PLoS ONE: Bendro Pristatymas doksorubicino ir SATB1 shRNR iki šilumai magnetinio katijoninių liposomos skrandžio vėžio gydymo

Anotacija

ankstesnio tyrimo, mes sukūrėme naujovišką šilumai magnetinio pristatymo sistemą, grindžiamą liposomos. Šis tyrimas buvo siekiama įvertinti šios sistemos už bendro pristatymo abiejų vaistų ir genų į tą pačią sekciją, ir jos antinavikinį poveikį skrandžio vėžio efektyvumą. Doksorubicino (DOX) ir SATB1 shRNR vektorius buvo sutalpinama į bendro padavimo sistemą, ir in vitro DOX thermosensitive atpalaidavimo veiklos, nukreiptos geną triukšmo slopinimo efektyvumą, tikslingą absorbciją ląstele, in vitro citotoksiškumo, taip pat in vivo Antinavikinis buvo nustatomas. Rezultatai parodė, kad šis bendradarbiavimas tiekimo sistema turėjo norimą tikslinę pristatymo efektyvumą, DOX šilumai išleisti ir SATB1 genai yra nuslopinami. Be to, bendras pristatymo DOX ir SATB1 shRNR Izstādīta sustiprintas veiklą slopina skrandžio vėžys ląstelių augimą in vitro ir in vivo, palyginti su vienu metu siunčiamas. Daroma išvada, kad romanas thermosensitive magnetinio narkotikais ir genų bendro tiekimo sistema turi daug žadančią taikymą kartu chemoterapijos ir genų terapija skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Peng Z Wang, C Fang El, Louis X Wang G tong K (2014) Bendradarbiavimas Pristatymas doksorubicino ir SATB1 shRNR iki šilumai magnetinio katijoninių liposomos skrandžio vėžio gydymo. PLoS ONE 9 (3): e92924. Doi: 10,1371 /journal.pone.0092924

redaktorius: Jelena A. Rozhkova, Argonne nacionalinė laboratorija, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Gruodžio 4, 2013 m Priėmė: Vasario 26, 2014 m Paskelbta: Kovo 27, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Peng et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 81.172.186). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra ketvirtas paplitusi vėžio ir antroji pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirties visame pasaulyje [1]. 2008, ten buvo maždaug 989.000 naujų atvejų skrandžio vėžio ir 738,000 mirčių pasaulyje, kuris pirmiausia įvyko Rytų, Pietų ir Centrinėje Azijoje; Centrinė ir Rytų Europa; ir Pietų Amerika [2], [3]. Kinijoje, skrandžio vėžys yra trečias paplitusi vėžio su apskaičiuota 380,000 naujų atvejų ir didžiausias mirtingumas apie 26,3 gyventojų 100,000 kiekvienais metais [4], [5]. Chirurginės rezekcija yra bendras gydomasis variantas, bet jis netinka daugumai pacientų, kuriems yra vėlai skrandžio vėžio. Kiti gydymo, pavyzdžiui, radioterapijos ir chemoterapijos rodo, kad kai veiksmingumą, bet dažnai netenkina [4], [6]. Be to, sisteminė administravimas chemoterapija sukelia nepageidaujamą poveikį [7], [8].

Dėl atsparumo vaistams vystymosi chemoterapijos, tradicinis chemoterapija taip pat eksponavo ribotas priešnavikinis veiksmingumas [9]. Todėl, multi-agentas bendrai tiekimo sistema, įgytą daugiau dėmesio neseniai, nes jis gali pristatyti skirtingų tipų agentų to paties auglio ląstelių, kurios tada yra būdingos sąveikaujantį antinavikinio poveikio. Pavyzdžiui, du skirtingi cheminių agentų gali būti derinami arba cheminė medžiaga agentas gali būti derinami su sirnr (siRNA) prieš onkogeno. Be to, tikslinė pristatymas ir kontroliuoja narkotikų spaudai gali dar labiau sustiprinti priešnavikinis poveikis ir sumažinti neigiamą poveikį.

Specialusis AT-turtingas surišančio baltymo (SATB1) yra pasaulinė chromatino organizatorius, kuris reguliuoja genų ekspresiją ir dalyvauja moduliavimas piktybinių biologinių elgesio vėžio [10]. Netipinė išraiška SATB1 buvo įrodyta, kad skatino krūties vėžio, plaučių vėžio ir limfomos [11] - [13]. Mūsų ankstesni tyrimai parodė, kad SATB1 vaidina svarbų vaidmenį skrandžio vėžio ir gali būti nepriklausoma prognozė žymeklis skrandžio vėžio [14], [15]. Ir slopina SATB1 išraišką pateikdami siRNA arba plazmidės kodavimas specifinis kištis trumpą harpin RNR (shRNR) prieš SATB1 gali slopinti platinimu ir invazija, ir skatinti apoptozę vėžinių ląstelių [16], [17]. Šie rezultatai rodo, kad SATB1 yra potencialus terapinis taikinys skrandžio vėžio.

spėlioti, kad genų terapijos ir chemoterapijos derinys galėtų žymiai padidinti gydomasis poveikis nuo skrandžio vėžio. Mūsų ankstesniame tyrime, mes sukūrėme tikslinę šilumai bendro tiekimo sistema grindžiama šilumai magnetinių katijoninių liposomos (TSMCL). Iki chalceino atleidimo testą, mes optimizavo šilumai liposominė, tada matuojamas magnetinių savybių ir genų pristatymo efektyvumą TSMCL. Šiame tyrime, mes pakrautas doksorubicino ir SATB1-shRNR vektorių į šią sistemą genų terapijos ir chemoterapijos deriniu, ir įvertinus jų sinergetinį priešnavikinį poveikį prieš skrandžio vėžio in vitro ir in vivo.

