1 tai TSMCL-DOX-shSATB1 hiiriin kautta häntälaskimoon. Hoito annettiin kerran joka 3 päivä, ja kasvaimet leikeltiin (Fig. 6A). Päivänä 15, kasvaimen tilavuus oli 0,44 ± 0,05 cm ^{3 hiirillä, joille TSMCL-DOX-shSATB1, merkittävästi pienempi kuin suolaliuoksella ryhmässä (2,14 ± 0,23 cm 3), vapaa DOX ryhmä (1,08 ± 0,13 cm 3), TSMCL-DOX ryhmä (0,68 ± 0,10 cm 3), TSCML-shSATB1 ryhmä (1,43 ± 0,21 cm 3), ja TsCI-DOX-shSATB1 ryhmä (0,77 ± 0,12 cm 3) (Fig. 6B).}

Lisäksi, kuten on esitetty kuviossa. 6 (C), mediaani aika kasvaimen tavoittaa 2 cm ^{3 oli 30 päivää TSMCL-DOX-shSATB1 ryhmä, pitempi kuin suolaliuoksella ryhmässä, vapaa DOX ryhmä, TSMCL-DOX ryhmä, TSCML-shSATB1 ryhmä ja TsCI-DOX-shSATB1 ryhmä (Fig. 6C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että yhteistyö tuottaa DOX ja shSATB1 mukaan TSMCL synergistinen anti-kasvain vaikutus in vivo.}

Keskustelu

Huolimatta viimeaikainen kehitys leikkaus, sädehoito ja kohdistaa hoito, kemoterapia vielä yksi tärkeä lähestymistapoja mahalaukun syövän hoidossa. Kuitenkin terapeuttiset vaikutukset kemoterapia ovat usein tyytymätön ja ei merkittävästi parantaa ennustetta syöpäpotilaiden [19]. Yksi tärkein syy on kasvaimen kehittymisen ja etenemisen mahasyövän liittyy erilaisia ​​mekanismeja; yhtenäinen anti kasvain mekanismi perinteinen kemoterapia on rajoittanut niiden terapeuttiset vaikutukset, mikä yhdistelmä kemoterapiaa geeniterapiaan voi parantaa antituumorivaikutuksia. Toinen este kemoterapia on, että lääkeaineen systeemisen annon johtaa rajoitetun lääkepitoisuus tuumorikohdat taas aiheuttaa monia kielteisiä vaikutuksia [8]. Avain näiden ongelmien ratkaisemiseksi perustuu uusien tapojen lääkeannostelun siis kehittämällä kohdennettuja multi-aineita tuottaa järjestelmä, joka voidaan suoraan ohjata tuumoripaikkaan ohjattu vapautuminen voi ratkaista nämä ongelmat ja parantaa terapeuttisia vaikutuksia [20] - [25] .

joukossa eri lääkkeen jakelujärjestelmät, liposomit ovat lupaavimpia hyvälle biocompatibilities jotka aiheuttavat vähän tai ei ollenkaan antigeenisiä, allerginen, ja toksisia reaktioita, ja helposti läpi biologista hajoamista. Koska sekä huumeiden ja geenin kantajia, liposomeja voidaan ei ainoastaan ​​suojata isäntää ei-toivottuja vaikutuksia kapseloidun lääkkeen, mutta myös estää suljetun sisällön ennenaikaisen inaktivoitumisen fysiologisessa väliaineessa [26]. Lisäksi liposomi on mahdollisesti kohdistuva lääkkeiden jakelujärjestelmä, onko se saavutetaan parannettu läpäisevyys ja säilyttäminen (EPR) vaikutus (Passive kohdennettu), tai magneettikenttä ohjausta ja immuuni yhteys (Active kohdennettu) [27]. Lisäksi jotkut liposomit hallussaan kontrolloitua laukaisi lääkeaineen vapautumista ominaisuuksia, kuten lämpö herkkyys, pH herkkyys ja mikroaaltouuni herkkyys.

