PLoS One: Co-Delivery a doxorubicin és SATB1 shRNS által hőérzékeny Mágneses kationos liposzómák gyomorrák Therapy

absztrakt katalógusa

A korábbi tanulmány azt már kifejlesztett egy újszerű hőérzékeny mágneses szállítórendszer alapuló liposzómák. Ez a tanulmány célja, hogy értékelje a hatékonyságát ez a rendszer a társ-szállítási mindkét gyógyszer és a gének ugyanazon sejt és tumorellenes hatásokat gyomorrák. Doxorubicin (DOX) és SATB1 shRNS vektort vittünk be a társ-szállítási rendszer, és az in vitro DOX hőérzékeny kioldó aktivitással, a célzott gén silencing hatékonyság, célzott celluláris felvétel in vitro citotoxicitást, valamint in vivo tumorellenes aktivitást meghatároztuk. Az eredmények azt mutatták, hogy ez a co-szállító rendszer volt kívánatos célzott szállítás hatékonyságát, DOX hőérzékeny kibocsátási és SATB1 géncsendesítéssel. Sőt, a társ-szállítási DOX és SATB1 shRNS mutattak az fokozott aktivitással, hogy gátolják a gyomor rákos sejtek növekedését in vitro és in vivo körülmények között, összehasonlítva egyetlen szállítás. Összefoglalva, a újszerű hőérzékeny mágneses gyógyszer és gén co-szállítási rendszer ígéretes alkalmazása a kombinált kemoterápia és génterápia gyomorrák.

bevezető hivatkozás: Peng Z, Wang C, Fang E, Lu X, Wang G., Tong Q (2014) Co-Delivery a doxorubicin és SATB1 shRNS által hőérzékeny Mágneses kationos liposzómák gyomorrák terápia. PLoS ONE 9 (3): e92924. doi: 10,1371 /journal.pone.0092924 katalógusa

Szerkesztő: Elena A. Rozhkova, Argonne National Laboratory, az Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: december 4, 2013; Elfogadva: február 26, 2014; Megjelent: március 27, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Peng et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány támogatta a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 81172186). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák a negyedik közös rák és a második vezető daganatos halálok világszerte. [1] 2008-ban mintegy 989.000 új esetet a gyomorrák és 738.000 halálesetet a világon, amely elsősorban történt Keleten, Dél-és Közép-Ázsiában; Közép- és Kelet-Európában; és Dél-Amerikában [2], [3]. Kínában, a gyomorrák a harmadik közös rák becsült 380.000 új esetet és a legmagasabb a halálozási arány mintegy 26,3 per lakossága 100.000 évente [4], [5]. Sebészi eltávolítását a közös gyógyító lehetőség, de ez nem alkalmas a legtöbb betegnél, akiknél késői szakaszában gyomorrák. Más terápiákkal, például a sugárkezelés és a kemoterápia mutatnak némi hatásosság, de gyakran nem kielégítő [4], [6]. Ezen túlmenően, a szisztémás kemoterápia okoz káros hatásokat [7], [8].

Mivel a fejlesztés a gyógyszer-rezisztencia, hogy a kemoterápia, a hagyományos kemoterápia szintén többször korlátozott tumorellenes hatékonyságát [9]. Ezért multi-ágens co-leadó rendszer nyert több figyelmet a közelmúltban, mert lehet szállítani a különböző típusú hatóanyagok ugyanazon tumorsejtek amelyek aztán szinergetikus tumorellenes hatást. Például két különböző kémiai ágensek is kombinálható, vagy egy kémiai anyag is kombinálható a kis interferáló RNS-t (siRNS-t) ellen egy onkogén. Sőt, a célzott szállítás és szabályozott hatóanyag-leadás tovább fokozza az anti-tumor hatását és csökkenti a kedvezőtlen hatásokat.

Különleges AT-gazdag fehérje (SATB1) egy globális kromatin szervező, hogy szabályozza a génexpressziót, és részt vesz a moduláció malignus biológiai viselkedés a rák [10]. Aberráns expresszióját SATB1 kimutatták, hogy támogatni emlőrák, a tüdőrák és a limfóma [11] - [13]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy SATB1 fontos szerepet játszik a gyomorrák, és előfordulhat, hogy egy független prognózis markere gyomorrák [14], [15]. Elnyomása expressziójának SATB1 azáltal siRNS vagy plazmid kódoló specifikus interferáló rövid harpin RNS (shRNS) ellen SATB1 gátolhatják a proliferációt és invázió, és elősegíti a tumorsejtek apoptózisát [16], [17]. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy SATB1 potenciális terápiás célpont gyomorrák. Katalógusa

Úgy gondoljuk, hogy a kombináció a génterápia és a kemoterápia jelentősen növelni lehetne terápiás hatékonyságot ellen gyomorrák. Korábbi vizsgálatunkban, kifejlesztettünk egy célzott hőérzékeny co-szállító rendszer alapján hőérzékeny mágneses kationos liposzómák (TSMCL). By Kalcein felszabadulás vizsgálatban azt is optimalizálták a hőérzékeny liposzómás, majd mérjük a mágneses tulajdonságait és génbeviteli hatékonyságát TSMCL. Ebben a vizsgálatban azt betöltve doxorubicin és SATB1-shRNS vektor ebbe rendszer kombinációja génterápia és a kemoterápia, és értékelték azok szinergikus tumorellenes hatást szemben a gyomorrák, in vitro és in vivo.