Medžiagos ir metodai

medžiagos

Cholesterolis, 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocholino (DPPC), ir 3β- [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) -karbamoil] cholesterolio (DC Chol) buvo nupirkta iš Avanti Polar Lipidai (JAV). Dimetildioktadecilamonio bromidas (DOAB) buvo gauti iš Sigma-Aldrich (JAV). Magnetinis Skysčių Fe _{3O 4 buvo susintetintas Galaxy Nanotechnologija (Kinija). FAM paženklinti siRNR ir plazmidės pGFP-SATB1 shRNR teikė GenePharma (Šanchajus, Kinija). Doksorubicinas buvo įsigytas iš HISUN medikamentai (Zhejiang, Kinija). Vaisiaus jaučio serumo (FBS), kultūros žiniasklaida, penicilino /streptomicino (PEST) ir tripsino buvo tiekiama iš Invitrogen (Carlsbad, CA, JAV). SATB1 triušio monokloninis antikūnas buvo iš Epitomics (Abcam, Jungtinė Karalystė). Visi kiti chemikalai buvo komercinės analiziškai gryni ir naudojama be tolesnio gryninimo.}

Pasirengimas bendrai tiekimo sistemos

Šis bendradarbiavimas tiekimo sistema buvo grindžiama šilumai katijoninių liposomų, kurios buvo parengtos su šilumai katijoninių formulavimas DPPC, DC-cholesterolio, DOAB ir cholesterolio moliniu santykiu 80:5:5:10 optimizuotas mūsų preliminariais eksperimentams. Liposomos (TSCL) buvo parengta plonasluoksnių hidratacijos metodą, po ekstruzijos būdu [18]. Amonio sulfato gradientas metodas buvo naudojamas įkelti DOX į TSCL (TSCL-DOX). Parengti magnetinių liposomos (TSMCL), magnetinis skystis Fe _{3O 4 buvo naudojamas kaip pagrindas ir kartu aplieti su amonio sulfato buferio į Liposomtl. Po to, kai plona plėvele formavimo į apvaliadugnę kolbą, buvo įtraukta vienas mililitre suspensijos geležies ir amonio sulfato hidratas filmą, ir tada ekstruzinio per polikarbonato filtrų ir pakrautas su DOX (TSMCL-DOX) pagal amonio sulfato gradiento metodu , Galiausiai, gaminiai iš gelfiltraciją buvo centrifuguojamas 1000 g 15 min pašalinti bekorpusį Fe 3O 4.}

pGFP-SATB1-shRNR (shSATB1) vektorius buvo inkubuojami su skirtingais liposomų į serumas laisvosios kambario temperatūroje 30 min, parengti TSCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1, TSMCL-shSATB1 ir TSMCL-DOX-shSATB1, atitinkamai.

nustatymas Dzeta potencialo, dalelių dydis ir polidispersiškumas

vidutinis dalelių dydis ir dalelių dydžio pasiskirstymo arba liposomų polidispersiškumas buvo nustatomas, esant 25 ° C temperatūroje, naudojant dinaminio šviesos sklaidos, naudojant ZetaPALS dalelių klijavimas priemonę (Brookhaven Instruments Corporation, JAV). Dzeta potencialas liposominių dispersijų buvo matuojamas naudojant tą patį priemonę, esant 25 ° C temperatūroje, taikant elektroforezės mobilumo.

nustatymas doksorubicino pakrautas efektyvumas

DOX koncentracija liposomas buvo matuojamas pagal fluorimetras ( Perkin Elmer, JAV) su 485 nm sužadinimo ir 590 nm emisijos filtrų su praskiedimo serijos nemokamai DOX kaip standartą. DOX pakrautas efektyvumas buvo skaičiuojamas remiantis DOX koncentracijos.

diferencinės skenavimo kalorimetrijos (DSC)

DSC buvo atliktas, siekiant įvertinti liposomų thermosensitivity nustatant fazinio virsmo temperatūra (TM). Tm buvo įvertintas naudojant nano DSC (TA Instruments, JAV) kaitinant 20 ° C /h su 20 mg /ml fosfolipidų.

in vitro šilumai DOX spaudai testą

20 iL DOX pakrauti liposomos buvo inkubuojami 1 ml PBS ir PBS su 50% vaisiaus galvijų serumo (FBS), kuris imituoja in vivo aplinką atskirai Eppendorfo vamzdžių. Mėginiai buvo kaitinamas vandens vonioje iki 37 ° C ir 42 ° C temperatūroje 1 h, atitinkamai. Tada fluorescencijos intensyvumas DOX buvo matuojamas fluorimetras (Perkin Elmer, JAV), naudojant 485 nm sužadinimo ir 590 nm emisijos filtrai. 100% išleidimo, mėginiai buvo inkubuojami 1 ml PBS su 1% Triton X-100 už 1 min. Į DOX spaudai procentai buvo apskaičiuojamas po: kur F _{S buvo mėginių fluorescencijos po šildymo F 0 buvo pradinis fluorescencija mėginių prieš šildymo, ir F 100 buvo mėginių fluorescencijos gydomi Triton X-100.}

