PLoS One: hipoxia-indukálható faktor 1α Meghatározza gyomorkarcinóma kemoszenzitivitás módosításán keresztül p53 és NF-kB

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

Csökkentett kemoszenzitivitás szilárd rákos sejtek képvisel döntő akadálya a klinikai onkológiában. Ezért, a molekuláris jellemzése utak szabályozása kemoszenzitivitás központi előfeltétele, hogy javítsa rákterápiában. A hipoxia által indukálható faktor HIF-1α összefüggésbe hozták a kemoszenzitivitás miközben az alapul szolgáló molekuláris mechanizmusok nagyrészt megfoghatatlan. Ezért átfogóan elemezte a HIF-1α szerepének meghatározásában kemoszenzitivitás összpontosítva felelős molekuláris útvonalakat. Katalógusa

Módszertan és legfontosabb eredmények katalógusa

Az RNS-interferencia alkalmazták inaktiválja HIF-1α vagy p53 az emberi gyomorrák sejtvonalak AGS és MKN28. A kemoterápiás ágensek az 5-fluor-uracil és a ciszplatin használtunk és kemoszenzitivitás értékelték sejt proliferációs vizsgálati eljárások, valamint a meghatározása sejtciklus eloszlása ​​és az apoptózist. Expressziója a p53 és p53 célfehérje analizáltuk Western-blottal. NF-kB aktivitást jellemezzük elektroforetikus mobilitás-eltolódásos vizsgálati eljárás. Inaktiválása HIF-1α gyomorrákban sejtek eredményezett erőteljes emelkedés kemoszenzitivitás. Ennek megfelelően a HIF-1α-kompetens sejteket mutatja jelentős csökkenését a kemoterápia által kiváltott öregedés és az apoptózis. Figyelemre méltó, hogy ez a fenotípus teljesen hiányzik p53 katalógusa mutáns sejtek míg inaktiválása p53 önmagában katalógusa nem befolyásolja kemoszenzitivitás. HIF-1α jelentősen elnyomott kemoterápia-indukált aktiválását a p53 és p21, valamint a retinoblasztóma fehérje, végül a sejtciklus leállásához. Csökkentett reaktív oxigén fajok HIF-1α-kompetens sejteket azonosítottuk, mint a molekuláris mechanizmusa HIF-1α-közvetített gátlása p53. Továbbá, elvesztése HIF-1α megszüntette, a p53-függő módon, a kemoterápia által indukált DNS-kötő az NF-kB és expressziója anti-apoptotikus NF-kB célgének. Ennek feloldására az NF-kB alegység p65 fordított fokozott kemoszenzitivitás HIF-1α-hiányos sejtek. Katalógusa

Következtetések és jelentőség katalógusa

Összefoglalva azonosítottunk HIF-1α, mint egy erős szabályozója p53 és NF-kB aktivitását feltételek mellett genotoxikus stressz. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a p53 katalógusa mutációk humán tumorokban tartsa a lehetőség, hogy megszégyenítse a hatékonyságát HIF-1-inhibitorok rákterápia. Katalógusa

Citation: Rohwer N Dame C Haugstetter A, B Wiedenmann , DETJEN K, Schmitt CA, et al. (2010) A hipoxia-indukálható faktor 1α Meghatározza gyomorkarcinóma kemoszenzitivitás módosításán keresztül p53 és NF-kB. PLoS ONE 5 (8): e12038. doi: 10,1371 /journal.pone.0012038 katalógusa

Szerkesztő: Deb Fox, A Kutató Intézet Gyermek Gyermekkórház New Orleans, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: április 28, 2010; Elfogadva: július 19, 2010; Megjelent: augusztus 10, 2010 katalógusa

Copyright © 2010 Rohwer et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány ben támogatták a Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de) TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 és 133 /2-3), és az NR (Graduiertenkolleg 276/4 - "Signalerkennung und -umsetzung"). TC is támogatta a támogatás a Berliner Krebsgesellschaft e.V. (Http://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

intrinsic és szerzett gyógyszer-rezisztencia az elsődleges okai korlátozott hatásossága a kemoterápia a legtöbb gasztrointesztinális daganatok, ideértve a gyomorrák [1], [2]. A gyógyszer-rezisztencia jelentése egy komplex és multifaktoriális jelenség kapcsolatos tumor mikrokörnyezetében, például hipoxia, acidózis és gyulladás, valamint a neoplasztikus sejt maga [3]. Celluláris rezisztencia lehet eredendő a specifikus genetikai háttérben a tumorsejt vagy a mutáció eredményeképpen létrejövő és epigenetikai változások után antiproliferatív terápia [4], [5].