Anyagok és módszerek

anyagok

koleszterin, 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-foszfokolin (DPPC) és 3β- [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) -karbamoil] koleszterin (DC-Chol) beszerezve Avanti Polar Lipids (USA). Dimetii-bromidot (DOAB) a Sigma-Aldrich (USA). Mágneses Fluid Fe _{3O 4-et szintetizálni Galaxy Nanotech (Kína). FAM jelölt siRNS és a plazmid beklónoztuk-SATB1 shRNS biztosította GenePharma (Sanghaj, Kína). Doxorubicin vásárolt Hisun Pharmaceutical (Zhejiang Kína). Magzati borjúszérummal (FBS), táptalajok, penicillin /sztreptomicin (Pest) és a tripszin szállított (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). SATB1 nyúl monoklonális antitest a Epitomics (ABCAM, UK). Az összes többi vegyszer kereskedelmi analitikai tisztaságú és további tisztítás nélkül használtuk.}

előállítása co-leadó rendszer

Ez a ko-leadó rendszer alapult hőérzékeny kationos liposzómákat, amelyeket helyben készítettünk egy hőérzékeny kationos készítmény DPPC, DC-koleszterin-, DOAB és koleszterin mólarányban 80:5:5:10 optimalizált Előkísérleteink. Liposzómák (TsCI) állítottuk elő a vékony film hidratációs módszer, majd extrudálással [18]. Az ammónium-szulfát gradiens módszert alkalmaztunk betölteni DOX be TsCI (TsCI-DOX). Hogy előkészítse mágneses liposzómák (TSMCL), mágneses folyadék Fe _{3O 4-et használjuk, mint a mag, és együtt kapszulázott ammónium-szulfáttal puffert a liposzómák. Miután a kialakulását vékony film a kerek fenekű lombikban Egy milliliter szuszpenzió a vas és ammónium-szulfátot adunk, hogy hidratálja a film, majd extrudáljuk keresztül a polikarbonát szűrők és megrakott DOX (TSMCL-DOX) által az ammónium-szulfát gradiens módszer . Végül a termékeket a gélszűrés centrifugáltuk 1000 g-vel 15 percig, hogy távolítsa el nem kapszulázott Fe 3O 4.}

beklónoztuk-SATB1-shRNS (shSATB1) vektor inkubáltunk különböző liposzómák szérummentes közegben, szobahőmérsékleten 30 percig, hogy készítsen TsCI-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1, TSMCL-shSATB1 és TSMCL-DOX-shSATB1, ill.

meghatározása zéta-potenciál, részecskeméret, és polidiszperzitás

az átlagos részecskeméret és a polidiszperzitása részecskeméret-eloszlása ​​a liposzómák határoztuk meg 25 ° C-on dinamikus fényszórás segítségével ZetaPALS részecske méretezés eszköz (Brookhaven Instruments Corporation, USA). A zéta-potenciál értéke a liposzóma diszperziók alkalmazásával mértük az azonos eszköz a 25 ° C a elektroforetikus mobilitás.

meghatározása doxorubicin betöltött hatékonyság

DOX koncentrációját a liposzómák mértük fluoriméter ( Perkin Elmer, USA), 485 nm gerjesztési és 590 nm-es emissziós szűrőket egy hígítási sort szabad DOX, mint a standard. DOX betöltött hatékonysága alapján számítottuk DOX koncentráció.

differenciál pásztázó kalorimetriás (DSC)

DSC végeztünk, hogy értékelje a thermosensitivity liposzómák meghatározásával a fázis átmeneti hőmérséklet (Tm). Tm alkalmazásával értékeltük egy nano DSC (TA Instruments, USA) egy fűtési sebesség 20 ° C /h, 20 mg /ml foszfolipid.