Mobilusis kultūra

žmogaus skrandžio adenokarcinoma MKN-28 ląstelių linija buvo įsigytas iš keygen Biotech (Nanjing, Kinija) ir kultūringas aukštos gliukozės DMEM papildytas 10% FBS, 100 V /ml penicilino ir 100 mikrogramų /ml streptomicino drėgmėje, 5% CO _{2 37 ° C temperatūroje.}

in vitro ląstelių transfekcija

MKN-28 buvo pasėjamos ląstelės į 12 duobučių plokštelėse po 4 × 10 ^{5 ląstelių tankis /gerai ir auginami per naktį, kad maždaug 80% santakoje. Kitą dieną, ląstelės buvo plaunama du kartus, pašildytame PBS, tada TSCL-shSATB1 ir TSMCL-shSATB1 buvo pridėta į kiekvieną šulinėlį ir inkubuojami 6 h. Ląstelės inkubuojamos su TSMCL-shSATB1 buvo pastatytas ant 12 šulinėlių magnetinio plokštelės per pirmąsias 30 min pasiūlyti magnetinį lauką. Kitą, inkubacinis vidutinės buvo pakeistas su DMEM, papildytoje 10% FBS ir ląstelės buvo inkubuojamos 24 h. GFP išraiška lygis buvo įvertintas pagal fluorescencijos mikroskopu (Nikon 80i) ir srauto citometre (BD FACS Canto II).}

Realaus laiko kiekybine polimerazės grandininė reakcija (AT-qPCR)

Viso RNR buvo išskirta nuo MKN-28 ląstelių naudojant TRIzol Regent (Invitrogen, Karlovi Varai, CA) pagal gamintojo nurodymus ir kDNR buvo susintetintas naudojant PrimeScript RT Master MIX (TAKARA, Dalian). PGR buvo atliekama naudojant SYBR Pašaro Ex Taq II (TAKARA, Dalian) ant StepOne Plus Realaus laiko PGR sistema (Applied BIOSYSTEMS, JAV). Pradmenų sekas buvo taip: SATB1 jausmą 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 ', ir Priešprasminis 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3' GADPH jausmą 5'-ACAGAACCCTGTGGGAGAAC-3 ', ir Priešprasminis 5'-GCGTTGCTCTCCTGTTCATA-3'. SATB1 iRNR lygis buvo normalizuotas kad GAPDH.

Vakarų dėmė analizė

MKN-28 ląstelių buvo nukirsta ir lizuoti į Ripa buferio. Supernatantq buvo surinkti po centrifugavimo 10000 g 10 min. Baltymo koncentracija supernatanto buvo nustatomi, naudojant BCA baltymų Analizės rinkinys. Tada 40 mikrogramų mėginių buvo paleisti 15% SDS-PAGE ir baltymai buvo perkelti į PVDF membranas. Kitą, membranos buvo inkubuojamos 5% lieso pieno 1 h blokuoti nespecifinį, ir inkubuojami per naktį 4 ° C su SATB1 arba beta-aktino antikūno (1:500 praskiedimo). tada Membranos buvo zonduotos su HRP-konjuguoto ožkos anti triušio antrinio antikūno 30 min. Galiausiai, membranos buvo ryškinamos su sustiprinto cheminės liuminescencijos sistemos (ECL Pierce) ir veikiami rentgeno filmą.

in vitro įvertinimas ląstelių įsisavinimo

Jei įvertinti ląstelėje vietą pristatytų DOX ir pGFP-SATB1 shRNR ir sustiprintas skverbtis liposomų į skrandžio vėžio ląstelių magnetinio tikslingai, ir FAM paženklinti siRNR (žalias fluorescencinis) buvo naudojamas imituoti pGFP-SATB1 shRNR ir DOX savaime turi instinktas raudona fluorescencija stebėti mobiliojo įsisavinimą , MKN-28 ląstelių buvo pasėjamos į 12 šulinėlių plokštelės 4 × 10 ^{5 ląstelių /gerai ir auginamos per naktį. Tada ląstelės inkubuojamos su nemokamu siRNA, TSCL-siRNR, TSMCL-siRNR, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-DOX-siRNR arba TSMCL-DOX-siRNR 6 val. Magnetinių liposomų, plokštelės buvo pastatytas ant 12 šulinėlių magnetinio plokštelės per pirmąją valandą inkubavimo. Ląstelės buvo ryškinamos pagal fluorescencijos mikroskopijos surasti liuminescencines etiketes DOX ir siRNA. Branduolys buvo tamsintas su DAPI (mėlyna fluorescencija).}

