PLoS ONE: Hipoksija-indukuojamąją faktorius 1α Nustato skrandžio vėžys Chemosensitivity per moduliavimo p53 ir NF-κB

Anotacija

Fonas

Sumažintas chemosensitivity kietųjų vėžinių ląstelių sudaro pagrindinį kliūtis klinikinės onkologijos. Taigi, molekulinė charakteristika kelius reguliuojančių chemosensitivity yra centrinis sąlyga, siekiant pagerinti vėžio terapija. Hipoksija-indukuojamąją veiksnys HIF-1α buvo susijęs su chemosensitivity o pagrindinės molekulinius mechanizmus esmės tebėra silpnas. Todėl mes išsamiai analizuojami HIF-1α vaidmenį nustatant chemosensitivity sutelkiant dėmesį į atsakingų molekulinės būdus.

Metodologija ir vyriausiųjų
išvados

RNR interferencija buvo taikomas nukenksminimui HIF-1α ar p53 žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų AGS ir MKN28. Chemoterapinis agentai 5-fluorouracilas ir cisplatina buvo naudojami ir chemosensitivity buvo įvertintas ląstelių proliferacijos tyrimų, taip pat nustatyti ląstelių ciklo paskirstymo ir apoptozės. Išraiška p53 ir p53 tikslinių baltymų buvo analizuojami Vakarų dėmė. NF-κB veikla buvo būdingas priemonėmis elektroforezės mobilumas poslinkio metodu. Inaktyvacija HIF-1α skrandžio vėžio ląstelių lėmė tvirta fasadams chemosensitivity. Taigi, HIF-1α-kompetentinga ląstelės rodomas žymiai sumažinti chemoterapijos sukelto senėjimo ir apoptozės. Nuostabiausia tai fenotipas buvo visiškai nėra, P53
mutantas ląstelės, o inaktyvacijai p53 , savaime
nepaveikė chemosensitivity. HIF-1α žymiai slopinamas chemoterapijos sukelta aktyvavimo p53 ir p21, taip pat Retinoblastoma baltymų, galiausiai dėl to ląstelės ciklo arešto. Sumažintas formavimas reaktyvių deguonies rūšių HIF-1α-kompetentingų ląstelių buvo įvardyta kaip molekulinės mechanizmo HIF-1α slopinamos p53. Be to, nuostolių HIF-1α panaikintas, į p53 priklausomu būdu, chemoterapija sukeltos DNR surišantis NF-κB ir išraiška anti-apoptozinių NF-κB tikslinių genų. Atitinkamai praskiedus NF-κB subvieneto 65 psl atstatomi padidėjusį chemosensitivity HIF-1α trūkumas ląstelėse.

Išvados ir reikšmė

Apibendrinant, mes nustatyti HIF-1α kaip stiprus reguliatorius p53 ir NF-κB veikla sąlygomis genotoksinio streso. Galime daryti išvadą, kad P53
mutacijos žmogaus navikų laikykite potencialą, kad sugėdintų HIF-1-inhibitorių veiksmingumą vėžio gydymo

nurodomoji dalis:. Rohwer N Motinos C Haugstetter A Wiedenmann B , DETJEN K, Schmitt CA, ir kt. (2010) Hipoksija-indukuojamąją faktorius 1α Nustato skrandžio vėžio Chemosensitivity per moduliavimo p53 ir NF-κB. PLoS ONE 5 (8): e12038. Doi: 10,1371 /journal.pone.0012038

redaktorius: Deb Lapė tyrimų institutas vaikams Vaikų ligoninės Naujajame Orleane, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo balandžio 28d, 2010; Priėmė: Lie 19 ", 2010; Paskelbta 10 Rugpjūčio, 2010

Visos teisės saugomos: © 2010 Rohwer et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė dotacijas iš Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de) TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 ir 133 /2-3) ir NA (Graduiertenkolleg 276/4 - "Signalerkennung und -umsetzung"). TC taip pat parėmė dotacijos iš Berliner Krebsgesellschaft e.V. (Http://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Vidinė ir įgytas atsparumas narkotikų yra pagrindinė priežastis ribojamą veiksmingumo chemoterapijos skrandžio ir žarnų piktybinių navikų dauguma, įskaitant skrandžio vėžio [1], [2]. atsparumo vaistams sudaro sudėtingą ir Daugiafaktorialus reiškinį, susijusį su vėžinių mikroaplinkos, pvz hipoksija, acidozė ir uždegimas, taip pat pati neoplastinė ląstelių [3]. Mobilieji atsparumas gali būti neatsiejamas nuo konkrečios genetinės fone naviko ląstelės arba atsiranda mutacijų ir epigenetinių pokyčių po proliferacijos terapija [4], [5].

