Plos ONE: inducirajo s hipoksijo Factor 1α Določa Rak želodca Chemosensitivity z modulacijo p53 in NF-κB

Povzetek

Ozadje

Zmanjšana chemosensitivity trdnih rakavih celic predstavlja ključno oviro v klinični onkologiji . Zato je molekularna karakterizacija poti urejajo chemosensitivity je osrednji pogoj za izboljšanje zdravljenja raka. Inducirajo s hipoksijo faktor HIF-1α je bila povezana z chemosensitivity medtem ko so osnovne molekularne mehanizme ostajajo večinoma nedosegljiva. Zato smo temeljito analizirali vlogo HIF-1 a pri določanju chemosensitivity poudarkom na odgovornih molekularnih poti.

Metodologija in glavne ugotovitve

interference RNA je bila uporabljena za inaktivacijo HIF-1 a ali p53 pri raku človeške želodčne celične linije AGS in MKN28. Kemoterapevtsko sredstva 5-fluorouracila in cisplatina so bile uporabljene in chemosensitivity je bila ocenjena s testi celične proliferacije, kot tudi določanje porazdelitve celičnega ciklusa in apoptozo. Izražanje p53 in ciljnih p53 proteinov smo analizirali z Western blot. NF-κB aktivnost je bila označena s elektropotopni izmenskega mobilnost testu. Inaktivacija HIF-1 a v želodcu rakavih celic za posledico robustno zvišanje chemosensitivity. V skladu s tem, HIF-1 a-kompetentni celice prikaže znatno zmanjšanje staranje in apoptoze kemoterapije. Zanimivo je, da je bil ta fenotip popolnoma odsoten v P53
mutirane celice, medtem ko inaktivacijo p53 per se
ni vplivala chemosensitivity. HIF-1α izrazito zatreti, s kemoterapijo inducirane aktivacijo p53 in p21 kot tudi retinoblastomnega proteina, sčasoma povzroči ustavitev celičnega cikla. Zmanjšana tvorba reaktivnih kisikovih spojin v HIF-1α-kompetentnih celic smo identificirali kot molekularni mehanizem HIF-1α posredovano zaviranja p53. Poleg tega izguba HIF-1 a odpravljeno, pri p53-odvisen način, s kemoterapijo inducirana DNA vezave NF-κB in izražanje anti-apoptotskih NF-κB ciljnih genov. Zato je priprava na podenoto p65 NF-κB obrnil povečano chemosensitivity za HIF-1 a s pomanjkanjem celic.

Zaključek in pomen

Če povzamemo, smo ugotovili HIF-1 a kot močan regulator p53 in NF-κB aktivnosti pod pogoji genotoksičnemu stresa. Sklepamo, da je p53
mutacije v človeških tumorjih imajo potencial, da zmešajmo učinkovitost HIF-1-zaviralcev pri zdravljenju raka

Navedba. Rohwer N, Dame C, Haugstetter A, Wiedenmann B , Detjen K Schmitt CA, et al. (2010) inducirajo s hipoksijo Factor 1α Določa želodca Rak Chemosensitivity z modulacijo p53 in NF-κB. PLoS ONE 5 (8): e12038. doi: 10,1371 /journal.pone.0012038

Urednik: Deb Fox, Raziskovalni inštitut za otroke v otroški bolnišnici v New Orleansu, Združene države Amerike

Prejeto: 28. april 2010; Sprejeto: 19. julij 2010; Objavljeno: 10. avgust 2010

Copyright: © 2010 Rohwer et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je podprta s sredstvi iz Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de) v TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 in 133 /2-3) in NR (Graduiertenkolleg 276/4 - "Signalerkennung und -umsetzung"). TC je bila podprta tudi z donacijo Berliner Krebsgesellschaft e.V. (Http://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Notranja in pridobljena odpornost drog so glavni vzrok za omejeno učinkovitost kemoterapije v večini gastrointestinalnih malignih bolezni, vključno z rakom želodca [1], [2]. odpornost na zdravilo predstavlja kompleksen in večstranskosti pojav v zvezi z tumorja mikrookolja, npr hipoksija, acidoza in vnetja kot tudi sama neoplastični celici [3]. Cellular odpornost lahko neločljivo povezano s posebno genetsko ozadje tumorske celice ali posledica mutacij in epigenetske spremembe po antiproliferacijskega terapijo [4], [5].