In vitro hőérzékeny DOX felszabadulási vizsgálatban

20 ul DOX feltöltött liposzómákat inkubáltunk 1 ml PBS-ben és PBS-ben 50% -os magzati marhaszérumot (FBS), amely utánozza az in vivo környezetben külön-külön Eppendorf csövekbe. A mintákat melegítjük vízfürdőn, 37 ° C-on és 42 ° C-on 1 órán át, ill. Ezután a fluoreszcencia intenzitását DOX mértük egy fluoriméter (Perkin-Elmer, USA) alkalmazásával 485 nm-es gerjesztési és 590 nm emissziós szűrőket. A 100% -os kibocsátás, a mintákat inkubáltuk 1 ml PBS-ben, 1% Triton X-100, 1 percig. A DOX kiadás százalékos számoltuk a következő: ahol F _{s volt fluoreszcencia minták melegítés után, F 0 volt a kezdeti fluoreszcencia minták melegítés előtt, és F 100 volt a fluoreszcencia kezelt mintákban Triton X-100.}

Sejtkultúra

emberi gyomor adenokarcinóma MKN-28 sejtvonalat vásárolt keygen Biotech (Nanjing, Kína) és tenyésztettük magas glükóz DMEM, kiegészítve 10% FBS-sel, 100 U /ml penicillinnel és 100 ng /ml sztreptomicinnel párásított atmoszférában, 5% CO _{2 37 ° C-on.}

in vitro cell transzfekciós

MKN-28 sejteket oltottunk 12-mélyedéses lemez sűrűségben 4 × 10 ^{5 sejt /lyuk, és egy éjszakán át tenyésztettük, hogy körülbelül 80% -os összefolyásig. Következő napon a sejteket kétszer mostuk előre melegített PBS, majd TsCI-shSATB1 és TSMCL-shSATB1 adtunk minden egyes lyukba és inkubáljuk 6 órán át. A sejteket inkubáltuk TSMCL-shSATB1 voltak elhelyezve 12 lyukú mágneses lemez alatt az első 30 perc nyújt mágneses mezőt. Ezután az inkubációs közeget kicseréltük DMEM, kiegészítve 10% FBS-t, és a sejteket 24 órán át inkubáltuk. GFP szinten értékeltük alatt fluoreszcens mikroszkóp (Nikon 80i) és áramlási citométerrel (BD FACS Canto II). Katalógusa}

Valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (RT-qPCR) hotelben

teljes RNS- származó MKN-28 sejtek TRIzol Regent (Invitrogen, Carlsbad, CA) a gyártó utasításai, és cDNS-t szintetizáltunk PrimeScript RT master Mix (Takara, Dalian). A PCR-t SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Dalian) egy StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). A szekvenciákat a primerek a következők voltak: SATB1 értelemben 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 ', és antiszensz 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3' GADPH értelemben 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 ', és antiszensz 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3'. SATB1 mRNS szintje normalizáltuk, hogy a GAPDH.

Western-blot-analízis

MKN-28 sejteket begyűjtöttük és lizáltuk RIPA pufferben. A felülúszókat összegyűjtöttük centrifugálás után 10000 g-nél 10 percig. Fehérjekoncentrációját a felülúszó alkalmazásával határoztuk meg egy BCA Protein Assay Kit. Ezután 40 ug mintákat futtattuk egy 15% -os SDS-PAGE és fehérjéket átvittük PVDF-membránokra. Ezután a membránokat 5% zsírmentes tej 1 órán át blokkoljuk a nemspecifikus kötődés, majd egy éjszakán át inkubáljuk 4 ° C hőmérsékleten SATB1 vagy β-aktin antitest (1:500 hígítás). A membránokat ezután próbaként HRP-konjugált kecske anti-nyúl másodlagos ellenanyagot 30 percig. Végül a membránokat tettük láthatóvá fokozott kemilumineszcenciás rendszert (ECL, Pierce), és ki vannak téve a röntgen film.

in vitro kiértékelését celluláris felvétel

értékeli a sejten belüli helye szállított DOX és beklónoztuk-SATB1 shRNS és a fokozott penetráció a liposzómák a gyomor rákos sejtek által mágneses célzott, egy FAM-jelölt siRNS (zöld fluoreszcencia) használtunk utánozni beklónoztuk-SATB1 shRNS és DOX önmagában rendelkezik egy ösztön vörös fluoreszcencia ellenőrzésére celluláris felvételét . MKN-28 sejteket szélesztettünk 12 lyukú lemezre 4 × 10 ^{5 sejt /lyuk, és egy éjszakán át tenyésztettük. Ezután a sejteket inkubáltuk szabad siRNS, TsCI-siRNS, TSMCL-siRNS, TsCI-DOX, TSMCL-DOX, TsCI-DOX-siRNS vagy TSMCL-DOX-siRNS 6 órán át. A mágneses liposzómák, a lemezeket elhelyezve egy 12 lyukú mágneses lemez az első órában az inkubáció. A sejteket tettük láthatóvá fluoreszcens mikroszkóppal, hogy keresse meg a fluoreszcens jelölések DOX és siRNS. A sejtmagokat megfestettük DAPI-t (kék fluoreszcencia).}