transkripcijos faktorius hipoksija-indukuojamąją koeficientas 1 (HIF-1 ) yra pagrindinis reguliatorius ląstelių prisitaikymą prie hipoksijos ir buvo susijęs atsparumo vaistams [6] - [8]. HIF-1 baltymas yra heterodimero sudaro konstitutyviai išreikštą beta-subvieneto (Arnt (aril angliavandenilių receptorių branduolinės translocator)) ir hipoksija indukuojamas α-subvieneto [9]. Pagal normoxic sąlygomis HIF-1α veikla gali būti sukeltas įvairių augimo faktorių, citokinų, aktyvuotos Onkogeny ar nuostolis iš savarankiškų mutavo navikas slopintuvas genų [10]. HIF-1α yra centralizuotai dalyvauti keliais aspektais tumorigenezei įskaitant naviko ląstelių proliferacijos, angiogenezės, metastazių, taip pat reaguojant į chemoterapijoje ir radioterapijos [11]. HIF-1α ekspresija yra daugybė solidinių navikų, ir navikinės HIF-1α išraiška yra dažnai susijęs su blogos prognozės [12] - [15]. Be to, slopinimas HIF-1α pasitelkiant RNR kišimosi arba farmakologinių junginių įrodė Antinavikinis veiksmingumas įvairioms graužikų vėžio modelių [16]. A HIF-1α indėlį į Atsparumas cheminėms navikinių ląstelių buvo pastebėta, kad plataus spektro solidinių navikų, įskaitant skrandžio vėžio [6] - [8], [17] - [20]. Iš kitos pusės, molekuliniai mechanizmai, taip pat HIF-1α vaidmuo atsparumo vaistams pagal normoxic sąlygomis daugiausia lieka silpnas [8], [18], [21]. Čia mes nustatyti slopinimo p53 ir skatinimo atominės faktoriaus κB (NF-κB) veiklos, kaip centrinių mechanizmų HIF-1α jautrumas nustatantys vaidmenį prieš 5-fluorouracilu (5-FU) ir cisplatina žmogaus skrandžio vėžio ląsteles.

rezultatai

HIF-1α lemia jautrumą skrandžio vėžio ląstelių link chemoterapiniais preparatais 5-FU ir cisplatinos

Funkcinis inaktyvacijai HIF-1α buvo pasiekta lentiviruso perdavime iš AGS ir MKN28 ląstelių sirnr (siRNA) konkrečiai skirta HIF-1α. Tai eksperimentinis požiūris davė labai efektyvų triuškinantis įrodytą artimiausioje visišką nesėkmę transdukuotų ląstelių indukuoti HIF-1α baltymų reaguojant į hipoksiją, kaip paskelbta anksčiau [22]. Įvertinti HIF-1α už žmogaus skrandžio vėžio ląstelių link nustatytų chemoterapiniais preparatais jautrumo svarbą, mes palygino 5-FU poveikio ir cisplatina HIF-1α-kompetentinga (plakta, "SCR") ir HIF-1α trūkumas (nokdaunas, "KD") AGS ląstelės. Funkcinis inaktyvacijai HIF-1α perėjo priklausomybę augimo slopinimo dozę į mažesnes vaisto koncentracijos (1a pav ir S1 paveiksle), o tai rodo, kad HIF-1α gali sumažinti chemoterapijos jautrumą skrandžio vėžio ląsteles pagal normoxic sąlygomis. Laikantis ankstesnėse ataskaitose [6] - [8], [17], [18], poveikis hipoksija padidino atsparumą 5-FU AGS ląsteles, tačiau inaktyvacijai HIF-1α lėmė tvirta fasadams chemosensitivity pagal hipoksinės sąlygomis ( S2 pav.) Be papildomas metodas, mes studijavo ekspresija HIF-1α (pcDNR HIF-1α) už AGS ląstelių chemosensitivity pasekmes. AGS ląstelės ekspresija HIF-1α buvo gerokai labiau atsparūs gydymui 5-FU (1b pav.) Stabilus HIF-1α išraiška buvo patvirtinta HRE (hipoksija reaguoja elementas) liuciferazė reporterio testą (1c pav). Šie rezultatai aiškiai rodo, kad HIF-1α riboja citotoksiniais veiksmų 5-FU ir cisplatinos žmogaus skrandžio vėžio ląsteles ir tą HIF-1α nukenksminimą gali turėti teigiamą poveikį chemosensitivity.

