PLoS ONE: Hypoksia-indusoituva tekijä 1α Määrää mahasyövän Kemosensitiivisyys kautta modulaatio p53 ja NF-KB

tiivistelmä

Background

Alennettu kemosensitiivisyys kiinteiden syöpäsolujen edustaa keskeinen este kliinisen onkologian. Siten molekulaarinen reittejä säännellä kemosensitiivisyys on keskeinen edellytys parantaa syövän hoidossa. Hypoksian indusoituva tekijä HIF-1α on liitetty kemosensitiivisyys kun taustalla molekyylitason mekanismit ovat edelleen suurelta osin hämäräksi. Siksi me kattavasti analysoitu HIF-1α: n rooli päätettäessä kemosensitiivisyys keskitytään vastuussa molekyylien polkuja.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

RNA-interferenssi sovellettiin inaktivoimiseksi HIF-1α tai p53 ihmisen mahasyövän solulinjoja AGS ja MKN28. Kemoterapeuttisten aineiden 5-fluorourasiili ja sisplatiini käytettiin ja kemosensitiivisyys arvioitiin soluproliferaatiomääritykset sekä määrittämiseksi solukierron jakelun ja apoptoosin. P53: n ja p53: n kohde-proteiinit analysoitiin Western blotilla. NF-KB: n aktiivisuus karakterisoitiin elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä. Inaktivointi HIF-1α mahasyövän soluissa johti vahvaa nousua kemosensitiivisyys. Niinpä HIF-1α-kompetentteja soluja näy merkittävästi vähentää kemoterapian aiheuttama vanhenemista ja apoptoosia. Yllättävää kyllä, tämä fenotyyppi oli täysin poissa p53
mutanttisoluja taas inaktivaatio p53 sinänsä
ei vaikuttanut kemosensitiivisyys. HIF-1α merkittävästi tukahdutti kemoterapian aiheuttama aktivointi p53 ja p21 sekä retinoblastoomaproteiiniin lopulta johtaa solusyklin pysähtymiseen. Alennettu reaktiivisten hapen lajien HIF-1α-kompetentteja soluja todettiin molekyylimekanismi HIF-1α-estoa p53. Lisäksi menetys HIF-1α kumottu, p53-riippuvaisella tavalla, kemoterapian aiheuttama DNA: ta sitovan NF-KB: n ja ilmentymisen anti-apoptoottisten NF-KB: n kohdegeenien. Niinpä rekonstituoinnista NF-KB-alayksikön p65 päinvastaiseksi lisääntynyt kemosensitiivisyys HIF-1α-vajaiden solujen.

Johtopäätös ja merkitys

Yhteenvetona tunnistimme HIF-1α tehokkaana säätelijänä p53 ja NF-KB: n aktiivisuutta olosuhteissa genotoksinen stressiä. Olemme päätellä, että p53
mutaatioita ihmisen kasvaimissa pidä potentiaalia hämmentää teho HIF-1-estäjät syövän hoidossa.

Citation: Rohwer N, Dame C, Haugstetter A, Wiedenmann B , Detjen K, Schmitt CA, et al. (2010) Hypoksia-indusoituva tekijä 1α Määrää mahasyövän Kemosensitiivisyys kautta modulaatio p53 ja NF-KB. PLoS ONE 5 (8): e12038. doi: 10,1371 /journal.pone.0012038

Editor: Deb Fox, The Research Institute for Children lastensairaalassa New Orleans, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 huhtikuu 2010; Hyväksytty: 19 heinäkuu 2010; Julkaistu: 10 elokuu 2010

Copyright: © 2010 Rohwer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de) TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 ja 133 /2-3), ja NR (Graduiertenkolleg 276/4 - "Signalerkennung und -umsetzung"). TC tuki myös avustusta Berliner Krebsgesellschaft e.V. (Http://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

luonnostaan ​​ja hankittu lääkeresistenssi ovat ensisijainen syitä rajoitettu tehoa kemoterapiaa useimmissa ruoansulatuskanavan maligniteetteja, mukaan lukien mahasyöpä [1], [2]. Lääkeresistenssi merkitsee monimutkaista ja monitekijäinen liittynyt ilmiö kasvaimen mikroympäristössä, esim. hypoksia, asidoosi ja tulehdus sekä vainsolukasvun itse [3]. Cellular vastus voi olla luontainen geneettisen taustan kasvainsolun tai johtuvat mutaatioista ja epigeneettisiä muutoksia sen jälkeen, kun antiproliferatiivinen hoidon [4], [5].