MTT

MKN-28 ląstelių buvo pasėjamos esant tankiui 2 × 10 ^{4 ląstelių /gerai 96-duobučių lėkštelėse ir išaugo per naktį. Po to ląstelės buvo inkubuojamos su skirtingų liposomų 37 ° C temperatūroje 2 val CO _{2 inkubatoriuje. Magnetinių liposomų, plokštelės per pirmuosius 1 h inkubacijos buvo pateikti pagal 96 šulinėlių magnetinio plokštės. Kitą ląstelės buvo plaunama du kartus PBS ir inkubuojami 46 h šviežia priemonėse. Vėliau, ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas pagal MTT. Kiekvieno iš jų šulinio vidutinės buvo pakeistas 20 mikrol MTT tirpalą (Sigma-Aldrich, JAV) ir inkubuojama 4 valandas 37 ° C temperatūroje, tada supernatantų, buvo atmestos ir formazano kristalai buvo ištirpinta su 200 mikrol, DMSO. Lėkštelės buvo matuojamas esant 490 nm mikroplokštelių skaitytojui, o ląstelių gyvybingumas buvo apskaičiuojamas pagal šią formulę:}}

tėkmės citometrijos

Apoptozę buvo aptiktas naudojant aneksinu-FITC Apoptozę nustatymo rinkinys (eBioscience, JAV). MKN-28 ląstelės buvo pasėjamos į 12-duobučių lėkštelėse ir apdorojamas, kaip aprašyta aukščiau. Po to, kai 24 h, ląstelės buvo surinkti, plaunama du kartus PBS ir suspenduotos 500 pL rišikliais buferį. Kitas ląstelės buvo dvigubai tamsintas su aneksinu-FITC ir propidiumo jodido (PI). Ląstelės anksti apoptozės tamsintas su aneksinu-FITC bet ne tamsintas su PI buvo kiekybiškai srauto cytometery.

ksenografiniuose pelės modelis

Nuo penkių iki šešių savaičių amžiaus vyrai BALB /c nude pelėms buvo nurodyta centro gyvūnų eksperimentai Tongji medicinos koledžo. Kiekvienas pelės buvo pasėta po oda į dešinio krašto su 5 × 10 ^{6 MKN-28 ląstelių. Keletą savaičių po to, kai buvo suleistas naviko, 36 naviko guolis pelių buvo atsitiktiniu būdu suskirstytos į šešias grupes (n = 6). Pelėms buvo suleista per uodegos venos su gyvūnais DOX, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1, TSMCL-DOX-shSATB1 ar fiziologinio tirpalo, kaip kontroliuoti. Iš DOX dozė buvo 2,5 mg /kg kūno svorio ir kad pGFP-SATB1 shRNR buvo 10 mikrogramų vienam pele. Gydymas buvo suteiktas kartą per 3 dienas ir naviko dydis buvo matuojamas per calipering ir tada naviko tūris gali būti skaičiuojamas pagal šią formulę: apimtis = (D _{min) 2 × D max /2, kai D max buvo ilgiausias naviko skersmuo ir D Min buvo trumpiausias. Dėl TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 ir TSMCL-DOX-shSATB1, magnetinis nukreipimas buvo pasiektas naudojant nuolatinį išorinį magnetinį lauką 5000 Gauss 30 min sutelkiant dėmesį į naviko po narkotikų vartojimo. Visi eksperimentai buvo patvirtinti Etikos komiteto Tongji medicinos koledžo ir visi gyvūnai buvo elgiamasi humaniškai pagal Institucinis gyvūnų globos ir vaistų komiteto rekomendacijas.}}

Statistika analizė

Duomenų buvo išreikštas vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD). Statistinis reikšmingumas tarp skirtingų grupių buvo vertinami Stjudento t-testas ir vienas veiksnių dispersinė analizė (ANOVA) testą. Dėl išlikimo laiką gyvūnų, buvo nustatytas ir log rank testą Kaplan-Meier kreivė kiekvienos grupės buvo atliktas palyginti išgyvenamumas. p < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas

Rezultatai

apibūdinimas liposomos

Kaip parodyta 1-oje lentelėje TSCL skersmuo buvo 83,6 ± 5,7 nm,, tuo tarpu TSCL. -DOX buvo padidintas iki 118,5 ± 7,9 nm dėl DOX hermetizuoti. Tuo tarpu TSCL-shSATB1 ir TSCL-DOX-shSATB1 skersmenys buvo žymiai padidėjo iki 161,1 ± 11,8 nm ir 238.1 ± 20,6 nm, atitinkamai, dėl sukibimo ir sintezės plazmidės DNR liposomos. Magnetinių liposomų, dalelių dydžių TSMCL, TSMCL-DOX, TSMCL-shSATB1 ir TSMCL-DOX-shSATB1 buvo 135,0 ± 11,6 nm 157,2 ± 14,3 nm 221,3 ± 15,7 nm, o 319,4 ± 20,1 nm, atitinkamai, gerokai didesnis nei iš TSCL, TSCL-DOX, TSCL-shSATB1 ir TSCL-DOX-shSATB1 dėl magnetinių nanodalelių provokacijos. Be to, TSMCL-shSATB1 ir TSMCL-DOX-shSATB1 dydis buvo gerokai didesnis negu TSMCL ir TSMCL-DOX, atitinkamai (p < 0,05). Visi liposomos turėjo siaurą dydžio pasiskirstymą, nes jų Polidispersiškumas buvo ne daugiau kaip 0,3.