transkripcijski faktor hipoksija-inducibilnih faktor 1 (HIF-1 ) predstavlja osrednjo regulator celične prilagajanje hipoksije in je vpleten v odpornosti drog [6] - [8]. HIF-1 protein heterodimer, sestavljen iz konstitutivno izražen beta-podenote (EKBL (aril ogljikovodikov receptor jedrska translocator)) in hipoksija-inducibilnih α-podenote [9]. Pod normoxic pogoji lahko HIF-1α dejavnost jih povzroča različne rastne faktorje, citokini, aktivirane onkogeni ali izguba-of-funkcijskih mutiral zaviralnih genov [10]. HIF-1α je centralno vključen v več vidikih tumorigeneze, vključno s celično proliferacijo tumorja, angiogenezo, metastaze, kot tudi odgovor na kemo- in radioterapijo [11]. HIF-1α je močno izraženi pri velikem številu solidnih tumorjev, in protitumorski HIF-1α izraz je pogosto povezan s slabo prognozo [12] - [15]. Poleg tega je zaviranje HIF-1 a s pomočjo interference RNA ali farmakološkimi spojinami dokazana protitumorsko učinkovitost pri različnih glodalcev modelih raka [16]. Prispevek od HIF-1 a k chemoresistance neoplastičnih celic so opazili pri širokem spektru solidnih tumorjev, vključno z rakom želodca [6] - [8], [17] - [20]. Vendar pa osnovne molekularne mehanizme, kot tudi vloga HIF-1 a za odpornost drog pod normoxic pogoji ostajajo večinoma nedosegljiva [8], [18] [21]. Tukaj smo ugotoviti zatiranje p53 in spodbujanje κB dejavnosti jedrskega faktor (NF-κB) kot osrednjih mehanizmov za HIF-1α je občutljivost določajo vlogo proti 5-fluorouracil (5-FU) in cisplatina v človeških želodca rakavih celic.

Rezultati

HIF-1α določa občutljivost želodčnih rakavih celic pri doseganju kemoterapevtikov 5-FU in cisplatina

Funkcijska inaktivacija HIF-1 a smo dosegli z lentivirusni transdukcije v letnem pregledu rasti in MKN28 celice z male interferenčne RNA (siRNA) posebej usmerjene HIF-1 a. Ta eksperimentalni pristop prinesla visoko učinkovite rasklapanje z blizu popoln neuspeh transduciranih celic za sprožanje HIF-1α beljakovin kot odgovor na hipoksijo dokazano kot prej [22] objavila. Da bi ocenila pomen HIF-1 a za občutljivost človeške želodčne rakavih celic do uveljavljenih kemoterapevtiki, smo primerjali učinke 5-FU in cisplatina v HIF-1α-kompetentni (plazenje, "SCR") in HIF-1 a primanjkuje (rasklapanje, "KD") AGS celice. Funkcionalna inaktivacijo HIF-1 a premaknilo odvisnost odmerka inhibicije rasti v smeri nižje koncentracije zdravila (Slika 1A in slika S1), kar kaže, da je HIF-1α sposoben zmanjšati kemoterapijo dovzetnosti želodčnih rakavih celic pod normoxic pogoji. V skladu s prejšnjimi poročili [6] - [8], [17] [18], izpostavljenost hipoksija poveča odpornost na 5-FU v AGS celicah, vendar inaktivacijo HIF-1 a povzročilo robustno nadmorski višini chemosensitivity pod hipoksičnih pogojih ( Slika S2). V dopolnilni pristop, smo proučevali posledice prekomerno ekspresijo HIF-1 a (pcDNA HIF-1 a) za chemosensitivity za AGS celic. AGS celice s prekomerno ekspresijo HIF-1 a so bistveno bolj odporne na zdravljenje s 5-FU (slika 1B). Stabilno HIF-1α izraz je potrdil HRE (hipoksija odziven element) luciferaza reporter test (slika 1C). Ti rezultati nakazujejo, da HIF-1α omejuje ukrepanje citotoksično 5-FU in cisplatin v človeške želodčne rakavih celic in da inaktivacijo HIF-1 a ima lahko pozitivne učinke na chemosensitivity.