transkriptiotekijä hypoksia-indusoituva tekijä 1 (HIF-1 ) muodostaa keskeinen säätelijä solujen sopeutuminen hypoksia ja on liitetty lääkeresistenssin [6] - [8]. HIF-1-proteiini on heterodimeeri, joka koostuu konstitutiivisesti β-alayksikön (ARNT (aryylihiilivetyreseptori ydin- translocator)) ja hypoksia-indusoituva α-alayksikkö [9]. Under happiolosuhteissa, HIF-1α aktiivisuutta voidaan saada aikaan erilaisia ​​kasvutekijöitä, sytokiineja, aktivoitu onkogeenien tai menettämisestä toiminnon mutatoitujen tuumorisuppressorigeeneille [10]. HIF-1α on keskeisesti mukana useita ominaisuuksia tumorigeneesin lukien kasvainsoluproliferaation, angiogeneesi, etäpesäke, sekä vastauksena kemo- ja sädehoidon [11]. HIF-1α yliekspressoituu suuri määrä kiinteitä kasvaimia, ja kasvaimen HIF-1α ilmentyminen liittyy usein huonoon ennusteeseen [12] - [15]. Lisäksi esto HIF-1α avulla RNA-interferenssi tai farmakologisen yhdisteitä on osoittautunut kasvaimia torjuvaa tehoa useille hiiren syöpä malleja [16]. Panos HIF-1α on chemoresistance neoplastisten solujen on havaittu monenlaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien mahasyöpä [6] - [8], [17] - [20]. Kuitenkin taustalla molekyylitason mekanismeja sekä rooli HIF-1α lääkeresistenssin alle happiolosuhteissa edelleen suurelta osin hämäräksi [8], [18], [21]. Täällä, tunnistamme tukahduttaminen p53 ja edistäminen Nukleaaritekijä KB (NF-KB) toimintaa keskeinen mekanismit HIF-1α: n herkkyyttä ratkaisevasti vastaan ​​5-fluorourasiilin (5-FU) ja sisplatiinin ihmisen mahalaukun syöpäsoluja.

tulokset

HIF-1α määrittää herkkyyttä mahasyövän solujen kohti kemoterapeuttisten aineiden 5-FU: n ja sisplatiinin

toiminnallinen inaktivoitumisen HIF-1α saavutettiin lentiviraalinen transduktio AGS ja MKN28 solut sirna (siRNA) erityisesti suunnattu HIF-1α. Tämä kokeellinen lähestymistapa tuotti erittäin tehokas knockdown osoitetaan lähes täydellisestä epäonnistumisesta transdusoidut solut aiheuttaa HIF-1α proteiini vastauksena hypoksia julkaisemassa aiemmin [22]. Arvioidaan, että on tärkeää HIF-1α varten herkkyys ihmisen mahalaukun syöpäsoluja kohti perustettu kemoterapeuttisten aineiden, me verrattiin 5-FU: n ja sisplatiinin HIF-1α-toimivaltaisen (salattu, "SCR") ja HIF-1α-puutosta (knockdown, "KD") AGS soluja. Funktionaalinen inaktivaatio HIF-1α siirtynyt annoksen riippuvuutta kasvun inhibition kohti alemman lääkeainepitoisuudet (kuvio 1A ja kuvio S1), viittaa siihen, että HIF-1α pystyy vähentämään kemoterapiaan alttiutta mahalaukun syövän soluja happiolosuhteissa. Aiempien raporttien [6] - [8], [17], [18], altistuminen hypoksia lisääntyneen resistenssin 5-FU AGS soluissa, mutta inaktivaatio HIF-1α johti vahvaa korkeudessa kemosensitiivisyys hypoksisissa olosuhteissa ( Kuva S2). Vuonna täydentävä lähestymistapa, tutkimme seurauksia yli-ilmentävät HIF-1α (pcDNA HIF-1α) varten kemosensitiivisyys AGS soluja. AGS-solut yli-ilmentävät HIF-1α olivat huomattavasti vastustuskykyisempiä hoito 5-FU: ta (kuvio 1 B). Vakaa HIF-1α ilmentyminen varmistettiin HRE (hypoksia reagoiva elementti) lusiferaasireportterista määritys (kuvio 1 C). Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että HIF-1α rajoittaa sytotoksisen toiminnan 5-FU: n ja sisplatiinin ihmisen mahalaukun syöpäsoluissa ja että inaktivaatio HIF-1α voi olla myönteisiä kemosensitiivisyys.