Zeta potencialai TSCL, TSCL-DOX, TSCL-shSATB1 ir TSCL-DOX-shSATB1 buvo 52,0 ± 7,3 mV, 50,1 ± 7,7 mV, 31,3 ± 5,2 mV, ir 26,7 ± 4,5 mV, atitinkamai. Po inkubacijos su pGFP-SATB1- shRNR, paviršiaus mokestis žymiai sumažėjo (p < 0,05), dėl to, kad elektrostatiniu sąveikos tarp katijoninių lipidų ir plazmidės DNR. Tačiau įstrigti Magnetinių nanodalelių nesukėlė reikšmingo sumažėjimo Zeta potencialo magnetinių liposomos.

DOX pakrautas efektyvumą, DOX sandarinimo lygis buvo 89 ± 3% ir 78 ± 8% (n = 3) už TSCL-DOX ir TSMCL-DOX, atitinkamai, ir buvo 85 ± 7% ir 73 ± 9% (n = 3), TSCL-DOX-shSATB1 ir TSMCL-DOX-shSATB1, atitinkamai. Šie duomenys rodo, kad skirtumas tarp liposomų ir plazmidžių sąveika nesukėlė DOX nutekėjimo.

Liposomtl
thermosensitivity

diferencinės skenavimo kalorimetrijos buvo atliktas siekiant nustatyti fazinio virsmo temperatūra TSCL. Kaip parodyta Fig. 1, TSCL sudarytas iš DPPC, DC-cholesterolio, DOAB ir cholesterolio moliniu santykiu 80:5:5:10 turėjo Tm iš 40,8 ° C temperatūroje, turintis santykinai platesnį pereinamojo viršūnes, kurios gali būti sulietas perėjimas smailė DPPC ir DOAB .

in vitro thermosensitive DOX išsiskyrimą iš liposomos

Kaip parodyta Fig. 2, DOX atpalaidavimo greitis nuo TSCL-DOX ir TSMCL-DOX buvo tik 12% ir 16% po inkubacijos su PBS esant 37 ° C, ir po inkubacijos padidinta iki 20% ir 19% su 50% FBS, atitinkamai. Dėl TSCL-DOX-shSATB1 ir TSMCL-DOX-shSATB1, DOX spaudai norma buvo 12% ir 15% po inkubacijos su PBS esant 37 ° C temperatūroje, ir buvo tiek 16% po inkubacijos su 50% FBS, nurodant, kad plazmidės įtraukimas turėjo reikšmingo poveikio liposomų stabilumo (p > 0,05).

DOX išsiskyrimo iš TSCL-DOX ir TSMCL-DOX buvo po inkubacijos su PBS padidėjo iki 37%, esant 42 ° C, o padidėjo iki 45% ir 49% po inkubacijos su 50% FBS, atitinkamai. Už TSCL-DOX-shSATB1 ir TSMCL-DOX-shSATB1, DOX atpalaidavimo greitis buvo 35% ir 43% po inkubacijos su PBS ir FBS esant 42 ° C, atitinkamai, tiek gerokai didesnis nei 37 ° C temperatūroje (p < 0,05). Šie rezultatai rodo, kad TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-DOX-shSATB1 ir TSMCL-DOX-shSATB1 turėti norimą thermosensitivity, ir gali būti naudojamas hipertermija sukėlė kontrolės išlaisvinti DOX.

Triukšmo slopinimo ir SATB1 išraiška MKN-28 ląstelių transfektuotose liposomos

Kitas mes įvertino Liposomtl efektyvumą pristatyti shSATB1 vektorių į MNK-28 ląstelių. Tipinės fluorescencijos vaizdai ląstelių transfektuotose TSCL-shSATB1 ir TSMCL-shSATB1 buvo parodyta pav. 3A. Tėkmės citometrijos analizė parodė, kad transfekcija efektyvumas TSCL-shSATB1 buvo tik 15,4 ± 0,15%. Tačiau po to, kai magnetinio lauko orientavimo prašymą, transfekcija efektyvumas TSMCL-shSATB1 buvo 34,3 ± 0,93%, žymiai didesnis negu TSCL-shSATB1 (3b pav.).

Norėdami nustatyti, ar pristatytą shSATB1 vektoriaus gali tarpininkauti nutildymo iš SATB1 raiškos MKN-28 ląstelių, mes atliekame realaus laiko kiekybine PGR ir Vakarų dėmė analizė. Rezultatai parodė, kad abi SATB1 iRNR ir baltymų kiekis sumažėjo ląstelių transfektuotose TSCL-shSATB1 ir TSMCL-shSATB1, palyginti su kontrolinių ląstelių. Be to, TSMCL-shSATB1 su magnetinio lauko pagalba buvo stipresnis nei TSCL-shSATB1 slopinti SATB1 išraišką MKN-28 ląstelių (pav. 3C, D).