HIF-1α omejitve kemoterapijo inducirane prijetje cikel celic in apoptoza prek zatiranja p53

začeli smo karakterizacijo opazili inhibicije rasti z analizo celičnega cikla vzorce razširjenosti po kemoterapiji. G _{1-sinhronizirana, AGS celic, seruma sestradana so izšla iz G 0 /G 1 faza z dodajanjem profilov serumu in celičnega ciklusa leta so bili določeni po dodatku 5-FU. Sproščene kulture neobdelanih AGS hitro napredovala skozi G 1 v S in G 2 /M faze [22], medtem ko je 5-FU obdelane celice ostala v G 1 faza (ni prikazano). Zanimivo je, da je 5-FU odvisna ohranitev celic G 1 fazi močno razširjena v AGS KD primerjavi z AGS SCR celic, v skladu z G 1 celični cikel prijetje (slika 2A). Nepovraten zaustavitev celičnega cikla se je izkazalo kot pomemben način delovanja antiproliferacijskimi agentov in je značilna celičnih funkcij staranje [7], [23]. Zato je bila določena frakcija senescentnih celic. Pravzaprav, zdravljenje s 5-FU je pripeljalo do trdnega indukcijo staranje v AGS celicah. Ta odgovor je bil precej razširjen v celicah s sočasno izgubo HIF-1 a (slika 2B). Poleg tega je bila indukcija apoptoze predlagali povečano napolnjeni G 1 frakcije v histogramih DNA 5-FU, zdravljenih AGS KD celic (ni prikazano). Zato je bila pridobljena kvantitativna analiza frakcije apoptotične celične temelji na odkritju razcepljene kaspaze-3 (slika 2C). V skladu s podatki o porazdelitvi celičnega cikla, je 5-FU povzroča apoptotično delež znatno povečal v HIF-1α s pomanjkanjem AGS KD celic v primerjavi z HIF-1 a-kompetentni celic.}

kemoterapije senescenco in apoptoza tako so tesno povezana z supresorski tumorja p53
. Tako smo predpostavili, da je p53 bi lahko prispevale k obogateno citotoksičnosti 5-FU ob izgubi HIF-1 a. Po obdelavi 5-FU, protein p53 postopoma nabrali v AGS celicah, učinek, ki se je presenetljivo izboljšano v AGS celicah HIF-1 a-pomanjkanjem (Slika 2D). Stabilizacija p53 je bila povezana s povečano stopnjo zaviralcev p21 ciklinsko odvisna kinaza (CDK), uveljavljenim transkripcijske ciljem in nadaljnji efektor p53 s funkcijami v ustavitev celičnega cikla, staranje indukcijo in apoptozo (slika 2D). Spet HIF-1 a-pomanjkanjem AGS celice so pokazali izrazito močnejše povečanje p21 kot AGS celic HIF-1 a-obvladajo. Močno indukcijo p21 se pričakuje, da inhibira aktivnost G _{1 ciklin /CDK kompleksi, kar hypophosphorylation za retinoblastom beljakovin (PRB) in nezmožnost inducira S fazo ciklini, npr ciklin A. Dejansko je tako pRb hypophosphorylation in znižane stopnje ciklin A so bili potrjeni v 5-FU, zdravljenih AGS KD celic in - v manjši meri - tudi v letnem pregledu rasti SCR celice (slika 2D). Te spremembe potrjujejo zadrževanje G 1 fazni opaziti v histogramov DNK in so v skladu z nepovratno G 1 aretacijo opazili v staranje kemoterapije. Tako različni biološki rezultati zdravljenja 5-FU v HIF-1α s pomanjkanjem in -proficient AGS celic izhajajo iz diferencialne ureditve p53 in njenega nadaljnjega ciljno p21.}

Inaktivacija p53 blunts vlogo HIF-1 a za chemosensitivity

za pridobitev eksperimentalne dokaze za predlagano vlogo p53 v HIF-1 a-posredovano ureditev chemosensitivity v AGS celicah, smo funkcionalno inaktivirano p53 s RNA interference uporabi prehodno transfekciji anti-p53 siRNA (SI p53) ali zakodirane nadzor siRNA (si sCR). P53 je učinkovito podrli, kot kaže neuspeh transficiranih celic za sprožanje na p53 efektor p21 in Mdm2 odziv na 5-FU zdravljenja (slika 3A). Zanimivo je, da so bili AGS KD transfektiranih s: si p53 bistveno manj dovzetni za inhibicijo rasti za 5-FU kot AGS KD celic transfekciji s kontrolno siRNA (Slika 3B). V skladu s temi ugotovitvami, so G zadrževanje cikel _{1 celic in apoptoza 5-FU, zdravljenih AGS KD celicah zmanjša za p53 rasklapanje v primerjavi s celicami transfekciji s kontrolno siRNA (slika 3D in 3E). V ostrem nasprotju, chemosensitivity od AGS celic HIF-1 a-obvladajo ni vplivala inaktivacijo p53 (slika 3C).}

