Plos ONE: Co-Dostava doksorubicinom in SATB1 shRNA s toplotno magnetno kationskih liposomov za želodca raka terapije

Povzetek

V prejšnji raziskavi, smo razvili nov toplotno sistem magnetni dostave, ki temelji na liposome. Ta študija je namenjena, da oceni učinkovitost tega sistema za skupnemu ustvarjanju obeh zdravil in genov v isti celici in njegovih anti-tumorskih učinkov na raka želodca. Doksorubicina (DOX) in SATB1 shRNA Vektor smo naložili v sistem co-dobave in vitro dox aktivnost thermosensitive sproščanje, ciljni gen utišanje učinkovitost ciljni celični privzem, smo določili vitro citotoksičnost, kot tudi in vivo aktivnost proti tumorjem. Rezultati so pokazali, da je ta sistem sodelovanja za zaželeno učinkovitost ciljano dostavo DOX toplotno sprostitev in SATB1 genov utišanja. Poleg tega je kazala sočasno dostavo dox in SATB1 shRNA okrepljeno delovanje, da zavirajo rast želodčni rak celic in vitro ter in vivo, glede na eno dobavo. Skratka, roman thermosensitive sistem magnetni drog in gen co-dostava ima obetavno vlogo v kombiniranem kemoterapije in genske terapije za raka želodca

Navedba. Peng Z, Wang C, Fang E, Lu X, Wang G, Tong Q (2014) Co-Dostava doksorubicinom in SATB1 shRNA s toplotno magnetno kationskih liposomov za želodca Cancer Therapy. PLoS ONE 9 (3): e92924. doi: 10,1371 /journal.pone.0092924

Urednik: Elena A. Rozhkova, Argonne National Laboratory, Združene države Amerike

Prejeto: 4. december, 2013; Sprejeto: 26. februar 2014; Objavljeno: 27. marec 2014

Copyright: © 2014 Peng et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske (št 81172186). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je četrta skupna raka in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu [1]. V letu 2008 je bilo približno 989.000 novih primerov raka želodca in 738,000 smrti v svetu, ki se je zgodila predvsem na vzhodu, v Južni in Srednji Aziji; Srednja in Vzhodna Evropa; in Južni Ameriki [2], [3]. Na Kitajskem, rak želodca je tretja oblika raka pri ocenjenih 380.000 novih primerov in najvišjo smrtnost približno 26,3 na populacijo 100.000 vsako leto [4], [5]. Kirurška resekcija je skupna kurativno možnost, vendar ni primerna za večino bolnikov, ki so v poznem stadiju raka želodca. Druge terapije, kot radioterapijo in kemoterapijo kažejo nekaj učinkovitost, vendar pogosto nezadovoljiva [4], [6]. Poleg tega sistemsko dajanje kemoterapije povzroča neželene učinke [7], [8].

Zaradi razvoja odpornosti proti zdravilom za kemoterapijo, tradicionalni kemoterapija tudi razstavljeno omejeno učinkovitost protitumorsko [9]. Zato je več sredstvo sistem za sodelovanje za pridobil več pozornosti v zadnjem času, saj lahko dostavi različne vrste agentov istih tumorskih celic, ki pa kažejo sinergijske učinke protitumorske. Na primer, lahko dva različna kemična sredstva kombinirati ali kemijska sredstva se lahko kombinirajo z male interferenčne RNA (siRNA) zoper onkogena. Poleg tega se lahko ciljno dostavo in nadzorovano sproščanje zdravila še povečati anti-tumorske učinke in zmanjšati škodljive učinke.

Posebna AT-rich vezavni protein (SATB1) je globalna kromatin organizator, ki uravnava izražanje genov, ki je vključen v modulacija malignih bioloških vedenj raka [10]. Abnormalnih izraz SATB1 Dokazano je, da spodbuja rakom dojke, pljučnim rakom in limfomi [11] - [13]. Naši prejšnje študije so pokazale, da ima SATB1 pomembno vlogo pri raku želodca, in je lahko neodvisno prognozo marker raka želodca [14], [15]. Zatirati izraz SATB1 jih dali siRNA ali plazmid kodiranje posebno motečih kratek harpin RNA (shRNA) proti SATB1 lahko zavira proliferacijo in invazijo, in spodbujajo apoptozo tumorskih celic [16], [17]. Ti rezultati kažejo, da je SATB1 potencialna terapevtska tarča za raka želodca.

