PLoS ONE: Hypoksi-induserbar faktor 1α Bestemmer Gastric Cancer kjemosensitivitet via Modulation av p53 og NF-kB

Abstract

Bakgrunn

Redusert kjemosensitivitet av solide kreftceller representerer en sentral hindring i klinisk onkologi. Derfor, den molekylære karakterisering av reaksjonsveier som regulerer kjemosensitivitet er en sentral forutsetning for å forbedre cancerterapi. Den hypoksi-induserbar faktor HIF-1α har vært knyttet til kjemosensitivitet mens de underliggende molekylære mekanismene fortsatt i stor grad unnvikende. Derfor har vi omfattende analysert HIF-1α rolle i å bestemme kjemosensitivitet fokus på ansvarlige molekylære stier.

Metodikk og hovedfunnene

RNA interferens ble brukt for å inaktivere HIF-1α eller p53 i den menneskelige magekreft cellelinjer AGS og MKN28. Den kjemoterapeutiske midler 5-fluorouracil og cisplatin ble anvendt og kjemosensitivitet ble bestemt ved proliferasjonsanalyser celle, så vel som bestemmelse av cellesyklusfordeling og apoptose. Ekspresjon av p53 og p53 target-proteiner ble analysert ved hjelp av western blot. NF-kB aktivitet ble karakterisert ved hjelp av elektroforetisk mobilitet skift analyse. Inaktivering av HIF-1α i magekreftceller resulterte i robust heving av kjemosensitivitet. Følgelig viste HIF-1a-kompetente celler som en betydelig reduksjon av kjemoterapi-indusert alderdom og apoptose. Bemerkelsesverdig, dette fenotype var helt fraværende i p53
mutante celler mens inaktivering av p53 per se
påvirket ikke kjemosensitivitet. HIF-1α markert undertrykket kjemoterapi-indusert aktivering av p53 og p21, så vel som retinoblastom-protein, eventuelt resultere i cellesyklus-stans. Redusert dannelse av reaktive oksygenarter i HIF-1α-kompetente celler ble identifisert som den molekylære mekanisme av HIF-1α-mediert inhibering av p53. Videre er tapet av HIF-1α opphevet, i et p53-avhengig måte, kjemoterapi-indusert DNA-binding av NF-kB og ekspresjon av anti-apoptotiske NF-kB målgener. Følgelig rekonstituering av NF-kB subenheten p65 snudd den økte kjemosensitivitet av HIF-1a-manglende celler.

Konklusjon og betydning

I sammendraget, identifiserte vi HIF-1α som en potent regulator av p53 og NF-kB aktivitet under forhold med gentoksisk stress. Vi konkluderer med at p53
mutasjoner i humane svulster har potensial til å forvirre effekt av HIF-1-hemmere i kreftbehandling

Citation. Rohwer N, Dame C, Haugstetter A, Wiedenmann B , Detjen K, Schmitt CA, et al. (2010) Hypoksi-induserbar faktor 1α Bestemmer Gastric Cancer kjemosensitivitet via Modulation av p53 og NF-kB. PLoS ONE 5 (8): e12038. doi: 10,1371 /journal.pone.0012038

Redaktør: Deb Fox, The Research Institute for barn ved Children Hospital New Orleans, USA

mottatt: 28 april 2010; Godkjent: 19 juli 2010; Publisert: 10 august 2010

Copyright: © 2010 Rohwer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de) til TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 og 133 /2-3), og NR (Graduiertenkolleg 276/4 - "Signalerkennung und -umsetzung"). TC ble også støttet av en bevilgning fra Berliner Krebsgesellschaft E.V. (Http://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Intrinsic og ervervet narkotika motstand er de viktigste årsakene til begrenset effekt av kjemoterapi i de fleste gastrointestinale maligniteter, inkludert magekreft [1], [2]. Legemiddelresistens representerer en kompleks og multifaktoriell fenomen knyttet til svulstens mikromiljø, f.eks hypoksi, acidose og inflammasjon, så vel som den neoplastiske cellen i seg selv [3]. Cellulær resistens kan foreligge i den spesifikke genetiske bakgrunnen til tumorcellen eller resulterer fra mutasjoner og epigenetiske forandringer etter antiproliferativ terapi [4], [5].