A transzkripciós faktor hypoxia-indukálható faktor 1 (HIF-1 ) képezi egy kulcsfontosságú szabályozója a celluláris alkalmazkodás hypoxia és szerepet játszik a drogrezisztencia [6] - [8]. A HIF-1 fehérje egy heterodimer, amely egy konstitutívan expresszált β-alegység (ARNT (aril szénhidrogén receptor nukleáris transzlokátor)), és egy hipoxia-indukálható α-alegység [9]. Normoxiás körülmények között, a HIF-1α aktivitás által kiváltott különböző növekedési faktorok, citokinek, aktivált onkogének vagy veszteség-of-function mutáns tumor szuppresszor gének [10]. HIF-1α, központi szerepet sok szempontból a tumorigenezis beleértve a tumor sejtek szaporodását, angiogenezis, áttétek, valamint a válasz kemo- és sugárterápia [11]. HIF-1α túlexpresszálódik nagyszámú szilárd tumorok, és tumoros HIF-1α expresszió gyakran rossz prognózissal társul [12] - [15]. Továbbá gátlása HIF-1α révén RNS-interferencia vagy farmakológiai vegyületek bizonyult tumorellenes hatékonyság különböző rágcsáló rák modellek [16]. Hozzájárulást a HIF-1α, hogy kemorezisztencia neoplasztikus sejtek észlelték széles spektrumát szilárd tumorok, beleértve a gyomorrák [6] - [8], [17] - [20]. Azonban a mögöttes molekuláris mechanizmusok, valamint a szerepe a HIF-1α a gyógyszer-rezisztencia normoxiás körülmények között továbbra is nagyrészt megfoghatatlan [8], [18], [21]. Itt azonosítjuk elnyomása p53 és a nukleáris faktor kB (NF-kB) aktivitás, mint a központi mechanizmusok HIF-1α érzékenységét meghatározó szerepet ellen az 5-fluorouracil (5-FU) és ciszplatin humán gyomor rákos sejtekben.

Eredmények

HIF-1α határozza érzékenységét gyomorrák-sejtek felé kemoterápiás ágensek az 5-FU és a ciszplatin

funkcionális inaktiválása HIF-1α értük el lentivirális transzdukciója AGS és MKN28 sejtek kis interferáló RNS (siRNS) kifejezetten a HIF-1α. Ez a kísérleti megközelítés hozott egy nagyon hatékony leütés mutatni egy közel teljes kudarcának transzdukált sejtek indukálására a HIF-1α fehérje hipoxia, mint korábban publikált [22]. Ahhoz, hogy értékelje a jelentőségét a HIF-1α érzékenységi humán gyomorrák sejtek felé létrehozott kemoterápiás szerek, összehasonlítottuk a hatását az 5-FU és ciszplatin HIF-1α-kompetens (kódolt "SCR") és a HIF-1α-hiányos (knockdown, "KD") AGS sejteket. Funkcionális inaktiválása HIF-1α eltolódott a dózisfüggés növekedésgátlás felé alacsonyabb hatóanyag koncentrációja (1A ábra S1), ami arra utal, hogy a HIF-1α képes csökkenteni a kemoterápia érzékenységének gyomorrák sejtek normoxiás körülmények között. A korábbi jelentések [6] - [8], [17], [18], az expozíciót a hypoxia fokozott ellenállást az 5-FU AGS sejtekben azonban inaktiválása HIF-1α eredményezett robusztus magasságban kemoszenzitivitás hipoxiás körülmények között ( ábra S2). Egy kiegészítő megközelítés, tanulmányoztuk a következményeit túltermelő HIF-1α (pcDNA HIF-1α) a kemoszenzitivitás AGS sejteket. AGS sejtek overexpresszáló HIF-1α jóval ellenállóbbak a kezelés 5-FU (1b ábra). Stabil HIF-1α expresszió igazoltuk HRE (hypoxia reszponzív elem) luciferáz riporter assay (1C). Ezek az eredmények határozottan arra utalnak, hogy a HIF-1α korlátozza a citotoxikus hatását az 5-FU és ciszplatin humán gyomor rákos sejteket, és hogy inaktiválása HIF-1α lehet kedvező hatással kemoszenzitivitás.

