Abstrakt
Bakgrund
Minskad chemosensitivity av solida cancerceller utgör en central hinder i klinisk onkologi . Följaktligen är den molekylära karakteriseringen av signalvägar som reglerar chemosensitivity en central förutsättning för att förbättra cancerterapi. Hypoxi-inducerbara faktor HIF-1α har kopplats till chemosensitivity medan de underliggande molekylära mekanismer i stort sett svårfångade. Därför omfattande analyserade vi HIF-1α roll vid fastställandet chemosensitivity fokus på ansvarsfulla molekylära vägar.
RNA-interferens användes för att inaktivera HIF-1α eller p53 i den mänskliga magcancer cellinjer AGS och MKN28. Den kemoterapeutiska medel 5-fluorouracil och cisplatin användes och chemosensitivity bedömdes genom cellproliferationsanalyser liksom bestämning av distribution och apoptos cellcykeln. Expression av p53 och p53 målproteiner analyserades genom western blöt. NF-KB-aktiviteten karakteriserades med hjälp av elektroforetisk mobilitet shift assay. Inaktivering av HIF-1α i gastriska cancerceller resulterade i robust förhöjning av chemosensitivity. Följaktligen HIF-1a kompetenta celler uppvisade en betydande minskning av kemoterapi-inducerad åldrande och apoptos. Anmärkningsvärt, denna fenotyp var helt frånvarande i p53 Sammanfattningsvis identifierade vi HIF-1α som en potent reglerare av p53 och NF-kB aktivitet under förhållanden av genotoxisk stress. Vi drar slutsatsen att p53 Citation: Rohwer N, Dame C, Haugstetter A, Wiedenmann B. , Detjen K, Schmitt CA, et al. (2010) Hypoxi-inducerbara faktor 1α Bestämmer Gastric Cancer Chemosensitivity via Modulering av p53 och NF-kB. PLoS ONE 5 (8): e12038. doi: 10.1371 /journal.pone.0012038 Redaktör: Deb Fox, Forskningscentralen för barn vid barnsjukhuset New Orleans, USA Mottagna: 28 april, 2010. Accepteras: 19 juli 2010. Publicerad: 10 augusti 2010 Copyright: © 2010 Rohwer et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit Finansiering:. Denna studie stöddes av bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de) till TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 och 133 /2-3), och NR (Graduiertenkolleg 276/4 - "Signalerkennung und -umsetzung"). TC stöddes också av ett bidrag från Berliner Krebsgesellschaft e.V. (Http://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns Introduktion Intrinsic och förvärvad läkemedelsresistens är de primära orsakerna till begränsad effekt av kemoterapi i majoriteten av gastrointestinala maligniteter, inklusive magcancer [1], [2]. Läkemedelsresistens är en komplex och multifaktoriell fenomen med anknytning till tumörmikro, t.ex. hypoxi, acidos och inflammation samt tumörcellen själv [3]. Cellulär resistens kan vara inneboende i specifika genetiska bakgrunden till tumörcellen eller resultatet av mutationer och epigenetiska förändringar efter antiproliferativ behandling [4], [5]. transkriptionsfaktor hypoxi-inducerbara faktor 1 (HIF-1 ) utgör en central regulator av cellulär anpassning till hypoxi och har varit inblandad i läkemedelsresistens [6] - [8]. HIF-1-proteinet är en heterodimer sammansatt av en konstitutivt uttryckt β-subenheten (Arnt (arylkolvätereceptor nukleär translokator)) och en hypoxi-inducerbar α-subenhet [9]. Under normoxiska förhållanden kan HIF-1α-aktivitet induceras av olika tillväxtfaktorer, cytokiner, aktiverade onkogener eller förlust-av-funktions muterade tumörsuppressorgener [10]. HIF-1α är centralt involverad i flera aspekter av tumörbildning, inklusive tumörcelltillväxt, angiogenes, metastaser, liksom svaret på kemoterapi och strålbehandling [11]. HIF-1α är överuttryckt i ett stort antal solida tumörer och tumör HIF-1α uttryck förknippas ofta med dålig prognos [12] - [15]. Vidare har hämning av HIF-1α genom RNA-interferens eller farmakologiska föreningar visat antitumoral