PLoS ONE: Co-Поставка доксорубицина и SATB1 shRNA от термочувствительного магнитной катионных липосом для рака желудка терапия

Абстрактный
<р> В предыдущем исследовании, мы разработали новую систему термочувствительный магнитной доставки, основываясь на липосом. Целью данного исследования являлась оценка эффективности этой системы для совместной доставки обоих препаратов и генов в той же клетке и его противоопухолевых эффектов на рак желудка. Доксорубицин (DOX) и SATB1 shRNA вектор были загружены в систему совместного доставки, а также в пробирке активности термочувствительный высвобождения DOX, целевой ген глушителей эффективность, целевой поглощение клетками, в пробирке цитотоксичность, а также противоопухолевую активность в естественных условиях были определены. Результаты показали, что эта система совместного доставки была желательной целевой эффективности доставки, DOX термочувствительный высвобождение и SATB1 генов глушителей. Кроме того, совместное поставка DOX и SATB1 shRNA показали повышенную активность ингибировать желудочный рост раковых клеток в пробирке и в естественных условиях, по сравнению с одной поставкой. В заключение отметим, что роман термочувствительный магнитная система лекарственного средства и ген совместного доставки имеет перспективное применение в комбинированной химиотерапии и генной терапии рака желудка
<р> Цитирование:. Пэн Z, Ван C, E Fang, Лу X, Ван G, Тонг Q (2014) Co-Поставка доксорубицина и SATB1 shRNA от термочувствительного магнитной катионных липосом для рака желудка терапии. PLoS ONE 9 (3): e92924. DOI: 10.1371 /journal.pone.0092924
<р> Редактор: Елена А. Рожкова, Argonne National Laboratory, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 4 декабря 2013 года; Принято 26 февраля 2014 года; Опубликовано: 27 марта 2014
<р> Copyright: © 2014 Пэн и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (№ 81172186). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является четвертым распространенным видом рака и второй ведущей причиной смерти от рака во всем мире [1]. В 2008 году насчитывалось около 989000 новых случаев рака желудка и 738,000 случаев смерти в мире, которые в первую очередь имели место в Восточной, Южной и Центральной Азии; Центральной и Восточной Европы; и Южная Америка [2], [3]. В Китае, рак желудка является третьим распространенным раком с оцениваемыми 380000 новых случаев заболевания и высокий уровень смертности около 26,3 населения 100000 каждый год [4], [5]. Хирургическая резекция является общим лечебным вариантом, но он не подходит для большинства пациентов, находящихся на поздней стадии рака желудка. Другие методы лечения, такие как химио- и лучевой терапии показывают некоторую эффективность, но часто неудовлетворительна [4], [6]. Кроме того, системное введение химиотерапии вызывает неблагоприятные последствия [7], [8].
<Р> В связи с развитием лекарственной устойчивости к химиотерапии, традиционная химиотерапия также демонстрирует ограниченную эффективность противоопухолевый [9]. Таким образом, многоагентная система совместного поставки получила больше внимания в последнее время, так как это может поставить различные типы агентов для одних и тех же опухолевых клеток, которые затем про вл ют синергетические эффекты противоопухолевых. Например, два различных химических агентов могут быть объединены или химический агент может быть объединен с малых интерферирующих РНК (киРНК) против онкогена. К тому же, направленной доставки и контролируемое высвобождение лекарственного средства может дополнительно усиливать противоопухолевые эффекты и уменьшить побочные эффекты.
<Р> Специальные АТ-богатые связывающий белок (SATB1) является глобальным организатором хроматин, который регулирует экспрессию генов и участвует в модуляция злокачественных биологических поведения рака [10]. Аберрантная экспрессия SATB1 Было показано, что способствовало рак молочной железы, рак легкого и лимфомы [11] - [13]. Наши предыдущие исследования показали, что SATB1 играет важную роль в развитии рака желудка, и может быть независимым маркером прогноза рака желудка [14], [15]. Подавляя экспрессию SATB1 путем доставки миРНК или плазмидой, кодирующей специфический мешая короткую harpin РНК (shRNA) против SATB1 может ингибировать пролиферацию и инвазию, а также стимулирует апоптоз опухолевых клеток [16], [17]. Эти результаты свидетельствуют о том, что SATB1 является потенциальным терапевтическим мишенью для рака желудка.
<Р> Мы предполагаем, что комбинация генной терапии и химиотерапии может значительно повысить терапевтическую эффективность против рака желудка. В нашем предыдущем исследовании мы разработали целевую термочувствительный систему совместного доставки на основе термочувствительных магнитных катионных липосом (TSMCL). По кальцеиновыми анализа высвобождения, мы оптимизировали формулировку термочувствительный липосом, а затем измеряли магнитные свойства и доставки генов эффективность TSMCL. В данном исследовании мы загрузили доксорубицин и SATB1-shRNA вектор в эту систему для комбинации генной терапии и химиотерапии, и оценивали их синергический противоопухолевый эффект против рака желудка в пробирке и в естественных условиях.

