PLoS ONE: Co-Levering van doxorubicine en SATB1 shRNA door warmtegevoelige Magnetische kationische liposomen voor maagkanker Therapy

Abstract

In de vorige studie, hadden we een nieuwe temperatuurgevoelige magnetische afgiftesysteem gebaseerd op liposomen ontwikkeld. Dit onderzoek was gericht op de efficiëntie van dit systeem voor de gelijktijdige levering van beide geneesmiddelen en genen dezelfde cel en de anti-tumor effecten op maagkanker evalueren. Doxorubicine (DOX) en SATB1 shRNA vector werden in de co-afgiftesysteem en in vitro DOX voor warmte afgifte activiteit doelgen silencing efficiëntie, gerichte cellulaire opname, in vitro cytotoxiciteit als in vivo antitumoractiviteit bepaald. De resultaten toonden aan dat co-afgiftesysteem had gewenst gerichte toediening werkzaamheid DOX warmtegevoelige afgifte en SATB1 genuitschakeling. Bovendien is de co-afgifte van DOX en SATB1 shRNA vertoonden verhoogde activiteit gastrische kanker celgroei remt in vitro en in vivo, in vergelijking met enkele aflevering. Kortom, de nieuwe temperatuurgevoelige magnetische drug en gen co-delivery systeem heeft veelbelovende toepassing in combinatie chemotherapie en gentherapie voor maagkanker

Visum:. Peng Z, Wang C, E Fang, Lu X, Wang G, Tong Q (2014) Co-Levering van doxorubicine en SATB1 shRNA door warmtegevoelige Magnetische kationische liposomen voor maagkanker Therapy. PLoS ONE 9 (3): e92924. doi: 10.1371 /journal.pone.0092924

Editor: Elena A. Rozhkova, Argonne National Laboratory, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 4 december 2013; Aanvaard: 26 februari 2014; Gepubliceerd: 27 maart 2014

Copyright: © 2014 Peng et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (nr 81172186). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de vierde voorkomende vorm van kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kanker overlijden wereldwijd [1]. In 2008 waren er ongeveer 989.000 nieuwe gevallen van maagkanker en 738.000 sterfgevallen in de wereld, die in de eerste plaats deed zich voor in Oost, Zuid en Centraal-Azië; Centraal- en Oost-Europa; en Zuid-Amerika [2], [3]. In China, maagkanker is de derde voorkomende vorm van kanker met een geschatte 380.000 nieuwe gevallen en een hoogste sterftecijfer ongeveer 26,3 per 100.000 inwoners per jaar [4], [5]. Chirurgische resectie gemeenschappelijke curatieve optie, maar het is niet geschikt voor de meeste patiënten met een vergevorderd stadium van maagkanker. Andere behandelingen zoals bestraling en chemotherapie tonen enkele werkzaamheid, maar zijn vaak onbevredigend [4], [6]. Bovendien, systemische toediening van chemotherapie veroorzaakt bijwerkingen [7], [8].

Door de ontwikkeling van resistentie tegen chemotherapie, traditionele chemotherapie ook geëxposeerd beperkt anti-tumoractiviteit [9]. Daarom heeft multi-agent co-afgiftesysteem meer aandacht gekregen recentelijk, omdat verschillende soorten middelen kunnen leveren aan dezelfde tumorcellen die vervolgens vertonen synergistische anti-tumor effecten. Zo kunnen twee verschillende chemische middelen worden gecombineerd of een chemisch middel kan worden gecombineerd met kleine interfererende RNA (siRNA) tegen een oncogen. Bovendien kan de gerichte afgifte en gereguleerde geneesmiddelafgifte verdere versterking antitumorale effecten en bijwerkingen verminderen.

Special AT-rijke bindingseiwit (SATB1) is een wereldwijde chromatine organisator dat de genexpressie en is betrokken bij de modulatie van maligne biologische effecten van kanker [10]. Afwijkende expressie van SATB1 is aangetoond dat bevorderd borstkanker, longkanker en lymfoom [11] - [13]. Onze vorige studies hebben aangetoond dat SATB1 speelt een belangrijke rol bij maagkanker en kan onafhankelijk prognose marker voor maagkanker [14], [15] zijn. Onderdrukken van de expressie van SATB1 door het leveren van siRNA of plasmide coderend specifieke korte interfererende harpin RNA (shRNA) tegen SATB1 kan de proliferatie en invasie remmen en apoptose bevorderen van tumorcellen [16], [17]. Deze resultaten suggereren dat SATB1 een potentieel therapeutisch doel voor maagkanker.