HIF-1α ribos chemoterapija sukeltas ląstelės ciklo areštas ir apoptozė per slopinimo p53

Mes pradėjome apie pastebėtas augimo slopinimas apibūdinimą analizuojant ląstelės ciklo pasiskirstymo modelius po chemoterapijos. G _{1-suderintas, serumo-alksta AGS ląstelės buvo paleistas iš G 0 /G 1 etapas pridedant profilių serumo ir ląstelinio ciklo buvo nustatyti po 5-FU to. Išleistas kultūros neapdorotų AGS lengvai pereidamas per G 1 į S ir G 2 /M fazių [22], kadangi 5-FU paveiktų ląstelių liko G 1 etapas (nerodomas). Įdomu tai, kad 5-FU priklauso išlaikymas ląstelių G 1 etapas buvo labai gausinami AGS KD palyginti su AGS SCR ląstelių, atitinkančių G 1 ląstelės ciklo areštas (2a pav.) Negrįžtamas ląstelės ciklo suėmimas tapo svarbiu veikimo būdą slopina proliferaciją agentų ir pasižymi korinio savybių senėjimo [7], [23]. Atitinkamai, buvo nustatyta iš senstančių ląstelių frakcija. Iš tiesų, gydymas su 5-FU pradėta su patikimu indukcijos senėjimo į AGS ląstelių. Šis atsakymas buvo gerokai sustiprintas ląstelių kartu taikant nuostolių HIF-1α (2b pav.) Be to, sukeliama apoptozė buvo pasiūlyta padidėjusia anksto G 1 frakcija DNR histogramos 5-FU gydytų AGS KD ląstelių (nerodomas). Todėl, buvo gaunama kiekybinė analizė apoptozės ląstelių frakcijos, remiantis suskaldoma kaspazė-3 (2C pav) aptikti. Suderinamas su duomenų apie ląstelių ciklo pasiskirstymą, 5-FU sukeltas aprotoninis frakcija buvo gerokai padidėjo HIF-1α-stokojančių AGS KD ląstelių, palyginti su HIF-1α-kompetentinga ląsteles.}

Chemoterapija sukeltos senatvė ir apoptozė tiek buvo glaudžiai susijęs su naviko slopintuvas p53
. Taigi, mes iškėlė hipotezę, kad p53 gali prisidėti prie papildytos citotoksiškumo 5-FU netekus HIF-1α. Po 5-FU gydymo Baltymas p53 palaipsniui susikaupė AGS ląstelių poveikį, kuris buvo stulbinančiai sustiprintas HIF-1α trūkumas AGS ląstelių (2d pav). Šis p53 stabilizavimas buvo susijęs su padidėjusiu su cikloniniai priklausoma kinazės (CDK) inhibitorius p21, gerai įsitvirtinęs transkripcijos tikslą ir vartotojų vykdymo elemento p53 su funkcijų ląstelės ciklo arešto, senėjimo indukcijos ir apoptozės (2d pav). Vėlgi, HIF-1α trūkumas AGS ląstelės parodė žymiai didesnį augimą p21 nei HIF-1α-įgudę AGS ląsteles. Stiprus indukcija p21 tikimasi slopina G _{1 cikloniniai /CDK kompleksai, todėl hypophosphorylation iš Retinoblastoma baltymų (PRB) ir nesugebėjimas sukelti S fazių ciklinų, pvz veikla CIKLONAS A. Iš tiesų, tiek PRB hypophosphorylation ir sumažinti cikloniniai A lygis buvo patvirtinti 5-FU gydytų AGS KD ląstelių ir - mažesniu mastu - taip pat AGS SCR ląstelės (2d pav). Šie pokyčiai patvirtina G 1 etapas susilaikymas pastebėtas DNR histogramos ir yra suderinamas su negrįžtamu G 1 arešto pastebėtas chemoterapijos sukelto senėjimo. Taigi, skirtingi biologiniai rezultatai iš 5-FU valymo HIF-1α-trūkumas ir -proficient AGS ląstelių kyla iš diferencialinio reguliavimo p53 ir jos vartotojų tikslinės p21.}