Материалы и методы

материалы
<р> Холестерин, 1,2-дипальмитоил-SN-глицеро-3-фосфохолин (ДПФХ), и 3β- [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) карбамоил] холестерин (DC-Хол) были приобретены у Avanti Polar Lipids (США). Диметилдиоктадециламмония бромид (Доаб) были получены от компании Sigma-Aldrich (США). Магнитные жидкости Fe <суб> 3О <суб> 4 был синтезирован Galaxy Nanotech (Китай). FAM маркированы миРНК и плазмиду pGFP-SATB1 shRNA были предоставлены GenePharma (Шанхай, Китай). Доксорубицин был приобретен у Hisun фармацевтической (Zhejiang Китай). Фетальной бычьей сыворотки (ФБС), культуральные среды, пенициллин /стрептомицин (PEST) и трипсин поставлялись из Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). SATB1 кролика моноклональное антитело было от Epitomics (Abcam, Великобритания). Все другие химические вещества были коммерческой аналитической чистоты и использовали без дополнительной очистки.

Подготовка системы совместного доставки
<р> Эта система совместно доставки была основана на термочувствительных катионными липосомами, которые были подготовлены с термочувствительным катионный формулировка DPPC, DC-холестерин, Доаб и холестерина в молярном соотношении 80:5:5:10 оптимизированной в наших предварительных экспериментах. Липосомы (TsCl) были приготовлены методом тонкой пленки гидратной, с последующей экструзией [18]. Метод градиента сульфата аммония был использован для загрузки DOX в TsCl (TsCl-DOX). Для приготовления магнитных липосомы (TSMCL), магнитные жидкости Fe <суб> 3О <суб> 4, использовали в качестве основы и совместно инкапсулированных с буфером сульфата аммония в липосомы. После образования тонкой пленки в круглодонную колбу, добавляли один миллилитр суспензии железа и сульфат аммония, чтобы гидрат пленку, а затем экструдируют через поликарбонатные фильтры и нагружают DOX (TSMCL-DOX) градиентным методом сульфата аммония , И, наконец, продукты от гель-фильтрации центрифугировали при 1000 г в течение 15 мин для удаления неинкапсулированной Fe <суб> 3О <суб> 4.
<Р> pGFP-SATB1-shRNA (shSATB1) вектор инкубировали с различными липосом бессывороточной среды при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы подготовить TsCl-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1, TSMCL-shSATB1 и TSMCL-DOX-shSATB1 соответственно.

Определение дзета-потенциала, размер частиц и полидисперсность
<р> средний размер частиц и полидисперсность распределения частиц по размерам липосом определяли при 25 ° с с помощью динамического рассеяния света с использованием ZetaPALS частиц проклейки инструмент (Brookhaven Instruments Corporation, США). Дзета-потенциал липосомальной дисперсии измеряли с помощью того же инструмента при 25 ° С с помощью электрофоретической подвижности.

Определение доксорубицина загружен эффективность
<р> концентрация DOX в липосом измеряли с помощью флуориметра ( Perkin Elmer, США) с 485 нм возбуждения и 590 нм фильтрами выбросов с разводящей серии свободного DOX в качестве стандарта. DOX загружена эффективность была рассчитана на основе концентрации DOX.

дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC)
<р> DSC проводили для оценки термочувствительность липосом путем определения температуры фазового перехода (Tm). Tm оценивали с использованием нано DSC (TA Instruments, США) при скорости нагрева 20 ° С /ч с 20 мг /мл фосфолипида.