We speculeren dat de combinatie van gentherapie en chemotherapie aanzienlijk kunnen verbeteren therapeutische werking tegen maagkanker. In onze vorige onderzoek, ontwikkelden we een gerichte temperatuurgevoelige co-delivery systeem op basis van temperatuurgevoelige magnetische kationische liposomen (TSMCL). Door calceïne afgifte assay, hadden we de voor warmte liposomale formulering geoptimaliseerd, en vervolgens gemeten de magnetische eigenschappen en gen levering efficiëntie van TSMCL. In deze studie hebben we geladen doxorubicine en SATB1-shRNA vector in dit systeem voor de combinatie van gentherapie en chemotherapie, en evalueerden hun synergetische antitumor effect tegen maagkanker in vitro en in vivo.

Materialen en Werkwijzen

Materialen

Cholesterol, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC) en 3β- [N- (N ', N'-dimethylaminoethaan) carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) werden gekocht bij Avanti Polar Lipids (USA). Dimethyldioctadecylammoniumbromide bromide (Doab) werden verkregen bij Sigma-Aldrich (USA). Magnetic Fluid Fe _{3O 4 werd gesynthetiseerd door Galaxy Nanotech (China). FAM gelabelde siRNA en plasmide pGFP-SATB1 shRNA werden verstrekt door GenePharma (Shanghai, China). Doxorubicine werd gekocht van Hisun Pharmaceutical (Zhejiang China). Foetaal runderserum (FBS), kweekmedia, penicilline /streptomycine (ongedierte) en trypsine werden geleverd door Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). SATB1 konijn monoklonaal antilichaam was van Epitomics (Abcam, UK). Alle andere chemicaliën waren van analytische kwaliteit commerciële en zonder verdere zuivering.}

Bereiding van co-afgiftesysteem

Dit co-afgiftesysteem gebaseerd op warmte gevoelige kationische liposomen die werden bereid met een temperatuurgevoelige samenstelling die DPPC, DC-cholesterol, Doab en cholesterol in een molaire verhouding van 80:5:5:10 geoptimaliseerd Preliminaire experimenten. Liposomen (TSCL) werden bereid door de dunne film hydratatie methode, gevolgd door extrusie [18]. Het ammoniumsulfaat gradient methode werd gebruikt om DOX in TSCL (TSCL-DOX) te laden. Magnetische liposomen (TSMCL), magnetische vloeistof Fe _{3 O 4 werd gebruikt als de kern en co-ingekapseld met ammoniumsulfaat buffer in de liposomen te bereiden. Na de vorming van de dunne film in de rondbodemkolf een milliliter suspensie van ijzer en ammoniumsulfaat werd toegevoegd aan de film hydrateren, en vervolgens geëxtrudeerd door polycarbonaatfilters en de ammoniumsulfaatgradiënt Werkwijze geladen met DOX (TSMCL-DOX) . Tenslotte de producten uit de gelfiltratie werden gecentrifugeerd bij 1000 g gedurende 15 min ingekapseld Fe 3O verwijderen 4.}

pGFP-SATB1-shRNA (shSATB1) vector werd geïncubeerd met verschillende liposomen serumvrij medium bij kamertemperatuur gedurende 30 min te bereiden TSCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1, TSMCL-shSATB1 en TSMCL-DOX-shSATB1 respectievelijk.

Bepaling van de zeta potentiaal, deeltjesgrootte en polydispersiteit

de gemiddelde deeltjesgrootte en de polydispersiteit van de deeltjesgrootte verdeling van de liposomen werd bepaald bij 25 ° C door middel van dynamische lichtverstrooiing met een ZetaPALS deeltjesgrootte instrument (Brookhaven Instruments Corporation, USA). De zeta potentiaal van het liposomale dispersies werd gemeten met behulp van hetzelfde instrument bij 25 ° C door de elektroforetische mobiliteit.

Bepaling van doxorubicine beladen efficiëntie

DOX concentratie in de liposomen werd gemeten met een fluorimeter ( Perkin Elmer, USA) met 485 nm excitatie en 590 nm emissie filters met een verdunningsreeks van vrije DOX als standaard. DOX geladen efficiëntie werd berekend op basis van de concentratie DOX.

Differential Scanning Calorimetrie (DSC)

DSC werd uitgevoerd om de thermosensitivity liposomen evalueren door het bepalen van de fase overgangstemperatuur (Tm). Tm werd geëvalueerd met behulp van een nano DSC (TA Instruments, VS) bij een verwarmingssnelheid van 20 ° C /uur met 20 mg /ml fosfolipide.