špekulirajo, da bi lahko kombinacija genske terapije in kemoterapije bistveno povečati terapevtsko učinkovitost proti raku želodca. V naši prejšnji raziskavi, smo razvili ciljno sistem sodelovanja dostave toplotno temelji na toplotno magnetnih kationskih liposomov (TSMCL). Z kalceina testa za javnost, smo optimizirali toplotno liposomski oblikovanje, in nato izmerili magnetne lastnosti in dostave gen učinkovitosti TSMCL. V tej študiji smo naložili doksorubicin in SATB1-shRNA vektor v ta sistem za kombinacijo genske terapije in kemoterapijo, in ocenili njihovo sinergistično protitumorsko proti raku želodca in vitro in in vivo.

Materiali in metode

Materiali

holesterol, 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-phosphocholine (DPPC) in 3β- [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) -karbamoil] holesterola (DC-Chol) so bile kupljene od Avanti Polar maščobah (ZDA). Dimethyldioctadecylammonium bromid (DOAB) smo dobili pri Sigma-Aldrich (USA). Magnetic Fluid Fe _{3O 4 sintetiziramo Galaxy nanotehnologija (Kitajska). FAM označeni siRNA in plazmida pGFP-SATB1 shRNA so posredovali GenePharma (Shanghai, Kitajska). Doksorubicin je bila kupljena od Hisun Pharmaceutical (Zhejiang Kitajska). Fetalni goveji serum (FBS), gojišča, penicilin /streptomicin (PEST) in tripsina priskrbeli Invitrogen (Carlsbad, CA, ZDA). SATB1 zajec monoklonsko protitelo, je bil iz Epitomics (Abcam, UK). Vse druge kemikalije so bili komercialno analitsko razreda in uporabimo brez nadaljnjega čiščenja.}

Priprava sistema co-dostavnega

Ta sistem sodelovanje dostava je temeljila na toplotno kationskih liposomov, ki so bili pripravljeni s toplotno kationsko formulacija DPPC, DC-holesterol, DOAB in holesterola v molskem razmerju 80:5:5:10 optimizirani v naših predhodnih poskusih. Liposome (TsCl) smo pripravili po metodi tanko filmsko hidracije, čemur sledi iztiskanje [18]. Postopek gradient amonijevega sulfata smo uporabili za nalaganje dox v TsCl (TsCl-DOX). Za pripravo magnetnih liposomov (TSMCL), magnetni fluid Fe _{3O 4 je bila uporabljena kot jedro in co-obdana s amonijevega sulfata pufrom v liposome. Po tvorbi tankega filma v bučo z okroglim dnom dodamo en mililiter suspenzije železa in amonijevega sulfata hidrirati filma, nato pa ekstrudiramo skozi filtre polikarbonat in obremenjeno s dox (TSMCL-dox) po postopku amonijevega sulfata gradientno . Na koncu so bili izdelki iz filtracije gela centrifugirali pri 1000 g 15 minut, da se odstranijo nezaščiteno Fe 3O 4.}

pGFP-SATB1-shRNA (shSATB1) vektor smo inkubirali z različnimi liposome v seruma prosti mediji pri sobni temperaturi 30 minut, da se pripravi TsCl-shSATB1, TsCl-Dox-shSATB1, TSMCL-shSATB1 in TSMCL-Dox-shSATB1 oz.

Določanje zeta potenciala, velikosti delcev in polidisperznost

Povprečna velikost delcev in polidisperznost porazdelitve delcev velikosti od liposome smo določili pri 25 ° C z dinamičnim sipanjem svetlobe z uporabo ZetaPALS delcev spreminjanja velikosti instrumenta (Brookhaven Instruments Corporation, ZDA). Zeta potencial liposomske disperzije smo merili z uporabo enake instrumenta pri 25 ° C po elektroforetske mobilnosti.

Določanje Doksorubicin naložen učinkovitosti

koncentracija DOX v liposome smo merili z fluorimeter ( Perkin Elmer, ZDA) z 485 nm vzbujanje in 590 nm filtri emisij z serijah dvakratnih redčenj prostega DOX kot standard. DOX naložen učinkovitost je izračunana na podlagi koncentracije dox.

Diferenčna dinamična kalorimetrija (DSC)

DSC je bila izvedena za ovrednotenje thermosensitivity liposomov z določitvijo temperature fazo prehoda (Tm). Tm je bil ovrednoten z nano DSC (TA Instruments, ZDA) s hitrostjo segrevanja 20 ° C /h, z 20 mg /ml fosfolipida.