HIF-1α határértékek a kemoterápia által indukált sejtciklus és apoptózis útján elnyomása p53 katalógusa

kezdtük jellemzése a megfigyelt növekedés gátlás elemzésével sejtciklus eloszlása ​​kemoterápia után. G _{1-szinkronizált, szérummal-éheztetett AGS sejteket eltávolítjuk a G 0 /G 1 fázis hozzáadásával szérum és a sejtciklus profilok határoztuk hozzáadását követően az 5-FU. Megjelent kultúrák kezeletlen AGS könnyen haladt keresztül G 1, az S és G 2 /M fázisban [22], míg az 5-FU-val kezelt sejtekben maradt G 1 fázis (nem látható). Érdekes, hogy a 5-FU-függő megtartását sejtek G 1 fázist nagymértékben fokozta az AGS KD összehasonlítva AGS SCR sejtek, összhangban a G 1 sejtciklus (2A ábra). Irreverzibilis sejtciklus vált, mint fontos hatásmechanizmusának antiproliferatív szerek, és jellemzi celluláris jellemzői öregedés [7], [23]. Ennek megfelelően, a frakció elöregedett sejtek meghatároztuk. Valóban, a kezelés az 5-FU vezetett robusztus indukcióját öregedés az AGS sejtekben. Ezt a választ jelentősen továbbfejlesztett sejtek egyidejű elvesztésével HIF-1α (2b ábra). Ezenkívül apoptózis indukcióját javasolta megnövekedett pre G 1 frakció DNS hisztogramok az 5-FU-val kezelt AGS KD sejtekben (nem mutatjuk). Ezért mennyiségi elemzését az apoptotikus sejt frakciót kapunk kimutatásán alapul a hasított kaszpáz-3 (2C ábra). Adatokkal összhangban a sejtciklus eloszlása, az 5-FU által kiváltott apoptotikus frakció szignifikánsan nagyobb volt a HIF-1α-deficiens AGS KD sejtek összehasonlítva a HIF-1α-kompetens sejteket.}

A kemoterápia által kiváltott öregedés és apoptózis mind kezdettől fogva szorosan kapcsolódik a tumor szupresszor p53 katalógusa. Ezért feltételeztük, hogy a p53 hozzájárulhat a kibővített citotoxicitását az 5-FU upon elvesztése HIF-1α. Miután az 5-FU kezeléssel, p53 fehérje fokozatosan felhalmozódott AGS sejtekben, amely hatás feltűnően fokozódott a HIF-1α-deficiens AGS sejtek (2D, ábra). Ez a stabilizáció a p53 társult megnövekedett szintje a ciklin-függő kináz (CDK) inhibitor p21, egy jól megalapozott transzkripciós target és a downstream effektor p53 függvényekkel a sejtciklus leállásához, öregedés indukció és az apoptózist (2D, ábra). Ismét HIF-1α-hiányos sejtek AGS mutatott erősebbek növekedése p21 mint a HIF-1α-jártas AGS sejteket. Erős indukcióját p21 várhatóan gátolja a G _{1 ciklin /CDK komplexek, így a hypophosphorylation a retinoblasztóma fehérje (pRb), valamint nem indukálja az S fázis ciklinek, például ciklin A. Valóban, mind a pRb hypophosphorylation és csökkentett ciklin A szinteket megerősítette az 5-FU-val kezelt AGS KD sejtek és - kisebb mértékben - szintén AGS SCR sejtekben (2D, ábra). Ezek a változások alátámasztják a G 1 fázisú megtartása megfigyelt DNS hisztogram és összhangban vannak a visszafordíthatatlan G 1 letartóztatás megfigyelhető a kemoterápia által kiváltott öregedést. Így a különböző biológiai eredményeket az 5-FU kezelés HIF-1α-hiányos és -proficient AGS sejtek származnak differenciális szabályozása p53 és downstream célpont P21.}

inaktiválása p53 tompítja a szerepe a HIF-1α a kemoszenzitivitás katalógusa

Ahhoz, hogy kísérleti bizonyíték a javasolt szerepe p53 HIF-1α közvetítette szabályozása kemoszenzitivitás AGS sejtekben, azt funkcionálisan inaktívvá p53 RNS interferencia segítségével tranziens anti-p53 siRNS (si p53) vagy egy kevert kontroll siRNS (si scr). P53 hatékonyan leütött, ahogy azt a tény, hogy a transzfektált sejtek indukálására a p53-effektorok p21 és MDM2 válaszul az 5-FU kezeléssel (3A ábra). Érdekes, AGS KD transzfektált sejtek SI p53 szignifikánsan kevésbé érzékeny a növekedés gátlás által az 5-FU, mint AGS KD transzfektált sejtek kontroll siRNS (3B ábra). Összhangban a fenti megállapításokat, G _{1 sejtciklus megtartása és az apoptózis az 5-FU-val kezelt AGS KD sejteket csökkentett p53 knockdown képest transzfektált sejtekben kontroll siRNS (ábra 3D és a 3E). Ezzel éles ellentétben, kemoszenzitivitás HIF-1α-jártas AGS sejtek nem befolyásolta inaktiválásával p53 (3C, ábra).}