In vitro warmte gevoelige DOX afgifte test

20 gl DOX geladen liposomen werden geïncubeerd in 1 ml PBS en PBS met 50% foetaal runderserum (FBS) die de in vivo omgeving nabootst afzonderlijk in Eppendorf buizen. De monsters werden verwarmd in een waterbad bij 37 ° C en 42 ° C gedurende 1 uur, respectievelijk. Dan de fluorescentie-intensiteit van DOX werd gemeten in een fluorimeter (Perkin Elmer, USA) onder toepassing van 485 nm excitatie en 590 nm emissiefilters. Voor 100% afgifte werden monsters geïncubeerd in 1 ml PBS met 1% Triton X-100 gedurende 1 min. De DOX vrijlating percentages werden berekend als volgt: waarin F _{s was de fluorescentie van de monsters na het verwarmen, F 0 is de initiële fluorescentie van de monsters voor verwarming en F 100 werd de fluorescentie van de monsters die werden behandeld met Triton X-100.}

Cell cultuur

Human adenocarcinoom MKN-28 cellijn werd gekocht van keygen Biotech (Nanjing, China) en gekweekt in high-glucose DMEM aangevuld met 10% FBS, 100 U /ml penicilline en 100 ug /ml streptomycine in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO _{2 bij 37 ° C.}

in vitro celtransfectie

MKN-28 cellen werden gezaaid in 12-well platen met een dichtheid van 4 x 10 ^{5 cellen /putje en gedurende de nacht gekweekt tot ongeveer 80% confluentie. De volgende dag werden de cellen tweemaal met voorverwarmd PBS, vervolgens TSCL-shSATB1 en TSMCL-shSATB1 werden toegevoegd aan elk putje en geïncubeerd gedurende 6 uur gewassen. Cellen geïncubeerd met TSMCL-shSATB1 werden geplaatst op 12-well magneetplaat gedurende de eerste 30 minuten op een magnetisch veld te bieden. Vervolgens werd het incubatiemedium vervangen door DMEM aangevuld met 10% FBS en de cellen werden gedurende 24 uur. GFP expressie werd geëvalueerd onder fluorescentiemicroscoop (Nikon 80i) en flow cytometer (BD FACS Canto II).}

Real-time kwantitatieve polymerase chain reaction (RT-qPCR)

Totaal RNA werd geëxtraheerd van MKN-28 cellen met behulp van TRIzol regent (Invitrogen, Carlsbad, CA) volgens instructies van de fabrikant, was en cDNA gesynthetiseerd met behulp van PrimeScript RT Master MIX (Takara, Dalian). PCR werd uitgevoerd met Ex Taq SYBR Premix II (Takara, Dalian) op een StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). De sequenties van de primers waren als volgt: SATB1 sense 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 'en 5'-antisense GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3' GADPH sense 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 'en 5'-antisense GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3'. SATB1 mRNA niveau was genormaliseerd tot die van GAPDH.

Western blotanalyse

MKN-28 cellen werden geoogst en gelyseerd in RIPA buffer. De supernatanten werden verzameld na centrifugatie bij 10.000 g gedurende 10 minuten. Eiwitconcentratie van het supernatans werd bepaald met een BCA Protein Assay Kit. Dan 40 ug monsters werden op een 15% SDS-PAGE en proteïnen werden overgebracht op PVDF membranen. Vervolgens werden de membranen geïncubeerd in 5% vetvrije melk gedurende 1 uur om niet-specifieke binding te blokkeren en dan overnacht geïncubeerd bij 4 ° C met SATB1 of β-actine antilichaam (1:500 verdunning). De membranen werden daarna onderzocht met HRP-geconjugeerd geit anti konijn secundair antilichaam gedurende 30 min. Tenslotte werden de membranen gevisualiseerd met versterkte chemoluminescentie systeem (ECL, Pierce) en blootgesteld aan röntgenfilm.

In vitro evaluatie van cellulaire opname

De intracellulaire locatie van DOX afgegeven evalueren en pGFP-SATB1 shRNA en verbeterde penetratie van liposomen in de maag kankercellen door magnetische gericht, een FAM gelabelde siRNA (groene fluorescentie) werd gebruikt imiteren pGFP-SATB1 shRNA en DOX zelf bezit een instinct rode fluorescentie cellulaire opname bewaken . MKN-28 cellen werden geënt in 12-putjes plaat bij 4 x 10 ^{5 cellen /putje en gedurende de nacht gekweekt. Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met gratis siRNA, TSCL-siRNA, TSMCL-siRNA, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-DOX-siRNA of TSMCL-DOX-siRNA gedurende 6 uur. Voor magnetische liposomen werden de platen geplaatst op een 12-well magneetplaat tijdens het eerste uur van incubatie. De cellen werden gevisualiseerd onder fluorescentiemicroscoop om de fluorescerende labels DOX en siRNA lokaliseren. De kernen werden gekleurd met DAPI (blauwe fluorescentie).}