MTT assay

MKN-28 sejteket oltottunk sűrűségben 2 × 10 ^{4 sejt /lyuk 96 lyukú lemezeken és egy éjszakán át tenyésztettük. A sejteket ezután inkubáljuk különböző liposzómákat 37 ° C-on 2 órán CO _{2 inkubátorban. A mágneses liposzómák, a lemezeket alá helyezzük egy 96-lyukú mágneses lemez alatt az első 1 órás inkubáció. Ezután a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, és inkubáltuk 46 órán friss tápközeggel. Ezt követően a sejtek életképességét mértük MTT vizsgálattal. A tápközeget mindegyik mérőhelyen váltotta 20 ul MTT-oldatot (Sigma-Aldrich, USA), és inkubáltuk 4 órán át 37 ° C-on, majd a felülúszókat eldobjuk és formazán kristályokat feloldjuk 200 pl DMSO-ban. A lemezeket mértük 490 nm-en, egy mikrotiterlemez-leolvasó, és a sejt életképességét alapján számoltuk a következő képlettel:}}

Áramlási citometria

Az apoptózist detektáltuk egy Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (eBioscience, USA). MKN-28 sejteket szélesztettünk 12 mérőhelyes lemezeken, és kezeljük a fent leírt módon. 24 óra elteltével a sejteket összegyűjtöttük, kétszer mostuk PBS-sel és szuszpendáljuk 500 ul kötőpufferrel. Ezután a sejteket kétszeres festettük Annexin V-FITC és propidium-jodid (PI). A sejteket egy korai időpontjában apoptózis festettük Annexin V-FITC-vel, de nem festettük PI mennyiségileg áramlási cytometery.

xenograft egérmodellben

Öt-hat hetes hím Balb /c csupasz egerek által biztosított Center for Animal Experiments Tongji Medical College. Minden egeret szubkután oltottuk be a jobb lágyék 5 × 10 ^{6 MKN-28 sejtekben. Néhány héttel a daganat beoltása után, 36 tumort hordozó egereket véletlenszerűen osztottuk hat csoportra (n = 6). Az egereket injektáltunk a farokvénába Free DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TsCI-DOX-shSATB1, TSMCL-DOX-shSATB1 vagy normál sóoldattal kontrollként. Az adagot a DOX volt 2,5 mg /kg, és hogy a beklónoztuk-SATB1 shRNS volt 10 ng egerenként. A kezelést naponta egyszer 3 naponként és a tumor méretét mértük keresztül calipering majd tumor térfogatát lehetett kiszámítani a következő képlettel: térfogat = (D _{Min) 2 × D max /2, ahol D Max volt a leghosszabb tumor átmérője D Min volt a legrövidebb. A TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 és TSMCL-DOX-shSATB1, a mágneses célzás alkalmazásával értük el folyamatos külső mágneses mező 5000 Gauss 30 percig összpontosítva a daganat a gyógyszer beadása után. Minden kísérletet jóvá Etikai Bizottsága Tongji Medical College, és minden állatot humánus szerint Institutional Animál Care and Use Committee irányelveket. Katalógusa}}

Statisztikai elemzés katalógusa

Az adatokat az átlag és ± szórás (SD). A statisztikai szignifikancia különböző csoportok között értékeltük a Student-féle t-teszt és egy a-faktor varianciaanalízissel (ANOVA) teszt. A túlélési idő az állatok, a Kaplan-Meier görbék az egyes csoportok jöttek létre és a log rank tesztet végeztük, hogy összehasonlítsuk a túlélési arány. p < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.

Eredmények

jellemzése liposzómák

Amint az 1. táblázatban látható, az átmérője TsCI 83,6 ± 5,7 nm-en, míg a TsCI -DOX emelték 118,5 ± 7,9 nm-en, mivel a kapszulázási DOX. Eközben a átmérői TsCI-shSATB1 és TsCI-DOX-shSATB1 jelentősen növelték a 161,1 ± 11,8 nm, és 238,1 ± 20,6 nM, köszönhetően a tapadás és a fúziós plazmid DNS-t, hogy a liposzómák. A mágneses liposzómák részecskemérete TSMCL, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 és TSMCL-DOX-shSATB1 voltak 135,0 ± 11,6 nm, 157,2 ± 14,3 nm, 221,3 ± 15,7 nm, és 319,4 ± 20,1 nm, illetve, lényegesen nagyobb, mint amely a TsCI, TsCI-DOX, TsCI-shSATB1 és TsCI-DOX-shSATB1 miatt a beszorulás a mágneses nanorészecskék. Továbbá, a mérete TSMCL-shSATB1 és TSMCL-DOX-shSATB1 szignifikánsan nagyobb, mint a TSMCL és TSMCL-DOX volt (p < 0,05). Minden liposzómák szűk méreteloszlása ​​mert polydispersities nem volt több, mint 0,3. Katalógusa

Zeta lehetőségeinek TsCl, TsCl-DOX, TsCl-shSATB1 és TsCl-DOX-shSATB1 volt 52,0 ± 7,3 mV, 50,1 ± 7,7 mV, 31,3 ± 5,2 mV és 26,7 ± 4,5 mV volt. Inkubálás után beklónoztuk-SATB1- shRNS, a felület költség jelentősen csökkent (p < 0,05) miatt az elektrosztatikus kölcsönhatás a kationos lipidek és a plazmid DNS-t. Azonban, beszorulás mágneses nanorészecskék nem eredményezett jelentős csökkenést a Zeta potenciál mágneses liposzómák.