transkripsjonsfaktor hypoksi-induserbar faktor 1 (HIF-1 ) utgjør en sentral regulator av cellulær tilpasning til hypoksi og har vært implisert i medikamentresistens [6] - [8]. Den HIF-1-proteinet er en heterodimer som består av et konstitutivt uttrykt β-subenheten (ARNT (aryl hydrokarbon-reseptor atom Translocator)) og en hypoksi-induserbar α-underenheten [9]. Under normoksisk betingelser kan HIF-1α aktiviteten indusert av forskjellige vekstfaktorer, cytokiner, aktiverte onkogener eller tap-av-funksjon muterte tumorsuppressorgener [10]. HIF-1α er sentralt involvert i flere aspekter av tumorgenese, inkludert tumorcelleformering, angiogenese, metastase, såvel som respons på kjemoterapi og radioterapi [11]. HIF-1α er overuttrykt i et stort antall solide svulster, og tumor HIF-1α uttrykk er ofte forbundet med dårlig prognose [12] - [15]. Videre har inhibering av HIF-1α ved hjelp av RNA-interferens eller farmakologiske forbindelser påvist antitumor effekt på forskjellige murine cancermodeller [16]. Et bidrag fra HIF-1α til chemoresistance av neoplastiske celler er blitt observert i et bredt spekter av faste tumorer, inkludert magekreft [6] - [8], [17] - [20]. Men de underliggende molekylære mekanismene samt rollen som HIF-1α for legemiddelresistens i henhold normoksisk forholdene fortsatt i stor grad unnvikende [8], [18], [21]. Her identifiserer vi undertrykkelse av p53 og promotering av nukleær faktor kB (NF-kB) aktivitet som sentrale mekanismer for HIF-1α følsomhet bestemmende rolle mot 5-fluorouracil (5-FU) og cisplatin i menneskelige mage kreftceller.

Resultater

HIF-1α bestemmer følsomheten av magekreftceller mot kjemoterapeutika 5-FU og cisplatin

Funksjonell inaktivering av HIF-1α ble oppnådd ved lentiviral transduksjon av AGS og MKN28 celler med lite interfering RNA (siRNA) spesifikt rettet mot HIF-1α. Dette eksperimentell tilnærming ga en svært effektiv knockdown demonstrert ved en nær fullstendig svikt av transduserte celler for å indusere HIF-1α protein som respons på hypoksi som er publisert tidligere [22]. For å evaluere betydningen av HIF-1α for sensitiviteten av humane magecancerceller mot etablerte kjemoterapeutiske midler, sammenlignet vi effektene av 5-FU og cisplatin i HIF-1α-kompetent (scrambled "SCR") og HIF-1α-mangel (knockdown, "KD") AGS celler. Funksjonell inaktivering av HIF-1α skiftet avhengighet dose av veksthemming mot lavere legemiddelkonsentrasjoner (Figur 1A og Figur S1), noe som tyder på at HIF-1α er i stand til å redusere kjemoterapi mottakelighet av magekreftceller i henhold normoksisk forhold. I samsvar med tidligere rapporter [6] - [8], [17], [18], eksponering for hypoksi øket motstand mot 5-FU i AGS-celler, men inaktivering av HIF-1α resulterte i sterk økning av kjemosensitivitet henhold hypoksiske betingelser ( Figur S2). På en komplementær måte, studerte vi konsekvensene av overekspresjon HIF-1α (pcDNA HIF-1α) for kjemosensitivitet av AGS-celler. AGS celler som overuttrykker HIF-1α var betydelig mer motstandsdyktig mot behandling med 5-FU (figur 1B). Stabil HIF-1α uttrykk ble bekreftet av HRE (hypoksi responsive element) luciferase reporter analysen (figur 1C). Disse resultatene antyder sterkt at HIF-1α begrenser cytotoksisk effekt av 5-FU og cisplatin i menneskelige mage kreftceller og at inaktivering av HIF-1α kan ha gunstige effekter på kjemosensitivitet.