Inaktyvacija p53 blunts su HIF-1α vaidmenį už chemosensitivity

Norėdami gauti eksperimentinius įrodymus siūlomo vaidmens p53 į HIF-1α tarpininkaujant reguliavimo chemosensitivity į AGS ląstelių, mes funkciškai inaktyvuota p53 pagal RNR trukdžių naudojant trumpalaikį transfekcijq anti-p53 siRNA (si p53) arba plakta kontrolė siRNR (SI SCR). P53 buvo efektyviai nuvertė, kaip nurodyta pagal iš perkeltų ląstelių nesugebėjimo indukuoti p53 vykdymo p21 ir MDM2 reaguojant į 5-FU gydymo (3a pav.) Įdomu tai, kad AGS KD ląstelės transfektuotose si p53 buvo gerokai mažiau linkusios į augimo slopinimas 5-FU nei AGS KD ląstelių transfektuotose valdymo siRNA (3b pav.) Laikantis šių išvadų G _{1 ląstelės ciklo susilaikymas ir apoptozė 5-FU gydytų AGS KD ląstelių sumažėjo p53 triuškinantis, palyginti su ląstelių transfektuotose valdymo siRNA (3D ir 3E paveikslą). Kontrastas, chemosensitivity HIF-1α-įgudę AGS ląstelių įtakos neturėjo nukenksminimo p53 (3C pav.)}

HIF-1α nepavyksta paveikti chemosensitivity į P53
mutantas ląstelių

Norėdami patvirtinti HIF-1α priklausoma reguliavimą 5-FU reagavimą ir toliau apibūdinti p53 indėlį, mes išnagrinėjo antrąjį žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijos (MKN28), kuri atlieka missense mutaciją į TP53
kodone 251 Įdomu tai, kad išbraukta HIF-1α į MKN28 ląstelių nepavyko padidinti augimo slopinimą po kontakto su 5-FU (4a pav.) Be to, 5-FU sukeltas G _{1 kaupimas ir apoptozę MKN28 ląstelių nebuvo paveikti nuostolių HIF-1α (4B paveiksle ir 4c). Laikantis šių išvadų, baltyminiai lygiai p53 ir PRB išliko nepakitęs 5-FU gydytų MKN28 ląstelių visoje 24 h laikotarpiu ir P21 indukcija buvo išvykęs (4D pav.) Tačiau, kai p53 funkcija buvo atkurta apdirbant su cheminio junginio PRIMA-1 [24] HIF-1α nokdaunas išverstos į žymiai tvirtesnį 5-FU citotoksiškumo (S3 pav.) Atitinka nustatytas vaidmuo p53 chemoterapijos sukelta citotoksinių /citostatikais poveikis, gydymą PRIMA-1 per se
šiek tiek sumažino MKN28 ląstelių proliferaciją ir žymiai glaudesnio 5-FU veiksmingumą MKN28 ląstelių (pav S3).}

NF-κB yra svarbus tarpininkas HIF-1α vaidmens chemosensitivity

aktyvinimas NF-κB yra susijusi su apsauga nuo chemoterapijos sukelta apoptozės ir, atvirkščiai, slopindamas NF -κB gali sustiprinti antinavikiniais preparatais veiksmingumą ir vivo, parsisiųsti ir in vitro
[25] - [27]. Todėl mes nustatomas NF-κB DNR surišantis veiklą HIF-1α-trūkumas ir -proficient AGS ląstelių po gydymo 5-FU taikant elektroforezės mobilumas pamainos tyrimo (EMSA). Gydymas 5-FU stipriai aktyvuota NF-κB DNR privalomas AGS SCR ląstelių, su didžiausios koncentracijos susidaro po 6 h po kontakto su 5-FU (5a pav.) Gydymas TNF 4 val tarnavo kaip teigiamą kontrolę aktyvavimo NF-κB. Be to, supershift buvo sukeltas anti-65 psl antikūnų, patvirtinantis, kad 5-FU sukeltų NF-κB kompleksai pateikta 65-kDa subvieneto (65 psl). Praradimas HIF-1α smarkiai slopino aktyvavimo NF-κB atsakant į 5-FU ir TNF (5a pav.) Laikantis šio stebėjimo, 5-FU gydymas taip pat nepavyko sukelti NF-κB tikslines genus cIAP1 ir A20 į AGS KD ląsteles, kadangi jos buvo lengvai sukeltas AGS SCR ląstelių (5b pav.)