HIF-1α nem befolyásolja kemoszenzitivitás p53
mutáns sejtek

Annak igazolására, a HIF-1α-függő szabályozása az 5-FU érzékenységet és az, hogy tovább jellemezzük a hozzájárulást a p53, megvizsgáltuk egy második humán gyomorrák sejtvonal (MKN28), amely hordozza a missense mutációt az TP53
kodonnál 251. Érdekes, törlés HIF-1α in MKN28 sejtek nem fokozza a növekedést gátlás expozíció után az 5-FU (4a ábra). Hasonlóképpen, az 5-FU által kiváltott G _{1 felhalmozódása és apoptózisát MKN28 sejteket nem befolyásolja elvesztése HIF-1α (4b ábra és 4C). Összhangban ezek a megállapítások, a fehérje szintje a p53 és pRB változatlan maradt az 5-FU-val kezelt MKN28 sejtek a 24 órás periódusban, és a p21 indukció volt jelen (ábra 4d). Azonban, amikor a p53 funkció helyreállították végzett előkezeléssel a kémiai vegyület PRIMA-1 [24] a HIF-1α knockdown lefordított egy jelentősen továbbfejlesztett 5-FU citotoxicitás (ábra S3). Összhangban a megállapított szerepét p53 kemoterápia által indukált citotoxikus /citosztatikus hatást, a kezelés Prima-1 önmagában
enyhén csökkent proliferációját MKN28 sejtek és jelentősen növelte a hatásosságát az 5-FU in MKN28 sejtekben (ábra S3).}

NF-kB egy fontos mediátora a HIF-1α szerepe a kemoszenzitivitás

NF-kB társított védelmet a kemoterápia által kiváltott apoptózis, és fordítva, gátlása NF -κB javíthatja a hatékonyságát neoplazma elleni szerek mind in vivo
és a in vitro katalógusa [25] - [27]. Ezért meghatároztuk az NF-kB DNS-kötő aktivitást a HIF-1α-hiányos és -proficient AGS sejteket kezelés után az 5-FU által elektroforetikus mobilitás eltolódás assay (EMSA). Kezelés Az 5-FU hatásosan aktivált NF-kB DNS-kötő AGS SCR sejtekben, a csúcs szintek követően 6 órán expozíció után az 5-FU (5A ábra). Kezelés TNFa 4 órán szolgált pozitív kontrollként NF-kB. Továbbá, egy supershift indukáltunk egy anti-p65 ellenanyag, amely megerősíti, hogy az 5-FU által kiváltott NF-kB komplexek tartalmazta a 65-kDa alegységből (p65). Elvesztése HIF-1 alfa szignifikánsan gátolta a NF-kB, válaszul az 5-FU-t és TNFa (5A ábra). Ezzel a megfigyeléssel összhangban, az 5-FU kezelés szintén nem indukálta a NF-kB célgének cIAP1 és A20 AGS KD sejtekben, mivel ezeket könnyen indukált AGS SCR sejtekben (5B ábra). Katalógusa

A címet a funkcionális jelentősége az NF-kB az 5-FU által kiváltott növekedés gátlás, mi overexpresszált p65 (pcDNA p65) a AGS KD sejtekben. Transzfekciója pcDNA p65, de nem az üres kontroll vektorral, eredményezett jelentős indukcióját p65 protein és az NF-kB transzkripciós aktivitás AGS KD sejtekben (ábra S4). Figyelemre, HIF-1α-deficiens AGS KD sejtek overexpresszáló p65 jelentősek voltak jobban ellenáll az 5-FU kezeléssel összehasonlítva AGS KD transzfektált sejtek a kontroll vektorral (5C), amely összhangban áll alapvető szerepet az NF-kB közvetítésében kemorezisztencia felé az 5-FU a gyomor rákos sejtekben. Mindent összevetve, egy egyidejű aktiválása p53 gátlása és a NF-kB az 5-FU-val kezelt, a HIF-1α-hiányos AGS sejtek volt megfigyelhető. Annak tisztázására, hogy mindkét esemény kölcsönösen függenek egymástól, megvizsgáltuk az 5-FU-indukált NF-kB aktivációt MKN28 sejtek mutáns p53. Katalógusa Mind az 5-FU és TNF aktivált NF-kB DNS-kötő egy idő- függő módon, jelezve, a p53-független mechanizmusok az NF-kB aktiválását az 5-FU (5D ábra). Azonban eltér a megállapítás AGS sejtekben ez az NF-kB aktiválását a p53 katalógusa mutáns sejtvonalat nem tompította a HIF-1α inaktiválása. Így a HIF-1α támogathatja a kemoterápia okozta NF-kB aktiválás ellensúlyozva p53-függő gátló mechanizmusok. Katalógusa