HIF-1α ne vpliva chemosensitivity v P53
mutiranih celic

za potrditev ureditev HIF-1 a-odvisno od 5-FU odzivnost ter nadaljnjo opredelitev prispevka p53, smo pregledali še eno človeško želodčni rak celične linije (MKN28), ki nosi missense mutacijo v TP53
na kodonu 251. Zanimivo je, da brisanje HIF-1 a v MKN28 celicah ni uspelo povečati zaviranje rasti po izpostavljenosti 5-FU (slika 4A). Podobno, 5-FU povzroča G _{1 kopičenje in apoptozo MKN28 celic ni vplivala izguba HIF-1 a (slika 4B in 4C). V skladu s temi ugotovitvami, raven beljakovin za p53 in PRB v 5-FU, zdravljenih MKN28 celic ostale nespremenjene v celotnem obdobju 24 h, in indukcija p21 je bil odsoten (slika 4D). Vendar, če je funkcija p53 obnovil predobdelave s kemijsko spojino PRIMA-1 [24] HIF-1α razgradljiv prevedena v bistveno izboljšano 5-FU citotoksičnosti (Slika S3). Skladne z uveljavljeno vlogo p53 v citotoksičnih kemoterapije /citostatiki učinki, zdravljenje z PRIMA-1 per se
nekoliko zmanjšano proliferacijo MKN28 celic in bistveno izboljšano učinkovitost 5-FU v MKN28 celice (Slika S3).}

NF-κB je pomemben posrednik vloge HIF-1 a pri chemosensitivity

Aktivacija NF-κB je povezana z zaščito pred apoptozo kemoterapije in obratno, inhibicijo NF -κB lahko poveča učinkovitost proti novotvorb tako in vivo
in in vitro
[25] - [27]. Zato smo ugotovili NF-κB DNA-vezavno aktivnost v HIF-1α s pomanjkanjem in -proficient AGS celic po zdravljenju s 5-FU, ki ga elektroforetsko izmensko mobilnost testom (EMSA). Zdravljenje s 5-FU močno aktivirajo NF-κB DNA veže v AGS SCR celicah, z najvišjih ravni, ki se pojavljajo 6 ur po izpostavljenosti 5-FU (slika 5A). Zdravljenje z TNFa za 4 h služil kot pozitivno kontrolo za aktivacijo NF-κB. Poleg tega je bil superpremikom jih povzroča protitelesa anti-p65, ki potrjuje, da je 5-FU induciranih NF-κB kompleksi vsebovala 65-kDa podenote (p65). Izguba HIF-1 a močno inhibirana aktivacije NF-κB v odziv na 5-FU in TNFa (Slika 5A). V skladu s tem opazovanjem, 5-FU obravnava tudi ni inducira NF-κB ciljnih genov cIAP1 in A20 v AGS KD celic, medtem ko so bili takoj povzročil v AGS SCR celic (slika 5b).

Za obravnavo funkcionalni pomen NF-κB za 5-FU inducirane inhibicije rasti, smo prekomerno p65 (pcDNA p65) v AGS KD celicah. Transfekcija pcDNA p65, vendar ni prazno kontrolni vektor, povzročila znatno indukcijo p65 proteina in NF-κB transkripcijske aktivnosti v AGS KD celic (slika S4). Pomembno je omeniti, so HIF-1 a-pomanjkanjem AGS KD celice s prekomerno ekspresijo p65 precej bolj odporna na zdravljenje 5-FU v primerjavi z AGS KD celic, transfektiranih s kontrolnim vektorjem (slika 5C), ki je skladen z bistveno vlogo NF-κB v posredovanju chemoresistance proti 5-FU v želodčnih rakavih celic. Skupaj, je sočasno aktivacijo p53 in zaviranje NF-κB v 5-FU obdelani, so opazili HIF-1 a s pomanjkanjem AGS celice. Da bi razčistili, ali sta oba dogodka soodvisni, smo raziskovali 5-FU-inducirano aktivacije NF-κB v MKN28 celic s mutanta p53.
Oba 5-FU in TNFa aktivira NF-κB DNA veže na časovno odvisna od načina, kar kaže na p53-neodvisne mehanizme aktivacije NF-κB za 5-FU (Slika 5D). Vendar pa se razlikuje od ugotovitev v AGS celicah, ta aktivacija NF-κB v P53
celično linijo mutant ni bil posneti s HIF-1α deaktivacijo. Tako lahko HIF-1α podporo kemoterapije aktivacije NF-κB s preprečevanjem p53 odvisna od zaviralnih mehanizmov.