DOX betöltve a hatékonyság, a DOX kapszulázó sebesség 89 ± 3%, illetve 78 ± 8% (n = 3) a TsCI-DOX és TSMCL-DOX, illetve és 85 ± 7% és 73 ± 9% -kal (n = 3) a TsCI-DOX-shSATB1 és TSMCL-DOX-shSATB1, ill. Ezek az adatok azt jelzik, hogy a kölcsönhatás a liposzómák és a plazmid nem eredményezett DOX szivárgást.

A thermosensitivity a liposzómák

Differenciális pásztázó kalorimetria végeztünk annak megállapítására, a fázis átmeneti hőmérséklet TsCI. Ábrán látható. 1, TsCI tagjai DPPC, DC-koleszterin-, DOAB és koleszterin mólarányban 80:5:5:10 Tm 40,8 ° C-on egy viszonylag szélesebb átmenet csúcs, amely lehet a fúziós átmenet csúcs DPPC-t és DOAB .

in vitro hőérzékeny DOX felszabadulását a liposzómák

ábrán látható. 2, DOX kibocsátási sebesség TsCI-DOX és TSMCL-DOX volt csak 12% és 16% inkubálás után PBS-sel 37 ° C-on és 20% -ra nőtt, és 19% az inkubálás után 50% FBS-t, ill. A TsCI-DOX-shSATB1 és TSMCL-DOX-shSATB1, DOX felszabadulás mértéke 12% volt, és 15% inkubálás után PBS-sel 37 ° C-on, is volt 16% inkubálás után 50% FBS-t, jelezve, hogy a beépítése plazmid volt nincs jelentős hatása a stabilitását liposzómák (p 0,05).

DOX kibocsátási sebesség TsCI-DOX és TSMCL-DOX-ben 37% -ra nőtt inkubálás után PBS-sel 42 ° C hőmérsékleten, és 45% -ra, és 49% inkubálás után 50% FBS-t, ill. A TsCI-DOX-shSATB1 és TSMCL-DOX-shSATB1, DOX felszabadulás mértéke 35% volt, és 43% az inkubálás után PBS-sel, és FBS-42 ° C hőmérsékleten, illetve mindkét szignifikánsan magasabb, mint 37 ° C (p < 0,05). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy TsCI-DOX, TSMCL-DOX, TsCI-DOX-shSATB1 és TSMCL-DOX-shSATB1 van kívánatos thermosensitivity, és fel lehet használni a hipertermia kiváltott kontroll felszabadulását DOX.

csendesítése SATB1 expresszió MKN-28 transzfektált sejtek liposzómákkal

Ezután értékeltük a hatékonyságot a liposzómák szállít shSATB1 vektor MNK-28 sejtekben. Tipikus fluoreszcencia képek transzfektált sejtek TsCI-shSATB1 és TSMCL-shSATB1 arra ábrán látható. 3A. Áramlási citometriás analízis azt mutatta, hogy a transzfekciós hatékonysága TsCI-shSATB1 csak 15,4 ± 0,15%. Azonban, miután az alkalmazás a mágneses mező útmutatást, a transzfekció hatékonysága TSMCL-shSATB1 volt 34,3 ± 0,93%, jelentősen magasabb, mint a TsCI-shSATB1 (ábra. 3B).

Annak meghatározására, hogy a szállított shSATB1 vektor közvetíthetik csendesítése SATB1 expresszió MKN-28 sejtek, végeztünk valós idejű kvantitatív PCR és Western blot analízissel. Az eredmények azt mutatták, hogy mind a SATB1 mRNS és fehérje szint csökkent transzfektált sejtekben TsCI-shSATB1 és TSMCL-shSATB1, kontroll sejtekhez viszonyítva. Sőt, TSMCL-shSATB1 segítségével mágneses mező volt hatásosabb, mint a TsCI-shSATB1 gátlására SATB1 expresszió MKN-28 sejtek (3C., D).

