PLoS ONE: Hipoksija indukcijske Factor 1α Određuje rak želuca kemijske osjetljivosti putem modulacije p53 i NF-κB

Sažetak pregled

Pozadina pregled

Smanjena kemijske osjetljivosti krutih stanica raka predstavlja ključnu prepreku u kliničkoj onkologiji , Dakle, molekularna karakterizacija putova koji reguliraju kemijske osjetljivosti je središnji preduvjet za poboljšanje terapije protiv raka. Hipoksije inducibilni faktor HIF-1α je povezan s kemosenzitivnost a temeljni molekularni mehanizmi ostaju uglavnom nedostižan. Stoga sveobuhvatno analizirao ulogu HIF-1 a-a u određivanju kemijske osjetljivosti s naglaskom na odgovornim molekularnih putova. Pregled

Metodologija i glavne nalaze

RNA interferencije je primijenjena inaktivirati HIF-1 a ili p53 u ljudskom raka želuca stanične linije AGS i MKN28. su korišteni kemoterapijski agensi 5-fluorouracil i cisplatina i kemosenzitivnost je procijenjena staničnim proliferacijskim ispitivanjima kao određivanje raspodjele staničnog ciklusa i apoptozu. Ekspresija p53 i p53 ciljnih proteina je analiziran pomoću Western blot. Aktivnost NF-kB je karakteriziran pomoću elektroforetskoj pokretljivosti testu smjene. Inaktivacija HIF-1 a na želučanih stanica raka rezultiralo robustan visini od kemijske osjetljivosti. Prema tome, HIF-1 a-kompetentne stanice pokazale su značajno smanjenje kemoterapije starenje i apoptozu. Zanimljivo je da ovaj fenotip je bio potpuno odsutan u P53 pregled mutant stanica, dok je inaktivacija p53 per se pregled ne utječe na kemijske osjetljivosti. HIF-1α značajno potiskuje kemoterapijom uzrokovanu aktivaciju p53 i p21, kao i retinoblastomskog proteina, a tijekom vremena staničnog ciklusa. Smanjeni formiranje reaktivnih vrsta kisika u HIF-1α-kompetentnih stanica identificirana kao molekularni mehanizam HIF-1α posredovanoj inhibiciji p53. Nadalje, gubitak HIF-1 a poništio, na način ovisan o p53, kemoterapijom inducirane DNA vezanja NF-kB i ekspresija anti-apoptotičkim NF-kB ciljnih gena. U skladu s tim, rekonstituciju NF-kB podjedinica P65 obrnuto povećanu kemosenzitivnost HIF-1 a-manjkav stanica. Pregled

Zaključak i značaj pregled

U sažetku, identificirali smo HIF-1 a kao moćan regulator p53 i NF-kB aktivnost u uvjetima genotoksični stres. Zaključujemo da P53
mutacije u ljudskim tumorima držite potencijal da posrami učinkovitost HIF-1 inhibitora u liječenju raka pregled

Izvor:. Rohwer N, Dame C, Haugstetter A, B Wiedenmann , Detjen K, Schmitt CA, et al. (2010) Hipoksija indukcijske Factor 1α Određuje rak želuca kemijske osjetljivosti putem modulacije p53 i NF-kB. PLoS ONE 5 (8): e12038. doi: 10,1371 /journal.pone.0012038 pregled

Urednik: Deb Fox, Istraživački institut za djecu u Klinici za dječje bolesti u New Orleans, Sjedinjene Američke Države Netlogu

Primljeno: 28. travnja 2010. godine; Prihvaćeno: 19. srpnja 2010; Objavljeno: 10. kolovoz 2010 pregled

Copyright: © 2010 Rohwer et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ova studija bio podržan od dotacija iz Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de) u TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 i 133 /2-3) i NR (Graduiertenkolleg 276/4 - "Signalerkennung und -umsetzung"). TC je također podržan od strane grant od Berliner Krebsgesellschaft E. V. (Http://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Unutrašnja i stekli otpornost na lijek su primarni razlozi za ograničenu učinkovitost kemoterapije u većini gastrointestinalnih malignih bolesti, uključujući rak želuca [1], [2]. Otpornost na lijekove predstavlja kompleksnu i više uzroka vezanih uz tumora mikro okolinu, na primjer hipoksija, acidoza i upala, kao i sama neoplastična stanica. [3] Cellular otpor može biti svojstvena određenom genetskom pozadini tumorske stanice ili rezultat mutacija i epigenetičkim promjene nakon antiproliferativnog terapije [4], [5]. Pregled