MTT assay

MKN-28 cellen werden geënt bij een dichtheid van 2 x 10 ^{4 cellen /putje in 96-putjesplaten en gedurende de nacht gekweekt. De cellen werden vervolgens geïncubeerd met verschillende liposomen bij 37 ° C gedurende 2 h in CO _{2 incubator. Voor magnetische liposomen werden de platen onder een 96-well magneetplaat tijdens de eerste 1 uur incubatie geplaatst. Naast de cellen werden tweemaal met PBS gewassen en gedurende 46 uur in vers medium. Vervolgens werd de cellevensvatbaarheid gemeten door MTT assay. Het medium in elk putje vervangen door 20 ul MTT-oplossing (Sigma-Aldrich, USA) en gedurende 4 uur bij 37 ° C, vervolgens werden de supernatanten verwijderd en formazan kristallen werden gl DMSO opgelost met 200. De platen werd gemeten bij 490 nm in een microplaat reader en de cellevensvatbaarheid werd berekend volgens de volgende formule:}}

Flowcytometrie

Apoptose werd gedetecteerd met een Annexine V-FITC Apoptose Detectie Kit (eBioscience, USA). MKN-28 cellen werden geënt in 12-putjesplaten en behandeld zoals hierboven beschreven. Na 24 uur werden de cellen verzameld, tweemaal met PBS gewassen en gesuspendeerd in 500 ul bindingsbuffer. Naast de cellen dubbel gekleurd met Annexine V-FITC en propidiumjodide (PI). Cellen in een vroeg stadium van apoptose gekleurd met Annexine V-FITC maar niet gekleurd met PI werden gekwantificeerd door flow cytometery.

xenograft muismodel

Vijf tot zes weken oude mannelijke Balb /c muizen werden naakt die door het Centrum voor dierproeven van Tongji Medical College. Elke muis werd subcutaan geïnoculeerd in de rechter flank met 5 x 10 ^{6 MKN-28 cellen. Enkele weken na tumor inoculatie werden 36 tumordragende muizen willekeurig verdeeld in zes groepen (n = 6). De muizen werden geïnjecteerd via de staartader met gratis DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1, TSMCL-DOX-shSATB1 of normale zoutoplossing als controle. De dosis DOX was 2,5 mg /kg en dat van pGFP-SATB1 shRNA was 10 ug per muis. De behandeling werd eenmaal per 3 dagen en tumorgrootte werd gemeten via een calipering en tumorvolume kon worden berekend door de volgende formule: volume = (D _{Min) 2 x D Max /2, waarbij D Max was de langste tumordiameter en D Min was de kortste. Voor TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 en TSMCL-DOX-shSATB1, werd de magnetische targeting bereikt door een continue extern magnetisch veld van 5000 Gauss voor 30 min gericht op de tumor na geneesmiddeltoediening. Alle experimenten werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Tongji Medical College en werden alle dieren humaan behandeld volgens Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen.}}

Statistiek analyse

De gegevens werden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaardafwijking (SD). De statistische significantie tussen verschillende groepen werd geëvalueerd met de t-test van Student en één-factor variantieanalyse (ANOVA) proef. Voor de overlevingstijd van de dieren waren de Kaplan-Meier curves van elke groep vastgesteld en log rank test werd uitgevoerd ter vergelijking overlevingskans. p < 0,05 werd als statistisch significant

Resultaten

Karakterisatie van liposomen

Zoals getoond in Tabel 1, de diameter van TSCL was 83,6 ± 5,7 nm, terwijl die van TSCL. -DOX verhoogd tot 118,5 ± 7,9 nm door het inkapselen van DOX. Ondertussen werden de diameters van TSCL-shSATB1 en TSCL-DOX-shSATB1 aanzienlijk tot 161,1 ± 11,8 nm en 238,1 ± 20,6 nm, respectievelijk door de hechting en fusie van plasmide-DNA-liposomen. Voor magnetische liposomen, de deeltjesgrootte van TSMCL, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 en TSMCL-DOX-shSATB1 waren 135,0 ± 11,6 nm, 157,2 ± 14,3 nm, 221,3 ± 15,7 nm en 319,4 ± 20,1 nm, respectievelijk, aanzienlijk groter dan dat van TSCL, TSCL-DOX, TSCL-shSATB1 en TSCL-DOX-shSATB1 als gevolg van de insluiting van de magnetische nanodeeltjes. Bovendien is de grootte van TSMCL-shSATB1 en TSMCL-DOX-shSATB1 was significant groter dan van TSMCL en TSMCL-DOX respectievelijk (p < 0,05). Alle liposomen hadden nauwe grootteverdeling, omdat hun polydispersiteiten waren niet meer dan 0,3.