In vitro toplotno DOX javnost testa s

20 ul dox naloženo liposome inkubiramo v 1 ml PBS in PBS s 50% fetalnega govejega seruma (FBS), ki posnema vivo okolja ločeno Eppendorf cevi. Vzorce smo segrevali v vodni kopeli pri 37 ° C in 42 ° C za 1 uro, oz. Nato se je intenziteta fluorescence za DOX meri v fluorimeter (Perkin Elmer, ZDA) z uporabo 485 nm vzbujanje in 590 nm filtri emisij. Za 100% sproščanje, so bili vzorci inkubirali v 1 ml PBS z 1% Triton X-100 za 1 min. Odstotki so sproščanjem dox smo izračunali kot sledilo: kjer _{je bilo F fluorescenca vzorcev po segrevanju, F 0 je bila začetna fluorescenca vzorcev pred segrevanjem in F 100 je fluorescenca vzorcev obdelamo z Triton X-100.}

celične kulture

Human želodca adenokarcinom MKN-28 celična linija je bila kupljena iz keygen Biotech (Nanjing, Kitajska) in gojimo v DMEM visoke glukoze dopolnjena z 10% FBS, 100 E /ml penicilina in 100 ug /ml streptomicina v vlažni atmosferi s 5% CO _{2 pri 37 ° C.}

vitro celična transfekcija

MKN-28 celice smo zasejali v 12 vdolbinami z gostoto 4 x 10 ^{5 celic /jamico in jih gojimo preko noči na okoli 80% konfluence. Naslednji dan smo celice dvakrat oprali s predhodno segreli PBS, nato smo TsCl-shSATB1 in TSMCL-shSATB1 dodane v vsako vdolbino in inkubiramo 6 ur. Celice inkubirana z TSMCL-shSATB1 bilo postavljenih 12 ter magnetno ploščo v prvih 30 minutah ponuditi magnetno polje. Naslednja je bila inkubacija medij nadomestimo z DMEM z dodatkom 10% FBS in celice inkubiramo 24 ur. Stopnja GFP izraz je bil ocenjen na podlagi fluorescenčnim mikroskopom (Nikon 80i) in pretoka citometrom (BD FACS Canto II).}

Real-time kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (RT-qPCR)

Total RNA je bila vzeta od MKN-28 celic z uporabo TRIzola regent (Invitrogen, Carlsbad, CA) po navodilih proizvajalca, je bila in cDNA sintetizirali z uporabo PrimeScript RT Master MIX (Takara, Dalian). PCR smo izvedli z uporabo SYBR premiks Ex Taq II (Takara, Dalian) na StepOne Plus PCR v realnem času sistem (Applied Biosystems, ZDA). Sekvence primerji so bili naslednji: SATB1 občutek 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 'in protismiselno 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3' GADPH občutek 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 'in protismiselno 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3'. Stopnja SATB1 mRNA je normalizirana tistemu GAPDH.

Western blot analiza

MKN-28 celice so bile pridelane in lizirali v RIPA pufra. Supernatante zberemo po centrifugiranju pri 10000 g 10 min. Koncentracija proteinov v supernatantu je bila določena z uporabo BCA protein analiznega kompleta. Nato 40 mikrogramov vzorcev smo izvedli na 15% SDS-PAGE in proteini so bile prenesene na PVDF membrane. Naslednji smo membrane inkubirali pri 5% nemastnega mleka 1 h blokirati nespecifične vezave in nato inkubiramo preko noči pri 4 ° C z SATB1 ali P-aktina protitelesa (1:500 redčenje). Membrane smo nato zaznati s HRP-konjugirano kozje anti kunec sekundarnih protiteles 30 minut. Končno smo membrane vizualizirali z izboljšano kemiluminiscentnim sistema (ECL, Pierce) in izpostavljene rentgenskim filmom.

In vitro ocena celični privzem

Za oceno znotrajcelično lokacijo dostavljenega dox in pGFP-SATB1 shRNA in okrepiti prodor liposomov v želodca rakavih celic z magnetno ciljno A FAM označeni siRNA (zelene fluorescence) je bila uporabljena za posnemati pGFP-SATB1 shRNA in DOX sama po sebi ima nagon rdeče fluorescence za spremljanje celični privzem . MKN-28 celice smo zasejali v 12-tudi ploščo na 4 × 10 ^{5 celic /dobro in zrasla čez noč. Nato celice inkubiramo s prostim siRNA, TsCl-siRNA, TSMCL-siRNA, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-DOX-siRNA ali TSMCL-DOX-siRNA 6 h. Za magnetne liposome, smo plošče pozicioniran na 12 vdolbinami magnetno ploščo v prvi uri inkubacije. Celice smo prikazali pod fluorescenčnim mikroskopom, da poiščete fluorescentne nalepke za DOX in siRNA. Jedra smo obarvali z DAPI (modro fluorescence).}