effekt i olika murina cancermodeller [16]. har observerats Ett bidrag av HIF-1α till chemoresistance av neoplastiska celler i ett brett spektrum av solida tumörer, innefattande magcancer [6] - [8], [17] - [20]. De bakomliggande molekylära mekanismer samt rollen som HIF-1α för läkemedelsresistens i normoxiska förhållanden i stort sett svårfångade [8], [18], [21]. Här identifierar vi undertryckande av p53 och främjande av nukleär faktor kB (NF-kB) aktivitet som centrala mekanismer för HIF-1α känslighet bestämmande roll mot 5-fluorouracil (5-FU) och cisplatin i humana gastriska cancerceller. Resultat HIF-1α bestämmer känsligheten hos gastric cancerceller mot cytostatika 5-FU och cisplatin Funktionell inaktivering av HIF-1α uppnåddes genom Lentiviral transduktion av AGS och MKN28 celler med små störande RNA (siRNA) specifikt rikta HIF-1α. Detta experimentella tillvägagångssätt gav en mycket effektiv knockdown visas genom ett nära fullständigt misslyckande av transducerade celler för att inducera HIF-1α protein som svar på hypoxi såsom tidigare [22] publicerats. För att utvärdera betydelsen av HIF-1α för känsligheten hos humana gastriska cancerceller mot etablerade kemoterapeutiska medel, vi jämförde effekterna av 5-FU och cisplatin i HIF-1α kompetenta (oordning, "SCR") och HIF-1α-brist (knockdown "KD") AGS celler. Funktionell inaktivering av HIF-1α skiftade dosberoende för tillväxthämning mot lägre läkemedelskoncentrationer (Figur 1A och Figur S1), vilket antyder att HIF-1α är kapabel att minska kemoterapi mottaglighet av gastriska cancerceller under normoxiska förhållanden. I linje med tidigare rapporter [6] - [8], [17], [18], exponering för hypoxi ökad motståndskraft mot 5-FU i AGS celler, men inaktivering av HIF-1α resulterade i robust förhöjning av chemosensitivity under hypoxiska förhållanden ( Figur S2). I en kompletterande strategi, studerade vi konsekvenserna av överuttryck av HIF-1α (pcDNA HIF-1α) för chemosensitivity av AGS-celler. AGS-celler som överuttrycker HIF-1α var betydligt mer resistent mot behandling med 5-FU (Figur 1B). Stabil HIF-1α uttryck bekräftades av HRE (hypoxi känsligt element) luciferas reporter analys (Figur 1C). Dessa resultat tyder starkt på att HIF-1α begränsar cytotoxiska verkan av 5-FU och cisplatin i mänskliga gastric cancerceller och att inaktivering av HIF-1α kan ha positiva effekter på chemosensitivity. Vi startade en karakterisering av den observerade tillväxthämning genom att analysera cellcykelns fördelningsmönster efter kemoterapi. G 1-synkroniserade, serumsvultna AGS celler frigjordes från G 0 /G en fas genom tillsats av serum och cellcykelprofiler bestämdes efter tillsats av 5-FU. Frigjorda kulturer av obehandlade AGS lätt utvecklats genom G 1 in i S och G 2 /M faser [22], medan 5-FU-behandlade celler förblev i G en fas (ej visad). Intressant, 5-FU-beroende retention av celler i G 1 fasen kraftigt förstärkt i AGS KD jämfört med AGS SCR-celler, som är förenliga med G en cellcykelstopp (Figur 2A). Irreversibel cellcykelstopp har framträtt som en viktig verkningsmekanism av antiproliferativa medel och kännetecknas av cellulära funktioner i senescens [7], [23]. Följaktligen var fraktionen av åldrande celler bestämdes. Faktiskt, behandling med 5-FU ledde till en robust induktion av senescens i AGS-celler. Detta svar var signifikant förhöjd i celler med samtidig förlust av HIF-1α (Figur 2B). Vidare var induktionen av apoptos föreslagits av en ökad pre G en fraktion i DNA-histogram av 5-FU-behandlade AGS KD-celler (ej visat). Därför gjordes en kvantitativ analys av den apoptotiska cellfraktion som erhållits baserat på detektering av klyvs kaspas-3 (fig 2C). Överensstämmelse med det underlag på cellcykelfördelning, var 5-FU-inducerad apoptotisk fraktionen signifikant förhöjd