Jei spręsti funkcinė reikšmė NF-κB už 5-FU sukeltas augimo slopinimas, mes ekspresija 65 psl (pcDNR 65 psl) ir "AGS KD ląsteles. Transfekciją pcDNR 65 psl, bet ne tuščia kontrolė vektorius, lėmė reikšmingą indukcijos 65 psl baltymų ir NF-κB transkripcijos veiklos AGS KD ląstelių (S4 pav). Pažymėtina, HIF-1α trūkumas AGS KD ląstelės ekspresija 65 psl buvo didelis atsparesni 5-FU gydymo, palyginti su AGS KD ląstelių, į kurias įvesti valdymo vektorių (5c pav), laikantis esminio vaidmens NF-κB tarpininkaujant Atsparumas cheminėms link 5-FU skrandžio vėžio ląsteles. Kartu paėmus, suderintą aktyvavimo p53 ir slopinimo NF-κB 5-FU elgiamasi, buvo pastebėta, HIF-1α trūkumas AGS ląstelės. Norėdami išsiaiškinti, ar abi įvykiai yra tarpusavyje susiję, mes studijavo 5-FU sukeltas NF-κB aktyvavimo MKN28 ląstelių su mutantas, P53.
Abu 5-FU ir TNF aktyvuota NF-κB DNR privalomas nuo laiko priklausomu būdu, nurodant p53-nepriklausoma mechanizmus NF-κB aktyvavimo 5-FU (5d pav). Tačiau skirtis nuo AGS ląstelių pažeidimas, tai NF-κB aktyvavimo P53
mutantas ląstelių linija nebuvo užapvalintos iki HIF-1α nukenksminimą. Taigi, HIF-1α gali remti chemoterapijos sukelta NF-κB aktyvacija kovos P53-priklausomas slopinamasis mechanizmus.

Altered ROS susidarymas yra atsakingas už HIF-1α sukeltos pakeitimo p53 veiklos

Jei paaiškinti molekulinę mechanizmo, lemiančio p53 superinduction į 5-FU elgiamasi HIF-1α trūkumas ląsteles, mes charakterizavo reaktyvių deguonies formų (ROS) vaidmenį. ROS sudaro nuorodą kandidačių (I) ROS yra stiprūs aktyvatoriai p53 funkciją ir laikomos pagrindiniai veiksniai, į p53 indukcijos įvairių chemoterapiniais preparatais [28], ir (ii) HIF-1α gali slopinti ROS susidarymą mažinant mitochondrijų aktyvumą ir Biogenezė [22], [29], [30]. Taigi, AGS KD ląstelės buvo išvalytos su ROS inhibitoriai diphenyleneiodonium chlorido (dpi) arba apocynin. Abu inhibitoriai suteikti didelę apsaugą nuo 5-FU sukeltas augimo slopinimas AGS KD ląstelių (6a pav ir 6b). Be to, DPI ir apocynin beveik visiškai užkirto kelią p53 indukcijos ir jos tolesnis tikslinę p21 į 5-FU paveiktų ląstelių (6c ir 6d pav). Šie rezultatai rodo, HIF-1α signalizacijos susikirtimas su p53 tarpininkaujant atsakant į 5-FU ties ROS gamybos lygį. Norėdami nustatyti priežastinį vaidmenį HIF-1α už redokso potencialo AGS ląstelių po 5-FU gydymo, viduląstelinių ROS koncentracija buvo nustatoma AGS KD ir SCR ląstelių tėkmės citometrijos. Mes nustatėme, kad ląstelėje superoksido lygiai 5-FU gydytų AGS KD ląstelės buvo 2,5 karto didesnė nei 5-FU gydytų AGS SCR ląstelių (S5 paveikslas) rodo, kad funkcinis inaktyvacijai HIF-1α į AGS ląstelių lėmė reikšmingas ir funkcinės aukštis intraceliulinės oksidacinio streso net chemoterapinių gydymo