HIF-1α rajojen kemoterapian aiheuttama solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin kautta tukahduttaminen p53

Aloitimme luonnehdinta kasvuinhibitiosta analysoimalla solusykliä leviämismallit kemoterapian jälkeen. G _{1-synkronoitu, seerumin puutteessa AGS solut vapautettiin G 0 /G 1 vaihe lisäämällä seerumin ja solukierron profiilit määritettiin sen jälkeen lisättiin 5-FU. Julkaistu kulttuureissa käsittelemättömän AGS helposti edennyt G 1 osaksi S ja G 2 /M vaihetta [22], kun taas 5-FU-käsitellyt solut pysyivät G 1 vaihe (ei esitetty). On mielenkiintoista, että 5-FU-riippuvainen säilyttäminen soluja G 1 vaihe suuresti vahvistunut AGS KD verrattuna AGS SCR soluihin, sopusoinnussa G 1 solukierron pysähtymisen (kuvio 2A). Peruuttamaton solusyklin pysähtymiseen on noussut tärkeäksi vaikutustavaksi antiproliferatiivisia aineita ja on ominaista solujen ominaisuuksia vanhenemisen [7], [23]. Näin ollen osa senescent soluja määritettiin. Todellakin, hoito 5-FU johti vankka induktion vanhenemisen in AGS soluissa. Tämä vaste oli merkittävästi parannettu soluissa samanaikaisen menetyksen HIF-1α (kuvio 2B). Lisäksi apoptoosin induktio ehdotti lisääntynyt ennalta G 1 osa DNA-histogrammit 5-FU-käsiteltyjen AGS KD-soluja (ei esitetty). Siksi määrällinen analyysi apoptoottisen solu- fraktiosta perustuen havaitsemiseen pilkkoa kaspaasi-3 (kuvio 2C). Yhdenmukainen tiedot solusyklin jakautumisen 5-FU aiheuttama apoptoottiset jae oli lisääntynyt HIF-1α-puutosta AGS KD soluja verrattuna HIF-1α-kompetentteja soluja.}

kemoterapian aiheuttama vanhenemista ja apoptoosin molemmat ovat läheisesti tuumorisuppressorigeenin p53
. Niinpä arveltu, että p53 voi myötävaikuttaa täydennetty sytotoksisuuden 5-FU hävitessä HIF-1α. Kun 5-FU hoidossa, p53-proteiinin vähitellen kertynyt AGS soluissa, vaikutus, joka oli silmiinpistävän parannettiin HIF-1α-puutosta AGS soluja (kuvio 2D). Tämä vakauttaminen p53 liittyi kohonneeseen sykliiniriippuvaisen kinaasin (CDK) estäjä p21, vakiintunut transkription kohde- ja alavirtavaikuttajainhibiittorit p53 toiminnoilla solusyklin pysähtymiseen, vanhenemista induktio ja apoptoosin (kuvio 2D). Jälleen HIF-1α-puutosta AGS solut osoittivat selkeästi merkittävämpi lisäys p21 kuin HIF-1α-taitavia AGS soluissa. Vahva induktio p21 odotetaan estävän aktiivisuuden G _{1 sykliini /CDK-kompleksien, jolloin hypophosphorylation retinoblastoomaa proteiinin (pRb), ja epäonnistuminen aiheuttaa S-vaihe sykliinien, esim. sykliini A. Itse asiassa sekä pRb hypophosphorylation ja vähentää sykliini A: tasot vahvistettiin 5-FU-käsiteltyjen AGS KD soluja ja - vähäisemmässä määrin - myös AGS SCR-soluissa (kuvio 2D). Nämä muutokset vahvistavat G 1 vaihe säilyttäminen havaittu DNA histogrammit ja ovat sopusoinnussa peruuttamattomia G 1 pidätys havaittu kemoterapiaindusoitu vanhenemista. Siten erilaiset biologiset vaikutukset 5-FU hoidon HIF-1α-puutosta ja -proficient AGS solut syntyvät ero sääntelyä p53 ja sen loppupään kohde p21.}

inaktivointi p53 pilaa roolin HIF-1α for kemosensitiivisyys

Jos haluat saada kokeellista näyttöä varten ehdotettu rooli p53 HIF-1α-välitteinen säätely kemosensi- AGS soluissa, me funktionaalisesti inaktivoitu p53 RNA interferenssin avulla lyhytaikaista transfektiota anti-p53 siRNA (si p53) tai salattu ohjaus siRNA (si scr). P53 on tehokkaasti tippuu alas, kuten on esitetty epäonnistuminen transfektoitujen solujen indusoimaan p53-efektoreja p21 ja MDM2 vasteena 5-FU hoitoa (kuvio 3A). Mielenkiintoista on, että AGS KD-solut, jotka on transfektoitu si p53 olivat merkittävästi vähemmän altis kasvun estäminen 5-FU kuin AGS KD: llä transfektoitujen solujen ohjaus siRNA (kuvio 3B). Mukaisesti Näiden havaintojen G _{1 solusyklin säilyttäminen ja apoptoosin 5-FU-käsiteltyjen AGS KD solut vähenivät p53 Knockdown verrattuna soluihin transfektoitu ohjaus siRNA (kuva 3D ja 3E). Jyrkästi, kemosensitiivisyys HIF-1α-taitavia AGS soluja ei vaikuttanut inaktivaation p53 (kuvio 3C).}