HIF-1α begrensninger kjemoterapi-indusert cellesyklus og apoptose via undertrykkelse av p53

Vi startet en karakterisering av den observerte veksthemming ved å analysere cellesyklus distribusjonsmønstre etter kjemoterapi. G _{1-synkronisert, serum-sultet AGS-celler ble frigjort fra G 0 /G 1 fase ved tilsetning av serum og cellesyklus-profiler ble bestemt etter tilsetning av 5-FU. Utgitt kulturer av ubehandlede AGS lett kommet gjennom G 1 i S og G 2 /M-fasene [22], mens 5-FU-behandlede celler forble i G en fase (ikke vist). Interessant, 5-FU-avhengige oppbevaring av cellene i G 1 fase ble sterkt utvidet i AGS KD forhold til AGS SCR celler, i samsvar med G en cellesyklus arrest (figur 2A). Irreversible cellesyklus arrest har dukket opp som en viktig virkningsmekanisme av antiproliferative midler og er preget av cellulære funksjoner i senescence [7], [23]. Følgelig ble den fraksjon av senescent celler bestemmes. Faktisk, behandling med 5-FU ført til et robust induksjon av alderdom i AGS celler. Dette svaret ble betydelig forbedret i celler med samtidig tap av HIF-1α (figur 2B). Videre er induksjon av apoptose ble foreslått ved et øket pre G en fraksjon i DNA-histogrammer av 5-FU-behandlede AGS KD-celler (ikke vist). Derfor ble en kvantitativ analyse av apoptotisk cellefraksjon erholdt basert på påvisning av spaltet caspase-3 (figur 2C). I samsvar med spesifikasjonene på cellesyklus distribusjon, ble 5-FU-indusert apoptose brøkdel betydelig økt i HIF-1α-manglende AGS KD celler sammenlignet med HIF-1a-kompetente celler.}

Kjemoterapi-indusert senescence og apoptose begge har blitt nært knyttet til tumor suppressor p53
. Således hypotese vi at p53 kan bidra til øket cytotoksisiteten av 5-FU ved tap av HIF-1α. Etter 5-FU behandling, p53-protein gradvis akkumuleres i AGS-celler, en virkning som ble påfallende forbedret i HIF-1a-manglende AGS-celler (figur 2D). Denne stabilisering av p53 var forbundet med økte nivåer av den cyklin-avhengige kinase (CDK) inhibitor p21, et veletablert mål transkripsjonen og nedstrøms effektor av p53 med funksjoner i cellesyklus-stans, begynnende alderdom induksjon og apoptose (figur 2D). Igjen, HIF-1a-mangel AGS celler viste en markert sterkere økning i p21 enn HIF-1a-dyktigere AGS celler. Sterk induksjon av p21 er ventet å inhibere aktiviteten av G _{1 cyklin /CDK-komplekser, noe som resulterer i hypofosforylering av retinoblastom protein (pRb) og manglende evne til å indusere S-fasen sykliner, f.eks cyclin A. Faktisk både pRb hypofosforylering og reduserte cyklin A-nivåer ble bekreftet i 5-FU-behandlede AGS KD celler og - i mindre grad - også i AGS SCR-celler (figur 2D). Disse endringene underbygge G 1 fase oppbevaring observert i DNA-histogram og er i samsvar med irreversible G 1 arrest observert i kjemoterapi-indusert alderdom. Dermed de ulike biologiske utfall av 5-FU behandling i HIF-1α-mangelfulle og -proficient AGS celler oppstår fra differensial regulering av p53 og dens nedstrøms mål p21.}

Inaktivering av p53 blunts rollen som HIF-1α for kjemosensitivitet

for å få eksperimentelle bevis for den foreslåtte rollen p53 i HIF-1α-mediert regulering av kjemosensitivitet i AGS celler, vi funksjonelt inaktivert p53 av RNA interferens hjelp transient transfeksjon av anti-p53 siRNA (si p53) eller en kryptert kontroll siRNA (si SCR). P53 var effektivt slått ned, som angitt ved svikt i de transfekterte cellene for å indusere p53 effektorer p21 og MDM2 som respons på 5-FU behandling (figur 3A). Interessant, AGS KD celler transfektert med si p53 var betydelig mindre utsatt for veksthemming av 5-FU enn AGS KD celler transfektert med kontroll siRNA (figur 3B). I samsvar med disse funn ble G _{en cellesyklus retensjon og apoptose av 5-FU-behandlede AGS KD-celler reduseres med p53 knockdown sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA (figur 3D og 3E). I skarp kontrast, ble kjemosensitivitet av HIF-1a-dyktigere AGS celler påvirkes ikke av inaktivering av p53 (figur 3C).}