Magnetinis skirta in vitro ląstelių patekimas

Norėdami palyginti perėjimų į tarp nemagnetinių ir magnetinių liposomų su magnetiniu tikslingai orientavimo taikymo, taip pat ląstelėje vietoje pristatyto DOX ir shSATB1, ląstelių FAM žymėto siRNR buvo naudojamas kaip indikatorius. Žaliosios fluorescencijos nebuvimą ląstelėse gydytų Nemokami siRNA nurodė, kad ji negalėjo prasiskverbti į ląsteles (duomenys neparodyti). Mes pastebėta, kad daugiau ląstelių, gydomiems TSMCL-siRNA eksponuojami žalią fluorescenciją, nei ląstelių gydomiems TSCL-siRNA (pav. 4A). Be to, daugiau ląstelių, gydomiems TSMCL-DOX parodė raudoną fluorescenciją, nei ląstelių gydomiems TSCL-DOX (pav. 4b). Ląstelėse gydomiems TSMCL-DOX-siRNA, buvo pastebėtas didelis fluorescencijos intensyvumas, o ląstelės atsirado rožinė dėl mėlynos, raudonos ir žalios spalvos (4c pav.) Sujungti. Šios pastabos rodo, kad TSMCL yra stipresnis teikiant siRNA ir DOX į ląsteles nei TSCL, po magnetinio lauko taikymo.

Be to, mes išnagrinėjo ląstelėje vietą pristatytų DOX ir siRNA. Raudona fluorescencija buvo stebimas tiek branduolių ir citoplazmos, nurodant, kad pristatytas DOX buvo įsikūrusi tiek branduolių ir citoplazmos. Priešingai, žalios fluorescencija visų pirma pasirodė citoplazmoje, o tai rodo, kad siRNAs buvo pareikšta į citoplazmą (pav. 4d). Raudonųjų ir žaliųjų sujungimas pasirodė geltonos citoplazmoje, o mėlyna ir raudona sujungti pasirodė levandų branduolius. Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad tiek TSCL ir TSMCL gali prasiskverbti į skrandžio vėžio ląsteles ir pristatyti savo turinį į citoplazmą (DOX ir siRNA) ir branduolių (DOX).

in vitro antinavikinio poveikį atitinkamai liposomos

Mes įvertinome in vitro priešnavikinis poveikis šio bendro pristatymo sistemą citotoksiškumo ir apoptozė indukcijos veikla. Liposomtl citotoksiškumo buvo įvertintas MTT. Siekdamos nustatyti DOX ir plazmidžių koncentracijos poveikį liposomų citotoksiškumo, mes išnagrinėjo liposomos pakrautas su įvairių koncentracijų DOX ir skirtingo dydžio SATB1 shRNR. Su DOX koncentracijos padidėjimą, arba liposomų citotoksiškumo buvo didesnė (5A pav.). Tačiau SATB1 shRNR koncentracijos to nebuvo padidėti citotoksiškumo, ir ten buvo tik šiek tiek padidinti citotoksiškumo, kai SATB1 shRNR koncentracija buvo apie 4 mikrogramų (pav. 5B). Taigi mes panaudojome 25 mkm DOX ir 4 mikrogramų SATB1 shRNR palyginti tarp laisvų DOX, Nemokama shRNR, TSCL, TSMCL, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 ir TSMCL- citotoksiškumo DOX-shSATB1.

Kaip parodyta Fig. 5C, nemokama shRNR, TSCL ir TSMCL turėjo mažai citotoksiškumo. Ląstelių gyvybingumas buvo 40,3 ± 3,4%, 73,6 ± 3,5% ir 51,3 ± 4,5% nemokamai DOX, TSCL-DOX ir TSMCL-DOX, atitinkamai, o tai rodo, kad TSMCL-DOX citotoksiškumo buvo didesnis nei TSCL-DOX, bet mažesnis kaip nemokamai DOX , Ląstelių gyvybingumas buvo 79,2 ± 6,9% ir 71,6 ± 4,7% už TSCL-shSATB1 ir TSMCL-shSATB1, atitinkamai, nematyti statistika reikšmę (p > 0,05). Dėl narkotikų ir genų bendradarbiavimo pristatymo, ląstelių gyvybingumas buvo tik 35,0 ± 3,2% ir 22,3 ± 3,4% už TSCL-DOX-shRNR ir TSMCL-DOX-shRNR, atitinkamai, gerokai mažesnis nei laisvosios DOX, TSCL-DOX, TSMCL- DOX ir SATB1shRNA pakrauti liposomos (p < 0,05). Be to, ląstelių gyvybingumas TSMCL-DOX-shRNR buvo gerokai mažesnis nei TSCL-DOX-shRNR (p < 0,05). Šie rezultatai rodo, kad sinergetinis citotoksiškumo efektas pasiekiamas bendrai teikiant DOX ir SATB1 shRNR. Be to, su magnetinio taikymo tikslingai, dar sustiprintos citotoksiškumo galima gauti.