MTT testu

MKN-28 celice smo zasejali z gostoto 2 x 10 ^{4 celic /vdolbino v 96-vdolbinami in gojimo preko noči. Celice smo nato inkubirali z različnimi liposome pri 37 ° C 2 h CO _{2 inkubatorju. Za magnetne liposome, smo plošče pod 96-magnetno ploščo v prvih 1 uri inkubacije. Naslednji so bile celice dvakrat izprali s PBS in inkubiramo 46 ur v svežem mediju. Nato se je viabilnost celic izmerjena z MTT testom. Medij v vsako jamico bil nadomeščen z 20 ul raztopine MTT (Sigma-Aldrich, ZDA) in inkubiramo 4 ure pri 37 ° C, nato supernatante zavržemo in kristale formazana raztopili s 200 ul DMSO. Plošče smo izmerili pri 490 nm v mikroploščnem čitalniku in sposobnost preživetja celic smo izračunali po naslednji formuli:}}

pretočno citometrijo

Apoptoza je bila odkrita s pomočjo kompleta za aneksin V-FITC Apoptoza zaznavanja (eBioscience, ZDA). MKN-28 celice smo zasejali v 12 vdolbinami in obdelamo, kot je opisano zgoraj. Po 24 urah zberemo celice dvakrat izprali s PBS in suspendiramo v 500 ul vezavnem pufru. Naslednji so bile celice dvojna obarvamo z aneksinom V-FITC in propidijevim jodidom (PI). Celice v zgodnji fazi apoptoze barvanega z aneksin V-FITC, vendar ne obarvajo s PI so ovrednoteni s cytometery toka.

Model ksenotransplantskih miška

stari pet do šest tednov moški Balb /c golih miši so bile ki jih je Center za poskuse na živalih v Tongji medicinske fakultete. Vsaka miš smo inokulirali kožo v desni bok s 5 x 10 6 MKN-28 celic ^{. Več tednov po okužbi tumorja smo 36 tumor ob miši naključno razdelimo v šest skupin (n = 6). Miši injiciramo preko repa vene s prost DOX, TSMCL-dox, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1, TSMCL-DOX-shSATB1 ali fiziološke raztopine kot kontrolo. Doza dox bila 2,5 mg /kg in da iz pGFP-SATB1 shRNA je 10 mikrogramov na miš. Obdelava je enkrat je vsak 3 dni in tumor velikosti merjena preko calipering in potem se lahko volumen tumorja izračuna po naslednji formuli: volumen = (D _{min) 2 x D max /2, kjer je D Max najdaljši premer tumorja in D Min je najkrajša. Za TSMCL-dox, TSMCL-shSATB1 in TSMCL-DOX-shSATB1, je magnetna ciljanje doseči z nadaljnjo zunanjega magnetnega polja 5000 Gauss za 30 min s poudarkom na tumorja po uporabi drog. Vsi poskusi so bili potrjeni za etiko Odbor Tongji medicinske fakultete in vse živali so bile humano v skladu s smernicami institucionalno varstvo živali in uporaba odbora.}}

Statistična analiza

Podatki so bili izraženi kot povprečje ± standardni odklon (SD). Statistična značilnost med različnimi skupinami je bila ocenjena s t-test in analizo en faktor variance test (ANOVA). Za časa preživetja živali, so bile določene in se prijavite rang test Kaplan-Meier krivulje vsake skupine je bila izvedena za primerjavo stopnjo preživetja. p < 0.05 smo imeli statistično značilno

Rezultati

Karakterizacija liposome

Kot je razvidno iz tabele 1, je bil premer TsCl 83,6 ± 5,7 nm, medtem ko je TsCl. -DOX se je povečala na 118,5 ± 7,9 nm zaradi enkapsulacijo DOX. Medtem so premeri TsCl-shSATB1 in TsCl-Dox-shSATB1 znatno povečala na 161,1 ± 11,8 nm in 238.1 ± 20,6 nm, oziroma zaradi adhezije in fuzijo plazmidne DNA v liposomih. Za magnetne liposome, so v delcih velikosti TSMCL, TSMCL-dox, TSMCL-shSATB1 in TSMCL-DOX-shSATB1 135,0 ± 11,6 nm, 157,2 ± 14,3 nm, 221,3 ± 15,7 nm in 319,4 ± 20,1 nm, v tem zaporedju, bistveno večji od tistega, za TsCl, TsCl-dox, TsCl-shSATB1 in TsCl-DOX-shSATB1 zaradi ujetosti magnetnih nanodelcev. Poleg tega je velikost TSMCL-shSATB1 in TSMCL-DOX-shSATB1 bistveno večja, da na TSMCL in TSMCL-dox, oziroma (p < 0,05). Vse liposomi so imeli ozko porazdelitev velikosti, ker so bili njihovi Polidisperznosti ne več kot 0,3.