i HIF-1α-saknande AGS KD celler jämfört med HIF-1 a-kompetenta celler. Kemoterapi-inducerad senescens och apoptos båda har intimt kopplade till tumörsuppressor p53 för att få experimentella bevis för den föreslagna roll p53 i HIF-1α-medierad reglering av chemosensitivity i AGS-celler, vi funktionellt inaktiv p53 genom RNA-interferens med hjälp av övergående transfektion av anti-p53 siRNA (si p53) eller en kodad kontroll siRNA (si SCR). P53 var effektivt slås ned, såsom indikeras av misslyckandet av de transfekterade cellerna att inducera p53-effektorer p21 och MDM2 som svar på 5-FU-behandling (figur 3A). Interestingly, AGS KD-celler transfekterade med si p53 var signifikant mindre känsliga för tillväxtinhibition av 5-FU än AGS KD-celler transfekterade med kontroll siRNA (figur 3B). I linje med dessa resultat var G en cellcykel retention och apoptos av 5-FU-behandlade AGS KD celler minskas genom p53 knockdown i jämförelse med celler transfekterade med kontroll siRNA (figur 3D och 3E). I skarp kontrast, var chemosensitivity av HIF-1 a-kompetenta AGS celler påverkas inte av inaktivering av p53 (Figur 3C). för att bekräfta HIF-1α beroende reglering av 5-FU lyhördhet och för att ytterligare karakterisera bidrag p53, undersökte vi en andra human magcancer cellinje (MKN28), som bär en missense-mutation i TP53 NF-kB är en viktig mediator av HIF-1α roll i chemosensitivity Aktivering av NF-kB är förknippad med skydd mot kemoterapiinducerad apoptos och, omvänt, hämning av NF -κB kan förstärka effekten av antineoplastiska medel både in vivo Mössor och in vitro För att ta itu med funktionella betydelsen av NF-kB för 5-FU-inducerad tillväxthämning, överuttryckt vi p65 (pcDNA p65) i AGS KD celler. Transfektion av pcDNA p65, men inte den tomma styrvektorn, resulterade i en signifikant induktion av p65-protein och NF-kB transkriptionsaktivitet i AGS KD-celler (Figur S4). Notera HIF-1a-brist AGS KD celler som överuttrycker p65 var betydligt mer resistenta mot 5-FU-behandling jämfört med AGS KD-celler transfekterade med kontrollvektor (figur 5C), i överensstämmelse med en viktig roll för NF-kB i medla chemoresistance mot 5-FU i gastriska cancerceller. Tagna tillsammans, en samtidig aktivering av p53 och hämning av NF-kB hos 5-FU-behandlade, HIF-1 a-deficient AGS-celler observerades. För att förtydliga, om båda händelser är beroende av varandra, studerade vi 5-FU-inducerad NF-KB-aktivering i MKN28 celler med mutant p53. För att klargöra den molekylära mekanismen underliggande p53 superinduktion i 5-FU-behandlade HIF-1α-fattiga celler, vi kännetecknad rollen av reaktiva syreradikaler (ROS). ROS utgör en kandidat länk som (i) ROS är potenta aktivatorer av p53-funktion och anses viktiga faktorer i induktion av p53 av olika kemoterapeutiska medel [28], och (ii) HIF-1α kan dämpa ROS generation genom att minska mitokondriell aktivitet och biogenes [22], [29], [30]. Följaktligen var AGS KD celler förbehandlats med ROS-hämmare diphenyleneiodonium klorid (DPI) eller apocynin. Båda hämmare ges signifikant skydd mot 5-FU-inducerad tillväxthämning i AGS KD-celler (figur 6A och 6B). Dessutom DPI och apocynin nästan helt förhindrade induktion av p53 och dess nedströms mål p21 i 5-FU-behandlade celler (Figur 6C och 6D). Dessa resultat tyder på en korsning av HIF-1α-signalering med p53-medierade svar på 5-FU på nivån för ROS-produktionen. Att fastställa ett orsaks roll HIF-1α för redoxpotentialen av AGS celler efter 5-FU behandling, var intracellulära ROS nivåer bestämdes i AGS KD och SCR celler genom flödescytometri. Vi fann att de intracellulära superoxidnivåer i 5-FU-behandlade AGS KD-celler var 2,5 gånger högre än de i 5-FU-behandlade AGS SCR-celler (Figur S5), vilket tyder på att funktionell inaktivering av HIF-1α i AGS-celler resulterade