Diskusijos

transkripcijos faktorius HIF-1α buvo įsteigta kaip svarbus tarpininkas hipoksijos tarpininkaujant Atsparumas cheminėms [6] - [8]. , [17], [18], [20]. Čia mes nustatyti HIF-1α kaip galingas veiksnys, nustatant chemosensitivity skrandžio vėžio ląsteles pagal normoxic sąlygomis. Taikant lentivirus pagrindu siRNA sistemą mes parodysime gerokai padidinti 5-FU ir cisplatinos toksiškumą HIF-1α trūkumas skrandžio vėžio ląsteles. Laisvi duomenys apie HIF-1α vaidmenį vėžio ląstelių chemosensitivity pagal normoxic sąlygos prieštaringi. Nors HIF-1α trūkumas fibrosarkoma ląstelės (HT1080), rodomą daug didesnis jautrumas etopozido pagal aplinkos ore, storosios žarnos vėžys (HCT116) ir hepatomos (HEPA-1) ląstelės nepadarė [6]. Unruh , et al.,
Pranešė sustiprintą jautrumą HIF-1α trūkumas pelių embrioninėmis fibroblastų į karboplatinos arba etopozido pagal normoxic taip pat hipoksinio sąlygas [8]. Atsižvelgiant į skrandžio vėžio, buvo įrodyta sustiprintas veiksmingumas 5-FU ir vinkristino pagal normoxia in vitro
[18]. Na pagal mūsų rezultatus, abu tyrimai sudarė pagrindinį vaidmenį HIF-1α tarpininkavimo Atsparumas cheminėms pagal normoxic sąlygomis. Įdomu tai, kad neseniai atliktas tyrimas iš Japonijos parodė mažesnį veiksmingumą 5-FU turinčiais chemoterapija HIF-1α ekspresija žmogaus skrandžio adenokarcinoma, stiprinant HIF-1 suvokimą kaip pagrindinį veiksnį skrandžio vėžio Atsparumas cheminėms [31] nustatyti.

Valdymo vėžio progresavimo chemoterapijos remiasi bent jau iš dalies dėl indukcijos korinio senėjimo. Neseniai praradimas HIF-1α buvo įrodyta, kad sukelti priešlaikinį sočią senatvę iš imortalizuotų pelių embrioninėmis fibroblastų pagal normoxic sąlygomis [32]. Mūsų dabartinė duomenys rodo, kad HIF-1α panašiai saugo skrandžio vėžio ląsteles nuo chemoterapijos sukelto senėjimo pagal normoxic sąlygomis. Tai yra pirmasis ataskaitą padidėjusi chemoterapijos sukelto senėjimo per funkcinės nukenksminimo HIF-1α į nustatytą žmogaus vėžio ląstelių linija. Be HIF-1α trūkumas ląstelėse, mes taip pat pastebėjo, pagerėjo apoptozę indukcijos reaguojant į 5-FU. Ankstesni tyrimai pranešė, kad proapoptotic faktorius aktyvavimą Perka [6], arba į pro- ir antiapoptotic BCL-2 šeimos nariams balanso duotų paaiškinimus dėl padidėjusių apoptozę normos šiais nukenksminimo HIF-1α narkotinių gydytų skrandžio vėžio ląstelių [Keisti ,,,0],. 18]