Zeta potencial TsCl, TsCl-dox, TsCl-shSATB1 in TsCl-DOX-shSATB1 bila 52,0 ± 7,3 mV, 50,1 ± 7,7 mV, 31.3 ± 5.2 mV in 26,7 ± 4,5 mV, oz. Po inkubaciji s pGFP-SATB1- shRNA, površinski stroški občutno zmanjšala (p 0.05), zaradi elektrostatične interakcije med kationskih lipidov in plazmidne DNA. Vendar zagozditev magnetnih nanodelcev ni povzročila znatno zmanjšanje Zeta potencial v magnetnih liposomov.

Za DOX naložen učinkovitost, DOX inkapsulaciji stopnja je bila 89 ± 3% in 78 ± 8% (n = 3) za TsCl-dox in TSMCL-DOX, in ki je bila 85 ± 7% in 73 ± 9% (n = 3) za TsCl-DOX-shSATB1 in TSMCL-DOX-shSATB1 oz. Ti podatki kažejo, da je interakcija med liposome in plazmida ni povzročilo uhajanje DOX.

thermosensitivity od liposome

diferencialno kalorimetrijo smo izvedli za določitev temperature faza prehoda TsCl. Kot je prikazano na sliki. 1, TsCl sestavljena iz DPPC, DC-holesterola, DOAB in holesterola v molskem razmerju 80:5:5:10 imelo Tm od 40,8 ° C z relativno širše prehodnem vrha, ki je lahko fuzijski prehod vrh DPPC in DOAB .

vitro thermosensitive DOX sproščanje od liposome

Kot je prikazano na sliki. 2, je DOX hitrost sproščanja od TsCl-dox in TSMCL-dox le 12% in 16% po inkubaciji s PBS pri 37 ° C in po inkubaciji poveča na 20% in 19%, z 50% FBS, oz. Za TsCl-Dox-shSATB1 in TSMCL-Dox-shSATB1, stopnja sproščanja DOX je bila 12% in 15% po inkubaciji s PBS pri 37 ° C, ter je oboje 16% po inkubaciji z 50% FBS, kar kaže, da je vključitev plazmida pomembnega vpliva na stabilnost liposomov (p > 0,05).

DOX hitrost sproščanja iz TsCl-dox in TSMCL-dox je po inkubaciji s PBS povečala na 37% pri 42 ° C, poveča na 45% in 49% po inkubaciji z 50% FBS, v tem zaporedju. Za TsCl-DOX-shSATB1 in TSMCL-DOX-shSATB1, stopnja sproščanja DOX je bila 35% in 43% po inkubaciji s PBS in FBS pri 42 ° C, v tem zaporedju, in sicer bistveno višja kot pri 37 ° C (p < 0,05). Ti rezultati kažejo, da imajo TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-DOX-shSATB1 in TSMCL-DOX-shSATB1 zaželeno thermosensitivity, in se lahko uporabijo za hipertermija sproži sproščanje nadzornega DOX.

utišanje SATB1 izražanja MKN-28 celice transficirane z liposomi

Nato smo ovrednotili učinkovitost liposome dostaviti shSATB1 vektor v MNK-28 celic. Tipični fluorescence podobe celic, transfektiranih s TsCl-shSATB1 in TSMCL-shSATB1 bile prikazane na sl. 3A. Pretok citometrija analiza je pokazala, da je bila učinkovitost transfekcije TsCl-shSATB1 le 15,4 ± 0,15%. Vendar pa je po uporabi magnetnega polja smernic, je bila učinkovitost transfekcije TSMCL-shSATB1 34,3 ± 0,93%, kar je bistveno višja od TsCl-shSATB1 (sl. 3B).

Da bi ugotovili, ali je dobavljeno shSATB1 vektorja lahko posreduje utišanje SATB1 izražanja v MKN-28 celice, smo izvedli v realnem času kvantitativne PCR in Western blot analizo. Rezultati so pokazali, da sta obe SATB1 mRNA in proteinske vrednosti zmanjšal v celicah, transfektiranih s TsCl-shSATB1 in TSMCL-shSATB1, v primerjavi s kontrolnimi celicami. Poleg tega je bila TSMCL-shSATB1 s pomočjo magnetnega polja močnejši kot TsCl-shSATB1 da inhibira SATB1 ekspresijo v MKN-28 celic (sl. 3C in D).