i betydande och funktionell förhöjning av intracellulär oxidativ stress även under kemoterapeutisk behandling Diskussion transkriptionsfaktor HIF-1α har etablerats som viktiga förmedlare av hypoxi-förmedlad chemoresistance [6] - [8]. [17], [18], [20]. Här identifierar vi HIF-1α som en kraftfull faktor för chemosensitivity i magcancer celler under normoxiska förhållanden. Genom att tillämpa en lentivirus-baserad siRNA system vi visar betydligt bättre 5-FU och cisplatin toxicitet i HIF-1a-brist gastric cancerceller. Tillgängliga data om den roll som HIF-1α för chemosensitivity av cancerceller under normoxiska förhållanden motstridiga. Medan HIF-1a-brist fibrosarkomceller (HT1080) uppvisade signifikant ökad känslighet mot etoposid i luften, tjocktarmscancer (HCT116) och hepatom (Hepa-1) celler misslyckats med att göra så [6]. Unruh et al. Kontroll av cancer progression av kemoterapi bygger åtminstone delvis på induktion av cellulärt åldrande. Nyligen var förlust av HIF-1α visats orsaka för tidig senescens av immortaliserade murina embryonala fibroblaster enligt normoxiska förhållanden [32]. Vår nuvarande data tyder på att HIF-1α vaktar liknande gastric cancerceller mot kemoterapi-inducerad senescens i normoxiska förhållanden. Detta utgör den första rapporten av förhöjd kemoterapi-inducerad senescens via funktionsinaktivering av HIF-1α i en etablerad human cancer cellinje. I HIF-1 a-bristande celler, vi även observerat förbättrat apoptosinduktion som svar på 5-FU. Tidigare studier har rapporterat en reaktivering av den proapoptotiska faktor bud [6], eller en förändring i balansen mellan pro- och antiapoptotiska Bcl-2 familjemedlemmar att ta hänsyn till ökad apoptos priser efter inaktivering av HIF-1α i läkemedelsbehandlade gastric cancerceller [ ,,,0],. 18] Vår aktuella studien identifierar en ny mekanism, varigenom HIF-1α motverkar både kemoterapi-inducerad åldrande och apoptos: Vi presenterar avgörande bevis för förmågan hos HIF-1α att undertrycka induktion av tumörhämmande p53 som svar på 5-FU i normoxiska förhållanden. P53 är en svängbar cellöde determinant på grund av dess roll i regleringen av cellcykelprogression och apoptos som svar på cellulär stress och utgör den vanligaste muterade genen i human cancer [33]. Ett stort antal olika kemoterapeutiska medel visades att stabilisera p53 och, omvänt, förlust av p53 utgör en princip mekanism av cancer resistens mot kemoterapi [33], [34]. Samspelet mellan p53 och HIF-1α har varit föremål för långvariga diskussioner som både positiva och negativa rapporter har publicerats [35]. Men hela tidigare publicerade arbeten fokuserade på p53-HIF-1a-interaktioner under hypoxiska (eller ens anoxiska) förhållanden. Så vitt vi vet, våra experiment för första gången lägga fram bevis för undertryckande av p53 aktivitet genom HIF-1α i normoxiska förhållanden. Som följd av p53 uppreglering i HIF-1a-bristande celler, observerade vi förändringar i effektenheter nedströms som är kopplade till den irreversibla cellcykelstopp kännetecknande för åldrande, t.ex. p21 stabilisering och hypophosphorylation av pRb. Till skillnad från vår observation, gjorde nyligen arbetet med chemoresistance mot etoposid i HIF-1α-brist immortaliserade murina embryonala fibroblaster inte observera en induktion av p21 [36]. Dessutom stabiliserade HIF-1α p21 och p27 samt lett till hypophosphorylation av pRb under hypoxi-inducerad tillväxthämning av immortaliserade murina embryonala fibroblaster och primära mjält-B-lymfocyter [37]. Dessa kontrasterande resultat är mest sannolikt förklaras av de undersökta celltyper: Medan Goda et al Medan p53 upprepade gånger visat sig motverka NF-kB-funktion [38], [39 ], våra nuvarande data tyder på en roll för tumörsuppressorgen i regleringen av HIF-1α-beroende NF-kB-aktivering. Bortsett