В пробирке термочувствительных анализа высвобождения DOX

20 мкл DOX нагруженные липосомы инкубировали в 1 мл PBS и PBS с 50% фетальной бычьей сыворотки (FBS), которые имитируют среду в естественных условиях отдельно в пробирки Эппендорф. Образцы нагревали на водяной бане при температуре 37 ° С и 42 ° С в течение 1 ч, соответственно. Затем измеряли интенсивность флуоресценции DOX на флуориметре (Perkin Elmer, США) с использованием 485 нм возбуждение и 590 нм фильтра выбросов. Для получения 100% высвобождения, образцы инкубировали в 1 мл PBS с 1% Triton X-100 в течение 1 мин. Проценты высвобождения DOX были рассчитаны как следует: где F <суб> s был флуоресценции образцов после нагревания, F <югу> 0 была начальная флуоресценция образцов перед нагреванием, и F <югу> 100 была флуоресценция образцов, обработанных Triton X-100.

культура клеток
<р> Человека аденокарциномы желудка MKN-28 клеточная линия была приобретена у Keygen Biotech (Нанкин, Китай) и культивировали в DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS, 100 ед /мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO <югу> 2 при 37 ° с.

в пробирке трансфекции клеток
<р> MKN-28 клеток высевали в 12-луночные планшеты при плотности 4 × 10 ^{5 клеток /лунку и выращивали в течение ночи до приблизительно 80% слияния. На следующий день клетки промывали дважды с предварительно подогретым PBS, а затем TsCl-shSATB1 и TSMCL-shSATB1 были добавлены в каждую лунку и инкубировали в течение 6 часов. Клетки, инкубированные с TSMCL-shSATB1 были расположены на 12-луночный магнитной пластины в течение первых 30 мин, чтобы предложить магнитное поле. Затем инкубационную среду заменяли DMEM, дополненной 10% FBS, и клетки инкубировали в течение 24 ч. Уровень экспрессии GFP оценивали под флуоресцентным микроскопом (Nikon 80i) и проточного цитометра (BD FACS Canto II).}

В реальном масштабе времени количественной полимеразной цепной реакции (RT-КПЦР)
<р> Суммарную РНК экстрагировали из клеток MKN-28 с использованием TRIzol регента (Invitrogen, Carlsbad, CA), следуя инструкции производителя, и кДНК синтезировали с использованием PrimeScript RT Master Mix (Takara, Далянь). ПЦР проводили с использованием SYBR премикса Ex Taq II (Takara, Далянь) на StepOne Plus ПЦР в реальном времени системы (Applied Biosystems, США). Последовательности праймеров были следующими: SATB1 смысл 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 ', и антисмысловая 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3' GADPH смысл 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 'и 5'-антисмысловой GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3'. Уровень мРНК SATB1 нормализовалось к тому, что из GAPDH.

Вестерн-блот-анализ
<р> MKN-28 клетки собирали и подвергали лизису в буфере RIPA. Супернатанты собирали после центрифугирования при 10000 г в течение 10 мин. Концентрацию белка в надосадочной жидкости определяли с помощью ВСА Protein Assay Kit. Затем 40 мкг образцов проводили на 15% SDS-PAGE и белки переносили на ПВДФ-мембраны. Затем мембраны инкубировали в 5% молоке обезжиренном в течение 1 ч, чтобы блокировать неспецифическое связывание, а затем инкубировали в течение ночи при 4 ° С с SATB1 или бета-актин антитела (1:500 разведение). Мембраны затем зондировали с конъюгированным с пероксидазой хрена козьих антител против кроличьего вторичным антителом в течение 30 мин. И, наконец, мембраны были визуализированы с расширенной системой хемилюминесценции (ECL, Пирс) и экспонировали на рентгеновской пленке.

В пробирке оценки клеточного поглощения
<р> Для оценки внутриклеточного расположения поставляемой DOX и pGFP-SATB1 shRNA и повышенное проникновение липосом в желудочную раковых клеток с помощью магнитного нацеливания на FAM маркированы миРНК (зеленая флуоресценция) была использована для имитации pGFP-SATB1 shRNA и DOX сам по себе обладает инстинктом красной флуоресценции для контроля клеточного поглощения , Клетки MKN-28 были высеяны в 12-луночный планшет при 4 × 10 5 клеток /лунку и выращивали в течение ночи. Затем клетки инкубировали с свободной миРНК, TsCl-миРНК, TSMCL-миРНК, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-DOX-миРНК или TSMCL-DOX-миРНК в течение 6 ч. Для получения магнитных липосом, пластины были расположены на 12-луночный магнитной пластины в течение первого часа инкубации. Клетки визуализировали под флуоресцентным микроскопом, чтобы определить местонахождение флуоресцентные метки DOX и миРНК. Ядра окрашивали DAPI (голубой флуоресценции).