HIF-1α unnlater å påvirke kjemosensitivitet i p53
mutante celler

for å bekrefte HIF-1α avhengig regulering av 5-FU respons og for ytterligere å karakter bidrag av p53, undersøkte vi en andre menneskelige magekreft cellelinje (MKN28), som bærer en missense mutasjon i TP53
i kodon 251. det er interessant delesjon av HIF-1α i MKN28 celler mislyktes i å forbedre veksthemming etter eksponering for 5-FU (figur 4A). Tilsvarende 5-FU-indusert G _{en opphopning og apoptose av MKN28 celler ble ikke påvirket av tap av HIF-1α (figur 4B og 4C). I samsvar med disse funn protein nivåene av p53 og pRb forble uendret i 5-FU-behandlede MKN28 celler i hele 24 timers perioden, og p21 induksjon var fraværende (figur 4D). Imidlertid, når p53-funksjon ble gjenopprettet ved forbehandling med den kjemiske forbindelse PRIMA-1 [24] HIF-1α knockdown settes til en betydelig forbedret 5-FU cytotoksisitet (fig S3). I samsvar med etablerte rollen p53 i kjemoterapi-indusert cytotoksisk /cytostatisk effekt, behandling med PRIMA-en per se
noe redusert spredning av MKN28 celler og betydelig forbedret effekt av 5-FU i MKN28 celler (Figur S3).}

NF-kB er en viktig mediator av HIF-1α rolle i kjemosensitivitet

Aktivering av NF-kB er forbundet med beskyttelse mot kjemoterapi-indusert apoptose og omvendt, inhibisjon av NF -κB kan forbedre effektiviteten av anti-neoplastiske midler både in vivo
og in vitro product: [25] - [27]. Derfor fant vi ut NF-kB DNA-bindende aktivitet i HIF-1α-mangelfulle og -proficient AGS celler etter behandling med 5-FU ved elektromobilitet shift analyse (EMSA). Behandling med 5-FU potent aktivert NF-kB DNA-binding i AGS SCR celler, med topp nivå oppstår seks timer etter eksponering for 5-FU (figur 5A). Behandling med TNFa i 4 timer tjente som positiv kontroll for aktivering av NF-kB. Videre ble en supershift indusert av et anti-p65-antistoff, noe som bekrefter at 5-FU indusert NF-kB-komplekser inneholdt det 65-kDa subenhet (p65). Tap av HIF-1 a signifikant inhiberte aktiveringen av NF-kB som respons på 5-FU og TNFa (figur 5A). I samsvar med denne observasjonen, 5-FU behandling også mislyktes i å indusere NF-kB målgener cIAP1 og A20 i AGS KD celler, mens de ble lett indusert i AGS SCR celler (figur 5B).

For å adressere funksjonelle betydningen av NF-kB for 5-FU-indusert veksthemming, overuttrykt vi p65 (pcDNA p65) i AGS KD celler. Transfeksjon av pcDNA p65, men ikke den tomme kontrollvektor, resulterte i en signifikant induksjon av p65 protein og NF-kB transkripsjonen aktivitet i AGS KD celler (figur S4). Av notatet, HIF-1a-manglende AGS KD-celler som overuttrykker p65 var betydelig mer resistente mot 5-FU-behandling sammenlignet med AGS KD celler transfektert med kontroll-vektor (figur 5C), i samsvar med en essensiell rolle av NF-kB i mediering chemoresistance langs 5-FU i magekreftceller. Tatt sammen, en samtidig aktivering av p53 og inhibisjon av NF-kB i 5-FU-behandlede, HIF-1a-manglende AGS-celler ble observert. For å klargjøre, om begge hendelsene er avhengige av hverandre, vi studerte 5-FU-indusert NF-kB aktivering i MKN28 celler med mutant p53.
Både 5-FU og TNFa aktivert NF-kB DNA-binding i en tids avhengig måte, som indikerer p53-uavhengige mekanismer for NF-kB-aktivering av 5-FU (figur 5D). Men forskjellig fra funn i AGS celler, dette NF-kB aktivering i p53
mutant cellelinje ble ikke avstumpet av HIF-1α inaktivering. Dermed kan HIF-1α støtte kjemoterapi-indusert NF-kB aktivering ved å motvirke p53 avhengig hemmende mekanismer.