Mágneses célzott in vitro celluláris felvételét katalógusa

összehasonlítani a behatolás a sejtekbe között nem mágneses és a mágneses liposzómák alkalmazásával mágneses célzott útmutatást, valamint a sejten belüli helye szállított DOX és shSATB1, egy FAM-jelölt siRNS-t alkalmaztunk indikátor. Az a tény, zöld fluoreszcencia-val kezelt sejtekben Free siRNS jelezte, hogy nem hatolnak be a sejtekben (adatokat nem mutatjuk). Megfigyeltük, hogy több sejt kezelt TSMCL-siRNS mutatott zöld fluoreszcencia, mint a kezelt sejtek TsCI-siRNS (ábra. 4A). Sőt, még kezelt sejtek TSMCL-DOX mutatta, vörös fluoreszcencia, mint a kezelt sejtek TsCI-DOX (ábra. 4B). A kezelt sejtek TSMCL-DOX-siRNS, a magas fluoreszcencia intenzitású volt megfigyelhető, és a sejteket megjelent rózsaszín összevonása miatt a kék, piros és zöld színű (ábra. 4C). Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy TSMCL hatásosabb nyilvánított siRNS és DOX be a sejtekbe, mint TsCI, alkalmazása után mágneses mezőt.

Továbbá megvizsgáltuk az intracelluláris helyét szállított DOX és siRNS. Vörös fluoreszcencia volt megfigyelhető mind a sejtmag és a citoplazma, jelezve, hogy szállított DOX volt található mind a sejtmagok és a citoplazmában. Ezzel szemben, a zöld fluoreszcencia elsősorban megjelent a citoplazmában, ami arra utal, hogy az siRNS szállították a citoplazmába (ábra. 4d). Összevonása a piros és zöld meg sárga a citoplazmában, és a összevonását kék és piros meg levendula a magok. Összefoglalva, ezek az adatok azt jelzik, hogy mind a TsCI és TSMCL tud behatolni gyomor rákos sejteket, és leszállítani a tartalma a citoplazmában (DOX és siRNS-t), és a sejtmagok (DOX).

In vitro tumor elleni hatásait liposzómák katalógusa

értékeltük in vitro tumorellenes hatását a co-szállító rendszer tesztjének és az apoptózis indukció tevékenységet. A citotoxicitást a liposzómák értékeltük MTT assay. Annak meghatározására, hatásainak DOX és a plazmid-koncentrációk a citotoxicitás liposzómák megvizsgáltuk ellátott liposzómák különböző koncentrációjú DOX és különböző mennyiségű SATB1 shRNS. A növekedés a DOX koncentráció, a citotoxicitás a liposzómák növeltük (ábra. 5A). Azonban, a mellett a SATB1 shRNS koncentráció nem eredményezett fokozott citotoxicitást, és már csak kis mértékben növeli a citotoxicitás amikor SATB1 shRNS koncentráció mintegy 4 ug (ábra. 5B). Így szoktuk 25 nM DOX és 4 ng SATB1 shRNS összehasonlítani a citotoxicitás között ingyenes DOX ingyenes shRNS, TsCl, TSMCL, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 és TSMCL- DOX-shSATB1.

ábrán látható. 5C, ingyenes shRNS, TsCl és TSMCL kevés citotoxikus hatását. A sejtek életképessége volt 40,3 ± 3,4%, 73,6 ± 3,5%, illetve 51,3 ± 4,5% a szabad DOX, TsCI-DOX és TSMCL-DOX, illetve, ami arra utal, hogy citotoxicitása TSMCL-DOX magasabb volt, mint TsCI-DOX, de alacsonyabb, mint a szabad DOX . A sejtek életképessége volt 79,2 ± 6,9%, illetve 71,6 ± 4,7% a TsCI-shSATB1 és TSMCL-shSATB1, illetve nem mutatja statisztika szignifikancia (p 0,05). A gyógyszer és gén co-szállítás, a sejtek életképessége már csak 35,0 ± 3,2%, illetve 22,3 ± 3,4% TsCI-DOX-shRNS és TSMCL-DOX-shRNS -kal, lényegesen alacsonyabb, mint a szabad DOX, TsCI-DOX, TSMCL- DOX és SATB1shRNA töltött liposzómák (p < 0,05). Ezen kívül, a sejt életképessége TSMCL-DOX-shRNS szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a TsCI-DOX-shRNS (p < 0,05). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a szinergikus citotoxicitás hatás érhető el co-szállító DOX és SATB1 shRNS. Sőt, az alkalmazás mágneses célzott, egy további citotoxikus hatás fokozódása lehet beszerezni.