Zeta mogelijkheden van TSCL, TSCL-DOX, TSCL-shSATB1 en TSCL-DOX-shSATB1 waren 52,0 ± 7,3 mV, 50,1 ± 7,7 mV, 31,3 ± 5,2 mV en 26,7 ± 4,5 mV, respectievelijk. Na incubatie met pGFP-SATB1- shRNA, de oppervlakteladingen significant af (p < 0,05) als gevolg van de elektrostatische interactie tussen de kationische lipiden en plasmide-DNA. Echter insluiten van magnetische nanodeeltjes resulteerde niet in een significante afname van Zeta potentieel magnetische liposomen.

Voor DOX geladen efficiëntie, de DOX inkapselende bedroeg 89 ± 3% en 78 ± 8% (n = 3) voor TSCL-DOX en DOX-TSMCL, respectievelijk, en was 85 ± 7% en 73 ± 9% (n = 3) voor TSCL-DOX-shSATB1 en TSMCL-DOX-shSATB1 respectievelijk. Deze gegevens geven aan dat de interactie tussen liposomen en plasmide niet tot lekkage DOX.

De thermosensitivity van de liposomen

differentiële scanning calorimetrie werd uitgevoerd om de fase overgangstemperatuur van TSCL bepalen. Zoals getoond in Fig. 1, TSCL uit DPPC, DC-cholesterol, Doab en cholesterol in een molaire verhouding van 80:5:5:10 had een Tm van 40,8 ° C met een relatief bredere piek overgang die de fusie overgang piek van DPPC en Doab kan .

in vitro afgifte van warmte gevoelige DOX liposomen

Zoals getoond in Fig. 2, DOX afgiftesnelheid van TSCL-DOX en DOX-TSMCL slechts 12% en 16% na incubatie met PBS bij 37 ° C en steeg tot 20% en 19% na incubatie met 50% FBS, respectievelijk. Voor TSCL-DOX-shSATB1 en TSMCL-DOX-shSATB1, DOX afgiftesnelheid was 12% en 15% na incubatie met PBS bij 37 ° C en was zowel 16% na incubatie met 50% FBS, wat aangeeft dat de opname van plasmide had geen significant effect op de stabiliteit van liposomen (p > 0,05).

DOX afgiftesnelheid van TSCL-DOX en TSMCL-DOX werd verhoogd tot 37% na incubatie met PBS bij 42 ° C en steeg tot 45% en 49% na incubatie met 50% FBS, respectievelijk. Voor TSCL-DOX-shSATB1 en TSMCL-DOX-shSATB1, DOX afgiftesnelheid was 35% en 43% na incubatie met PBS en FBS bij 42 ° C, respectievelijk, beide significant hoger dan die bij 37 ° C (p < 0,05). Deze resultaten geven aan dat TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-DOX-shSATB1 en TSMCL-DOX-shSATB1 hebben wenselijk thermosensitivity, en kan worden gebruikt voor hyperthermie veroorzaakt controle release van DOX.

Silencing van SATB1 meningsuiting in MKN-28 cellen die met liposomen

Vervolgens evalueerden we de doelmatigheid van de liposomen shSATB1 vector geven in MNK-28 cellen. Typische fluorescentiebeelden van cellen getransfecteerd met TSCL-shSATB1 en TSMCL-shSATB1 worden getoond in Fig. 3A. Flow cytometrie analyse toonde aan dat de transfectie-efficiëntie van TSCL-shSATB1 slechts 15,4 ± 0,15%. Na de toepassing van het magnetisch veld leiding, de transfectie-efficiëntie van TSMCL-shSATB1 was 34,3 ± 0,93%, aanzienlijk hoger dan die van TSCL-shSATB1 (fig. 3B).

Om te bepalen of de afgeleverde shSATB1 vector kon silencing van SATB1 expressie bemiddelen in MKN-28 cellen, voerden wij real-time kwantitatieve PCR en Western blot analyse. De resultaten toonden dat zowel SATB1 mRNA en eiwitniveaus verlaagd in cellen getransfecteerd met TSCL-shSATB1 en TSMCL-shSATB1, vergeleken met controlecellen. Bovendien TSMCL-shSATB1 met behulp van magnetisch veld was krachtiger dan TSCL-shSATB1 te SATB1 expressie in MKN-28 cellen te remmen (Fig. 3C, D).