Altered ROS formasjonen er ansvarlig for HIF-1α-indusert endring av p53 aktivitet

Å klargjøre den molekylære mekanismen som ligger bak p53 superinduction på 5-FU-behandlede HIF-1α-manglende celler, karakterisert vi rollen av reaktive oksygenarter (ROS). ROS utgjør en kandidat kobling som (i) ROS er potente aktivatorer av p53-funksjon og anses viktige faktorer i induksjon av p53 av ulike cytostatika [28], og (ii) HIF-1α kan undertrykke ROS generasjon ved å redusere mitokondrie aktivitet og biogenesis [22], [29], [30]. Følgelig ble AGS KD celler forbehandlet med ROS-hemmere diphenyleneiodonium klorid (DPI) eller apocynin. Hemmer begge overdratt betydelig beskyttelse mot 5-FU-indusert veksthemming i AGS KD-celler (figur 6A og 6B). Videre DPI og apocynin nesten fullstendig forhindret induksjon av p53 og dets nedstrøms mål p21 på 5-FU-behandlede celler (figur 6C og 6D). Disse resultatene tyder på et skjæringspunkt mellom HIF-1α signalering med p53-mediert respons på 5-FU på nivået av ROS produksjon. Å etablere en årsaks rolle HIF-1α for redokspotensial av AGS celler etter 5-FU behandling, ble intracellulære ROS-nivåer bestemt i AGS KD og SCR celler ved flowcytometri. Vi fant at intracellulære superoksyddannende nivåer i 5-FU-behandlede AGS KD celler var 2,5 ganger høyere enn i 5-FU-behandlede AGS SCR celler (figur S5), noe som indikerer at funksjonell inaktivering av HIF-1α i AGS celler resulterte i betydelig og funksjonell heving av intracellulær oksidativt stress selv under kjemoterapeutisk behandling

Diskusjoner

transkripsjonsfaktor HIF-1α er etablert som viktig formidler av hypoksi-mediert chemoresistance [6] -. [8] , [17], [18], [20]. Her identifiserer vi HIF-1α som en kraftig determinant av kjemosensitivitet i magekreftceller i henhold normoksisk forhold. Ved å bruke et lentivirus-basert siRNA system viser vi betydelig forbedret 5-FU og cisplatin toksisitet i HIF-1a-mangel mage kreftceller. Tilgjengelige data om rollen til HIF-1α for kjemosensitivitet av kreftceller i henhold til normoksisk forhold er motstridende. Mens HIF-1a-mangel fibrosarkom celler (HT1080) vises betydelig forbedret følsomhet overfor etoposid etter luften, tykktarmskreft (HCT116) og hepatoma (Hepa-1) celler klarte å gjøre det [6]. Unruh et al.
Rapporterte økt mottakelighet for HIF-1a-mangel murine embryonale fibroblaster til karboplatin eller etoposid henhold normoksiske samt hypoksiske forhold [8]. Med hensyn til magekreft, ble forsterket effekt av 5-FU og vinkristin vist nedenfor normoxia in vitro product: [18]. Vel i tråd med våre resultater, både studier konkluderte en sentral rolle for HIF-1α i formidling chemoresistance henhold normoksisk forhold. Interessant, en fersk studie fra Japan viste lavere effekt av 5-FU-basert kjemoterapi i HIF-1α-uttrykke menneskelige mage adenokarsinomer, styrke oppfatningen av HIF-1 som en avgjørende faktor i fastsettelsen av magekreft chemoresistance [31].

Kontroll av kreft progresjon av kjemoterapi er avhengig i det minste delvis på induksjon av mobilnettet senescence. Nylig, tap av HIF-1α ble vist å føre til for tidlig alderdom av udødelig murine embryonale fibroblaster etter normoksisk forhold [32]. Vår nåværende data tyder på at HIF-1α tilsvar vokter magekreftceller mot kjemoterapi-indusert senescence henhold normoksisk forhold. Dette utgjør den første rapporten om forhøyet kjemoterapi-indusert senescence via funksjonell inaktivering av HIF-1α i et etablert human kreftcellelinje. I HIF-1a-manglende celler, vi også sett forbedret apoptoseinduksjon i respons til 5-FU. Tidligere studier har rapportert en reaktivering av proapoptotiske faktor Bud [6], eller en endring i balansen mellom pro- og antiapoptotic BCL-2 familiemedlemmer til å ta høyde for økt apoptose priser følgende inaktivering av HIF-1α i narkotika-behandlede magekreftceller [ ,,,0],. 18]