HIF-1α ei vaikuta kemosensi- p53
mutanttisoluihin

vahvista HIF-1α-riippuvainen säätely 5-FU reagointikykyä ja edelleen luonnehtia osuus p53, tutkimme toinen ihmisen mahasyövän solulinja (MKN28), joka kantaa missensemutaatio in TP53
kodonissa 251. Kiinnostavaa kyllä, poistetaan HIF-1α in MKN28 soluissa ei ole parantaa kasvun estäminen altistumisen jälkeen 5-FU: ta (kuvio 4A). Samoin 5-FU aiheuttama G _{1 keskittymisen ja apoptoosin MKN28 soluja ei vaikuta menetys HIF-1α (kuvio 4B ja 4C). Mukaisesti Näiden havaintojen proteiinin tasot p53 ja pRb pysyi ennallaan 5-FU-käsiteltyjen MKN28 solujen koko 24 tunnin ajan, ja p21 induktio oli poissa (kuvio 4D). Kuitenkin, kun p53 toiminto palautettiin esikäsittelemällä kemiallinen yhdiste PRIMA-1 [24] HIF-1α knockdown käännetty tehostaa merkittävästi 5-FU sytotoksisuus (kuvio S3). Yhdenmukainen vakiintunut asema p53 kemoterapian aiheuttaman sytotoksisia /solunsalpaajavaikutus hoito PRIMA-1 sinänsä
hieman vähennetty leviämisen MKN28 solujen ja tehostaa merkittävästi tehoa 5-FU MKN28 soluissa (kuvio S3).}

NF-KB on tärkeä välittäjäaine HIF-1α rooli kemosensitiivisyys

NF-KB liittyy suojan kemoterapian aiheuttama apoptoosin ja päinvastoin, NF -κB voi parantaa tehoa antineoplastisten lääkeaineiden sekä in vivo
ja in vitro
[25] - [27]. Niinpä määritettiin NF-KB: n DNA: ta sitovan aktiivisuuden HIF-1α-puutosta ja -proficient AGS solujen käsittelyn jälkeen 5-FU elektroforeettisen liikkuvuuden shift (EMSA). Hoito 5-FU voimakkaasti aktivoitua NF-KB: n DNA-sitoutumisen AGS SCR soluissa, joissa huipputasot esiintyvät 6 h kuluttua altistumisen 5-FU (kuvio 5A). Hoito TNFa 4 h toimi positiivisena kontrollina NF-KB. Lisäksi supermuutoksena indusoitiin anti-p65-vasta-ainetta, joka vahvistaa, että 5-FU indusoidun NF-KB-kompleksit sisälsi 65 kDa: n alayksikkö (p65). Menetys HIF-1a esti merkittävästi NF-KB: n vasteena 5-FU: n ja TNFa: n (kuvio 5A). Tämän mukaisesti havainnon, 5-FU hoidossa myös onnistunut indusoimaan NF-KB-kohdegeenien cIAP1 ja A20 AGS KD soluissa, kun taas ne helposti indusoitiin AGS SCR soluissa (kuvio 5B).

Vastatakseen toiminnallinen merkitys NF-KB: n 5-FU aiheuttama kasvun estäminen, me yli-ilmentynyt p65 (pcDNA p65) in AGS KD soluissa. Transfektio pcDNA p65, mutta ei tyhjä ohjaus vektori, johti merkittävään induktion p65-proteiinin ja NF-KB: n transkriptionaalista aktiivisuutta AGS KD soluissa (kuvio S4). Huomattavaa on, että HIF-1α-puutosta AGS KD solut yli-ilmentävät p65 olivat huomattavasti vastustuskykyisempiä 5-FU hoidossa verrattuna AGS KD transfektoitu kontrollivektorilla (kuvio 5C), sopusoinnussa keskeinen rooli NF-KB välittämisessä chemoresistance kohti 5-FU mahalaukun syöpäsoluja. Yhdessä samanaikaiseen aktivointi p53 ja NF-KB: 5-FU-käsitelty, HIF-1α-puutosta AGS soluissa ei havaittu. Selventää, ovatko molemmat tapahtumat ovat toisistaan ​​riippuvaisia, tutkittiin 5-FU aiheuttama NF-KB-aktivaation MKN28 solujen mutantti p53.
Sekä 5-FU ja TNFa aktivoitua NF-KB: n DNA-sitova aika- riippuvaisella tavalla, mikä osoittaa, p53-riippumattomien mekanismien NF-KB: n aktivaatio 5-FU: ta (kuvio 5D). Kuitenkin eroaa löydös AGS soluissa, tämä NF-KB: p53
mutantti solulinja ei tylppäpäiseksi HIF-1α inaktivaatiota. Näin ollen, HIF-1α voivat tukea kemoterapian aiheuttama NF-KB: n aktivaatio torjua p53-riippuvainen inhiboiva mekanismeja.