МТТ
<р> Клетки MKN-28 высевали при плотности 2 × 10 4 клеток /лунку в 96-луночные планшеты и выращивали в течение ночи. Затем клетки инкубировали с различными липосом при температуре 37 ° С в течение 2 часов в CO <югу> 2 инкубаторе. Для получения магнитных липосом, планшеты помещали в 96-луночный магнитной пластины в течение первых 1 ч инкубации. Затем клетки дважды промывали PBS и инкубировали в течение 46 ч в свежей среды. Впоследствии, жизнеспособность клеток измеряли с помощью МТТ-теста. Среда, в каждую лунку был заменен на 20 мкл раствора МТТ (Sigma-Aldrich, США) и инкубировали в течение 4 ч при температуре 37 ° С, а затем надосадочную жидкость отбрасывают, а кристаллы формазана растворяли в 200 мкл ДМСО. Планшеты измеряли при длине волны 490 нм в ридере для микропланшетов, и жизнеспособность клеток рассчитывали по следующей формуле:

поточной цитометрии
<р> Апоптоз детектировали с использованием набора дл аннексина V-FITC обнаружения Апоптоз (eBioscience, США). MKN-28 клеток высевали в 12-луночные планшеты и обрабатывали, как описано выше. Через 24 часа клетки собирали, дважды промывали PBS и суспендировали в 500 мкл буфера для связывания. Затем клетки были дважды окрашивали аннексина V-FITC и пропидийиодидом (PI). Клетки в ранней стадии апоптоза, окрашенных аннексина V-FITC, но не окрашивали PI были количественно cytometery потока.

модели ксенотрансплантата мыши

От пяти до шести недель самцов BALB /C голых мышей при условии, Центром экспериментов на животных Тунцзи медицинского колледжа. Каждую мышь инокулировали подкожно в правый бок с 5 × 10 ^{6 MKN-28 клеток. Через несколько недель после того, как прививки опухоли, 36 несущих опухоль мышей были случайным образом разделены на шесть групп (n = 6). Мышам вводили через хвостовую вену с свободной DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1, TSMCL-DOX-shSATB1 или нормального физиологического раствора в качестве контроля. Доза DOX составляла 2,5 мг /кг, и что из pGFP-SATB1 shRNA составляла 10 мкг на мышь. Лечение проводилось один раз каждые 3 дня и опухоли размер был измерен с помощью calipering, а затем объем опухоли можно рассчитать по следующей формуле: объем = (D <югу> Min) 2 × D <суб> Max /2, где D <суб> Макс был самый длинный диаметр опухоли и D <югу> Мин был самым коротким. Для TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 и TSMCL-DOX-shSATB1, магнитная нацеливание была достигнута с использованием непрерывного внешнего магнитного поля 5000 Гаусс в течение 30 мин фокусировки на опухоль после введения препарата. Все эксперименты были одобрены Комитетом по этике Тунцзи медицинского колледжа по и все животные были обработаны гуманно в соответствии с директивами Institutional ухода за животными и использование комитета.}

Статистический анализ
<р> Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Статистическая значимость между различными группами оценивали с Т-тест Стьюдента и однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) испытания. За время выживания животных, были созданы и логарифмический ранговый кривые Каплана-Мейера каждой группы было проведено с целью сравнения выживаемости. р ≪ 0,05 рассматривалось как статистически значимое

Результаты

Характеристика липосом
<р> Как показано в таблице 1, диаметр TsCl был 83,6 ± 5,7 нм, в то время как TsCl. -DOX была увеличена до 118,5 ± 7,9 нм вследствие инкапсулирования DOX. В то же время, диаметры TsCl-shSATB1 и TsCl-DOX-shSATB1 были значительно увеличены до 161,1 ± 11,8 нм и 238,1 ± 20,6 нм, соответственно, за счет адгезии и слияния плазмидной ДНК с липосомами. Для получения магнитных липосом, размеры частиц TSMCL, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 и TSMCL-DOX-shSATB1 были 135,0 ± 11,6 нм, 157,2 ± 14,3 нм, 221,3 ± 15,7 нм и 319,4 ± 20,1 нм, соответственно, значительно больше, чем из TsCl, TsCl-DOX, TsCl-shSATB1 и TsCl-DOX-shSATB1 из-за защемления магнитных наночастиц. Кроме того, размер TSMCL-shSATB1 и TSMCL-DOX-shSATB1 был значительно больше, что из TSMCL и TSMCL-DOX, соответственно (р &ЛТ; 0,05). Все липосом имели узкое распределение по размерам, потому что их полидисперсности не было более 0,3.
<Р> Зета потенциалы TsCl, TsCl-DOX, TsCl-shSATB1 и TsCl-DOX-shSATB1 были 52,0 ± 7,3 мВ, 50,1 ± 7,7 мВ, 31,3 ± 5,2 мВ и 26,7 ± 4,5 мВ соответственно. После инкубации с pGFP-SATB1- shRNA, поверхностные заряды значительно снизилась (р ≪ 0,05), вследствие электростатического взаимодействия между катионными липидами и плазмидной ДНК. Тем не менее, улавливание магнитных наночастиц не приводит к существенному снижению дзета-потенциала в магнитных липосом.
<Р> Для DOX загруженной эффективность, скорость капсулирования DOX составляла 89 ± 3% и 78 ± 8% (п = 3) для TsCl-DOX и TSMCL-DOX, соответственно, и было 85 ± 7% и 73 ± 9% (п = 3) для TsCl-DOX-shSATB1 и TSMCL-DOX-shSATB1 соответственно. Эти данные свидетельствуют о том, что взаимодействие между липосом и плазмиды не привело к утечке DOX.