studien identifiserer en ny mekanisme, hvorved HIF-1α motvirker både kjemoterapi-indusert alderdom og apoptose: Vi presenterer avgjørende bevis for kapasiteten av HIF-1α å undertrykke induksjon av p53 tumor suppressor som respons på 5-FU i henhold til normoksisk betingelser. P53 er en sentral celle skjebne determinant på grunn av sin rolle i regulering av cellesyklusprogresjon og apoptose som reaksjon på cellulært stress, og utgjør den mest vanlige muterte genet i humane cancere [33]. Et bredt utvalg av kjemoterapeutiske midler ble vist å stabilisere p53 og omvendt, tap av p53 utgjør et prinsipp mekanisme av kreft resistens mot kjemoterapi [33], [34]. Samspillet mellom p53 og HIF-1α har vært gjenstand for langvarige debatter som både positive og negative rapporter er publisert [35]. Men hele tidligere publiserte arbeidet fokusert på p53-HIF-1a-interaksjoner i henhold hypoksisk (eller til og med anoksisk) betingelser. Så langt vi kjenner til, våre eksperimenter for første gang gi bevis for undertrykkelse av p53 aktivitet ved HIF-1α i henhold normoksisk forhold. Som følge av p53 oppregulering i HIF-1a-manglende celler, observerte vi endringer i nedstrøms effektorer som er knyttet til irreversible cellesyklus arrest karakteristisk for senescence, f.eks p21 stabilisering og hypofosforylering av pRb. Forskjellig fra vår observasjon, gjorde siste arbeidet med chemoresistance mot etoposid i HIF-1α-mangeludødelig murine embryonale fibroblaster ikke observere en induksjon av p21 [36]. Også HIF-1α stabilisert p21 og p27 samt ført til hypofosforylering av pRb under hypoksi-indusert vekst arrestasjonen av udødelig murine embryonale fibroblaster og primære milt-B-lymfocytter [37]. Disse motstridende resultatene er mest sannsynlig forklares av de undersøkte celletyper: Mens Goda et al
. tegnes en fysiologisk respons på hypoksi i ikke-transformerte celletyper, analyserte vi svaret til alvorlig skade på DNA i etablerte kreftcellelinjer.

Mens p53 ble gjentatte ganger vist seg å motvirke NF-kB funksjon [38], [39 ], vår nåværende data indikerer en rolle for tumor suppressor i reguleringen av HIF-1α avhengig NF-kB-aktivering. Bortsett fra p53, har NF-kB dukket opp som en andre, sentral determinant av resistens mot kjemoterapi [40]. Flere forskjellige studier har etablert funksjonelle koblinger mellom NF-kB og HIF-1α, selv om de variabelt plassere HIF-1α enten oppstrøms av NF-kB eller vice versa. For eksempel er hypoksi-indusert stabilisering av HIF-1α i glatte muskelceller under transkripsjonen kontroll av NF-kB [41]. Tilsvarende resultater oppnådd med betinget IKK-p knockout mus bekreftet sentral rolle NF-kB i å kontrollere basal og hypoksi-indusert ekspresjon av HIF-1α in vivo product: [42]. Omvendt, ble genekspresjon av NF-kB subenheten p65 vist å bli styrt av HIF-1α i forbindelse med hypoksi-trykkes apoptose av nøytrofile celler [43]. Vår funn av markert redusert NF-kB aktivitet i HIF-1a-manglende celler ved behandling med 5-FU er derfor vel på linje med denne sistnevnte rapport. Interessant, vi også observert betydelig redusert DNA binding av NF-kB subenheter i HIF-1α-manglende celler etter stimulering med TNFa, et veletablert induser av NF-kB aktivitet [44]. Dette reiser relevant spørsmål under hvilke fysiologiske og patofysiologiske tilstander HIF-1α er i stand til å regulere NF-kB-aktivering. HIF-1α og NF-kB har avgjørende betydning for ulike prosesser, slik som inflammasjon, mikrobiell dreping og tumorigenesis. Den nøyaktige molekylære natur samt hierarkiet av deres samhandling er mest sannsynlig celle- og kontekstavhengig og kan ikke generaliseres.