från p53 har NF-kB dykt upp som en andra, central faktor för resistens mot kemoterapeutiska medel [40]. Flera olika studier har fastställt funktionella kopplingar mellan NF-kB och HIF-1α, även om de variabelt placera HIF-1α antingen uppströms av NF-kB eller vice versa. Till exempel, är hypoxi-inducerad stabilisering av HIF-1α i glatta muskelceller under transkriptionell kontroll av NF-kB [41]. På samma sätt bekräftade resultaten från villkorliga IKK-p knockoutmöss den avgörande roll som NF-kB i styra basal och hypoxi-inducerad expression av HIF-1α In vivo I den aktuella studien kunde vi peka ROS som en skärningspunkt HIF- 1a med p53-medierad cellulär stress svar på kemoterapi. Intracellulär ROS är kända som potenta inducerare av p53 och delta i aktiveringen av p53 genom kemoterapeutiska läkemedel [45]. Mitokondrierna utgör den främsta källan till intracellulära ROS [46], och HIF-1α sannolikt motverkar ROS produktion på mitokondrienivå via flera mekanismer, inklusive hämning av mitokondriell biogenes och pyruvat skytteltrafik in i mitokondrierna, minskning av mitokondriell aktivitet på grund av ökat utnyttjande av glykolys och aktivering av mitokondriell autophagy [29], [30], [47], [48]. Tidigare har vi etablerat en funktionell koppling mellan HIF-1α-kontrollerad minskning av ROS och förankring oberoende gastric cancerceller [22], blandar HIF-1α i patogenesen av magcancer i frånvaro av hypoxi. Vi finner nu att capacitiy av HIF-1α att begränsa ROS produktionen av gastric cancerceller också ger resistens mot kemoterapeutiska medel som fungerar via aktivering av p53 (Figur 6E). Intressant nog har ökande effekter på terapiresistens via modulering av p53 och ROS också rapporterats för HIF-2α [49]. De HIF-a-isoformerna 1 och 2 visar ett brett överlappning i förmodade HIF mål och bindning till hypoxiska svarselement och bestämd fördelning av hypoxi-inducerade effekter till antingen isoformen är inte alltid accomplishable [50]. Bertout et al. Med tanke på det kliniska behovet av att identifiera svars prediktorer för tillgängliga behandlingsalternativ, vår resultaten skulle kunna direkta behandlingsbeslut: å ena sidan, kunskap om HIF-1α uttryck kan rikta ett urval av läkemedel som till stor del verkar i en p53-oberoende sätt. Å andra sidan kan en särskild nytta resultatet av att kombinera HIF-1-hämmare och DNA-skadande medel (t ex 5-FU) i cancer med funktionell p53. Omvänt kan en minskad effekt av HIF-1-hämmare förväntas för behandling av p53 defekta tumörer, en aspekt som kan utgöra en confounding faktor i kliniska prövningar av HIF-1α hämmande behandlingar. Cellodling och kemikalier AGS (CRL-1739, ATCC, Rockville, Maryland, USA) och MKN28 (JCRB Cell Bank, Tokyo, Japan) celler odlades som monolagerkulturer i standardmedium . Generering av AGS och MKN28 celler som stabilt uttrycker antingen siRNA specifikt rikta HIF-1α (knockdown "KD") eller ospecifik kontroll siRNA (oordning, "SCR") har tidigare publicerats [22]. 5-fluorouracil (5-FU), cis-diaminplatina (II) diklorid (cisplatin) och superoxidanjonen inhibitorer diphenyleneiodonium klorid (DPI) och apocynin köptes från Sigma-Aldrich (Tyskland) och upplöstes i DMSO. PRIMA-1 (för p53-reaktivering och induktion av massiv apoptos) erhölls från Tocris Biosciences (Ellisville, Missouri, USA) och löstes upp i sterilt vatten. Vehikelkontroll av lösningsmedlen inkluderades i alla experiment. För bestämning av celltillväxt, 3 × 10 4 celler ympades i triplikat i 24-brunnsplattor, fick fästa under 16 h och därefter behandlades såsom anges under normoxiska eller hypoxiska betingelser. Efter behandling, trypsinerades cellerna, och levande celler räknades med hjälp av en hemocytometer. Cellcykelfördelning inklusive pre-G 1 fraktion bestämdes från DNA-histogram som beskrivits [52]. Apoptos också kvantifieras från detektering av aktiv, klyvs kaspas-3 genom flödescytometri med användning av en Alexa Fluor® 488-konjugerad antikropp (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). Åldrande associerade β-galaktosidasaktivitet analyserades i cytospinpreparat som beskrivits [53]. Immunoblotanalys Hela cellysat framställdes som tidigare beskrivits [52], sedan beslutade om en 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel och överfördes till nitrocellulosa (Amersham Biosciences, Freiburg, Tyskland). Blöts sonderade med antikroppar mot p53 och CDK2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornien, USA), p21 (Oncogene Research Products, Bad Soden, Tyskland), cyklin A (Upstate, Temecula, Kalifornien, USA), pRb (BD Pharmingen , Heidelberg, Tyskland), MDM2 (Calbiochem, San Diego, Kalifornien, USA), p65 (Cell Signaling Technology) och aktin (Sigma-Aldrich). Sekundära antikroppar konjugerades till pepparrotsperoxidas (Dianova, Hamburg, Tyskland) och peroxidasaktiviteten visualiserades med hjälp av Western blixt Kemiluminiscens Reagens Plus (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA). För realtids-PCR-analys, var totalt cellulärt RNA extraherades med Trizol-reagens (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Första sträng cDNA syntetiserades med en oligo (dT) primer och ett Superscript ™ First Strand Synthesis System (Invitrogen). Kvantitativ realtids-PCR-analys utfördes genom användning av TaqMan-PCR Universal Mastermix (för β-aktin) eller SYBR GREEN PCR Master Mix (till A20 och cIAP1; Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland). Primersekvenser levereras i tabell S1. För att normalisera den ingående RNA, var PCR-reaktioner gjordes med sond och primersekvenser för β-aktin. Transienta transfektioner av AGS-celler utfördes med användning av Effectene Transfection reagens (Qiagen, Hilden, Tyskland) enligt tillverkarens protokoll. För överuttryck studier såddes celler vid 3 × 10 4 celler /24-brunn och transfekterades med 100 ng pcDNA HIF-1α (vänligen tillhandahållen av Wanja Bernhardt, Universitätsklinikum Erlangen, Erlangen, Tyskland) eller pcDNA p65 (vänligen tillhanda av Hiroyasu Nakano, Jutendo University, Tokyo, Japan), respektive. För HRE eller NF-kB luciferas analys 3 × 10 4 celler /24 brunnar samtransfekterades med 100 ng pHRE-Luc (en gåva från Randall S. Johnson, UCSD, San Diego, Kalifornien, USA) eller IgκB-Luc (en gåva från Florian R. Greten, Technische Universität München, München, Tyskland), och 30 ng phRL-noll (Promega, Mannheim, Tyskland). Luciferasaktiviteten mättes med Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) såsom beskrivits [54]. För att uppnå övergående p53 dämpning ades AGS celler transfekterades vid 30% sammanflödet med 75 eller 150 nmol /L si p53, ( Ljuddämpare Nukleära proteinextrakt framställdes såsom beskrivits [54]. EMSA utfördes såsom tidigare beskrivits [55] med användning av 8 | ig av nukleärt protein och 100 fmol /L av slutradiomärkta 22 bp dubbelsträngad NF-KB-konsensus oligonucelotide (främre strängen: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C- 3 '; E3292, Promega).
mutantceller medan inaktivering av p53 i sig
påverkade inte chemosensitivity. HIF-1α markant undertryckt kemoterapi-inducerad aktivering av p53 och p21 samt retinoblastomproteinet, så småningom resulterar i cellcykelstopp. Minskad bildning av reaktiva syrespecies i HIF-1α-kompetenta celler identifierades som den molekylära mekanismen av HIF-1α-medierad hämning av p53. Vidare förlust av HIF-1α upphävts, i ett p53-beroende sätt, kemoterapiinducerad DNA-bindning av NF-kB och uttrycket av anti-apoptotiska NF-kB målgener. Följaktligen beredning av NF-kB-subenhet p65 vände ökade chemosensitivity av HIF-1a-bristande celler.