The термочувствительность липосом
<р> Дифференциальная сканирующая калориметрия проводили для определения температуры фазового перехода TsCl. Как показано на рис. 1, TsCl состоит из DPPC, DC-холестерин, Доаб и холестерин при мольном соотношении 80:5:5:10 имели Tm 40,8 ° С с относительно более широким пиком перехода, который может быть слитый переход пик ДПФХ и Доаб .

в пробирке термочувствительный DOX-релиз от липосом
<р> Как показано на рис. 2, скорость высвобождения DOX из TsCl-DOX и TSMCL-DOX был только 12% и 16% после инкубации с PBS при 37 ° С, и увеличилась до 20% и 19% после инкубации с 50% FBS, соответственно. Для TsCl-DOX-shSATB1 и TSMCL-DOX-shSATB1, скорость высвобождения DOX составила 12% и 15% после инкубации с PBS при 37 ° С, и было и 16% после инкубации с 50% FBS, что указывает, что введение плазмиды было не оказывает существенного влияния на стабильность липосом (р > 0,05).
<р> скорость высвобождения DOX из TsCl-DOX и TSMCL-DOX был увеличен до 37% после инкубации с PBS при 42 ° с, и увеличилась до 45% и 49% после инкубации с 50% FBS, соответственно. Для TsCl-DOX-shSATB1 и TSMCL-DOX-shSATB1, скорость высвобождения DOX составила 35% и 43% после инкубации с PBS и FBS при 42 ° С, соответственно, и значительно выше, чем при 37 ° С (р &л; 0,05). Эти результаты указывают на то, что TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-DOX-shSATB1 и TSMCL-DOX-shSATB1 имеют желательную термочувствительность, и могут быть использованы для гипертермии вызвало высвобождение управления DOX.

Сайленсинг выражения SATB1 в MKN-28 клетки, трансфицированные липосом
<р> Далее мы оценивали эффективность липосом для доставки shSATB1 вектора в клетки MNK-28. Типичные изображения флуоресценции клеток, трансфицированных TsCl-shSATB1 и TSMCL-shSATB1 были показаны на рис. 3A. Анализ проточной цитометрией показал, что эффективность трансфекции TsCl-shSATB1 было только 15,4 ± 0,15%. Тем не менее, после применения руководства магнитного поля, эффективность трансфекции TSMCL-shSATB1 был 34,3 ± 0,93%, что значительно выше, чем у TsCl-shSATB1 (рис. 3б).
<Р> Для того, чтобы определить, является ли поставленный вектор shSATB1 может посредничать глушителей экспрессии SATB1 в клетках MKN-28, мы провели в режиме реального времени количественный ПЦР и Вестерн-блот-анализ. Результаты показали, что оба уровня SATB1 мРНК и белка снижалась в клетках, трансфицированных TsCl-shSATB1 и TSMCL-shSATB1, по сравнению с контрольными клетками. Кроме того, TSMCL-shSATB1 с помощью магнитного поля была более мощным, чем TsCl-shSATB1 для ингибирования экспрессии SATB1 в клетках MKN-28 (рис. 3C, D).