Faktor faktor transkripcije hipoksije-induktivni 1 (HIF-1 ) predstavlja ključnu regulator staničnog prilagodbe hipoksije i bila je uključena u rezistencije na lijek [6] - [8]. HIF-1 protein je heterodimer koji se sastoji od tvorbene izražen P-podjedinice (Amt (aril ugljikovodik receptor nuklearni translocator)) i hipoksije inducibilni α-podjedinica [9]. Pod normoksičnim uvjetima, HIF-1α aktivnost može biti izazvana različitim čimbenicima rasta, citokini, aktivirani onkogeni ili gubitak-of-function mutirani tumor supresorski geni [10]. HIF-1α je potpuno uključen u mnoge aspekte tumorigenesis uključujući proliferaciju stanica tumora, angiogeneza, metastaze, kao odgovora na kemo i radioterapijom [11]. HIF-1α je izraženo u velikom broju solidnih tumora, a izraz tumornog HIF-1α je često povezana s lošom prognozom [12] - [15]. Nadalje, inhibicija HIF-1 a pomoću RNA miješanja ili farmakološkim spojevima dokazano Antitumorsko učinkovitost u raznim životinjskim modelima karcinoma [16]. Doprinos za HIF-1 a na kemijska otpornost neoplastičnih stanica uočeno je u širokom spektru solidnih tumora, uključujući rak želuca, [6] - [8], [17] - [20]. Međutim, temeljni molekularni mehanizmi, kao i uloga HIF-1 a za otpornost na lijek normoksičnim uvjetima u velikoj mjeri ostaju neuhvatljivi [8], [18], [21]. Ovdje ćemo prepoznati potiskivanje p53 i promociju nuklearnog faktora kB aktivnosti (NF-kB) kao središnje mehanizme za HIF-1α osjetljivost određuju ulogu protiv 5-fluorouracila (5-FU) i cisplatina u ljudskim stanicama raka želuca.

Rezultati

HIF-1α određuje osjetljivost želuca stanica raka spram kemoterapijskih agenasa 5-FU i cisplatina Netlogu

Funkcionalna inaktivacija HIF-1 a postignut je lentivirusnim prijenosu AGS i MKN28 stanice s malim ometa RNA (siRNA) posebno usmjerene HIF-1 a. Ovaj eksperimentalni pristup da bi se dobio vrlo učinkovito obaranje ogleda se u blizini potpunog neuspjeha transduciranih stanica induciranja HIF-1α proteina u odgovoru na hipoksiju kao prethodno [22] objavljen. Ocijeniti značaj HIF-1 a za osjetljivosti stanica raka želuca prema utvrđenim kemoterapeutika usporedili smo učinke 5-FU i cisplatina u HIF-1α-kompetentne (izokrenut ", SCR") i HIF-1 a-deficijentnih (obaranje "KD") AGS stanice. Funkcionalna inaktivacija HIF-1 a pomaknuo doze ovisnost inhibicije rasta prema nižim koncentracijama lijeka (Slika 1A i Slika S1), što ukazuje da HIF-1α je sposoban smanjiti kemoterapijom osjetljivost želučanih stanica raka u normoksičnim uvjetima. U skladu s prethodnim izvješćima [6] - [8], [17], [18], izloženost hipoksije povećana otpornost na 5-FU u AGS stanicama, međutim inaktivacija HIF-1 a rezultirala je robustan visini od kemijske osjetljivosti pod uvjetima hipoksije ( slika S2). U komplementarnog pristupa, proučavali smo posljedice prekomjerna ekspresija HIF-1 a (pcDNA HIF-1 a) za kemijske osjetljivosti od AGS stanica. AGS stanice ekspresirane HIF-1 a bili su znatno otporniji na liječenje sa 5-FU (Slika 1B). Stabilno HIF-1α izraz je potvrdio i ljudska prava (hipoksija dio koji reagira) reporter luciferaze (slika 1C). Ovi rezultati jasno ukazuju da HIF-1α ograničava citotoksično djelovanje 5-FU i cisplatina u humanim stanicama karcinoma želuca i to inaktivaciju HIF-1 a može imati blagotvoran utjecaj na kemijske osjetljivosti. Pregled