Altered ROS muodostuminen vastaa HIF-1α aiheuttama muutos p53 aktiivisuuden

selventää molekyylimekanismin taustalla p53 superinduk- 5-FU-käsitellyn HIF-1α-vajaiden solujen, me tunnettu rooli reaktiivisia happiradikaaleja (ROS). ROS muodostavat ehdokas linkki (i) ROS voivat aktivoida p53-toiminto ja pidetään avaintekijöitä induktio p53 erilaisilla kemoterapia-aineiden [28], ja (ii) HIF-1α voi estää ROS vähentämällä mitokondrioiden toiminnan ja biogeneesin [22], [29], [30]. Näin ollen, AGS KD-soluja esikäsiteltiin ROS-inhibiittorit diphenyleneiodonium kloridi (DPI) tai apocynin. Molemmat inhibiittorit siirrettävä merkittävän suojan 5-FU aiheuttama kasvun estäminen in AGS KD soluissa (kuvio 6A ja 6B). Lisäksi DPI ja apocynin lähes kokonaan esti induktio p53 ja sen loppupään tavoite p21 5-FU-käsitellyt solut (kuvio 6C ja 6D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että risteyksessä HIF-1α signalointia p53-välitteinen vaste 5-FU tasolla ROS tuotannon. Osoittaa syy rooli HIF-1α varten redox AGS solujen jälkeen 5-FU hoidossa, solunsisäiset ROS tasot määritettiin AGS KD ja SCR solujen virtaussytometrialla. Huomasimme, että solunsisäistä superoksidi tasoa 5-FU-käsiteltyjen AGS KD soluja 2,5-kertainen 5-FU-käsiteltyjen AGS SCR soluja (kuvio S5), mikä osoittaa, että funktionaalinen inaktivaatio HIF-1α in AGS soluissa johti merkittävä ja toiminnallinen solunsisäisten oksidatiivisen stressin jopa kemoterapian.

keskustelu

transkriptiotekijä HIF-1α on perustettu tärkeänä välittäjänä hypoksia-välitteisen chemoresistance [6] - [8] , [17], [18], [20]. Täällä, tunnistamme HIF-1α voimakas tekijä kemosensi- mahasyövän soluja normoxic olosuhteissa. Soveltamalla lentivirus-pohjainen siRNA järjestelmä osoitamme huomattavasti korkeampia 5-FU: n ja sisplatiinin toksisuutta HIF-1α-puutosta mahalaukun syöpäsoluja. Käytettävissä olevat tiedot roolista HIF-1α varten kemosensitiivisyys syöpäsolujen alla normoxic edellytykset ristiriitaisia. Vaikka HIF-1α-puutosta fibrosarkoomasoluissa (HT1080) näytetä merkittävästi parannettu herkkyyttä etoposidi ympäristön ilmaa, paksusuolen syöpä (HCT116) ja hepatooma (Hepa-1) solujen tehnyt niin [6]. Unruh et al.
Raportoitu parannettu herkkyys HIF-1α-puutosta hiiren alkion fibroblasteja karboplatiini tai etoposidia alla normoxic sekä hypoksinen olosuhteet [8]. Osalta mahasyövän, parannettu tehokkuus 5-FU: n ja vinkristiinin osoitettiin alle normoksia in vitro
[18]. Hyvin linjassa tuloksia, molempien tutkimusten päätökseen keskeinen rooli HIF-1α välittämisessä chemoresistance alle normoxic olosuhteissa. Mielenkiintoista, tuore tutkimus Japanin osoitti alempaa tehoa 5-FU-kemoterapiaan in HIF-1α-ilmentävät ihmisen mahalaukun adenokarsinoomia vahvistaminen käsitys HIF-1: n keskeinen tekijä määritettäessä mahasyövän chemoresistance [31].

Ohjaus syövän etenemisen kemoterapialla perustuu ainakin osittain solussa indusoituminen vanhenemista. Viime aikoina menetys HIF-1α osoitettiin aiheuttaa ennenaikaisen vanhenemisen ikuistettu hiiren alkion fibroblasteja alle happiolosuhteissa [32]. Nykyinen tieto viittaa siihen, että HIF-1α samalla suojelee mahalaukun syöpäsoluja vastaan ​​kemoterapian aiheuttama vanhenemista alle normoxic olosuhteissa. Tämä on ensimmäinen raportti kohonnut kemoterapian aiheuttaman vanhenemisen kautta toiminnallisen inaktivoinnin HIF-1α on vakiintunut ihmisen syöpäsolu linja. In HIF-1α-vajaiden solujen, Havaitsimme myös parantunut apoptoosin vasteena 5-FU. Aiemmat tutkimukset raportoitu aktivoituminen proapoptoottiset tekijä Bid [6], tai muutos tasapainon pro- ja antiapoptoottisten Bcl-2-perheen jäsenten osuus nousi apoptoosin jälkeisiä inaktivoitumisen HIF-1α huumeisiin käsiteltyjen mahalaukun syöpäsoluja [ ,,,0],18].