Slutsats och betydelse
mutationer i humana tumörer hålla potential att förväxla effekten av HIF-1-hämmare i cancerterapi
HIF-1α gränser kemoterapi-inducerad cellcykelstopp och apoptos via undertryckande av p53
. Således hypothesized vi att p53 kan bidra till augmented cytotoxiciteten hos 5-FU vid förlust av HIF-1α. Efter 5-FU behandling, p53-protein gradvis ackumuleras i AGS-celler, en effekt som slående var förstärkt med HIF-1 a-deficient AGS-celler (figur 2D). Denna stabilisering av p53 var associerad med förhöjda nivåer av cyklin-beroende kinas (CDK) hämmare p21 i en väletablerad transkriptions mål och nedströms effektor av p53 med funktioner i cellcykelstopp, åldrande induktion och apoptos (figur 2D). Återigen, HIF-1a-brist AGS celler visade en markant starkare ökning av p21 än HIF-1a-kunnig AGS celler. Stark induktion av p21 förväntas hämma aktiviteten av G 1 cyklin /CDK-komplex, vilket resulterar i hypophosphorylation av retinoblastom-proteinet (pRb) och misslyckande att inducera S-fas cykliner, t.ex. cyklin A. I själva verket, både pRb hypophosphorylation och minskade cyklin A nivåer bekräftades i 5-FU-behandlade AGS KD celler och - i mindre utsträckning - även i AGS SCR-celler (figur 2D). Dessa förändringar bekräftar bibehållandet G en fas observerades i DNA-histogram och är förenliga med den irreversibla G 1 stillestånd observerats i kemoterapi-inducerad senescens. Sålunda är de olika biologiska resultaten av 5-FU behandling i HIF-1α-saknande och -proficient AGS celler härrör från differentiell reglering av p53 och dess nedströmsmålet p21.
Inaktivering av p53 avtrubbar rollen av HIF-1α för chemosensitivity
HIF-1α misslyckas med att påverka chemosensitivity i p53
mutantceller
vid kodon 251. Intressant, radering av HIF-1α i MKN28 celler misslyckades med att öka tillväxthämning efter exponering för 5-FU (Figur 4A). På liknande sätt, 5-FU-inducerad G en ackumulering och apoptos av MKN28 celler påverkades inte av förlusten av HIF-1α (figur 4B och 4C). I linje med dessa resultat, förblev proteinnivåer av p53 och pRb oförändrad i 5-FU-behandlade MKN28 celler i hela 24-timmarsperiod, och p21 induktion var frånvarande (Figur 4D). Men när p53-funktion återställdes genom förbehandling med den kemiska föreningen PRIMA-1 [24] HIF-1α knockdown översättas till en avsevärt förbättrad 5-FU cytotoxicitet (Figur S3). Överensstämmer med den etablerade roll p53 i kemoterapi-inducerad cytotoxiska /cytostatiska effekter, behandling med PRIMA-1 i sig
minskat något spridningen av MKN28 celler och avsevärt förbättrat effektiviteten av 5-FU i MKN28 celler (Figur S3).
[25] - [27]. Därför bestämde vi NF-KB-DNA-bindande aktivitet i HIF-1α-saknande och -proficient AGS-celler efter behandling med 5-FU genom elektroforetisk mobilitetsförskjutningsanalys (EMSA). Behandling med 5-FU kraftigt aktiverad NF-kB DNA-bindande i AGS SCR-celler, med toppnivåer inträffar 6 timmar efter exponering för 5-FU (figur 5A). Behandling med TNFa under 4 h tjänade som positiv kontroll för aktivering av NF-kB. Vidare har en supershift induceras av en anti-p65-antikropp, vilket bekräftar att 5-FU-inducerade NF-kB-komplex innehöll subenheten 65-kDa (p65). Förlust av HIF-1 a inhiberade signifikant aktivering av NF-kB som svar på 5-FU och TNFa (figur 5A). I överensstämmelse med denna observation, 5-FU behandling misslyckades också att inducera NF-kB målgener cIAP1 och A20 i AGS KD celler, medan de lätt induceras i AGS SCR-celler (Figur 5B).