Viimeksi olimme kehittäneet uuden magneettisen kohdennettu lämpöherkkä huumeiden ja geeni yhteistyössä jakelujärjestelmä (TSMCL). Perustuu elektroneutraaleja lämpöherkän formulaation (DPPC:Cholesterol = 80:20), meillä oli lisätty erilaisia ​​kationisia komponentteja ja optimoitu thermosensitivity liposomien calcein vapautumisen määrityksellä. Tulokset oli ilmoittanut, että voisimme saada toivottava thermosensitivity korvaamalla 10 mol osaa Kolesteroli on 5 mol osaa DC-kolesteroli ja 5 mol osaa DOAB (DPPC:DC-Cholesterol:DOAB:Cholesterol = 80:5:5:10), ja calcein vapautuminen liposomeista olisi pienempi 37 ° C, mutta merkitsevä korkeampi 42 ° C tässä formulaatiossa. Seuraavaksi Magnetic nesteen Fe _{3 O 4 oli käytetty ydin ja toimineet magneettiset kohdentamista ja lämmitys lähde TSMCL. Tärisevä Näyte magnetometri (VSM) mittaus oli ilmoittanut, että magneettinen neste Fe 3 O 4 oli superparamagneet-, mikä TSMCL olisi hyvä magneettinen epäsuorat vaikutukset. Samaan aikaan, ajasta riippuvainen lämpökäyrä oli myös osoittanut, että magneettinen neste Fe 3O 4 ja TSMCL voidaan kuumentaa 25 ° C: sta 42 ° C: seen 20 minuutin kuluessa. Avulla Magnetic nesteen Fe 3 O 4, sekä magneettinen kohdistaminen ja lämpötilaliipaistu lääkeaineen vapautumista TSMCL voisi toteutua. Lopuksi sekä TsCI ja TSMCL oli näytteillä tyypillinen liposomaalisen morfologioita ja hyvä jaettavissa oleviin TEM. Perustuu onnistuneen rakentamisen TSMCL, tässä tutkimuksessa ladattu DOX ja SATB1 shRNA vektori TSMCL tehdä TSMCL-DOX-shSATB1 ja arvioitiin kasvaimen vastainen vaikutus vastaan ​​mahalaukun syövän solujen kasvua in vitro ja in vivo.}

DOX on yleisesti käytetty huume kemoterapiassa korkea hyötysuhde estävän kasvainsolujen proliferaatiota ja indusoi tuumorisolun apoptoosia, mutta sen terapeuttiset vaikutukset rajoittuvat aiheuttamien vakavien kardiotoksisuuden ja myelosuppression kun ylläpitäjä systeemisesti [28]. Vaikka DOX liposomit ovat osittain parantaneet tilannetta, puuttumista täsmäannostelujärjestelmiä edelleen limites niiden hyödyntäminen [29]. SATB1 on maailmanlaajuinen chromatin järjestäjä, joka suoraan säätelee ilmentymistä ERRB2, MMP2, ABL1 ja E-kadheriinin, joka toimii keskeinen säätelijä syövän kehittymisen [30]. N yli-ilmentyminen SATB1 eri kasvaimissa on liittynyt pahanlaatuinen biologista käyttäytymistä kuten invaasio, proliferaatio ja etäpesäkkeiden [10] - [13]. Hiljentäminen SATB1 ilmentymisen Sirna (siRNA) tai plasmidilla, joka koodaa lyhyen HARPIN RNA (shRNA) voi estää, lisääntymistä, invaasiota ja etäpesäkkeiden, ja indusoida eri kasvainsolujen [16], [17]. Näin ollen, SATB1 tulee potentiaalinen kohde syövän hoidossa [30]. Kuitenkin tarkoituksenmukaista toimitus vektorit siRNA tai shRNA ovat tärkeitä SATB1 kohdennettuja syövän geeniterapia.

Tässä tutkimuksessa käyttäen TSMCL-DOX-shSATB1 järjestelmä, sekä DOX ja SATB1 shRNA vektori voidaan ohjata kasvaimen magneettisella jätetty ohjausta, ja DOX vapautuu lämmönnousua laukaisi tavalla. Hypertermia laukeaa vapautuminen on riippuvainen lämpöherkkä liposomeja, jotka koostuvat pääasiassa Dipalmitoyphosphocholine (DPPC), joka läpikäy geeli-neste kidefaasinsiirtolämpötila (Tm), joka muuttuu erittäin vuotavat pieniä vesiliukoisia molekyylejä 41 ° C: ssa [31]. Liposomit koostuvat eri DPPC ja lipidien on erilaiset Tm ja thermosensitivity [32]. DSC-analyysi osoitti, että Tm meidän jakelujärjestelmän oli 40,8 ° C, ja DOX vapautumisen määritys osoitti, että se oli tasaista 37 ° C: ssa samalla DOX vapautui, kun lämpötila nostetaan 42 ° C: ssa.

• PLoS ONE: n ilmentyminen EGR Family mahasyövän: alassäätely HER4 ja sen aktivoivat Ligandi NRG4
• PLoS ONE A Novel Toiminnallinen TagSNP Rs7560488 että DNMT3A1 järjestäjä liittyy Alttius mahasyövän moduloimalla Promoottori Activity