Magnetni usmerjeno in vitro celični privzem

za primerjavo prebojev v celice med nemagnetnih in magnetnih liposomov z uporabo magnetne usmerjeno vodenje, kot tudi znotrajcelične lokacije dobavljenega dox in shSATB1, siRNA FAM označenih bila uporabljena kot kazalnik. Odsotnost zeleno fluorescenco v celicah, obdelanih s prosto siRNA navedla, da ne more prodreti v celice (podatki niso prikazani). Opazili smo, da več celic zdravijo z TSMCL-siRNA razstavljena zeleno fluorescenco kot celice, ki so se zdravili z TsCl-siRNA (sl. 4A). Poleg tega je več celic, zdravljenih z TSMCL-dox je pokazala rdeče fluorescence kot celice, ki so se zdravili z TsCl-DOX (sl. 4b). V celicah, obdelanih z TSMCL-DOX-siRNA, so opazili visoke intenzivnosti fluorescence in celice pojavil roza zaradi združevanja modre, rdeče in zelene barve (sl. 4C). Te ugotovitve kažejo, da je TSMCL bolj učinkovit pri zagotavljanju siRNA in dox v celicah kot TsCl, po uporabi magnetnega polja.

Poleg tega smo pregledali znotrajcelično lokacijo dostavljenega dox in siRNA. Rdeče fluorescence opazili v obeh jedrih in citoplazmo, kar kaže, da je bila dostavljena DOX nahaja na obeh jedrih in citoplazmo. V nasprotju s tem, zeleni fluorescenčni pojavil predvsem v citoplazmi, kar kaže, da so bile siRNAs podano v citoplazmo (sl. 4D). Združitev rdeče in zelene pojavil rumeno v citoplazmi in združitev modre in rdeče pojavil sivke v jedra. Če povzamemo, ti podatki kažejo, da se lahko tako TsCl in TSMCL prodrejo v želodcu rakavih celic in zagotavljajo njihovo vsebino v citoplazmo (DOX in siRNA) in jeder (DOX).

In vitro anti-tumorske Učinkov liposomi

smo ocenili in vitro anti-tumorske učinke tega sistema co dostavo z citotoksičnosti in apoptozo indukcijsko dejavnosti. Citotoksičnost liposome je bila ocenjena z MTT testom. Za določitev učinkov dox in plazmida koncentracije na citotoksičnosti liposome, smo pregledali liposome naloženi z različnimi koncentracijami dox in različnimi količinami SATB1 shRNA. S povečanjem koncentracije dox smo Citotoksičnost liposome povečala (sl. 5A). Vendar pa je poleg koncentracije SATB1 shRNA ni povzročila povečane citotoksičnosti, in tam so bili le rahlo povečanje citotoksičnosti, ko je koncentracija SATB1 shRNA približno 4 mikrogramov (sl. 5B). Tako smo uporabili 25 mikrometrov dox in 4 ig SATB1 shRNA primerjati citotoksičnost med prosto DOX, prosti shRNA, TsCl, TSMCL, TsCl-dox, TSMCL-dox, TsCl-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 in TSMCL- DOX-shSATB1.

Kot je prikazano na sliki. 5C, brez shRNA, TsCl in TSMCL le malo citotoksičnost. sposobnost preživetja celic je bila 40,3 ± 3,4%, 73,6 ± 3,5% in 51,3 ± 4,5% brezplačno DOX, TsCl-dox in TSMCL-DOX, oziroma, kar kaže, da je citotoksičnost TSMCL-dox je bila višja od TsCl-DOX, vendar nižja od prostega DOX . sposobnost preživetja celic je bila 79,2 ± 6,9% in 71,6 ± 4,7% za TsCl-shSATB1 in TSMCL-shSATB1, oziroma, ki ne kaže statistično pomembna (p > 0,05). Za drogami in genski skupnemu ustvarjanju, je viabilnost celic, le 35,0 ± 3,2% in 22,3 ± 3,4% za TsCl-DOX-shRNA in TSMCL-DOX-shRNA, oziroma, kar je bistveno nižja od svobodne DOX, TsCl-DOX, TSMCL- dox in SATB1shRNA naloženo liposome (p < 0,05). Poleg tega je bila viabilnost celica TSMCL-Dox-shRNA znatno nižja od tiste TsCl-Dox-shRNA (p 0.05). Ti rezultati kažejo, da je sinergistično citotoksičnost učinek dosežemo z co-dali dox in SATB1 shRNA. Poleg tega je z uporabo magnetne usmerjeno, dodatno okrepljeno citotoksičnost mogoče dobiti.