Altered ROS képződés felelős HIF-1α kiváltott módosítása p53 aktivitás katalógusa

tisztázzák a molekuláris mechanizmusa p53 szuperindukciós az 5-FU-val kezelt HIF-1α-deficiens sejtek, jellemeztük a szerepe a reaktív oxigén (ROS). ROS képeznek jelölt Link (I) ROS hatásos aktivátorok a p53 funkció és a figyelembe vett legfontosabb tényező az indukciós a p53 által különféle kemoterápiás szerek [28], és (ii) a HIF-1α elnyomhatja a ROS-termelés csökkentésével mitokondriális aktivitás és biogenezist [22], [29], [30]. Ennek megfelelően, AGS KD sejteket előkezeltük a ROS-inhibitorok diphenyleneiodonium-kloridot (DPI) vagy apocynin. Mindkét inhibitorok biztosított jelentős védelmet nyújt az 5-FU által kiváltott növekedés gátlást AGS KD sejtekben (6a ábra és a 6B). Továbbá, DPI és apocynin szinte teljesen megakadályozta az indukciós a p53 és a downstream célpont P21 5-FU-val kezelt sejtekben (ábra 6C és 6D). Ezek az eredmények azt sugallják, egy kereszteződést HIF-1α jelátvitel a p53-közvetített válasz az 5-FU szintjén ROS-termelés. Hogy ok-okozati szerepét HIF-1α a redox potenciál AGS után a sejtek 5-FU kezelés, ROS szintek meghatározása az AGS KD és SCR sejteket áramlási citometriával. Azt találtuk, hogy az intracelluláris szuperoxid szint az 5-FU-val kezelt AGS KD sejteket 2,5-szer nagyobb, mint az 5-FU-val kezelt AGS SCR sejtek (ábra S5), jelezve, hogy a funkcionális inaktiválása HIF-1α AGS sejtekben eredményezte jelentős és funkcionális az intracelluláris oxidatív stressz alatt is kemoterápiás kezelést. katalógusa

Vita katalógusa

A transzkripciós faktor HIF-1α jött létre, mint fontos közvetítője hipoxia által közvetített kemorezisztenciájának [6] - [8] [17], [18], [20]. Itt vagyunk azonosítani a HIF-1α, mint egy erős meghatározója kemoszenzitivitás gyomorrákban sejtek normális körülmények között. Alkalmazásával egy lentivírus alapú siRNS rendszer mi mutatnak jelentősen továbbfejlesztett 5-FU és ciszplatin toxikus HIF-1α-deficiens gyomor rákos sejteket. A rendelkezésre álló adatok a szerepét HIF-1α a kemoszenzitivitás rákos sejtek normális körülmények között ütköznek. Míg a HIF-1α-hiányos fibrosarcoma sejtek (HT 1080) szignifikánsan fokozott érzékenységet felé etopozid alatt a levegő, a vastagbélrák (HCT116) és hepatoma (Hepa-1) sejtek elmulasztotta megtenni [6]. Unruh et al.
Jelentett fokozott fogékonyság HIF-1α-deficiens egér embrionális fibroblasztok karboplatin vagy etopozid normoxiás valamint hipoxiás körülmények [8]. Tekintettel a gyomorrák, a fokozott hatékonyság az 5-FU és vinkrisztin mutattuk alatt normoxia in vitro katalógusa [18]. Valamint összhangban van az eredmények, mind a tanulmányok arra a következtetésre jutott a döntő szerepet a HIF-1α közvetítésében kemorezisztenciájának normális körülmények között. Érdekes, hogy egy nemrégiben készült tanulmány Japánban kimutatták kevésbé hatékony az 5-FU-alapú kemoterápiával HIF-1α-t expresszáló humán gyomor adenocarcinoma, erősítve azt a felfogást a HIF-1 a döntő tényező meghatározására gyomorrák kemorezisztenciájának [31].

Control rák progressziójának a kemoterápia által támaszkodik legalább részben az indukciós a celluláris öregedés. Nemrégiben elvesztése HIF-1α bebizonyosodott, hogy káros idő előtti elöregedését, immortalizált egér embrionális fibroblasztok normoxiás körülmények között [32]. A jelenlegi adatok azt sugallják, hogy a HIF-1α hasonlóan őrzi gyomorrák sejtek ellen kemoterápia által kiváltott öregedés normális körülmények között. Ez az első jelentés emelkedett a kemoterápia okozta öregedés viafunctional inaktiválása HIF-1α egy szokásos humán rákos sejtvonal. A HIF-1α-deficiens sejtek, azt is megfigyeltük javult apoptózis indukció válaszul az 5-FU. Korábbi vizsgálatok szerint újraaktiválódása proapoptotikus faktor Bid [6], vagy változás az egyensúlyt a pro- és antiapoptotikus Bcl-2 család tagjainak felelősségre fokozott apoptózist arányok alábbi inaktiválása HIF-1α hatóanyaggal kezelt gyomor rákos sejtek [ ,,,0],18]. katalógusa