Annak megállapításához, a további anti-tumor mechanizmus mellett a citotoxicitását a társ-szállítási rendszer, megvizsgáltuk a apoptózis mértéke MKN-28 kezelt sejtek szabad DOX, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 és TSMCL-DOX-shSATB1 áramlási citometriával. Amint azt mutatta látható. 5D, apoptózis aránya 22,3% kezelt sejtek szabad DOX, 8,9% volt a kezelt sejtek TsCI-DOX, de a megnövekedett 13,4%-val kezelt sejtekben TSMCL-DOX és a mágneses mező. Hasonlóképpen, az apoptózis aránya 9,4% kezelt sejtek TsCI-shSATB1, de nőtt 17,4% kezelt sejtek TSMCL-shSATB1 és mágneses mező. Ezzel szemben, az apoptózis aránya 27,7% volt a sejtekben kezelt TsCI-DOX-shSATB1, nagyobb, mint a kezelt sejtek TsCI megrakott DOX vagy shSATB1 egyedül. Az apoptózis aránya 32,4% kezelt sejtek TSMCL-DOX-shSATB1, a legmagasabb az összes csoportban. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az együttes nyilvánított DOX és SATB1 shRNS vezet együttes hatása az apoptózis indukció. Egy szó, ez a ko-leadó rendszer mutat erős tumorellenes hatását in vitro.

in vivo anti-tumor aktivitás a liposzómák

Annak érdekében, hogy meghatározzuk a in vivo anti-tumor aktivitás a co-szállító rendszer, hoztuk létre MKN-28 egér xenograftmodellekben és a betáplált Free DOX, TSMCL-DOX, TSCML-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 vagy TSMCL-DOX-shSATB1 be az egerekbe a farok vénába. A kezelést naponta egyszer minden 3 nap, és a tumorokat kimetszettük (a 6A.). A 15. napon a daganat térfogatát az 0,44 ± 0,05 cm ^{3 kezelt egerekben TSMCL-DOX-shSATB1, lényegesen alacsonyabb, mint a fiziológiás sóoldatban csoportban (2,14 ± 0,23 cm 3), ingyenes DOX csoport (1,08 ± 0,13 cm 3), TSMCL-DOX csoportban (0,68 ± 0,10 cm 3), TSCML-shSATB1 csoport (1,43 ± 0,21 cm 3), és TsCl-DOX-shSATB1 csoport (0,77 ± 0,12 cm 3) (6B.).}

Továbbá, ahogy az ábrán. 6. (C), a medián ideje tumor térfogata eléri a 2 cm ^{3 volt 30 napot TSMCL-DOX-shSATB1 csoport, hosszabb sóoldatban csoport, ingyenes DOX-csoport, TSMCL-DOX-csoport, TSCML-shSATB1 csoport és TsCl-DOX-shSATB1 csoport (ábra. 6C). Összefoglalva, ezek az eredmények azt jelzik, hogy a társ-szállító DOX és shSATB1 által TSMCL szinergista tumorellenes hatást in vivo.}

Discussion

Annak ellenére, hogy a közelmúltban fejlődés sebészet, radioterápia és a cél terápia, kemoterápia még mindig az egyik legfontosabb megközelítések gyomorrák terápiában. Azonban, a terápiás hatások a kemoterápia gyakran kielégítetlen, és nem jelentősen javítja a prognózist a rákos betegek [19]. Az egyik fő oka az a tumorigenezis és progressziója gyomorrák magában foglalja a különféle mechanizmusokat; az egységes anti tumor mechanizmusának hagyományos kemoterápia korlátozott terápiás hatásukat, ezért a kombinált kemoterápia génterápiával javíthatja tumorellenes hatásokat. Egy másik akadály a kemoterápia az, hogy a szisztémás Drug Administration vezet korlátozott gyógyszer koncentrációja a tumor oldalakat míg okozó sok káros hatásokat [8]. A legfontosabb, hogy megoldja ezeket a problémákat támaszkodik az új modor gyógyszeradagoló, ezért fejlesztése célzott multi-szereket szállító rendszer, amely közvetlenül vezetett a tumort mutatott felszabadulás leküzdeni ezeket a problémákat és fokozza a terápiás hatások [20] - [25] .

között különböző gyógyszer-adagolási rendszerek, liposzómák legígéretesebb jó biocompatibilities okozó alig vagy egyáltalán nem antigén, allergiás és toxikus reakciók, és könnyen esnek át biológiai lebomlás. Mivel mind a gyógyszer és a gén-hordozók, liposzómák nem csak megvédeni a gazdaszervezetet a nemkívánatos hatásokat a kapszulázott gyógyszer, hanem megakadályozza a bezárt tartalmát az idő előtti inaktiválódását a fiziológiás közegben [26]. Sőt, liposzóma egy potenciálisan célzott gyógyszerhordozó rendszerben, függetlenül attól, hogy érjük el fokozott permeabilitás és a retenciós (EPR) hatás (Passzív célzott), vagy a mágneses mező útmutatást és az immunrendszer kapcsolat (aktív célzott) [27]. Ezen felül, néhány liposzómák rendelkeznek szabályozott kiváltott gyógyszer-felszabadulás funkciók, mint például termo érzékenység, a pH érzékenység és mikrohullámú érzékenység.