nykyinen tutkimuksessa nimetään tuntematon mekanismi, jolla HIF-1α ehkäisee sekä kemoterapian aiheuttama vanhenemista ja apoptoosia: Esitämme ratkaisevia todisteita kapasiteetin HIF-1α tukahduttaa induktion tuumorisuppressorigeenin p53 vastauksena 5-FU alle normoxic olosuhteissa. P53 on keskeinen solun kohtalon ratkaiseva, koska sen säätelijänä solusyklin etenemisen ja apoptoosin vastauksena solustressiä ja muodostaa yleisimmin mutatoitunut geeni ihmisen syövissä [33]. Monia erilaisia ​​kemoterapeuttisia aineita osoitettiin vakauttamiseksi p53 ja päinvastoin, menetys p53 muodostaa periaatteessa mekanismi syövän vastustuskyvyn kemoterapiaa [33], [34]. Vuorovaikutus p53 ja HIF-1α on käyty jo pitkään keskustelua koska sekä positiivisia että negatiivisia raportit on julkaistu [35]. Kuitenkin koko aiemmin julkaistu työ keskittyi p53-HIF-1α-vuorovaikutukset hypoksisissa (tai jopa hapettomissa) olosuhteissa. Parhaan tietomme mukaan meidän kokeita ensimmäistä kertaa todisteita varten tukahduttamista p53 aktiivisuuden HIF-1α alle normoxic olosuhteissa. Koska seurauksena p53 säätelyyn ylöspäin HIF-1α-vajaiden solujen, havaitsimme muutoksia loppupään efektoreja jotka ovat sidoksissa peruuttamattomaan solukierron pysähtymisen ominaisuus vanhenemista, esim. p21 vakauttaminen ja hypophosphorylation of pRb. Eroaa havaintomme, viimeaikainen työ chemoresistance kohti etoposidi in HIF-1α-puutosta ikuisti hiiren alkion fibroblasteja ei havainnut induktio p21 [36]. Myös HIF-1α stabiloitua p21 ja p27 sekä johti hypophosphorylation of pRb aikana hypoksian aiheuttaman kasvun pidätys ikuistettu hiiren alkion fibroblasteja ja ensisijainen pernan B-lymfosyytit [37]. Nämä vastakkaisia ​​tuloksia todennäköisimmin selittää tutkittujen solutyypeistä: Vaikka Goda et al
. tunnettu fysiologinen vaste hypoksia ei-transformoitu solutyyppejä, me analysoinut vakavia DNA-vaurioita perustettu syöpäsolulinjoissa.

Vaikka p53 toistuvasti osoitettu vastapainoksi NF-KB-toiminto [38], [39 ], nykyinen tiedot osoittavat rooli tuumorisuppressorigeenin sääntelyn HIF-1α-riippuvainen NF-KB: n aktivoitumisen. Lisäksi p53, NF-KB: n on muodostunut toinen, keskeinen tekijä, vastustuskyvyn kemoterapeuttisten aineiden [40]. Useat eri tutkimukset ovat osoittaneet toiminnallisia yhteyksiä NF-KB ja HIF-1α, vaikka he portaattomasti sijoittaa HIF-1α joko ylävirtaan NF-KB tai päinvastoin. Esimerkiksi, hypoksian indusoiman vakauttaminen HIF-1α sileän lihaksen soluissa on transkription säätelyn alla NF-KB: n [41]. Vastaavasti saadut tulokset ehdollinen IKK-β hiirten vahvisti keskeistä roolia NF-KB valvoa perus- että hypoksian indusoima HIF-1α in vivo
[42]. Kääntäen, geenien ilmentyminen NF-KB-alayksikön p65 osoitettiin ohjata HIF-1α yhteydessä hypoksia tukahdutti apoptoosin neutrofiilien [43]. Meidän havainto lyhensi NF-KB aktiivisuuden HIF-1α-vajaiden solujen käsiteltäessä 5-FU siksi on hyvin linjassa tämän jälkimmäisen raportin. Kiinnostavaa kyllä, myös havaittu merkittävästi vähentää DNA: ta sitovaa NF-KB alayksiköiden in HIF-1α-vajaiden solujen stimulaation jälkeen TNFa, vakiintunut indusoija NF-KB: n aktiivisuuden [44]. Tämä herättää olennainen kysymys, jonka mukaan fysiologisia ja patofysiologisia olosuhteissa HIF-1α pystyy säätelemään NF-KB: n aktivaation. HIF-1α ja NF-KB jakaa ratkaiseva merkitys eri prosessien kuten tulehduksen, mikrobien tappaminen ja kasvaimen kehittymisen. Tarkka molekyyli luonne sekä hierarkiassa niiden vuorovaikutusta on todennäköisesti solu- ja kontekstisidonnaisia ​​eikä sitä voida yleistää.