Altered ROS formacija je odgovoren za HIF-1α-inducirane spremembe p53 dejavnosti

pojasniti mehanizem osnovno p53 superinduction molekulsko v 5-FU obdelani HIF-1α-pomanjkanjem celic, smo značilno vlogo reaktivnih kisikovih spojin (ROS). ROS predstavljajo povezavo kandidatke, kot je (i) ROS so močni aktivatorji funkcije p53 in obravnavajo ključni dejavniki indukcijo p53 pri različnih kemoterapevtikov [28], in (ii) HIF-1α lahko zavre nastajanje ROS z zmanjševanjem mitohondrijsko aktivnost in BIOGENESIS [22], [29], [30]. V skladu s tem so bile AGS KD celice obdelamo z ROS zaviralci diphenyleneiodonium klorida (DPI) ali apocynin. Oba zaviralci podeljenih pomembno zaščito pred 5-FU inducirane inhibicije rasti v AGS KD celic (slika 6A in 6B). Poleg tega, DPI in apocynin skoraj popolnoma preprečiti indukcijo p53 in njenega pomena za ciljno p21 v 5-FU obdelanih celic (Slika 6c in 6d). Ti rezultati kažejo na presečišče HIF-1 a signalizacije z-p53 posredovan odgovor na 5-FU na ravni proizvodnje ROS. Ugotoviti vzročno vlogo HIF-1 a za redoks potencial AGS celic po obdelavi 5-FU, so znotrajcelične koncentracije ROS določena v AGS KD in SCR celic s pretočno citometrijo. Ugotovili smo, da so bile znotrajcelične vrednosti superoksid v 5-FU, zdravljenih AGS KD celic 2,5-krat večja kot pri 5-FU, zdravljenih AGS SCR celic (Slika S5), kar kaže, da je funkcionalna inaktivacija HIF-1 a v AGS celic za posledico pomemben in funkcionalno zvišanje znotrajcelične oksidativnega stresa tudi pri kemoterapiji

Pogovor

transkripcijski faktor HIF-1α je uveljavil kot pomemben posrednik, hipoksija posredovano chemoresistance [6] - [8]. [17] [18] [20]. Tukaj smo ugotoviti HIF-1 a kot močan dejavnik chemosensitivity v želodcu rakavih celic pod normoxic pogoji. Z uporabo temelji na lentivirusom siRNA sistem smo kažejo bistveno izboljšan 5-FU in cisplatin toksičnost pri HIF-1 a-pomanjkanjem želodčne rakavih celic. Razpoložljivi podatki o vlogi HIF-1 a za chemosensitivity rakavih celic pod normoxic pogoji so v sporu. Medtem ko je na zaslonu prikazano HIF-1 a pomanjkanjem fibrosarkoma celice (HT1080) znatno povečala občutljivost za etopozidom pod zunanjem zraku, rak debelega črevesa (HCT116) in hepatom (Hepa-1) celice ni storila [6]. Unruh et al.
Poročali večjo dovzetnost HIF-1 a-pomanjkanjem mišje embrionalne fibroblaste do karboplatin ali etopozidom pod normoxic kot tudi hipoksičnih pogojev [8]. V zvezi z rakom želodca, je bila izboljšana učinkovitost 5-FU in vinkristin dokazali pod normoxia in vitro
[18]. No, v skladu z našimi rezultati obeh študij zaključili osrednjo vlogo HIF-1 a pri posredovanju chemoresistance pod normoxic pogoji. Zanimivo je, da je nedavna študija iz Japonske je pokazala nižjo učinkovitost kemoterapije na osnovi 5-FU v HIF-1 a-izražanje človeške želodčne adenokarcinomov, krepitev percepcijo HIF-1 kot ključni dejavnik pri določanju želodca chemoresistance raka [31].

Nadzorna napredovanja raka s kemoterapijo opira vsaj delno na indukcijo celično staranje. Pred kratkim je bila prikazana izguba HIF-1 a, da povzročajo prezgodnje staranje za imortaliziranih mišje embrionalne fibroblaste pod normoxic pogoji [32]. Naš sedanji podatki kažejo, da HIF-1α podobno varuje želodčne rakave celice pred staranjem kemoterapije pod normoxic pogoji. To predstavlja prvo poročilo povišanem staranje kemoterapije preko funkcijsko inaktivacijo HIF-1 a v ugotovljenega raka človeške celične linije. V HIF-1 a pomanjkanjem celic, smo tudi opazili izboljšano apoptozo indukcije v odzivu na 5-FU. Prejšnje študije poročali obuditev proapoptotičnih faktorja Bid [6], ali sprememba v bilanci nih in antiapoptotic Bcl-2 družinskih članov, da predstavljajo povečano stopnjo apoptoze po inaktivacijo HIF-1 a rakavih obolenj želodca celice, obdelane z drogami [ ,,,0],. 18]