HIF-1α ograničenja izazvana kemoterapijom zaustavljanje staničnog ciklusa i apoptoze putem suzbijanje p53 Netlogu

počeli smo karakterizaciju promatranom inhibicije rasta analizom uzoraka distribucije staničnog ciklusa nakon kemoterapije. G _{1 sinkronizirano AGS stanice serum izgladnjele se oslobađaju iz G 0 /G 1 faze dodatkom profila serum i staničnog ciklusa su određeni nakon dodatka 5-FU. Objavljen kulture netretiranih AGS lako napredovala kroz g 1 u S i G 2 /M faze [22], dok su obrađene 5-FU-stanice ostaju u G 1 faza (nije prikazano). Zanimljivo je da je 5-FU ovisan zadržavanje stanica u G 1 fazi uvelike proširen u AGS KD u odnosu na AGS SCR stanica, u skladu s G 1 staničnog ciklusa (slika 2a). Nepovratno staničnog ciklusa uhićenje je nastao kao važan načinu djelovanja antiproliferativnih sredstava, a karakterizira ga staničnih svojstava starenjem [7], [23]. S tim u skladu, frakcija starih stanica se određuje. Doista, liječenje s 5-FU dovela je do snažnog indukcije starenje u AGS stanicama. Ovaj odgovor je znatno poboljšana u stanicama s istovremenim gubitkom HIF-1 a (slika 2B). Nadalje, indukcija apoptoze je predložio povećanim prethodno G 1 frakcije u DNA histograma tretiranih 5-FU-AGS KD stanica (nije prikazano). Stoga je kvantitativna analiza frakcija apoptotičnih stanica dobivena je na temelju otkrivanja cijepaju caspase-3 (Slika 2C). U skladu sa podacima o distribuciji staničnog ciklusa, gdje je 5-FU inducirane apoptoze frakcija bila je značajno povećana u HIF-1α-deficijentnih AGS KD stanica u usporedbi s HIF-1 a-kompetentnih stanica. Pregled}

kemoterapijom potaknutu starenje i apoptoza obje su blisko povezani s tumorski supresor p53 Netlogu. Dakle, pretpostavili smo da je p53 mogu doprinijeti prošireni citotoksičnosti 5-FU nakon gubitka HIF-1 a. Nakon 5-FU liječenja, p53 protein postepeno akumulira u AGS stanica, učinak koji je izrazito pojačan u AGS stanica HIF-1 a-manjkav (Slika 2D). Stabilizacije p53 je bio povezan s povećanim razinama ciklin-ovisne kinaze (CDK) inhibitora p21, što je dobro poznato transkripcijski cilj i daljnji efektor p53 s funkcijama staničnog ciklusa, starenje indukcije i apoptoze (Slika 2D). Opet, HIF-1 a-manjkav AGS stanice su pokazali značajno snažniji porast p21 nego AGS stanica HIF-1 a-stručnjak. Jaka indukcija p21 se očekuje da inhibiraju aktivnost G _{1 ciklin /CDK kompleksima, što rezultira hypophosphorylation u protein retinoblastoma (pRb) i izazivanje S fazi ciklinima, npr ciklin A. Doista, kako pRb hypophosphorylation i niža razina ciklin A potvrđeni su u tretiranih 5-FU-AGS KD stanica i - u manjoj mjeri - iu AGS SCR stanica (Slika 2D). Ove promjene potvrđuju zadržavanje G 1 faza koja udovoljava u DNA histograma i sukladne su s nepovratnom G 1 uhićenja zabilježena u kemoterapije starenje. Dakle, različite biološke ishodi 5-FU tretmana u HIF-1α-deficijentnih i -proficient AGS stanice nastaju iz diferencijalne regulacije p53 i izlaznom ciljne p21. Pregled}

inaktivacija p53 otupljuje ulogu HIF-1 a za kemijske osjetljivosti pregled

Da bi se dobila eksperimentalne dokaze za predloženi ulogu p53 u HIF-1 a posredovani regulaciji kemijske osjetljivosti u AGS stanicama, mi funkcionalno inaktivirani p53 s RNA interferencije pomoću prijelazne transfekcije anti-p53 siRNA (si p53) ili kodirani za kontrolu siRNA (SI SCR). P53 učinkovito srušen, na što ukazuje neuspjeha inficiranim stanicama da induciraju p53 efektora p21 i MDM2 kao odgovor na 5-FU obrade (slika 3A). Zanimljivo, AGS KD stanice transfecirane si p53 bili su znatno manje osjetljivi na inhibiciju rasta za 5-FU od AGS KD stanicama zaraženim s kontrolnom siRNA (slika 3b). U skladu s tim nalazima, G zadržavanje _{1 staničnog ciklusa i apoptoze tretiranih 5-FU-AGS KD stanica smanjeni su za p53 obaranje u odnosu na stanicama zaraženim s kontrolnom siRNA (Slika 3D i 3E). U oštrom kontrastu, kemijske osjetljivosti od AGS stanica HIF-1 a-stručnjak nije bio pod utjecajem inaktivacije p53 (slika 3C). Pregled}