I denne studien var vi i stand til å finne ROS som et skjæringspunkt HIF- 1a med p53-mediert cellulær stressrespons på kjemoterapi. Intracellulær ROS er kjent som potente induktorer av p53 og deltar i aktivering av p53 ved kjemoterapeutiske medikamenter [45]. Mitokondrier representerer den viktigste kilden til intracellulær ROS [46], og HIF-1α motvirker sannsynlig ROS produksjon på mitokondrienivå via flere mekanismer, inkludert hemming av mitokondriell biogenesis og pyruvat skyt inn i mitokondriene, reduksjon av mitokondriell aktivitet på grunn av økt utnyttelse av glykolyse og aktivering av mitokondrisk autophagy [29], [30], [47], [48]. Tidligere har vi etablert en funksjonell kobling mellom HIF-1α-kontrollert reduksjon av ROS og forankring uavhengighet av magekreftceller [22], impliserer HIF-1α i patogenesen av magekreft i fravær av hypoksi. Vi finner nå at capacitiy av HIF-1α å begrense ROS produksjonen av mage kreftceller også gir resistens mot kjemoterapeutika som fungerer via aktivering av p53 (figur 6E). Interessant, økende effekt på terapien motstand via modulering av p53 og ROS har også blitt rapportert for HIF-2α [49]. De HIF-a isoformene 1 og 2 viser en bred overlapping i putative HIF mål og binding til hypoksiske responselementer og bestemt fordeling av hypoksi-indusert effekter til enten isoform er ikke alltid accomplishable [50]. BERTOUT et al.
Vist at hemming av HIF-2α øker stråling-indusert apoptose via ROS akkumulering og påfølgende styrking av p53 aktivitet [49]. I tillegg Roberts et al.
Viste at motstanden mot kjemoterapi er delvis mediert av HIF-2α-mediert hemming av p53 hos nyrecellekreft celler [51]. Derfor de herved rapportert observasjoner tilsier etterforskning av potensielle rolle HIF-2α, en oppgave som er for tiden i gang i vårt laboratorium.

I lys av den kliniske behov for å identifisere respons prediktorer for behandlingsmåter, vår resultatene kan potensielt direkte behandling beslutninger: på den ene siden, kunnskap om HIF-1α overekspresjon kunne lede et utvalg av legemidler som i stor grad handler i en p53-uavhengig måte. På den annen side kan en spesiell fordel ved å kombinere HIF-1-inhibitorer og DNA-ødeleggende midler (f.eks 5-FU) på kreftformer med funksjonell p53. Motsatt kan en redusert effekt av HIF-1-hemmere forventes for behandling av p53 defekte svulster, et aspekt som kan utgjøre en konfunderende faktor i kliniske studier av HIF-1α hemmende behandlingsregimer.

Materialer og Metoder

Cell kultur og kjemikalier

AGS (CRL-1739, ATCC, Rockville, Maryland, USA) og MKN28 (JCRB Cell Bank, Tokyo, Japan) celler ble dyrket som monolagskulturer i standard medium . Generering av AGS og MKN28 celler som stabilt uttrykker enten siRNA spesielt rettet mot HIF-1α (knockdown, "KD") eller uspesifikke kontroll siRNA (eggerøre, "SCR») ble publisert tidligere [22]. 5-fluorouracil (5-FU), cis-Diammineplatinum (II) diklorid (cisplatin) og superoksydanioner inhibitorer diphenyleneiodonium klorid (DPI) og apocynin ble anskaffet fra Sigma-Aldrich (Tyskland), og oppløst i DMSO. PRIMA-1 (for p53-reaktivering og induksjon av massiv apoptose) ble oppnådd fra Tocris Biosciences (Ellisville, Missouri, USA) og oppløst i sterilt vann. Bærerkontroll av løsningsmidlene ble inkludert i alle forsøk.

celleproliferasjonsanalyse

For bestemmelse av cellevekst, 3 x 10 ^{4 celler ble sådd ut i triplikat i 24-brønners plater, lov til å feste i 16 timer og deretter behandlet som angitt under normoksiske og hypoksiske betingelser. Etter behandling ble cellene trypsinert, og levedyktige celler ble tellet ved bruk av et hemocytometer.}