Naša trenutna študija opredeljuje mehanizem novo, pri čemer HIF-1α deluje nasproti tako kemoterapijo povzročena senescenco in apoptoza: predstavljamo trdnih dokazov o zmogljivosti HIF-1 a za zatiranje indukcije zaviralnih p53 v odgovor na 5-FU pod normoxic pogojih. P53 je ključna celica usoda dejavnik zaradi svoje vloge pri urejanju potek celičnega ciklusa in apoptozo kot odziv na celični stres in predstavlja najpogosteje mutiran gen človeških raka [33]. Najrazličnejše kemoterapevtikov je pokazalo za stabilizacijo p53 in obratno, izguba p53 predstavlja načelo mehanizma odpornosti raka do kemoterapije [33], [34]. Interakcija p53 in HIF-1 a je bil predmet dolgotrajnih razprav, kot so bile pozitivne in negativne poročila objavljena [35]. Vendar pa je celotna že objavljeno delo osredotočeno na p53-HIF-1 a-interakcije pod hipoksično (ali celo anoksično) pogojih. Kolikor nam je znano, so naši poskusi prvič predložiti dokaze za zatiranje p53 dejavnosti s HIF-1 a pod normoxic pogoji. Kot posledica p53 uravnavanjem v HIF-1 a pomanjkanjem celicah, smo opazili spremembe v spodnjem toku efektor, ki so povezane z nepovratno celičnega cikla za prijetje, značilnih za staranje, npr stabilizacija p21 in hypophosphorylation za PRB. Razlikuje od našega opazovanja, nedavna dela na chemoresistance proti etopozidom v HIF-1α s pomanjkanjem imortaliziranih mišje embrionalne fibroblaste ni opaziti indukcijo p21 [36]. Tudi HIF-1α stabiliziran p21 in p27 kot tudi v času, hipoksija povzroča rast aretacijo imortaliziranih mišje embrionalne fibroblaste in osnovnih vranici limfocitov B [37] privedla do hypophosphorylation za PRB. Te nasprotujoče si rezultate, najverjetneje pojasniti z preiskanih tipov celic: Medtem ko Goda et al
. značilna je fiziološki odziv na hipoksijo v vrstah niso spremenili celic, smo analizirali odziv na hude poškodbe DNK v urejenih raka celičnih linijah.

Medtem ko je p53 večkrat izkazale za preprečevanje funkcijo NF-κB [38], [39 ], naši trenutni podatki kažejo na vlogo supresorski tumorja pri urejanju HIF-1 a odvisna od aktivacije NF-κB. Poleg p53, je NF-κB pojavila kot drugi, osrednji dejavnik odpornosti proti kemoterapevtikov [40]. Številne različne študije so vzpostavile funkcionalne povezave med NF-κB in HIF-1 a, čeprav se prilagaja postaviti HIF-1 a ali gorvodno od NF-κB ali obratno. Na primer, stabilizator, hipoksija povzročena z HIF-1 a v gladkih mišičnih celic, pod prepisovalno kontrolo NF-κB [41]. Podobno, rezultati pridobljeni iz pogojnih IKK-beta knockout miših potrdil osrednjo vlogo NF-κB pri nadzoru bazalno in izražanja, hipoksije inducirano HIF-1 a in vivo
[42]. Nasprotno pa je bila dokazana izražanje genov za podenoto p65 NF-κB biti pod nadzorom HIF-1 a v kontekstu, hipoksija zatreti apoptoze nevtrofilcev [43]. Naša ugotovitev bistveno zmanjšane aktivnosti NF-κB v HIF-1 a-pomanjkanjem celic ob zdravljenju s 5-FU, zato je tudi v skladu s tem zadnjem poročilu. Zanimivo je, da smo opazili tudi bistveno zmanjšano DNA vezavo NF-κB podenot v celicah HIF-1α s pomanjkanjem po stimulaciji z TNFa, dobro uveljavljeno induktor NF-κB dejavnosti [44]. To sproža ustrezne vprašanje, pod katerimi je fizioloških in patofizioloških stanj HIF-1α mogli urediti aktivacije NF-κB. HIF-1α in NF-κB deliti odločilen pomen za različne postopke, kot so vnetja, mikrobiološkega ubijanjem in tumorigeneze. Natančna molekularne narave kot je hierarhija njihove interakcije najverjetneje celično in vsebinsko odvisne in jih ni mogoče posplošiti.