Nykyisessä tutkimuksessa pystyimme havaitsemaan ROS kuin leikkauspiste HIF- 1a kanssa p53-välitteinen solustressiä vastaus kemoterapiaa. Solunsisäiset ROS tunnetaan voimakkaita indusoijia p53 ja osallistua aktivointi p53 kemoterapeuttisten [45]. Mitokondrioita edustavat ensisijainen lähde solunsisäisten ROS [46], ja HIF-1α todennäköisesti ehkäisee ROS tuotanto mitokondrion tasolla useiden eri mekanismien myös estämällä mitokondrioiden biogeneesiä ja pyruvaatin shuttling mitokondrioita, vähentämistä mitokondrioiden toiminnan takia tehostetun hyödyntämisen Glykolyysivaiheen ja aktivointi mitokondrioiden autophagy [29], [30], [47], [48]. Aiemmin loimme välillä on toiminnallinen yhteys HIF-1α-ohjattu vähentäminen ROS ja ankkurointiriippumattomuudeksi mahalaukun syöpäsolujen [22], syyllistämättä HIF-1α patogeneesissä mahasyövän puuttuessa hypoksian. Nyt huomaavat capacitiy HIF-1α rajoittaa ROS tuotanto mahalaukun syöpäsolujen myös antaa vastustuskyvyn kemoterapia-aineiden, jotka toimivat aktivoimalla p53 (kuvio 6E). Mielenkiintoista, lisäämällä vaikutukset hoidon kestävyys kautta modulaatio p53 ja ROS on myös raportoitu HIF-2α [49]. HIF-α-isoformit 1 ja 2 esittävät laajan päällekkäisyyttä oletetun HIF tavoitteet ja sitoutuminen hypoksisiin vaste-elementit ja selvä jako hypoksian indusoiman vaikutuksia joko isoformi ei ole aina accomplishable [50]. BERTOUT et al.
Osoittaneet, että inhiboiva HIF-2α lisää säteilyn indusoiman apoptoosin kautta ROS kertymistä ja sen jälkeen lisäämisen p53 toimintaa [49]. Lisäksi, Roberts et al.
Osoitti, että resistenssi kemoterapiaa osittain välittyy HIF-2α-välitteisen suppression p53 munuaissyövän soluihin [51]. Näin ollen täten raportoitu havainnot takaa tutkimuksia mahdollista roolia HIF-2α, tehtävä, joka on parhaillaan käynnissä laboratoriossamme.

Koska kliininen tarve tunnistaa vastauksen ennustavat käytettävissä hoitovaihtoehtoja, meidän tulokset saattavat suoraan hoitopäätöksiä: toisaalta tietoa HIF-1α yliekspressio voi ohjata valikoiman lääkkeitä, jotka suurelta osin toimia p53-riippumatonta tavalla. Toisaalta, erityisesti hyöty voi johtua yhdistämällä HIF-1-inhibiittorit ja DNA: ta vaurioittavat aineet (esim. 5-FU), syövät, joilla on toimiva p53. Vastaavasti tehon heikkenemiseen HIF-1-estäjät voisivat olla mahdollisia hoitoon p53 viallisen kasvaimia, näkökohta, joka voi olla sekoittava tekijä kliinisten kokeiden HIF-1α estävä hoito-ohjelmien.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja kemikaalien

AGS (CRL-1739, ATCC, Rockville, Maryland, USA) ja MKN28 (JCRB Cell Bank, Tokio, Japani) soluja kasvatettiin yksikerrosviljelyissä standardissa väliaineessa . Sukupolven AGS ja MKN28 soluista jotka ilmentävät pysyvästi joko siRNA erityisesti suunnattu HIF-1α (knockdovvn, "KD") tai epäspesifinen kontrolli siRNA (salattu, "SCR") julkaistiin aiemmin [22]. 5-fluorourasiili (5-FU), cis-Diammineplatinum (II) dikloridia (sisplatiini) ja superoksidianionin inhibiittorit diphenyleneiodonium kloridi (DPI) ja apocynin ostettiin Sigma-Aldrich (Saksa) ja liuotettiin DMSO: hon. PRIMA-1 (p53-uudelleenaktivointi ja induktio massiivinen apoptoosin) saatiin Tocris Biosciences (Ellisville, Missouri, USA) ja liuotetaan steriiliin veteen. Ajoneuvon hallinnan liuottimet oli kaikissa kokeissa.