HIF-1α ne utječe na kemijske osjetljivosti na P53 pregled mutant stanica

za potvrdu HIF-1 a ovisne regulacije 5-FU odaziv i dalje karakterizirati doprinos p53, ispitali smo drugi ljudski rak želuca stanične linije (MKN28), koja nosi missens mutaciju u TP53 pregled na kodonu 251. Zanimljivo, brisanje HIF-1 a u MKN28 stanica nije uspjela poboljšati inhibicije rasta nakon izlaganja 5-FU (slika 4a). Isto tako, 5-FU-inducirana G _{1 akumulacije i apoptoze MKN28 stanica nisu bili pogođeni gubitkom HIF-1 a (slika 4b i 4c). U skladu s tim nalazima, razina proteina p53 i pRb ostao nepromijenjen u-FU tretiranih 5-MKN28 stanica tijekom 24 sata razdoblju, a indukcija p21 bio odsutan (slika 4D). Međutim, kada je funkcija p53 obnovljena predobradom s kemijskog spoja PRIMA-1 [24] HIF-1α obaranje preveden u znatno povećanim 5-FU citotoksičnosti (Slika S3). U skladu s utvrđenom ulogu p53 u kemoterapije citotoksičkog /citostatičkog efekta, liječenje PRIMA-1 per pregled neznatno smanjene proliferacije MKN28 stanica i značajno poboljšanu učinkovitost 5-FU u MKN28 stanicama (Slika S3). pregled}

NF-kB je važan posrednik uloge HIF-1 a-a u kemosenzitivnost pregled

aktivaciju NF-kB je povezana sa zaštitom od kemoterapije apoptoze i obrnuto, inhibicija NF -κB može poboljšati učinkovitost antineoplastičnih sredstava i in vivo pregled i In vitro pregled [25] - [27]. Zbog toga smo utvrdili NF-kB DNA vezanja aktivnost HIF-1α-deficijentnih i -proficient AGS stanica nakon tretiranja s 5-FU elekroforetskim testu pokretljivost smjenama (EMSA). Liječenje sa 5-FU snažno aktivira NF-kB DNA-vezivanja u AGS SCR stanicama, sa srednjim najvišim razinama nastaju 6 sati nakon izlaganja 5-FU (Slika 5A). Tretman sa TNFa tijekom 4 sata služili su kao pozitivna kontrola za aktiviranje NF-kB. Nadalje, supershift je inducirano anti-p65 antitijelo, potvrđujući da su 5-FU inducirane NF-kB kompleksi sadržavao 65 kDa podjedinicu (p65). Gubitak HIF-1 a značajno inhibira aktivaciju NF-kB, kao odgovor na 5-FU i TNFa (slika 5A). U skladu s tom promatranju, 5-FU tretman također nije inducirao NF-kB ciljnih gena cIAP1 i A20 u AGS KD stanicama, dok su lako inducirana u AGS SCR stanicama (Slika 5b). Pregled

Da bi se riješila funkcionalni značaj NF-kB za 5-FU-inducirane inhibicije rasta, prekomjerna ekspresija se p65 (pcDNA p65) u AGS KD stanicama. Transfekcija pcDNA P65, ali ne prazni kontrolni vektor, rezultirala je značajnim indukciju p65 proteina i NF-kB transkripcijsku aktivnost u AGS KD stanica (Slika S4). Napomenuti, HIF-1 a-deficijentnih AGS KD stanica koje prekomjerno eksprimiraju p65 bile znatno otporniji na 5-FU tretmana u usporedbi sa AGS KD stanicama presječenim samo sa kontrolnim vektorom (Slika 5C), u skladu s bitnu ulogu NF-kB u posredovanju kemijska otpornost prema 5-FU u želučanim stanice raka. Uzeti zajedno, istodobno aktiviranje p53 i inhibicija NF-kB u 5-FU-liječi, uočeno je HIF-1 a-manjkav AGS stanice. Naime, da li su oba događaja su međuovisne, proučavali smo 5-FU-inducirana aktivacija NF-kB u MKN28 stanica s mutanta P53. Pregled i 5-FU i TNFa aktiviran NF-kB DNA vežu na put ne način ovisan o, što ukazuje na p53-neovisni mehanizmi NF-kB aktivaciju 5-FU (Slika 5D). Međutim, za razliku od nalaza u AGS stanicama, taj NF-kB aktivaciju u P53 pregled mutant stanična linija nije otupjela od HIF-1α inaktivacije. Dakle, HIF-1α može podržavati kemoterapijom uzrokovanu aktivaciju NF-kB po suzbijanju inhibitornih mehanizama p53 ovisan. Pregled