Magnetische gerichte in vitro cellulaire opname

de penetraties vergelijken in de cellen tussen niet-magnetische en magnetische liposomen met toepassing van magnetische doelgerichte sturing en de intracellulaire locatie van geleverde DOX en shSATB1 een FAM-gemerkt siRNA werd gebruikt als indicator. Het ontbreken van groene fluorescentie in cellen behandeld met een siRNA aangegeven dat zij niet kunnen doordringen in de cellen (gegevens niet getoond). We vonden dat meer cellen behandeld met TSMCL-siRNA vertoonde groene fluorescentie dan cellen behandeld met TSCL-siRNA (fig. 4A). Bovendien hebben meer cellen behandeld met TSMCL-DOX rode fluorescentie vertoonden dan cellen behandeld met TSCL-DOX (Fig. 4B). In cellen behandeld met TSMCL-DOX-siRNA, werd een hoge fluorescentie-intensiteit waargenomen, en de cellen bleken roze als gevolg van de samenvoeging van de blauwe, rode en groene kleur (afb. 4C). Deze waarnemingen suggereren dat TSMCL potenter is het leveren siRNA en DOX in de cellen dan TSCL, na toepassing van het magnetisch veld.

Verder onderzochten we de intracellulaire locatie van geleverde DOX en siRNA. Rode fluorescentie werd waargenomen in zowel de kern en het cytoplasma, wat aangeeft dat geleverd DOX werd in zowel de kern en het cytoplasma. Daarentegen groene fluorescentie verscheen voornamelijk in het cytoplasma, wat suggereert dat het siRNA in het cytoplasma (fig. 4D) werden opgeleverd. Het samenvoegen van rode en groene verscheen geel in het cytoplasma en de samenvoeging van blauwe en rode verscheen lavendel in de kernen. Samengenomen geven deze gegevens aan dat zowel TSCL en TSMCL kan doordringen in maagkanker cellen en hun inhoud afgeven in het cytoplasma (DOX en siRNA) en de kernen (DOX).

In vitro antitumor effecten van de liposomen

We evalueerden de in vitro anti- tumor effecten van deze co-afgiftesysteem door cytotoxiciteit en inductie van apoptose activiteit. De cytotoxiciteit van de liposomen werd bepaald door MTT assay. Om de effecten van DOX en plasmide concentraties op de cytotoxiciteit van liposomen te bepalen, onderzochten wij liposomen geladen met verschillende concentraties van DOX en verschillende hoeveelheden SATB1 shRNA. Met de toename van DOX concentratie werd de cytotoxiciteit van de liposomen toegenomen (Fig. 5A). Echter, de toevoeging van SATB1 shRNA concentratie resulteren in verhoogde cytotoxiciteit, en er werden slechts licht toenemen van cytotoxiciteit SATB1 shRNA concentratie ongeveer 4 ug (Fig. 5B). Zo gebruikten we 25 uM DOX en 4 ug SATB1 shRNA de cytotoxiciteit onder Gratis DOX, Gratis shRNA, TSCL, TSMCL, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 en TSMCL- vergelijken DOX-shSATB1.

Zoals getoond in Fig. 5C, gratis shRNA, TSCL en TSMCL had weinig cytotoxiciteit. Levensvatbaarheid van de cellen was 40,3 ± 3,4%, 73,6 ± 3,5% en 51,3 ± 4,5% gratis DOX, TSCL-DOX en TSMCL-DOX, respectievelijk, wat erop wijst dat de cytotoxiciteit van TSMCL-DOX was hoger dan TSCL-DOX, maar lager dan gratis DOX . Levensvatbaarheid van de cellen was 79,2 ± 6,9% en 71,6 ± 4,7% voor TSCL-shSATB1 en TSMCL-shSATB1, respectievelijk, blijkt er geen statistische significantie (p > 0,05). Voor geneesmiddelen en gen co-levering, levensvatbaarheid van de cellen was slechts 35,0 ± 3,2% en 22,3 ± 3,4% voor TSCL-DOX-shRNA en TSMCL-DOX-shRNA, respectievelijk, beduidend lager dan die van de Vrije DOX, TSCL-DOX, TSMCL- DOX en SATB1shRNA geladen liposomen (p < 0,05). Bovendien cellevensvatbaarheid van TSMCL-DOX-shRNA was significant lager dan die van TSCL-DOX-shRNA (p < 0,05). Deze resultaten suggereren dat een synergistische cytotoxiciteit effect wordt bereikt door gelijktijdig leveren DOX en SATB1 shRNA. Bovendien, de toepassing van magnetische gericht, een verder verbeterde cytotoxiciteit verkrijgbaar.