A közelmúltban kifejlesztett egy újszerű mágneses célzott hőérzékeny gyógyszer és gén co-leadó rendszer (TSMCL). Alapuló elektroneutrális hőérzékeny készítmény (DPPC:Cholesterol = 80:20), mi volt hozzá más kationos komponensek és optimalizált a thermosensitivity liposzómák által calcein felszabadulás vizsgálatban. Az eredmények azt mutatták, hogy mi lehetne még kívánatos thermosensitivity helyett 10 mol alkatrészek Koleszterin 5 mol alkatrészek DC-koleszterin és 5 mol alkatrészek DOAB (DPPC:DC-Cholesterol:DOAB:Cholesterol = 80:5:5:10), és calcein kiadás a liposzómák alacsonyabb lenne, 37 ° C, de szignifikánsan magasabb 42 ° C-on ezt a készítményt. Ezután mágneses folyadék Fe _{3O 4 használták volna, mint a mag, és működött a mágneses célzás és fűtési forrás TSMCL. Rezgőmintás Magnetometer (VSM) mérés jelezte, hogy a mágneses folyadék Fe 3O 4 volt szuperparamágneses, így TSMCL lenne jó mágneses célzott hatást. Eközben a időfüggő fűtési görbe is azt mutatták, hogy mind a mágneses folyadék Fe 3O 4 és TSMCL lehetne melegítjük 25 ° C-tól 42 ° C-20 percen belül. A rendszer segítségével a mágneses folyadék Fe 3O 4, mind mágneses célzás és hőmérsékletfüggő nyitású hatóanyag felszabadulását TSMCL lehetne megvalósítani. Végül mindkét TsCl és TSMCL is kiállította tipikus liposzómás alakúak és jó eloszlás alapján TEM. Ennek alapján a sikeres építése TSMCL, Ebben a tanulmányban betöltve DOX és SATB1 shRNS vektor TSMCL hogy TSMCL-DOX-shSATB1 és értékelte a tumorellenes hatások ellen gyomorrák-sejtek in vitro és in vivo.}

DOX egy általánosan használt gyógyszer kemoterápiás nagy hatékonysággal gátolja a tumor sejtek szaporodását és indukál tumorsejt apoptózisát, de a terápiás hatása korlátozott miatt súlyos kardiotoxicitás és mieloszuppresszió, amikor adminisztrátora szisztémásán [28]. Bár DOX liposzómák részlegesen javult a helyzet, hogy nem a célzott eljuttatása még LIMITES hasznosításuk [29]. SATB1 globális kromatin szervező, hogy közvetlenül szabályozza a kifejezés a ERRB2, MMP2, ABL1 és E-cadherin fellépni kulcsfontosságú szabályozó rák kialakulása [30]. Túlexpressziója SATB1 a különböző tumorok összefüggésbe hozták malignus biológiai viselkedés, mint a invázió, proliferáció és metasztázis [10] - [13]. Hangtompító SATB1 expresszióját kis interferáló RNS-t (siRNS-t) vagy a kódoló plazmid rövid harpin RNS-t (shRNS) gátolta, a proliferáció, invázió és metasztázis, és apoptózist indukál különböző tumorsejtek [16], [17]. Ezért SATB1 válik potenciális célpontja rákterápia [30]. Azonban megfelelő szállítási vektorok siRNS vagy shRNS fontosak SATB1 célzott rák génterápia.

Ebben a vizsgálatban, a TSMCL-DOX-shSATB1 rendszer, mind a DOX és SATB1 shRNS vektor lehet irányítani, hogy a tumor helyén alatt mágneses benyújtott útmutatást, és DOX-ben megjelent a hipertermia kiváltott módon. Hyperthermia kiváltott Release függ termoszenzitív liposzómákat, amelyek fő alkotóelemei a Dipalmitoyphosphocholine (DPPC), amely keresztülmegy egy gél folyékony kristályos fázis átmenet (Tm), amely válik nagyon lyukas a kis vízoldható molekulák át 41 ° C-on [31]. Liposzómák különböző DPPC és lipidek különböző Tm és thermosensitivity [32]. A DSC analízis azt mutatta, hogy a TM-a mi-leadó rendszer volt 40,8 ° C-on, és a DOX felszabadulási vizsgálatban azt jelezték, hogy állandó, 37 ° C-on, míg a DOX-ben megjelent, amikor a hőmérséklet emeljük 42 ° C-on.

• PLoS One: Expression az EGF család gyomorrákban: downregulációját HER4 és annak aktiválása ligand NRG4
• PLoS One: A Novel funkcionális TagSNP Rs7560488 a DNMT3A1 Promoter társul fogékonyság gyomorrák által szabályozású promoter aktivitását