Altered stvaranja ROS je odgovoran za HIF-1α-inducirane modifikacije djelovanjem p53 pregled

Da pojasniti molekulski mehanizam u pozadini p53 superinduction u 5-FU tretirane HIF-1α-deficijentne stanice, naznačen time, da ulogu reaktivnih vrsta kisika (ROS). ROS predstavljati vezu kandidata kao (i) ROS su moćni aktivatori funkciju p53 i smatra se ključnim faktorima u indukciji p53 strane različitih kemoterapijskih agenasa [28], i (ii) HIF-1α može suzbiti ROS generacije smanjuje mitohondrijsku aktivnost i Biogeneze [22], [29], [30]. Prema tome, AGS KD su stanice prije tretirane sa ROS inhibitori diphenyleneiodonium klorid (DPI) ili apocynin. I inhibitori pruža značajnu zaštitu protiv 5-FU-inducirane inhibicije rasta u AGS KD stanicama (Slika 6A i 6B). Nadalje, DPI i apocynin gotovo potpuno spriječiti indukciju p53 i njegovu nizvodni cilj p21 u 5-FU-tretiranih stanica (Slika 6c i 6d). Ovi rezultati upućuju na sjecište HIF-1 a signaliziranja s odgovorom p53 posredovane s 5-FU na razini ROS proizvodnje. Uspostaviti uzročnu ulogu HIF-1 a za redoks potencijala AGS stanica nakon 5-FU liječenja intracelularne razine ROS određene su KD AGS i SCR stanica protočnom citometrijom. otkrili smo da su unutarstanične razine superoksidnih u tretiranih 5-FU-AGS KD stanice su 2,5 puta veće od onih kod tretiranih 5-FU-AGS SCR stanica (Slika S5), što znači da bi se funkcionalan inaktivacija HIF-1 a u AGS stanica rezultirala značajna i funkcionalna povišenje intracelularne oksidativnog stresa, čak i pod kemoterapijski tretman pregled

Rasprava pregled

transkripcijski faktor HIF-1α je utvrđena kao važan medijator hipoksija posredovane kemijska otpornost [6] - [8]. [17], [18], [20]. Ovdje ćemo prepoznati HIF-1 a kao snažan determinanta kemijske osjetljivosti na želučanih stanica raka u normoksičnim uvjetima. Primjenom lentivirusom temelji siRNA sustav nam pokazuju značajno poboljšana 5-FU i cisplatina toksičnost u želučanih stanica raka HIF-1 a-manjkav. Dostupni podaci o ulozi HIF-1 a za kemijske osjetljivosti stanica raka u normoksičnim uvjetima su u konfliktu. Dok HIF-1 a-manjkav fibrosarkomskih stanica (HT1080) pokazali značajno poboljšana osjetljivost prema etopozid u vanjskom zraku, rak debelog crijeva (HCT 116) i hepatoma (Hepa-1) stanice nisu učinili [6]. Unruh i sur. Pregled, izvijestio pojačanu osjetljivost HIF-1 a-manjkav mišjih embrionalnih fibroblasta do karboplatin ili etopozid normoksičnim kao hipoksička stanja [8]. S obzirom na rak želuca, poboljšana učinkovitost 5-FU i vinkristin pokazana u normoxia in vitro pregled [18]. Pa u skladu s našim rezultatima, oba studija zaključila ključnu ulogu za HIF-1 a u posredovanju kemijska otpornost normoksičnim uvjetima. Zanimljivo je da je nedavna studija iz Japana pokazala manju efikasnost 5-FU-based kemoterapije u HIF-1 a-izražavanje ljudskog želučanog adenokarcinoma, jačanje percepcije HIF-1 kao središnji čimbenik u određivanju želučanog raka kemijska otpornost [31].

kontrola progresije raka kemoterapijom oslanja barem djelomično na indukciju stanične starenje. Nedavno, gubitak HIF-1 a pokazalo se da uzrokuje prerano starenje besmrtnih mišjih embrionalnih fibroblasta normoksičnim uvjetima [32]. Naš trenutni podaci ukazuju da HIF-1α na sličan način čuva želudac stanice raka protiv kemoterapije starenje pod normoksičnim uvjetima. To predstavlja prvo izvješće povišene kemoterapije starenjem preko funkcionalnu inaktivaciju HIF-1 a u uspostavljenom raka humane stanične linije. U HIF-1 a s manjkom stanica, Također smo uočili poboljšana indukcija apoptoze u odgovoru na 5-FU. Prethodne studije izvijestio je reaktivaciju proapoptotski faktor ponudu [6], ili promjena u ravnoteži pro- i ancijapoptotskih članova Bcl-2 obitelji na račun za povećane stope apoptoze nakon inaktivacije HIF-1 a u stanicama karcinoma želuca droge tretira [ ,,,0],. 18] pregled