Магнитный мишенью в пробирке клеточное поглощение
<р> Для сравнения проникновений в клетки между немагнитной и магнитной липосом с применением магнитного целевого руководства, а также внутриклеточное расположение поставляемого DOX и shSATB1, принимали участие в FAM-меченных миРНК был использован в качестве индикатора. Отсутствие зеленой флуоресценции в клетках, обработанных свободной миРНК показал, что он не может проникать в клетки (данные не показаны). Мы наблюдали, что большее количество клеток, обработанных TSMCL-миРНК выставлены зеленую флуоресценцию, чем клетки, обработанные TsCl-миРНК (рис. 4, а). Кроме того, большее количество клеток, обработанных TSMCL-DOX показал красную флуоресценцию, чем клетки, обработанные TsCl-DOX (рис. 4, б). В клетках, обработанных TSMCL-DOX-миРНК, наблюдалась высокая интенсивность флуоресценции, а клетки появились розовые из-за слияния синего, красного и зеленого цвета (рис. 4в). Эти наблюдения указывают на то, что TSMCL является более мощным в доставке миРНК и DOX в клетки, чем TsCl, после применения магнитного поля.
<Р> Кроме того, мы исследовали внутриклеточное расположение поставляемого DOX и миРНК. Красной флуоресценции наблюдалась в обоих ядрах и цитоплазме, что указывает, что доставлены DOX находился в обоих ядрах и цитоплазме. В отличие от этого, зеленая флуоресценция в основном появились в цитоплазме, предполагая, что миРНК были доставлены в цитоплазму (рис. 4D). Слияние красного и зеленого появился желтый в цитоплазме, а слияние синего и красного цвета появились лаванды в ядрах. Взятые вместе, эти данные указывают на то, что оба TsCl и TSMCL могут проникать в раковые клетки желудка и доставить их содержимое в цитоплазму (DOX и миРНК) и ядер (DOX).

В пробирке противоопухолевые эффекты липосомы
<р> Мы оценили в условиях in vitro противоопухолевые эффекты этой системы совместно доставки цитотоксичности и индукции апоптоза активности. Цитотоксичность липосом оценивали с помощью МТТ-теста. Для определения влияния DOX и плазмидных концентрации на цитотоксичность липосом, мы исследовали липосом, загруженных с различными концентрациями DOX и различных количеств SATB1 shRNA. С увеличением концентрации DOX, цитотоксичность липосом увеличивалась (рис. 5А). Тем не менее, добавление концентрации SATB1 shRNA не приводит к увеличению цитотоксичности, и там были лишь незначительно увеличить цитотоксичности при концентрации SATB1 shRNA составляла около 4 мкг (рис. 5В). Таким образом, мы использовали 25 мкМ DOX и 4 мкг SATB1 shRNA для сравнения цитотоксичность среди свободных DOX, Free shRNA, TsCl, TSMCL, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 и TSMCL- DOX-shSATB1.
<р> Как показано на рис. 5C, свободный shRNA, TsCl и TSMCL было мало цитотоксичность. Жизнеспособность клеток была 40,3 ± 3,4%, 73,6 ± 3,5% и 51,3 ± 4,5% бесплатно DOX, TsCl-DOX и TSMCL-DOX, соответственно, предполагая, что цитотоксичность TSMCL-DOX был выше, чем TsCl-DOX, но ниже, чем свободного DOX , Жизнеспособность клеток 79,2 ± 6,9% и 71,6 ± 4,7% для TsCl-shSATB1 и TSMCL-shSATB1, соответственно, не показывая статистической значимости (р > 0,05). Для получения лекарственного средства и генного совместного доставки, жизнеспособность клеток составляла только 35,0 ± 3,2% и 22,3 ± 3,4% для TsCl-DOX-shRNA и TSMCL-DOX-shRNA, соответственно, значительно ниже, чем у свободного DOX, TsCl-DOX, TSMCL- DOX и SATB1shRNA нагруженных липосом (р &л; 0,05). Кроме того, жизнеспособность клеток из TSMCL-DOX-shRNA была значительно ниже, чем у TsCl-DOX-shRNA (р &л; 0,05). Эти результаты свидетельствуют о том, что синергический цитотоксический эффект достигается за счет совместного доставки DOX и SATB1 shRNA. Кроме того, с применением магнитного нацеливания на дополнительно усиливается цитотоксичность может быть получена.
<Р> Чтобы определить дополнительный механизм противоопухолевой помимо цитотоксичности системы совместного доставки, мы исследовали скорость апоптоза MKN-28 клетки, обработанные свободной DOX, TsCl-DOX, TSMCL-DOX, TsCl-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 и TSMCL-DOX-shSATB1 с помощью проточной цитометрии. Как показано на рис. 5D, скорость Апоптоз 22,3% в клетках, обработанных свободной DOX, составила 8,9%, в клетках, обработанных TsCl-DOX, но увеличилась до 13,4%, в клетках, обработанных TSMCL-DOX и магнитным полем. Точно так же, частота Апоптоз 9,4% в клетках, обработанных TsCl-shSATB1, но увеличилась до 17,4%, в клетках, обработанных TSMCL-shSATB1 и магнитным полем. В противоположность этому, скорость Апоптоз 27,7% в клетках, обработанных TsCl-DOX-shSATB1, выше, чем в клетках, обработанных TsCl, нагруженных DOX или shSATB1 в одиночку. Скорость апоптоза в клетках, обработанных TSMCL-DOX-shSATB1, самый высокий среди всех групп 32,4%. Эти результаты показывают, что совместное поставляя DOX и SATB1 shRNA приводит к совместным действием индукции апоптоза. Одним словом, эта система совместного доставки проявляет сильные противоопухолевые эффекты в пробирке.