Siekiant nustatyti papildomą priešnavikinį mechanizmą Be to, kad bendro tiekimo sistema citotoksiškumo, mes išnagrinėjo apoptozę normą MKN-28 ląstelės apdorotų Nemokami DOX, TSCL-DOX, TSMCL-DOX, TSCL-shSATB1, TSMCL-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 ir TSMCL-DOX-shSATB1 tėkmės citometrijos. Kaip parodyta Fig. 5D, apoptozė lygis buvo 22,3% ląstelėse gydytų Nemokami DOX, buvo 8,9% ląstelių gydomiems TSCL-DOX, tačiau ląstelėse gydomiems TSMCL-DOX ir magnetinio lauko padidėjo iki 13,4%. Be to, apoptozė norma buvo 9,4% ląstelėse gydomiems TSCL-shSATB1, tačiau ląstelėse gydomiems TSMCL-shSATB1 ir magnetinio lauko padidėjo iki 17,4%. Priešingai, apoptozė lygis buvo 27,7% ląstelėse gydomiems TSCL-DOX-shSATB1, didesnis negu gydomiems TSCL ląstelių pakrautas su DOX ar shSATB1 vien. Apoptozę lygis buvo 32,4% ląstelėse gydomiems TSMCL-DOX-shSATB1, didžiausias tarp visų grupių. Šie rezultatai rodo, kad bendradarbiavimas teikiant DOX ir SATB1 shRNR sukelia bendrą poveikį apoptozės indukcija. Vienu žodžiu, tai bendrai pristatymo sistema pasižymi stipriu anti-vėžinių poveikį in vitro.

in vivo antinavikinis aktyvumas liposomos

Siekiant nustatyti in vivo antinavikinį poveikį nuo bendro padavimo sistemą, mes sukūrėme MKN-28 pelių ksenografiniuose modelius ir švirkščiamas Nemokama DOX, TSMCL-DOX, TSCML-shSATB1, TSCL-DOX-shSATB1 arba TSMCL-DOX-shSATB1 į pelių per uodegos venos. Gydymas buvo vieną kartą kas 3 dienas, ir navikai buvo išpjaunamas (6a pav.). Dieną 15, naviko tūris buvo 0,44 ± 0,05 cm, ^{3 pelėms gydomiems TSMCL-DOX-shSATB1, gerokai mažesnė negu fiziologinio grupėje (2.14 ± 0,23 cm, 3), Nemokama DOX grupė (1,08 ± 0,13 cm, 3), TSMCL-DOX grupė (0,68 ± 0,10 cm, 3), TSCML-shSATB1 grupė (1,43 ± 0,21 cm, 3), ir TSCL-DOX-shSATB1 grupė (0,77 ± 0,12 cm, 3) (6B pav.).}

Be to, kaip parodyta Fig. 6 (C) vidutinis laikas naviko tūrio pasiekti 2 cm ^{3 buvo prieš 30 dienų TSMCL-DOX-shSATB1 grupės, ilgiau nei, kad druskos grupės, Nemokama DOX grupė, TSMCL-DOX grupė, TSCML-shSATB1 grupė ir TSCL-DOX-shSATB1 grupė (6C pav.). Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad bendrai teikiant DOX ir shSATB1 iki TSMCL sinergetiškai Priešnavikinio poveikį in vivo.}

Diskusijos

Nepaisant neseniai plėtros chirurgija, radioterapija ir nukreipti terapija, chemoterapija vis dar yra vienas iš svarbiausių metodų, skirtų skrandžio vėžio gydymo. Tačiau, terapinis poveikis chemoterapijos yra dažnai nepatenkinti ir negalėjo žymiai pagerinti vėžiu sergantiems pacientams [19] prognozę. Viena pagrindinių priežasčių yra Tumorigenesis ir progresavimo skrandžio vėžys apima įvairių mechanizmų įvairovė; vieningas kovos navikas mechanizmas tradicinės chemoterapijos apribojo savo gydomąjį poveikį, todėl chemoterapijos su genų terapija gali pagerinti priešnavikinis poveikis derinys. Kitas chemoterapijos kliūtis yra ta, kad sisteminė vaistų administracija veda prie riboto vaisto koncentracijos naviko svetainių, o sukelia daug neigiamų padarinių [8]. Svarbiausia išspręsti šias problemas remiasi naujų būdų narkotikų pristatymo, todėl kuriant kryptingą multi-agentų, gabenantiems sistemą, kuri gali būti tiesiogiai nukreipti į auglio vietą su kontroliuojamo medžiagų išsiskyrimo gali išspręsti šias problemas ir sustiprinti gydomąjį poveikį [20] - [25] .

Tarp įvairių vaistų pristatymo sistemų, liposomos yra perspektyviausia gerų biocompatibilities, kurie sukelia mažai arba jokio Antigeninė, alergija, ir toksines reakcijas, ir lengvai atliekama biologinio skaidymo. Kadangi abi narkotikų ir genų vežėjų, liposomos gali ne tik apsaugoti šeimininką nuo nepageidaujamų poveikių aplieti narkotikų, bet ir užkirsti kelią uždarytų turinį iš priešlaikinio slopinamasis fiziologinės terpėje [26]. Be to, liposomos yra potencialiai skirta narkotikų tiekimo sistema, ar tai pasiekiama didesnio pralaidumo ir susilaikymas (EPR) poveikio (Pasyvus tikslingai) arba magnetinio lauko orientavimo ir imuninės jungtimi (Active tikslingai) [27]. Be to, kai liposomos disponuotų kontroliuojamos sukėlė narkotikų spaudai funkcijas, pavyzdžiui, termo jautrumo pH jautrumo ir mikrobangų jautrumo.