Bestemmelse av cellesyklusfordelingen og apoptose ved flowcytometri

Cell syklus fordeling inkludert pre-G _{1 fraksjon ble bestemt fra DNA-histogrammer som beskrevet [52]. Apoptose ble også kvantifisert fra påvisning av aktiv, kløyvde caspase-3 av flowcytometri ved hjelp av en Alexa Fluor® 488-konjugert antistoff (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA).}

Kvantifisering av senescence

senescence-assosiert β-galaktosidase-aktivitet ble undersøkt i Cytospin preparater som beskrevet [53].

immunoblotanalyse

Hele cellelysatene ble fremstilt som tidligere beskrevet [52], og deretter løst på en 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel og overført til nitrocellulose (Amersham Biosciences, Freiburg, Tyskland). Blotter ble analysert med antistoffer mot p53 og CDK2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA), p21 (onkogen Forskning Products, Bad Soden, Tyskland), cyclin A (Upstate, Temecula, California, USA), pRb (BD Pharmingen , Heidelberg, Tyskland), MDM2 (Calbiochem, San Diego, California, USA), p65 (Cell Signaling Technology) og aktin (Sigma-Aldrich). Sekundære antistoffer ble konjugert til pepperrotperoksidase (Dianova, Hamburg, Tyskland) og peroxydaseaktivitet ble visualisert ved hjelp av Western Lightning Chemiluminescence Reagens Plus (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA).

kvantitativ real-time PCR analyse

For real-time PCR-analyse, ble totalt cellulært RNA ekstrahert med Trizol reagens (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Første kjede-cDNA ble syntetisert med en oligo (dT) primer og et Superscript ™ First Strand Synthesis System (Invitrogen). Kvantitativ real-time PCR-analyse ble utført ved hjelp av TaqMan PCR Universal Mastermix (for β-aktin) eller SYBR GREEN PCR Master Mix (for A20 og cIAP1, Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland). Primer sekvenser leveres i tabell S1. For å normalisere mengden av inngangs RNA, ble PCR-reaksjoner utført med probe og primere for β-aktin.

Transient transfeksjon og reporter luciferase-assay

Forbigående transfeksjoner av AGS-celler ble utført ved anvendelse av Effectene Transfeksjon reagens (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. For overekspresjon studier ble cellene sådd på 3 × 10 ^{4 celler /24-brønn og transfektert med 100 ng av pcDNA HIF-1α (vennlig levert av Wanja Bernhardt, Universitätsklinikum Erlangen, Erlangen, Tyskland) eller pcDNA p65 (vennlig levert av Hiroyasu Nakano, Jutendo University, Tokyo, Japan), henholdsvis. For HRE eller NF-kB luciferase assay, 3 × 10 4 celler /24-brønnen ble co-transfektert med 100 ng av pHRE-Luc (en gave fra Randall S. Johnson, UCSD, San Diego, California, USA) eller IgκB-Luc (en gave fra Florian R. Greten, Technische Universität München, München, Tyskland), og 30 ng phRL-null (Promega, Mannheim, Tyskland). Luciferase-aktivitet ble målt med den doble luciferase reporter Assay System (Promega) som beskrevet [54]. For å oppnå forbigående p53 undertrykkelse, ble AGS celler transfektert med 30% samløpet med 75 eller 150 nmol /L si p53, ( Silencer
Velg siRNA, Applied Biosystems) og analysert 48 timer etter transfeksjon. En ikke-spesifikke siRNA (si scr, Eurogentec, Seraing, Belgia) ble brukt som kontroll.}

Elektro mobilitet shift analyse (EMSA)

Nuclear proteinekstrakter ble fremstilt som beskrevet [54]. EMSA ble utført som tidligere beskrevet [55] med 8 ug kjerneprotein og 100 fmol /L av ende-radioaktivt merkede 22 bp dobbeltkjedet NF-kB konsensus oligonucelotide (forover tråd: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C- 3 ', E3292, Promega). Prøvene ble løst ved elektroforese på en ikke-denaturerende 5% polyakrylamidgel.

• PLoS ONE: La-7 mikroRNA Familie selektivt utskilles i det ekstracellulære miljøet via Exosomes i en magekreft med spredning Cell Line
• PLoS ONE: Høy Mangfold av Vaca og CagA Helicobacter pylori genotyper hos pasienter med og uten Gastric Cancer