a jelenlegi tanulmány szerint egy új mechanizmus, amellyel a HIF-1α ellene mind a kemoterápia által kiváltott öregedést és az apoptózis: Bemutatjuk meggyőző bizonyítékot kapacitása HIF-1α, hogy elnyomja az indukciós a p53 tumor szuppresszor válaszul az 5-FU normoxiás körülmények között. A p53 egy pivotális sejt sorsát meghatározó miatt szabályozásában betöltött szerepe miatt a sejtciklus progresszióját és az apoptózis, válaszul a celluláris stressz, és ez alkotja a leggyakrabban mutált gén a humán rákok [33]. A sokféle kemoterápiás szerek kimutatták, hogy stabilizálja a p53, és fordítva, elvesztése p53 minősül elv mechanizmusa rák ellenállás felé kemoterápia [33], [34]. A kölcsönhatás a p53 és a HIF-1α tárgyát képezte a régóta fennálló vitákat, mind pozitív, mind negatív jelentéseket tettek közzé [35]. Ugyanakkor az egész korábban megjelent munkája középpontjában p53-HIF-1α-kölcsönhatások hipoxiás (vagy akár oxigénhiányos) körülmények között. Ahhoz, hogy a legjobb tudásunk, kísérleteink első alkalommal bizonyítják a elnyomása p53 aktivitás által HIF-1α normoxiás körülmények között. Ennek következtében a p53 upreguláció a HIF-1α-deficiens sejtek, mi megfigyelt változásokat downstream hatások, amelyek kapcsolódnak a visszafordíthatatlan sejtciklus jellemző öregedés, például p21 stabilizációs és hypophosphorylation pRb. Eltér a megfigyelés, a legutóbbi munka kemorezisztenciájának felé etopozidot HIF-1α-hiányos halhatatlanná egér embrionális fibroblasztok nem tapasztaltam indukciós p21 [36]. Továbbá, HIF-1α stabilizált p21 és p27 valamint vezetett hypophosphorylation pRb során hypoxia-indukált növekedési gátlás immortalizált egér embrionális fibroblasztok és az elsődleges lép-B-limfociták [37]. Ezek ellentétes eredményeket valószínűleg azzal magyarázható, a vizsgált sejttípus: Bár Goda és munkatársai katalógusa. azzal jellemezve, hogy egy fiziológiai választ, hogy a hipoxia a nem-transzformált sejt típusok, elemeztük a válasz súlyos DNS-károsodás a létrehozott rákos sejtvonalak.

Miközben p53 ismételten kimutatták, hogy ellensúlyozza az NF-kB funkció [38], [39 ], a jelenlegi adatok azt mutatják, szerepe a tumor szupresszor szabályozásában HIF-1α függő NF-kB aktiválást. Eltekintve a p53, az NF-kB vált, mint a második, a központi meghatározója ellenállás felé kemoterápiás szerek [40]. Számos különböző vizsgálatok megállapították funkcionális kapcsolatok között az NF-kB és a HIF-1α, bár változó helyezze a HIF-1α akár upstream az NF-kB, vagy fordítva. Például, a hipoxia-indukált stabilizálása HIF-1α simaizomsejtekben transzkripciós szabályozása alatt áll az NF-kB [41]. Hasonlóképpen, kapott eredmények feltételes IKK-β knockout egerekben megerősítette a kulcsfontosságú szerepét az NF-kB szabályozásában bazális és hipoxia által indukált expresszióját a HIF-1α in vivo katalógusa [42]. Ezzel szemben, a génexpresszió a NF-kB alegység p65-ben kimutatták, hogy szabályozható a HIF-1α keretében hypoxia-elfojtott apoptózis a neutrofilek [43]. A mi megállapítása jelentősen csökkent NF-kB aktivitását a HIF-1α-deficiens sejtek kezelés hatására az 5-FU, ezért jól összhangban van ez utóbbi jelentés. Érdekes módon azt is megfigyelték, szignifikánsan csökkentette a DNS-kötő az NF-kB alegységek HIF-1α-deficiens sejtek stimulálás után a TNFa, egy jól megalapozott induktor az NF-kB aktivitását [44]. Ez felveti azt a vonatkozó kérdés, amelyek mellett élettani és kórélettani körülmények HIF-1α képes szabályozni az NF-kB aktiválást. HIF-1α és NF-kB megosztani döntő jelentőségű a különböző folyamatokat, mint a gyulladás, a mikrobiális leölése és tumorogenezisben. A pontos molekuláris természete, valamint a hierarchiában való kölcsönhatás valószínűleg sejt- és kontextus-függő, és nem általánosítható. Katalógusa