Za določitev dodaten mehanizem proti tumorjem poleg citotoksičnosti sistema co-dostavo, smo ugotavljali stopnjo apoptoze MKN-28 celice, ki se zdravijo z prosto DOX, TsCl-dox, TSMCL-dox, TsCl-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 in TSMCL-DOX-shSATB1 s pretočno citometrijo. Kot je razvidno iz sl. 5D, je bila stopnja apoptoza 22,3% v celicah, ki so se zdravili z brezplačnim DOX, je bila 8,9% v celicah, zdravljenih z TsCl-DOX, vendar v celicah, ki so se zdravili z TSMCL-dox in magnetnega polja povečal na 13,4%. Podobno je bila stopnja apoptoze 9,4% v celicah, zdravljenih z TsCl-shSATB1, vendar v celicah, ki so se zdravili z TSMCL-shSATB1 in magnetnega polja povečal na 17,4%. V nasprotju s tem, stopnja apoptoza je v celicah, ki so se zdravili s TsCl-DOX-shSATB1 27,7% višja kot v celicah, ki so se zdravili z TsCl obremenjenih s DOX ali shSATB1 sam. Stopnja apoptoza je v celicah, ki so se zdravili z TSMCL-DOX-shSATB1, kar je največ med vsemi skupinami 32,4%. Ti rezultati kažejo, da je-co dali DOX in SATB1 shRNA vodi v kombiniranih učinkov indukcije apoptoze. Skratka, ta sistem sodelovanja za izkazuje močne učinke protitumorske vitro.

vivo protitumorsko aktivnost liposomi

Za določitev in vivo protitumorsko aktivnost sistema co-dostavo, smo ugotovili, MKN-28 mišje modeli ksenotransplantskih in vbrizga prost DOX, TSMCL-dox, TSCML-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 ali TSMCL-DOX-shSATB1 v miši skozi rep veno. Obdelava je enkrat vsakih 3 dni, in tumorji smo secirali (sl. 6A). Na dan 15., je bil obseg tumor 0,44 ± 0,05 cm ^{3 pri miših, zdravljenih z TSMCL-DOX-shSATB1, precej nižja od tiste v solno skupini (2,14 ± 0,23 cm 3), Free DOX skupina (1,08 ± 0,13 cm 3), TSMCL-DOX skupina (0,68 ± 0,10 cm 3), TSCML-shSATB1 skupina (1,43 ± 0,21 cm 3), in TsCl-DOX-shSATB1 skupine (0,77 ± 0,12 cm 3) (sl. 6B).}

Poleg tega, kot je prikazano na sliki. 6 (C), mediana časa za volumen tumorja, da dosežejo 2 cm ^{3 je bil 30 dni v skupini TSMCL-DOX-shSATB1, daljša kot v solno skupini, Free DOX skupina, TSMCL-DOX skupina, skupina TSCML-shSATB1 in TsCl-DOX-shSATB1 filter (sl. 6C). Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da sodelovanje dali DOX in shSATB1 jih TSMCL kaže sinergistični proti tumorjem učinka in vivo.}

Pogovor

Kljub nedavni razvoj na operacijo, obsevanjem in ciljno zdravljenje, kemoterapija je še eden od pomembnih pristopov k zdravljenju raka želodca. Vendar terapevtske učinke kemoterapije so pogosto nezadovoljni in se ne bi bistveno izboljšala prognozo bolnikov z rakom [19]. Eden od glavnih razlogov je tumorigeneze in napredovanje raka želodca vključuje vrsto različnih mehanizmov; enotna proti tumorjem mehanizem tradicionalnega kemoterapije je omejila njihove terapevtske učinke, s tem kombinacijo kemoterapije z gensko terapijo lahko izboljša protitumorskih učinkov. Ena ovira kemoterapije je, da se sistemsko dajanje droge povzroča omejeno koncentracije zdravila v tumorskih mestih, medtem ko povzroča veliko škodljivih učinkov [8]. Ključ za reševanje teh problemov se opira na nove načine dobave drog, zato razvojem ciljno usmerjenih multi-agenti dostavljajo sistem, ki jih je mogoče neposredno vodene na mestu tumorja z nadzorovanim sproščanjem mogoče odpraviti te probleme in izboljšali terapevtske učinke [20] - [25] .

Med različnimi drug delivery systems, liposomi so najbolj obetavne za dobrih biocompatibilities, ki povzročajo malo ali nič antigeni, alergični, in toksične reakcije in lahko opravijo biorazgradnjo. Kot tako nosilci zdravil in genov, liposome ne le zaščitijo gostitelja pred škodljivimi učinki kapsulah zdravila, ampak tudi preprečiti, ujete vsebine iz prezgodnjo inaktivacijo zaradi fiziološkem mediju [26]. Poleg tega je v liposome, je potencialno ciljno Sistem za dajanje zdravila, ali je doseženo s povečano prepustnostjo in zadrževanje (EPR) učinkom (pasivno usmerjena), ali z usmerjanjem magnetnega polja in imunskega povezavo (Active ciljno) [27]. Poleg tega so nekatere liposomi imajo pod nadzorom sproži značilnosti sproščanja drog, kot so termo občutljivosti, občutljivost pH in občutljivosti v mikrovalovni pečici.