Neseniai buvo sukurtas naujoviškas magnetinį tikslinę šilumai narkotikų ir genų bendro tiekimo sistema (TSMCL). Remiantis electroneutral šilumai formavimo (DPPC:Cholesterol = 80:20), mes buvo įtraukta įvairių katijoninių komponentai ir optimizuotas liposomų thermosensitivity pagal chalceino spaudai tyrimu. Rezultatai nurodė, kad galėtume gauti norimą thermosensitivity pakeičiant 10 mol dalys cholesterolio 5 mol dalių DC cholesterolio ir 5 mol dalių DOAB (DPPC:DC-Cholesterol:DOAB:Cholesterol = 80:5:5:10) ir chalceino išsiskyrimo iš liposomų būtų mažesnis 37 ° C temperatūroje, bet reikšmingas yra ne mažesnis kaip 42 ° C šiame preparate. Kitas, magnetinis skystis Fe _{3O 4 buvo naudojamas kaip pagrindas, ir veikė kaip magnetinio nukreipimą ir šildymo šaltinis TSMCL. Vibracija Imties Magnetometras (VSM) matavimo nurodė, kad magnetinis skystis Fe 3O 4 buvo superparamagnetinės, todėl TSMCL būtų geras magnetines tikslines poveikį. Tuo tarpu, nuo laiko priklausantis šildymas kreivė taip pat parodė, kad tiek magnetinio skysčio Fe 3O 4 ir TSMCL gali būti kaitinamas nuo 25 ° C iki 42 ° C per 20 min. Su magnetinio skysčio Fe 3O 4, ir nuo magnetinio nukreipimą ir temperatūros pagalba sukėlė narkotikų spaudai TSMCL gali būti realizuota. Galiausiai, abiejų TSCL ir TSMCL buvo eksponuojami tipiškus liposominis morphologies ir gerų paskirstymus pagal TEM. Remiantis sėkmingai statybos TSMCL, šiame tyrime mes pakrautas DOX ir SATB1 shRNR vektorių į TSMCL padaryti TSMCL-DOX-shSATB1 ir vertinamos priešnavikinis poveikis prieš skrandžio vėžio ląsteles in vitro ir in vivo.}

DOX yra dažniausiai naudojamas vaistas chemoterapijos su didelio efektyvumo slopinti auglio ląstelių proliferaciją ir indukuoja auglio ląstelių apoptozę, tačiau jo gydomasis poveikis yra ribotas dėl sunkaus toksinio poveikio širdžiai ir mieloidinio audinio funkcijos slopinimas, kai administravo sistemiškai [28]. Nors DOX liposomos iš dalies pagerino situaciją, tikslinę pristatymo trūksta dar limites jų panaudojimą [29]. SATB1 yra pasaulinė chromatino organizatorius, kurie tiesiogiai reguliuoja ERRB2, MMP2, ABL1 ir E-cad išraišką veikti kaip pagrindinis reguliatorius vėžio išsivystymo [30]. Padidėjusi SATB1 įvairių navikų buvo susijęs su piktybiniais biologinių elgesį, pavyzdžiui, invazija, platinimu ir metastazių [10] - [13]. Triukšmo slopinimo SATB1 ekspresiją sirnr (siRNA) arba plazmidės, koduojančio trumpą harpin RNR (shRNR) gali slopinti, dauginimąsi, invazija ir metastazes, ir sukelti apoptozę įvairių vėžinių ląstelių [16], [17]. Todėl SATB1 tampa potencialus taikinys vėžio gydymo [30]. Tačiau atitinkamos pristatymo vektoriai siRNA ar shRNR yra svarbūs SATB1 skirta vėžio genų terapija.

Šiame tyrime naudojant TSMCL-DOX-shSATB1 sistemą, tiek DOX ir SATB1 shRNR vektorius gali būti nukreipti į auglio vietą pagal magnetinio pateikė gaires, ir DOX buvo išleistas hipertermija sukėlė būdą. Hipertermija sukėlė spaudai priklauso nuo šilumai liposomų, kurios visų pirma sudarytas iš Dipalmitoyphosphocholine (DPPC), kurioje buvo atliktas gelį nuo skysčių kristalinė fazė pereinamuoju (TM), kuri tampa labai nesandarus mažoms vandenyje tirpių molekulių 41 ° C [31]. Liposomos, sudarytas iš įvairių DPPC ir lipidai turi atskirą TM thermosensitivity [32]. DSC analizė parodė, kad mūsų tiekimo sistema Tm buvo 40,8 ° C, o DOX atpalaidavimo tyrimas parodė, kad tai buvo pastovus 37 ° C temperatūroje, o DOX buvo išleistas, kai temperatūra pakeliama iki 42 ° C temperatūroje.

• PLoS ONE: išraiška EGF Šeima skrandžio vėžiu: downregulation iš HER4 ir jos aktyvinimas ligandas NRG4
• PLoS ONE: romanas Funkcinis TagSNP Rs7560488 į DNMT3A1 Rėmėjas yra susijęs su polinkiu į skrandžio vėžys, keičiant Rėmėjas Activity