A jelenlegi vizsgálat során tudtuk pontosan ROS mint metszéspontja HIF- 1 alfa a p53 által közvetített celluláris stressz válasz a kemoterápiára. Intracelluláris ROS ismert potens induktorai p53, és részt vesznek az aktiválási a p53 által kemoterápiás szerek [45]. A mitokondriumok jelentik az elsődleges forrása a ROS [46], és a HIF-1α valószínűleg ellensúlyozza ROS termelést a mitokondrium szintjén keresztül számos mechanizmussal gátolja a mitokondriális biogenezist és piruvát ingáznak a mitokondriumok, csökken a mitokondriális aktivitás miatt fokozott hasznosítása glikolízis és aktiválását a mitokondriális autofágia [29], [30], [47], [48]. Korábban létrehozott között funkcionális kapcsolat HIF-1α vezérelt csökkentése ROS és rögzítési függetlenségét gyomorrák sejtek [22], hozó HIF-1α patogenezisében gyomorrák hiányában hypoxia. Most meg, hogy a capacitiy HIF-1α, hogy korlátozza a ROS-termelés a gyomor rákos sejtek is rezisztenciát biztosít a kemoterápiás szerek, amelyek működnek aktiválása útján p53 (ábra 6E). Érdekes módon, a növekvő hatások terápia rezisztencia modulálásán keresztül a p53 és a ROS is beszámoltak a HIF-2α [49]. A HIF-α izoformák az 1. és 2. ábrák egy széles átfedést vélt HIF célokat és kötődés hipoxiás válasz elemeket és határozott elosztása hipoxia-indukált hatások, hogy vagy izoforma nem mindig kivitelezhető [50]. Bertout et al.
Kimutatták, hogy gátolja a HIF-2α növeli sugárzás által indukált apoptózis keresztül ROS akkumuláció és az azt követő dúsításának p53 aktivitás [49]. Ezen túlmenően, Roberts et al.
Azt mutatta, hogy az ellenállás ellen kemoterápia részben közvetíti a HIF-2α-mediált elnyomása p53 vesesejtes karcinóma sejteket [51]. Ezért az ezzel bejelentett észrevételeket indokolja vizsgálatot a potenciális szerepét a HIF-2α, a feladat, hogy jelenleg folyik a laboratóriumban. Katalógusa

Tekintettel a klinikai igény azonosítása válasz előrejelzője álló kezelési lehetőségek, a eredmények potenciálisan közvetlen terápiás döntések: egyrészt, a tudás a HIF-1α túltermelése is közvetlenül a választás a gyógyszerek, melyek nagyrészt cselekedni p53-független módon. Másrészt, egy különösen előnyös eredhet kombinálásával HIF-1-inhibitorok és a DNS-károsító szerekkel (például 5-FU) a daganatok funkcionális p53. Megfordítva, egy csökkent hatásossága HIF-1-inhibitorok lehet várható kezelésére p53 hibás tumorok olyan szempont, hogy minősülhet zavaró tényező a klinikai vizsgálatok során a HIF-1α-gátló kezelési rendszerek.

Anyagok és módszerek

Sejttenyésztés és vegyszerek

AGS (CRL-1739, ATCC, Rockville, Maryland, USA) és MKN28 (JCRB Cell Bank, Tokió, Japán) sejteket növesztünk, mint egyrétegű tenyészeteket standard tápközegben . Generációs AGS és MKN28 sejtek stabilan expresszáló akár siRNS kifejezetten a HIF-1α (knockdown, "KD"), vagy a nem specifikus kontroll siRNS (kódolt "SCR") tette közzé korábban [22]. 5-fluor-uracil (5-FU), a cisz-Diammineplatinum (II) diklorid (ciszplatin) és a szuperoxid anion inhibitorok diphenyleneiodonium-kloridot (DPI), és apocynin a Sigma-Aldrich (Németország) és DMSO-ban oldott. PRIMA-1 (p53-reaktiváció és indukciója masszív apoptózist) kapunk Tocris Biosciences (Ellisville, Missouri, USA), és steril vízben feloldjuk. A vivőanyag-kontrollcsoport Az oldószerek tartalmazta az összes kísérletben.