V zadnjem času smo razvili nov magnetno usmerjen sistem toplotno drogami in genski sodelovanje dostave (TSMCL). Na podlagi elektronevtralni toplotno oblikovanje (DPPC:Cholesterol = 80:20), smo dodali različne kationskih komponent ter optimizirali thermosensitivity liposomov s testom kalcein sproščanja. Rezultati so navedli, da bi lahko dobili želene thermosensitivity z zamenjavo 10 mol delov holesterol 5 mol delov DC-holesterola in 5 mol delov DOAB (DPPC:DC-Cholesterol:DOAB:Cholesterol = 80:5:5:10), in kalcein sproščanje iz liposome bi bila nižja pri 37 ° C, vendar znatno višja kot 42 ° C, pri tej formulaciji. Dalje, Magnetic fluid Fe _{3O 4 je bil uporabljen kot jedro in deloval kot magnetno ciljno usmerjenostjo in vir segrevanja TSMCL. Vibracijski Vzorec Magnetometer (VSM) meritev je pokazala, da magnetni fluid Fe 3O 4 je bil Superparamagnetni, s čimer bi TSMCL imajo dobre magnetne usmerjene učinke. Medtem, časovno odvisne ogrevalne krivulje tako so pokazale, da sta magnetni fluid Fe 3O 4 in TSMCL lahko segrevamo od 25 ° C do 42 ° C v 20 min. S pomočjo magnetnega fluida Fe 3O 4, magnetnega ciljno usmerjenost in temperature sproži sproščanje zdravilo TSMCL bilo mogoče uresničiti. Nazadnje, TsCl in TSMCL so razstavljene tipične liposomski morfologijo in dobre distribucij pod TEM. Na podlagi uspešnega gradnjo TSMCL, v tej študiji smo naložili DOX in SATB1 shRNA vektor v TSMCL da TSMCL-DOX-shSATB1 in ocenili učinke anti-tumorske proti želodčnih rakavih celic in vitro in in vivo.}

DOX je pogosto uporabljena droga v kemoterapiji z visokim izkoristkom, da zavira proliferacijo tumorskih celic in inducira tumorja apoptozo celic, vendar njegovi zdravilni učinki so omejeni zaradi hude kardiotoksičnostjo in supresijo kostnega mozga, ko upravlja sistemsko [28]. Čeprav so DOX liposome delno izboljšalo stanje, pomanjkanje ciljano dostavo še limites njihove uporabe [29]. SATB1 je globalno kromatin organizator, ki neposredno ureja izražanje ERRB2, MMP2, ABL1 in E-kadherina, da deluje kot ključni regulator razvoja raka [30]. Čezmerno SATB1 v različnih tumorjih je bila povezana z malignimi bioloških vedenja, kot invazija, orožja in metastaz [10] - [13]. Utišati SATB1 izražanje male interferenčne RNA (siRNA) ali plazmida, ki kodira kratko harpin RNA (shRNA) lahko zavira, proliferacije, invazijo in metastaze in inducira apoptozo različnih tumorskih celic [16], [17]. Zato SATB1 postane potencialno primerna za zdravljenje raka [30]. Vendar pa je primerno dostavna vektorji za siRNA ali shRNA so pomembne za SATB1 ciljni gen raka zdravljenje.

V tej študiji s pomočjo TSMCL-DOX-shSATB1 sistem, tako DOX in SATB1 shRNA vektor lahko vodijo do mesta tumorja na podlagi magnetne vložena smernice in DOX je izšla v hipertermija sproži način. Hipertermija sproži sproščanje je odvisno od toplotno liposome, ki so v glavnem sestavljeni iz Dipalmitoyphosphocholine (DPPC), ki je pod gel za tekoče kristalni fazi prehoda (Tm), ki postane zelo utor za mala vodotopne molekule pri 41 ° C [31]. Liposomi sestavljeni iz različnih DPPC in lipidi imajo izrazito Tm in thermosensitivity [32]. DSC analiza je pokazala, da je Tm našega dostavnega sistema 40,8 ° C in vsebnosti DOX sproščanjem je pokazala, da je bila nespremenjena pri 37 ° C, medtem ko je DOX sprosti, ko se temperatura dvigne na 42 ° C.

• Plos ONE: Izražanje družine ESPG želodčnega raka: downregulation za HER4 in njenega Aktiviranje ligand NRG4
• Plos ONE: Roman Funkcionalna TagSNP Rs7560488 v DNMT3A1 Promotor je povezan z dovzetnostjo za Rak želodca s spreminjanjem Promotor Activity