Naš trenutni studija identificira novi mehanizam, pri čemu HIF-1α neutralizira i kemoterapijom izazvana starenje i apoptoze: predstavljamo uvjerljiv dokaz za kapacitet HIF-1 a za suzbijanje indukciju tumor supresor p53 kao odgovor na 5-FU u normoksičnim uvjetima. P53 je središnji sudbina stanica odrednica zbog svoje uloge u reguliranju napredovanja staničnog ciklusa i apoptozu kao odgovor na stanični stres i predstavlja najčešće mutirani gen kod humanih karcinoma [33]. Široki raspon kemoterapijskih sredstava je pokazala da se stabilizira p53 i, s druge strane, gubitak p53 predstavlja princip mehanizma rezistencije tumora na kemoterapiju [33], [34]. Interakcija p53 i HIF-1 a bila je predmet dugogodišnjeg rasprava, kao i pozitivnih i negativnih izvješća objavljeni su [35]. Međutim, cijeli prethodno objavljeni rad usmjeren na p53-HIF-1 a-interakcije pod hipoksičkih (ili čak anoksično) uvjetima. Koliko je nama poznato, naši pokusi po prvi puta pružaju dokaze za suzbijanje p53 aktivnosti po HIF-1 a pod normoksičnim uvjetima. Kao posljedica p53 ranijim koracima u HIF-1 a s manjkom stanica, zapazili smo promjene u silaznih efektora koji su povezani s nepovratnom staničnog ciklusa obilježje starenje, npr Stabilizacija p21 i hypophosphorylation pRb. Za razliku od našeg promatranja, noviji radovi na kemijska otpornost prema etopozid u HIF-1α-deficijentnih besmrtnih mišjih embrionalnih fibroblasta nisu promatrati indukciju p21 [36]. Također, HIF-1α stabilizirana p21 i p27, kao i dovelo do hypophosphorylation od pRb tijekom hipoksija izazvanog rasta uhićenja besmrtnih mišjih embrionalnih fibroblasta i osnovnim slezene B-limfocita [37]. Ovi kontrastne rezultati su najvjerojatnije objasniti ispitivanih tipova stanica: Dok Goda i sur pregled. karakterizira fiziološki odgovor na hipoksiju u vrstama ne-transformirane stanice, analizirali smo odgovor na teška oštećenja DNA u utvrđenim staničnim linijama karcinoma. pregled

Dok p53 puta se pokazalo da se suprotstavi NF-kB funkciju [38], [39 ], naš trenutni podaci ukazuju na ulogu tumorski supresor u regulaciji HIF-1 a-ovisnu aktivaciju NF-kB. Osim p53 NF-kB je nastao kao drugi, centralno determinante otpornosti prema kemoterapijskih agensa [40]. Nekoliko različitih studije su utvrdile funkcionalne veze između NF-kB i HIF-1 a, iako su varijabilno staviti HIF-1 a bilo uzvodno od NF-kB ili obrnuto. Na primjer, hipoksije inducirana stabiliziranje HIF-1 a u stanicama glatkih mišića pod transkripcijskom kontrolom NF-kB [41]. Slično tome, rezultati dobiveni uvjetnog IKK-beta knockout miševa potvrđeno na ključnu ulogu NF-kB u kontroli bazalno i hipoksiju inducirana ekspresija HIF-1 a in vivo pregled [42]. S druge strane, ekspresija gena za NF-kB podjedinica p65 pokazano je da se kontrolira HIF-1 a u kontekstu hipoksijom potiskuje apoptozu neutrofila [43]. Naš nalaz znatno smanjene aktivnosti NF-kB u HIF-1 a-manjkav stanica nakon tretmana s 5-FU, dakle, dobro je u skladu s ovom potonjem izvješću. Zanimljivo je također uočeno je značajno smanjen DNA vezanja NF-kB podjedinica u HIF-1α-deficijentnih stanica nakon stimulacije s TNFa, afirmirana izazivač NF-kB aktivnosti [44]. Postavlja se primjereno pitanje pod kojima fizioloških i patofizioloških stanja HIF-1α je u stanju regulirati NF-kB aktivaciju. HIF-1α i NF-kB podijeliti presudnu važnost za razne procese, kao što su upale, mikroba ubijanja i nastanku tumora. Točan molekularna priroda, kao i hijerarhija njihove interakcije najvjerojatnije staničnoj i ovisna o kontekstu i ne može se generalizirati. Pregled