V sedanji raziskavi smo uspeli izslediti ROS kot stičišče HIF- 1 a s-p53 posredovana celičnega odziva telesa na stres na kemoterapijo. Intracelularni ROS so znani kot močnih induktorjev p53 in sodelujejo pri aktiviranju p53 ga citostatikov [45]. Mitohondriji predstavljajo glavni vir znotrajcelične ROS [46], in HIF-1α verjetno preprečuje nastajanje ROS na mitohondrijske ravni prek različnih mehanizmov, vključno z zaviranjem mitohondrijev BIOGENESIS in piruvata shuttling v mitohondrije, zmanjšanje mitohondrijske aktivnosti zaradi okrepljenega uporabe glikolize in aktiviranje mitohondrijske avtofagija [29], [30], [47], [48]. Prej smo ugotovili, funkcionalno povezavo med HIF-1α-nadzorovano zmanjšanje ROS in pritrditve neodvisnosti želodčne rakavih celic [22], implicating HIF-1 a v patogenezi raka želodca v odsotnosti hipoksijo. Zdaj ugotovili, da zmogljivosti, ki se od HIF-1 a omejiti ROS nastajanje želodčne rakavih celic daje tudi odpornost na kemoterapevtiki, ki delujejo preko aktivacije p53 (slika 6E). Zanimivo je, da so poročali tudi o povečani učinki na odpornosti terapijo prek modulacije p53 in ROS za HIF-2α [49]. HIF-a izooblike 1 in 2 kažejo veliko prekrivanje domnevne cilje HIF in vezavo na hipoksičnih odzivanja in dokončno dodelitev učinkov, hipoksijo povzročena na obeh izooblike ni vedno accomplishable [50]. Bertout et al.
Pokazale, da inhibicijo HIF-2α poveča apoptozo sevanja povzroča prek akumulacije ROS in kasnejše bogatenja p53 dejavnosti [49]. Poleg tega, Roberts et al.
Je pokazala, da je odpor proti kemoterapijo delno posreduje HIF-2α posredovano zatiranja p53 s karcinomom ledvičnih celic celic [51]. Zato je treba z njo poročali ugotovitve upravičujejo preiskavo o potencialni vlogi HIF-2α, naloge, ki trenutno poteka v našem laboratoriju.

Glede na klinične potrebe za določitev odzivne predvidevanja razpoložljive možnosti zdravljenja, naše Rezultati bi odločitve lahko neposredna obdelava: na eni strani, poznavanje HIF-1 a prekomerno lahko neposredno izbiro zdravil, ki v veliki meri delujejo na p53 neodvisen način. Po drugi strani pa je lahko posebej koristna izhajajo iz kombiniranja HIF-1-inhibitorjev in sredstva za poškodovanje DNK (npr 5-FU), pri rakih s funkcionalnim p53. Nasprotno pa bi lahko pričakovali zmanjša učinkovitost HIF-1 inhibitorjev za zdravljenje napako tumorjev p53, vidik, ki lahko pomenijo moteč dejavnik v kliničnih preskušanjih HIF-1 a-zaviranjem režime obdelave.

Materiali in metode

celične kulture in kemikalije

AGS (CRL-1739, ATCC, Rockville, Maryland, ZDA) in MKN28 (JCRB Cell Bank, Tokio, Japonska) celice smo gojili kot enoslojne kulture v standardnem mediju . Generacija AGS in MKN28 celic stabilno izražajo bodisi siRNA posebej usmerjene HIF-1 a (rasklapanje, "KD") ali nespecifični nadzor siRNA (umešana, "SCR") je bil že objavljen [22]. 5-fluorouracil (5-FU), cis-Diammineplatinum (II) diklorid (cisplatina) in superoksid inhibitorji anione diphenyleneiodonium klorid (DPI) in apocynin bili kupljeni pri Sigma-Aldrich (Nemčija) in raztopimo v DMSO. PRIMA-1 (pri p53-reaktivacijo in indukcijo apoptoze masivne) dobimo iz Tocris Biosciences (Ellisville, Missouri, ZDA) in raztopili v sterilni vodi. krmiljenje vozila topil je bil vključen v vseh poskusih.