Både 5-FU och TNF aktiverad NF-kB DNA-bindande på ett tids- beroende sätt, vilket tyder på p53-oberoende mekanismer av NF-kB aktivering med 5-FU (figur 5D). Men skiljer sig från konstaterandet i AGS celler, detta NF-KB-aktivering i p53
mutant cellinje inte hämmats av HIF-1α inaktivering. Således kan HIF-1α stödja kemoterapi-inducerad NF-KB-aktivering genom att motverka p53-beroende hämmande mekanismer.
Förändrad ROS formation är ansvarig för HIF-1α-inducerad modifiering av p53 aktivitet
Rapporterade förbättrad känslighet av HIF-1a-brist murina embryonala fibroblaster till karboplatin eller etoposid enligt normoxisk liksom hypoxiska förhållanden [8]. När det gäller magsäckscancer, förstärktes effekten av 5-FU och vinkristin påvisas under normoxi In vitro
[18]. Väl i linje med våra resultat, båda studierna ingått en central roll för HIF-1α i medla chemoresistance enligt normoxiska förhållanden. Intressant nog en färsk studie från Japan visade lägre effekt av 5-FU-baserad kemoterapi i HIF-1α-uttryckande humana gastriska adenokarcinom, stärka uppfattningen av HIF-1 som en central faktor vid fastställandet av magcancer chemoresistance [31].
. kännetecknas en fysiologisk reaktion på hypoxi i icke-transformerade celltyper, analyserade vi svaret på svåra DNA-skador i etablerade cancercellinjer.
[42]. Omvänt var genuttryck av NF-KB-subenhet p65 visat sig styras av HIF-1α i samband med hypoxi-undertryckt apoptos av neutrofiler [43]. Vår slutsats markant reducerad NF-kB-aktivitet i HIF-1a-bristande celler vid behandling med 5-FU är därför väl i linje med den senare rapporten. Intressant nog observerades vi minskade också signifikant DNA-bindning av NF-kB-subenheter i HIF-1α-fattiga celler efter stimulering med TNFa, en väletablerad inducerare av NF-KB-aktivitet [44]. Detta väcker relevant fråga under vilka fysiologiska och patofysiologiska tillstånd HIF-1α kan reglera NF-KB-aktivering. HIF-1α och NF-kB dela avgörande betydelse för olika processer såsom inflammation, mikrobiell dödande och tumörbildning. Den exakta molekylära naturen samt hierarki av deras interaktion är troligtvis cell- och kontextberoende och kan inte generaliseras.
Visade att hämma HIF-2α ökar strålningsinducerad apoptos via ROS ackumulering och efterföljande ökning av p53-aktivitet [49]. Dessutom Roberts et al.
Visade att resistens mot kemoterapi delvis förmedlas av HIF-2α-medierad hämning av p53 i njurcellscancerceller [51]. Därför, de härmed rapporterade observationer motiverar undersökningar av potentiella roll HIF-2α, en uppgift som pågår i vårt laboratorium.
Material och metoder
cellprolifereringsanalys
Fastställande av distribution och apoptos cellcykeln genom flödescytometri
Kvantifiering av åldrande
Kvantitativ realtids-PCR analys
Transient transfektion och reporter luciferasanalys
Välj siRNA, Applied Biosystems) och analyserades 48 timmar efter transfektion. En icke-specifik siRNA (si scr, Eurogentec, Seraing, Belgien) användes som kontroll.
Elektroforetisk mobilitet shift assay (EMSA) Review
Mikrobiotmodulering och återupprättande av eubios kan hjälpa till att begränsa COVID-19-komplikationer
Coronavirussjukdomen (COVID-19), orsakad av det allvarliga akuta andningssyndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2), påverkar många organ i kroppen. Förutom att vara en andningssjukdom, det kan också påverk
Glycyrrhizic acid som läkemedelskandidat för COVID-19
Terapier för att motverka skador orsakade av det allvarliga akuta respiratoriska syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) har varit få, trots ansträngningar att upptäcka nya läkemedel och återanvända reda
Svampar och bakterier i tarmen kan också påverka människors hälsa och sjukdomens svårighetsgrad
Tarmmikrobiomet har fått mycket uppmärksamhet, men ny forskning visar att svampar i tarmen också är en viktig mikroorganism för tarmens funktion och hälsa, som sedan påverkar människors hälsa.