De aanvullend anti-tumor mechanisme naast de cytotoxiciteit van de co-afgiftesysteem te bepalen, onderzochten wij de mate van apoptose MKN-28 cellen behandeld met gratis DOX, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 en TSMCL-DOX-shSATB1 door flowcytometrie. Zoals uit Fig. 5D, apoptose bedroeg 22,3% in cellen behandeld met gratis DOX, was 8,9% in cellen behandeld met TSCL-DOX, maar steeg tot 13,4% in cellen behandeld met TSMCL-DOX en magnetisch veld. Evenzo apoptose bedroeg 9,4% in cellen behandeld met TSCL-shSATB1, maar steeg tot 17,4% in cellen behandeld met TSMCL-shSATB1 en magnetisch veld. Daarentegen apoptose bedroeg 27,7% in cellen behandeld met TSCL-DOX-shSATB1, hoger dan in cellen behandeld met TSCL beladen met DOX of shSATB1 alleen. De apoptose bedroeg 32,4% in cellen behandeld met TSMCL-DOX-shSATB1, de hoogste van alle groepen. Deze resultaten tonen aan dat co-DOX en leveren SATB1 shRNA leidt tot gecombineerde effecten van apoptose-inductie. Kortom, deze co-afgiftesysteem vertoont sterke anti-tumor effecten in vitro.

In vivo antitumoractiviteit van de liposomen

Om de in vivo anti-tumor activiteit te bepalen van de co-delivery systeem, opgericht we MKN-28 van muis xenograft modellen en geïnjecteerd Gratis DOX, TSMCL-DOX, TSCML-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 of TSMCL-DOX-shSATB1 in de muizen door de staartader. De behandeling werd eenmaal elke 3 dagen, en werden de tumoren ontleed (fig. 6A). Op dag 15, tumor volume was 0,44 ± 0,05 cm ^{3 in muizen behandeld met TSMCL-DOX-shSATB1, beduidend lager dan die in een zoutoplossing groep (2,14 ± 0,23 cm 3), Gratis DOX groep (1,08 ± 0,13 cm 3), TSMCL-DOX-groep (0,68 ± 0,10 cm 3), TSCML-shSATB1 groep (1,43 ± 0,21 cm 3), en TSCL-DOX-shSATB1 groep (0,77 ± 0,12 cm 3) (Fig. 6B).}

zoals getoond in Fig. 6 (C), de mediane tijd voor de tumor volume 2 cm bereiken ^{3 was 30 dagen in TSMCL-DOX-shSATB1 groep, langer dan die in een zoutoplossing groep, Gratis DOX groep, TSMCL-DOX groep, TSCML-shSATB1 groep en TSCL-DOX-shSATB1 groep (afb. 6C). Samengenomen geven deze resultaten aan dat co-DOX en leveren shSATB1 door TSMCL vertoont synergistisch antitumoreffect in vivo.}

Discussie

Ondanks recente ontwikkelingen in chirurgie, radiotherapie en target therapie, chemotherapie steeds een van de belangrijkste benaderingen van maagkanker therapie. Maar therapeutische effecten van chemotherapie vaak ontevreden en kon niet aanzienlijke verbetering van de prognose van patiënten met kanker [19]. Een belangrijke reden is de tumorigenese en progressie van maagkanker omvat een grote verscheidenheid aan mechanismen; de unitaire antitumor mechanisme van traditionele chemotherapie hun therapeutische effecten, waardoor de combinatie van chemotherapie met gentherapie kan antitumorale effecten te verbeteren beperkt. Een ander obstakel van de chemotherapie is dat systemische toediening van geneesmiddelen leidt tot een beperkte concentratie geneesmiddel in de tumor, terwijl waardoor veel negatieve effecten [8]. De sleutel tot deze problemen voert nieuwe manieren van geneesmiddelafgifte derhalve van gerichte meerdere middelen leveren systeem dat direct kan worden geleid naar de tumorplaats met gecontroleerde afgifte kunnen deze problemen therapeutische effecten te overwinnen en te verbeteren [20] - [25] .

Tussen de verschillende geneesmiddelafgiftesystemen, liposomen zijn veelbelovend voor goede biocompatibilities die weinig of geen antigeen, allergische en toxische reacties kunnen veroorzaken, en ondergaan gemakkelijk biodegradatie. Aangezien zowel geneesmiddel als gendragers, kunnen liposomen niet alleen beschermen host ongewenste effecten van het ingekapselde geneesmiddel, maar ook voorkomen dat de ingesloten inhoud voortijdige inactivering door fysiologisch medium [26]. Bovendien liposoom een ​​potentieel gericht geneesmiddel afgiftesysteem, of het wordt bereikt door verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) effect (Passive gericht), of door magnetische veld begeleiding en immuun verbinding (actief gericht) [27]. Bovendien hebben sommige liposomen bezitten gereguleerde geneesmiddelafgifte geactiveerd functies, zoals thermo gevoeligheid pH gevoeligheid en magnetron gevoeligheid.