В естественных условиях противоопухолевая активность липосом
<р> Для того, чтобы определить противоопухолевую активность в естественных условиях системы совместного доставки, мы установили MKN-28 мышиных моделей ксенотрансплантатов и вводили Free DOX, TSMCL-DOX, TSCML-shSATB1, TsCl-DOX-shSATB1 или TSMCL-DOX-shSATB1 в мышей через хвостовую вену. Лечение проводилось один раз в 3 дня, а опухоли были вскрыты (рис. 6, а). На 15-й день, объем опухоли был 0,44 ± 0,05 см 3 у мышей, получавших TSMCL-DOX-shSATB1, значительно ниже, чем в солевом группе (2,14 ± 0,23 см 3), свободная DOX группа (1,08 ± 0,13 см 3), TSMCL-DOX группы (0,68 ± 0,10 см 3), TSCML-shSATB1 группы (1,43 ± 0,21 см 3), и TsCl-DOX-shSATB1 группы (0,77 ± 0,12 см 3) (рис. 6Б).
<р> Кроме того, как показано на рис. 6 (С), среднее время для объема опухоли достигнет 2 см 3 было 30 дней в группе TSMCL-DOX-shSATB1, больше, чем в солевом группе, группа Free DOX, группа TSMCL-DOX, группа TSCML-shSATB1 и группа TsCl-DOX-shSATB1 (рис. 6C). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что совместно поставлять DOX и shSATB1 путем TSMCL проявляет синергический противоопухолевый эффект в естественных условиях.