Soluproliferaatiomääritys

määrittämiseksi solujen kasvua, 3 x 10 ^{4-solut ympättiin kolmena rinnakkaisena 24-kuoppalevyillä annettiin kiinnittyä 16 tunnin ajan ja sitten käsiteltiin kuten alla normoxic tai hypoksinen olosuhteet. Käsittelyn jälkeen solut trypsinoitiin, ja elävät solut laskettiin hemosytometrillä.}

määritys solusyklin jakautuminen ja apoptoosin virtaussytometrialla

Cell cycle jakelu, mukaan lukien pre-G _{1 jae määritettiin DNA histogrammit kuvatulla [52]. Apoptoosi oli myös kvantitoida havaitseminen aktiivinen, pilkottiin kaspaasi-3 virtaussytometrialla käyttämällä Alexa Fluor® 488-konjugoitu vasta-aine (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA).}

kvantifiointi vanhenemisen

Vanheneminen liittyvä β-galaktosidaasin aktiivisuus arvioitiin cytospin valmisteita, kuten on kuvattu [53].

immunoblot-analyysi

kokosolulysaateille valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [52], sitten eroteltiin 10% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin nitroselluloosalle (Amersham Biosciences, Freiburg, Saksa). Blotit vasta-aineilla p53 ja CDK2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA), p21 (Oncogene Research Products, Bad Soden, Saksa), sykliini A (Upstate, Temecula, Kalifornia, USA), pRb (BD Pharmingen , Heidelberg, Saksa), MDM2 (Calbiochem, San Diego, Kalifornia, USA), p65 (Cell Signaling Technology) ja aktiini (Sigma-Aldrich). Toissijainen vasta-aineet piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua (Dianova, Hampuri, Saksa) ja peroksidaasin aktiivisuus tehtiin näkyväksi käyttämällä Western Lightning kemiluminesenssin Reagent Plus (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA).

Quantitative real-time PCR analyysi

reaaliaikainen PCR-analyysi, solun totaali-RNA uutettiin Trizol reagenssilla (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa). Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin oligo (dT) aluketta ja SuperScript ™ First Strand Synthesis System (Invitrogen). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysi suoritettiin käyttäen TaqMan PCR Universal Mastermix (varten β-aktiini) tai SYBR GREEN PCR Master Mix (varten A20 ja cIAP1, Applied Biosystems, Darmstadt, Saksa). Alukesekvenssit toimitetaan taulukossa S1. Normalisoimaan määrän tulon RNA PCR-reaktiot toteutettiin koetin ja alukkeita β-aktiini.

Transient transfektio ja toimittaja lusiferaasianalyysissä

ohimenevä transfektiosta AGS soluista suoritettiin käyttäen Effectene transfektio reagenssia (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. Sillä yliekspressio-tutkimuksia varten solut ympättiin 3 x 10 ^{4 solua /24-kuoppaisen ja transfektoitiin 100 ng pcDNA HIF-1α (ystävällisesti Wanja Bernhardt, Universitätsklinikum Erlangen, Erlangen, Saksa) tai pcDNA p65 (saatiin ystävällisesti by Hiroyasu Nakano, Jutendo yliopisto, Tokio, Japani), tässä järjestyksessä. Sillä HRE tai NF-KB-lusiferaasianalyysissä, 3 x 10 4 solua /24-kaivo kotransfektoitiin 100 ng pHRE-Luc (lahja Randall S. Johnson, UCSD, San Diego, Kalifornia, USA) tai IgκB-Luc (lahja Florian R. Greten, Technische Universität München, München, Saksa), ja 30 ng phRL-null (Promega, Mannheim, Saksa). Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega), kuten on kuvattu [54]. Saavuttaakseen ohimenevä p53 tukahduttaminen, AGS solut transfektoitiin 30% yhtymäkohdassa 75 tai 150 nmol /l si p53, ( Äänenvaimennin
Valitse siRNA, Applied Biosystems) ja analysoitiin 48 h kuluttua transfektion. Ei-spesifinen siRNA (si scr, Eurogentec, Seraing, Belgia) käytettiin kontrollina.}

Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) B

tumaproteiiniuutteet valmistettiin, kuten on kuvattu [54]. EMSA suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [55] käyttämällä 8 ug tumaproteiinin ja 100 fmol /l lopun radioleimattuja 22 emäsparin kaksijuosteinen NF-KB konsensus oligonucelotide (eteenpäinjuoste: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C- 3 ', E3292, Promega). Näytteet erotettiin elektroforeesilla ei-denaturoivissa 5% polyakryyliamidigeelissä.

• PLoS ONE: Anna-7 MicroRNA Family valikoidusti erittyy solun ulkopuolelle kautta Eksosomit on mahalaukun metastasoivaa syöpäsolu Line
• PLoS ONE: Korkea moninaisuuden Vaca ja Caga helikobakteeri genotyypit potilailla, joilla on ilman Mahalaukun Cancer