Cell proliferacijo vsebnosti

Za določanje celične rasti, 3 x 10 ^{4 Celice smo zasejali v trojniku v 24-vdolbinami, pustimo pritrditev za 16 h in nato obdelamo, kot je navedeno pod normoxic ali hipoksičnih pogojih. Po obdelavi tripsiniziramo celice in izvedljivih celice preštejemo ob uporabi hemocitometer.}

Določitev porazdelitve celičnega cikla in apoptozo s pretočno citometrijo

Cell porazdelitve cikla, vključno s pre-G _{1 frakcijo smo določili iz histogramov DNA, kot je opisano [52]. Apoptoza kvantitativno tudi odkrivanje aktiven, razklani kaspaze-3 s pretočno citometrijo uporabo Alexa Fluor® 488-konjugirano protitelesa (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, ZDA).}

Količinska staranje

-staranjem povezano aktivnost β-galaktozidaza so ocenjevali v cytospin pripravkov, kot je opisano v [53].

Imunoblot analiza

Cela lizati celic smo pripravili, kot je opisano prej [52], nato pa ločimo na 10% natrijev dodecil sulfat, poliakrilamid gel in prenesli na nitrocelulozo (Amersham Biosciences, Freiburg, Nemčija). Prepivke zaznati s protitelesi proti p53 in CDK2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, ZDA), P21 (onkogena Research Products, Bad Soden, Nemčija), ciklin A (Upstate, Temecula, California, ZDA), PRB (BD Pharmingen , Heidelberg, Nemčija), Mdm2 (Calbiochem, San Diego, California, ZDA), p65 (Cell signalizacija Technology) in aktin (Sigma-Aldrich). Sekundarna protitelesa konjugirana s hrenovo peroksidazo (Dianova, Hamburg, Nemčija) in aktivnosti peroksidaze smo vizualizirali s pomočjo zahodne Lightning Kemiluminescenca Reagent Plus (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, Massachusetts, ZDA).

Kvantitativni PCR v realnem času analiza

Za realnem času analize PCR, se je celotni celični RNA, pridobljeni z Trizol reagenta (Invitrogen, Karlsruhe, Nemčija). Najprej cDNA sklop smo sintetizirali z oligo (dT) temelj in z eksponentom ™ prve Strand zbirnega sistema (Invitrogen). Kvantitativni PCR v realnem času analiza je bila narejena s pomočjo TaqMan PCR Universal izhodiščne (za beta-aktin) ali SYBR GREEN PCR Master Mix (za A20 in cIAP1, Applied Biosystems, Darmstadt, Nemčija). Primer zaporedja so na voljo v tabeli S1. Normalizirati zneska vstopnega RNA, so PCR reakcije končali s sondo in primerji za beta-aktin.

prehodna transfekciji in reporter luciferazni test

prehodno transfekcije za AGS celic so bile izvedene z uporabo Effectene transfekciji reagent (Qiagen, Hilden, Nemčija) po protokolu proizvajalca. Za študij overexpression smo celice zasejali na 3 x 10 ^{4 celic /24-dobro in transfekciji s 100 ng pcDNA HIF-1 a (prijazno, ki jih Wanja Bernhardt, Universitätsklinikum Erlangen, Erlangen, Nemčija) ali pcDNA p65 (sami pripravili s Hiroyasu Nakano, Jutendo University, Tokyo, Japonska), oz. Za HRE ali NF-κB luciferazni test, 3 x 10 4 celic /24-dobro je bilo sodelovanje transficirane s 100 ng pHRE-Luc (darilo od Randall S. Johnson, UCSD, San Diego, Kalifornija, ZDA) ali IgκB-Luc (darilo od Florian R. Greten, Technische Universität München, München, Nemčija), in 30 ng phRL-null (Promega, Mannheim, Nemčija). Merimo luciferazno aktivnost z dvojno luciferazni Reporter Vsebnost System (Promega), kot je opisano [54]. Da bi dosegli prehodno zatiranje p53, so AGS celice transficirane na 30% sotočja z 75 ali 150 nmol /l Si p53, ( Silencer
Izberite siRNA, Applied Biosystems) in analizirali 48 ur po transfekciji. Ne-specifični siRNA (si SCR, Eurogentec, Seraing, Belgija) smo uporabili kot kontrolo.}

Elektroforetskimi premik mobilnosti test (EMSA)

Nuklearne ekstrakte proteinske smo pripravili, kot je opisano [54]. EMSA je bila izvedena kot je opisano prej [55] z uporabo 8 ig jedrske beljakovin in 100 fmol /L končnega-radioaktivno označen 22 bp dvojno vijačnico NF-κB soglasje oligonucelotide (prednjega sklopa: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C- 3 ', E3292, Promega).

• Plos ONE: Naj-7 MicroRNA Family selektivno Izločeni v zunajcelični okolje preko eksozomov, prostazomov v celični liniji metastatskega želodca raka
• Plos ONE: Visoka Raznolikost Vaca cagA Helicobacter pylori genotipov pri bolnikih z in brez želodca raka