Обсуждение
<р> Несмотря на недавнее развитие в области хирургии, лучевой терапии и таргетной терапии, химиотерапии до сих пор одним из важных подходов к терапии рака желудка. Тем не менее, терапевтические эффекты химиотерапии часто являются неудовлетворенным и не могут существенно улучшить прогноз больных раком [19]. Одной из главных причин является канцерогенез и прогрессирование рака желудка включает в себя множество различных механизмов; унитарная анти механизм опухоли традиционной химиотерапии ограничивает их терапевтический эффект, таким образом сочетание химиотерапии с использованием генной терапии может улучшить противоопухолевые эффекты. Другим препятствием химиотерапии является то, что системное введение препарата приводит к ограниченной концентрации лекарственного средства в опухолевых участках, вызывая много негативных последствий [8]. Ключ к решению этих проблем опирается на новые манеры доставки лекарственных средств, поэтому, разработки целевых мульти-агентов, доставляющие системы, которые могут быть непосредственно подводится к месту локализации опухоли с контролируемым высвобождением может преодолеть эти проблемы и повысить терапевтический эффект [20] - [25] .
<р> Среди различных систем доставки лекарственных средств, липосомы являются наиболее перспективными для хороших biocompatibilities, которые вызывают мало или нет антигенными, аллергический и токсические реакции, и легко подвергаются биодеградации. Поскольку и наркотиков и носителей гена, липосомы могут не только защитить хозяина от нежелательных эффектов капсулированного препарата, но и предотвратить Захваченный содержимое от преждевременной инактивации физиологической среды [26]. Кроме того, липосома представляет собой потенциально целевой системы доставки лекарственных средств, будь то достигается за счет повышенной проницаемости и удерживания (EPR) эффект (Пассивное целевые), или путем указания магнитного поля и иммунной связи (активный целевой) [27]. Кроме того, некоторые липосомы обладают контролем вызвали возможности высвобождения лекарственного средства, такие как термо- чувствительность, чувствительность к рН и микроволновой чувствительности.
<Р> Недавно мы разработали новый магнитный целевой термочувствительный наркотиков и генной системы совместного доставки (TSMCL). На основе электронейтральном термочувствительной композиции (DPPC:Cholesterol = 80:20), мы добавили различные катионные компоненты и оптимизировали термочувствительность липосом путем анализа высвобождения кальцеин. Результаты указали, что мы могли бы получить желаемое термочувствительность путем замены 10 мол частей Холестерин 5 моль частей DC-холестерина и 5 частей (моль Доаб DPPC:DC-Cholesterol:DOAB:Cholesterol = 80:5:5:10), и релиз кальцеин от липосом будут ниже, при температуре 37 ° с, но значительное выше при 42 ° с в этой композиции. Далее Магнитная жидкость Fe <к югу> 3О <суб> 4 были использованы в качестве основного и функционировал в качестве магнитного нацеливания и источника нагрева TSMCL. Вибрационный магнитометра (VSM) измерение было указано, что магнитная жидкость Fe <югу> 3О <суб> 4 был суперпарамагнитны, таким образом TSMCL будет иметь хорошие магнитные целевые эффекты. В то же время, зависящее от времени кривая нагрева также показали, что оба магнитная жидкость Fe <югу> 3О <суб> 4 и TSMCL может быть нагрет от 25 ° С до 42 ° С в течение 20 мин. С помощью магнитной жидкости Fe <югу> 3О <югу> 4, как магнитного нацеливания и температуры вызвало высвобождение лекарственного средства из TSMCL может быть реализован. И, наконец, как TsCl и TSMCL были выставлены типичные липосомальных морфологию и хорошие распределения под ТЭМ. На основе успешного построения TSMCL, в данном исследовании мы загрузили DOX и SATB1 shRNA вектор в TSMCL сделать TSMCL-DOX-shSATB1 и оценивали противоопухолевое действие против клеток рака желудка в пробирке и в естественных условиях.
<Р> DOX является широко используемым препаратом в химиотерапии с высокой эффективностью ингибировать пролиферацию опухолевых клеток и индуцируют апоптоз клеток опухоли, но его терапевтические эффекты ограничены из-за тяжелой кардиотоксичности и миелосупрессии, когда вводили системно [28]. Хотя DOX липосом частично улучшили ситуацию, отсутствие целенаправленной доставки по-прежнему Limites их использования [29]. SATB1 является глобальным организатором хроматина, который непосредственно регулирует экспрессию ERRB2, ММР2, ABL1 и Е-кадгерина действовать в качестве ключевого регулятора развития рака [30]. Избыточная экспрессия SATB1 в различных опухолей было связано со злокачественными биологического поведения, таких как вторжение, пролиферацию и метастазирование [10] - [13]. Глушащий экспрессию SATB1 малыми интерферирующих РНК (миРНК) или плазмиды, кодирующей короткий harpin РНК (shRNA) может ингибировать пролиферацию, инвазию и метастазирование и индуцирует апоптоз различных опухолевых клеток [16], [17]. Поэтому SATB1 становится потенциальной мишенью для терапии рака [30]. Однако соответствующие векторы доставки для миРНК или shRNA имеют важное значение для SATB1 целевой генной терапии рака.
<Р> В этом исследовании с использованием системы TSMCL-DOX-shSATB1, как DOX и SATB1 shRNA вектор можно было бы ориентироваться на месте опухоли под магнитным подал руководство, и DOX был выпущен в гипертермии срабатывает образом. Гипертермии вызвало высвобождение зависит от термочувствительных липосом, которые в основном состоят из Dipalmitoyphosphocholine (ДПФХ), которое подвергаетс гель на жидкокристаллическую фазу перехода (Tm), который становится крайне неплотно малым водорастворимых молекул при 41 ° С [31]. Липосомы составлены из различных ДПФХ и липиды имеют отчетливую Tm и термочувствительность [32]. ДСК анализ показал, что Тт нашей системы доставки была 40,8 ° С, и анализ DOX релиз показал, что он был устойчивым при температуре 37 ° С в то время как DOX был освобожден, когда температуру повышают до 42 ° С.

• PLoS ONE: Экспрессия EGF семьи в рака желудка: подавление HER4 и его активирующее Лиганд NRG4
• PLoS ONE: Роман Функциональный TagSNP Rs7560488 в DNMT3A1 Promoter связан с предрасположенностью к рака желудка путем модулиров…