Onlangs hebben we een nieuwe magnetische gerichte warmte gevoelige geneesmiddel en gen co-afgiftesysteem (TSMCL) ontwikkeld. Gebaseerd op electroneutraal warmte gevoelige samenstelling (DPPC:Cholesterol = 80:20), hadden wij verschillende kationische componenten toegevoegd en geoptimaliseerd thermosensitivity liposomen door calceïne-afgifte test. De resultaten had aangegeven dat we een wenselijke thermosensitivity kon krijgen door het vervangen van 10 mol delen Cholesterol van 5 mol delen DC-cholesterol en 5 mol delen Doab (DPPC:DC-Cholesterol:DOAB:Cholesterol = 80:5:5:10), en calceïneafgifte uit de liposomen zou lager bij 37 ° C maar significant hoger bij 42 ° C in deze formulering. Vervolgens magnetische vloeistof Fe _{3 O 4 werd gebruikt als de kern en fungeerde als magnetische targeting en warmtebron van TSMCL. Magnetometer met vibrerend monster (VSM) meting had aangegeven dat magnetische vloeistof Fe 3O 4 was superparamagnetische geweest, zou dus TSMCL goede magnetische beoogde effecten hebben. Intussen is de tijdsafhankelijke stooklijn had ook aangetoond dat beide magnetische vloeistof Fe 3 O 4 en TSMCL kan worden tot 42 ° C verwarmd van 25 ° C binnen 20 min. Met behulp van magnetische vloeistof Fe 3 O 4, zowel magnetische targeting en temperatuur veroorzaakt geneesmiddelafgifte van TSMCL kan worden gerealiseerd. Tot slot, hadden beiden TSCL en TSMCL typische liposomale morfologie en goede uitkeringen onder TEM tentoongesteld. Gebaseerd op de succesvolle constructie van TSMCL, in deze studie geladen DOX en SATB1 shRNA vector in TSMCL aan TSMCL-DOX-shSATB1 maken en beoordeelde de antitumorale effecten tegen maagkanker cellen in vitro en in vivo.}

DOX is een veel gebruikte drug in chemotherapie met hoog rendement te tumorcel proliferatie te remmen en induceren tumorcel apoptose, maar de therapeutische effecten worden beperkt als gevolg van ernstige cardiotoxiciteit en myelosuppressie wanneer systemisch toegediend [28]. Hoewel DOX liposomen gedeeltelijk situatie verbeterd, het gebrek aan gerichte aflevering limites steeds hun gebruik [29]. SATB1 is een wereldwijde chromatine organisator of direct de expressie van ERRB2, MMP2, ABL1 en E-cadherine om als een belangrijke regulator van kankerontwikkeling [30] regelt. Overexpressie van SATB1 in verschillende tumoren geassocieerd met maligne biologische effecten zoals invasie, proliferatie en metastase [10] - [13]. Silencing SATB1 expressie door kleine interfererende RNA (siRNA) of plasmide dat codeert korte harpin RNA (shRNA) kan remmen, de proliferatie, invasie en metastase, en induceren apoptose van verschillende tumorcellen [16], [17]. Daarom SATB1 wordt een potentieel doelwit voor kankertherapie [30]. Echter passende afgiftevectoren voor siRNA of shRNA zijn belangrijk voor SATB1 gerichte kanker gentherapie.

In deze studie gebruikt TSMCL-DOX-shSATB1 systeem, zowel DOX en SATB1 shRNA vector kan worden geleid naar tumorplaats onder magnetisch ingediend begeleiding, en DOX werd uitgebracht in een hyperthermie getriggerd manier. Hyperthermie veroorzaakt afgifte afhankelijk is warmte gevoelige liposomen die voornamelijk bestaan ​​uit Dipalmitoyphosphocholine (DPPC) met een gel vloeibaar kristallijne faseovergang (Tm) ondergaat die wordt zeer kleine lek in water oplosbare moleculen bij 41 ° C [31]. Liposomen bestaande uit verschillende DPPC lipiden en hebben verschillende Tm en thermosensitivity [32]. DSC-analyse toonde aan dat de Tm van ons afgiftesysteem was 40,8 ° C en DOX afgifte test gaf aan dat het stabiel op 37 ° C terwijl DOX werd vrijgegeven wanneer de temperatuur tot 42 ° C.

• PLoS ONE: Expressie van de EGF Family bij maagkanker: negatieve regulatie van HER4 en haar activeren Ligand NRG4
• PLoS ONE: A Novel Functionele TagSNP Rs7560488 in de DNMT3A1 Promoter wordt geassocieerd met gevoeligheid voor maagkanker door het moduleren Promotor Activity