U trenutnoj studiji bili smo u stanju odrediti ROS kao Sjecište HIF- 1 a sa p53 posredovane stanične odgovoru na stres na kemoterapiju. Intracelularni ROS su poznati kao potentni induciraju p53 i sudjeluje u aktivaciji p53 pomoću kemoterapijskih lijekova [45]. Mitohondriji predstavljaju glavni izvor intracelularne ROS [46], i HIF-1α vjerojatno neutralizira ROS proizvodnju u mitohondrijske razini putem više mehanizama, uključujući inhibiciju mitohondrijske biogenezu i piruvata shuttling u mitohondrijima, smanjenje mitohondrijske aktivnosti zbog pojačanog korištenja glikolize i aktiviranje mitohondrija autophagy [29], [30], [47], [48]. Prije toga, osnovali smo funkcionalnu vezu između HIF-1α-kontroliranom smanjenju ROS i sidrište neovisnosti želučanih stanica raka [22], što ukazuje da HIF-1 a u patogenezi karcinoma želuca u odsutnosti hipoksije. Sada smatraju da sposobnosti koje od HIF-1 a ograničiti ROS proizvodnju želučanih stanica raka također stječe otpornost na kemoterapijska sredstva koja djeluju preko aktivacije p53 (slika 6e). Zanimljivo je da sve veći učinak na otpornost terapije, putem modulacije p53 i ROS također su prijavljeni za HIF-2a [49]. HIF-a izoforme 1 i 2 pokazuju širok preklapanje u pretpostavljenim HIF ciljeva i vezivanje na hipoksije elemenata odgovora i definitivno dodjelu hipoksijom induciranog djelovanja na obje izoforme nije uvijek accomplishable [50]. Bertout i sur. Pregled je pokazao da inhibira HIF-2a povećava zračenje-inducirana apoptoza preko ROS akumulacije i naknadno povećanje p53 aktivnosti [49]. Osim toga, Roberts i sur. Pregled je pokazao da je otpor protiv kemoterapije djelomično posredovana HIF-2α posredovane suzbijanje p53 u stanicama karcinoma bubrega stanica [51]. Dakle, ovime su izvijestili promatranja jamči istrage o potencijalnoj ulozi HIF-2a, zadatak koji je u tijeku u našem laboratoriju. Pregled

S obzirom na kliničku potrebu identifikacije prediktori odgovor dostupnih mogućnosti liječenja, naš rezultati mogu potencijalno izravne odluke tretman: s jedne strane, poznavanje HIF-1 a pojačane ekspresije može usmjeriti izbor lijekova koji uglavnom djeluju na p53 neovisan način. S druge strane, određeni koristi može biti posljedica kombiniranja HIF-1 inhibitore i sredstva koja oštećuju DNK (npr 5-FU) u karcinomima s funkcionalnog p53. Obratno, smanjena efikasnost HIF-1 inhibitora se može očekivati ​​za liječenje p53 defektnim tumora aspekt koji bi mogli predstavljati zapanjujuće faktor u kliničkim ispitivanjima HIF-1 a za inhibiciju režime liječenja. Pregled

Materijali i Metode pregled

kultura stanica i kemikalije pregled

AGS (CRL-1739, ATCC, Rockville, Maryland, SAD) i MKN28 (JCRB Cell Bank, Tokyo, Japan) stanice su rasle kao jednoslojne kulture u standardnom mediju , Generiranje AGS i MKN28 stanica koje stabilno eksprimiraju bilo siRNA posebno usmjerene HIF-1 a (obaranje "KD") ili nespecifični kontrola siRNA (kodirani "SCR") je ranije objavljeno [22]. 5-fluorouracil (5-FU), cis-Diammineplatinum (II) diklorid (cisplatin) i superoksid anion inhibitori diphenyleneiodonium klorid (DPI) i apocynin su nabavljeni od Sigma-Aldrich (Njemačka) i otopljen u DMSO. PRIMA-1 (za p53-aktiviranja i indukciju apoptoze masivni) dobivena od Tocris Biosciences (Ellisville, Missouri, USA) i otopi u sterilnoj vodi. Kontrolno sredstvo otapala je uključen u sve pokuse. pregled