Cell proliferációs vizsgálati

meghatározásához sejtek növekedését, 3 × 10 ^{4 sejteket oltottunk három párhuzamosban be 24 lyukú lemezeken, hagyjuk megtapadni 16 órán át, majd kezeltük amint az a normoxiás vagy hipoxiás körülmények között. A kezelés után a sejteket tripszinnel kezeltük, és az életképes sejteket megszámoltuk egy hemocitométerrel.}

meghatározása sejtciklus eloszlása ​​és apoptózist áramlási citometriával

Sejtciklus eloszlás, beleértve a pre-G _{1 frakciót határozzuk DNS hisztogramok leírt [52]. Az apoptózist is mennyiségileg származó kimutatása aktív, hasított kaszpáz-3, áramlási citometriával alkalmazásával Alexa Fluor® 488-konjugált antitestet (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA).}

számszerűsítése öregedés

Öregedés-asszociált β-galaktozidáz aktivitás értékelték citospin készítményekben leírt [53].

immunfoltelemzés

a teljes sejt lizátumokat készítünk a korábban leírtak [52], majd megoldani a 10% -os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gél és átvittük nitrocellulóz (Amersham Biosciences, Freiburg, Németország). A blottokat elleni antitestekkel p53 és CDK2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA), a P21 (Oncogene Research Products, Bad Soden, Germany), ciklin A (Upstate, Temecula, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok), a pRb (BD Pharmingen , Heidelberg, Németország), MDM2-t (Calbiochem, San Diego, Kalifornia, amerikai Egyesült Államok), a p65 (Cell Signaling Technology) és az aktin (Sigma-Aldrich). Szekunder antitesteket konjugált torma-peroxidáz (Dianova, Hamburg, Németország) és a peroxidáz-aktivitást láthatóvá segítségével WESTERN LIGHTNING Kemilumineszcencia Reagent Plus (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA).

kvantitatív valós idejű PCR analízis

valós idejű PCR-analízis, a teljes sejtes RNS-t kivontuk Trizol reagens (Invitrogen, Karlsruhe, Németország). Az első szál cDNS-t szintetizáltunk egy oligo (dT) primer és Superscript ™ First Strand szintézis rendszer (Invitrogen). Kvantitatív valós idejű PCR-elemzést végeztünk TaqMan PCR Univerzális Mastermix (FOR β-aktin), vagy SYBR Green PCR Master Mix (FOR A20 és cIAP1; Applied Biosystems, Darmstadt, Németország). Primer szekvenciák szállítjuk táblázat S1. Normalizálására input mennyisége RNS PCR reakciókat végezni szonda és a primerek β-aktin.

Tranziens transzfekció és riporter Luciferase Assay

Tranziens transzfekció AGS sejtek alkalmazásával hajtottuk végre Effectene transzfekciós reagens (Qiagen, Hilden, Germany) alkalmazásával a gyártó protokollja. A overexpresszió vizsgálatok sejteket oltottunk 3 × 10 ^{4 sejt /24 lyukú és transzfektált 100 ng pcDNA HIF-1α (bocsátotta rendelkezésünkre Wanja Bernhardt Universitätsklinikum Erlangen, Erlangen, Németország), vagy pcDNA p65 (szívességéből által Hiroyasu Nakano, Jutendo University, Tokyo, Japán), ill. A HRE vagy NF-kB Luciferase Assay, 3 × 10 4 sejt /24 lyukú kotranszfektáltunk 100 ng pHRE-Luc (ajándéka Randall S. Johnson, UCSD, San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) vagy IgκB-Luc (ajándék Florian R. Greten, Technische Universität München, München, Németország) és 30 ng phRL-null (Promega, Mannheim, Németország). A luciferáz aktivitást a Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) leírtak [54]. Ahhoz, hogy az átmeneti p53 elnyomás, AGS sejteket 30% összefolyás 75 vagy 150 nmol /l si p53, ( Silencer katalógusa Válassza siRNS, Applied Biosystems), és vizsgáljuk 48 óra után transzfekció. A nem-specifikus siRNS (si scr, Eurogentec, Seraing, Belgium) alkalmaztunk kontrollként.}

Elektroforetikus mobilitás-eltolódásos vizsgálati eljárás (EMSA)

Nuclear protein extraktumokat készítettünk leírtak [54]. EMSA végeztük a korábban leírtak [55] alkalmazásával 8 ug nukleáris fehérje és 100 fmol /l a végső radioaktív izotóppal jelzett 22 bp kétszálú NF-kB konszenzus oligonucelotide (előre szál: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C- 3 '; E3292, Promega). A mintákat felbontottuk elektroforézissel egy nem denaturáló 5% -os poliakrilamid gélen.

• PLoS One: let-7 miRNS Family szelektíven az extracelluláris környezet keresztül exoszómák a metasztatikus gyomor sejtvonal
• PLoS One: Nagy Diversity vacA és cagA Helicobacter pylori genotípusok betegek anélkül Gyomor- Cancer