Test stanične proliferacije pregled

određivanje staničnog rasta, 3 × 10 ^{4 stanice su posađene u triplikatu u pločicama s 24 jamice, ostavi se primiti tijekom 16 sati, a zatim je obrađena kao što je navedeno u normoksičnim ili hipoksičnim stanjima. Nakon tretmana, stanice su tripsinizirane, a žive stanice su broje korištenjem hemocitometra. Pregled}

Određivanje raspodjele staničnog ciklusa i apoptozu protočnom citometrijom

Cell Distribution ciklusa, uključujući pre-G _{1 frakcija se određuje iz DNA histograma kao što je opisano [52]. Apoptoza također se kvantificira iz detekcije aktivni cijepa kaspaza-3 protočnom citometrijom pomoću Alexa Fluor® 488-konjugiranih protutijela (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). Pregled}

Kvantifikacija starenjem pregled

aktivnosti β-galaktozidaze Starenje povezana je procijenjena u citospinu pripravke kao što je opisano [53]. pregled

Imunoblot analiza pregled

cijelih stanični lizati su pripravljeni kako je prethodno opisano [52], a zatim razdvojeni na 10% natrij-dodecil-sulfat-poliakrilamid gel te preneseni na nitrocelulozu (Amersham Biosciences, Freiburg, Njemačka). Mrlje su ispitane s antitijelima protiv p53 i CDK2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, SAD), p21 (Oncogene Research Products, Bad Soden, Njemačka), ciklin A (Upstate, Temecula, California, SAD), pRb (BD Pharmingen , Heidelberg, Njemačka), MDM2 (Calbiochem, San Diego, California, SAD), p65 (Cell Signaling Technology) i aktin (Sigma-Aldrich). Sekundarna antitijela bio vezan na peroksidaza (Dianova, Hamburg, Njemačka) i aktivnosti peroksidaze vizualizira pomoću Western Lightning chemiluminescence Reagens Plus (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA). Pregled

Kvantitativna real-time PCR analiza pregled

Za real-time PCR analize, ukupna stanična RNA je ekstrahirana Trizol reagensa (Invitrogen, Karlsruhe, Njemačka). Prvi lanac cDNA sintetiziran je s oligo (dT) primera i eksponent ™ Prvi lanac Synthesis sustava (Invitrogen). Kvantitativna real-time PCR analiza je provedena pomoću TaqMan PCR Universal Mastermix (za p-aktin) ili SYBR Green PCR Master Mix (za A20 i cIAP1 Applied Biosystems, Darmstadt, Njemačka). Sekvencijama se isporučuju u tablici S1. Za normalizaciju količine ulaznog RNA PCR reakcije su izvršena sonde i početnice za beta-aktina. Pregled

Prijelazna transfekcija i pokusom luciferaznog reportera

prolaznih transfekcija AGS stanica provedeno je primjenom Effectene transfekcije reagensa (Qiagen, Hilden, Njemačka) prema naputku proizvođača. Za Prekomjerna ekspresija ispitivanja, stanice su nasađene u 3 x 10 ^{4 stanica /24 jažica i transfektirane s 100 ng pcDNA HIF-1 a (dobiveno od Wanja Bernhardt, Universitätsklinikum Erlangen, Erlangen, Njemačka) ili pcDNA P65 (osiguran ljubaznošću by Hiroyasu Nakano, Sveučilište Jutendo, Tokyo, Japan), respektivno. Za ljudska prava ili analizi NF-kB luciferaza, 3 × 10 4 stanica /24-te su ko-transficirane s 100 ng pHRE-Luc (poklon od Randall S. Johnson, UCSD, San Diego, California, USA) ili IgκB-Luc (poklon od Florian R. Greten, Technische Universität München, München, Njemačka), i 30 ng phRL-nula (Promega, Mannheim, Njemačka). Aktivnost luciferaze izmjerena je Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega), kako je opisano [54]. Da bi se postigao prolazno potiskivanje p53, AGS stanice su transfektirane na 30% spajanja sa 75 ili 150 nmol /L si p53 ( Silencer pregled Odaberite siRNA, Applied Biosystems) i analizirana 48 sata nakon ubacivanja. Nespecifična siRNA (si scr, Eurogentec, Seraing, Belgija) je korišten kao kontrola. Pregled}

pokretljivosti pomak ispitivanje (EMSA) pregled

Nuklearni proteinski ekstrakti su pripravljeni kao što je opisano [54]. EMSA je izvedena kao što je ranije opisano [55] pomoću 8 ug nuklearnog proteina i 100 fmol /L krajnjeg radio-obilježeni 22 bp dvostruke uzvojnice NF-kB konsenzus oligonucelotide (nadalje lanca: 5'-TGA AGT GGG GAC TTT CCC AGG C- 3 ', E3292, Promega).