Mūsų dabartinis tyrimas identifikuoja romaną mechanizmą, kuriuo HIF-1α neutralizuoja tiek chemoterapija sukeltos senėjimo ir apoptozė: Pristatome įtikinamų įrodymų dėl HIF-1α gebėjimu slopinti auglio slopinamojo p53 indukcijos reaguojant į 5-FU pagal normoxic sąlygomis. P53 yra pagrindinis ląstelių likimas veiksnys dėl jos vaidmenį reguliuojant ląstelių ciklą ir apoptozę reaguojant į ląstelių streso ir sudaro dažniausiai mutavo genas žmogaus vėžio [33]. Platus chemoterapiniais preparatais, pastebėta, kad stabilizuoti p53 ir, atvirkščiai, praradimas p53 yra principas mechanizmo atsparumo vėžio link chemoterapijos [33], [34]. Iš p53 ir HIF-1α sąveika buvo iš ilgalaikių diskusijų objektas, nes abu teigiami ir neigiami pranešimai buvo paskelbti [35]. Tačiau visa anksčiau skelbtas darbas dėmesio skiriama P53-HIF-1α-sąveiką pagal hipoksijos (ar net anoksinėmis) sąlygomis. Kiek mums žinoma, mūsų eksperimentai pirmą kartą pateikti įrodymų už p53 veiklos slopinimas HIF-1α pagal normoxic sąlygomis. Kaip pasekmė p53 ląstelę į HIF-1α trūkumas ląstelėse, mes jos pokyčius tolesniems vykdomuosius, kurie yra susiję su negrįžtamu ląstelių ciklo arešto charakteristika senėjimo, pavyzdžiui, P21 stabilizavimas ir hypophosphorylation iš PRB. Skirtingai nuo mūsų stebėjimo, neseniai darbą Atsparumas cheminėms į etopozido į HIF-1α-stokojančių imortalizuotų pelių embrioninėmis fibroblastų nesilaikė žinutę p21 [36] indukcijos. Be to, HIF-1α stabilizavosi p21 ir p27, taip pat paskatino hypophosphorylation iš PRB metu hipoksija sukeltas augimo arešto imortalizuotų pelių embrioninėmis fibroblastų ir pradinių blužnies B-limfocitų [37]. Šios kontrastingos rezultatai greičiausiai paaiškinti tirtų ląstelių tipų: Nors Goda ir kt
. būdingas fiziologinį atsaką į hipoksiją į netransformuotos tipų ląstelių, mes analizuojami reagavimas į didelius DNR žalą nustatytų vėžio ląstelių linijas.

Nors p53 kartą buvo įrodyta, kad neutralizuoti NF-κB funkciją [38], [39 ], mūsų dabartiniai duomenys rodo vaidmenį navikų slopintuvas į HIF-1α priklauso nuo NF-κB aktyvavimo reglamentą. Be p53 NF-κB tapo antruoju, centrinis veiksnys atsparumo link chemoterapiniais preparatais [40]. Keletas skirtingų tyrimų sukūrė funkcinius ryšius tarp NF-κB ir HIF-1α, nors jie įvairiai vieta HIF-1α arba aukštupio pusę nuo NF-κB arba atvirkščiai. Pavyzdžiui, hipoksija sukeltos stabilizavimas HIF-1α į lygiųjų raumenų ląstelėse yra po transkripcijos kontrolės NF-κB [41]. Be to, gauti iš sąlyginių IKK-beta pelç rezultatai patvirtino esminį NF-κB kontroliuoti bazinę, tiek ir hipoksijos sukeltos išraišką HIF-1α vivo
[42]. Priešingai, buvo įrodyta, kad būti kontroliuojami HIF-1α į hipoksija-slopino apoptozės neutrofilų [43] kontekste genų ekspresija NF-κB subvieneto 65 psl. Todėl mūsų išvada ženkliai sumažintas NF-κB veiklos HIF-1α trūkumas ląstelėse Gydant 5-FU yra gerai atitiko pastarojo ataskaitoje. Įdomu tai, kad mes taip pat pastebėjo gerokai sumažintas DNR privalomą NF-κB padalinių į HIF-1α-trūkumas ląstelėse po stimuliacijos TNF, gerai įsitvirtinęs induktoriaus NF-κB veiklos [44]. Tai kelia svarbus klausimas, pagal kuriuos fiziologinius ir patofiziologiniai sąlygos HIF-1α gali reguliuoti NF-κB aktyvacijos. HIF-1α ir NF-κB pasidalinti labai svarbu dėl įvairių procesų, pavyzdžiui, uždegimo, mikrobų žudymas ir Tumorigenesis. Tikslus molekulinė prigimtis, taip pat jų sąveika hierarchija yra labiausiai tikėtina, somatinių ląstelių bei nuo aplinkos priklauso ir negali būti apibendrinti.

dabartinės studijų mes galėjome tiksliai ROS kaip susikirtimo taškas HIF- 1α su p53 tarpininkaujant ląstelių streso atsakas į chemoterapiją. Ląstelės viduje ROS yra žinomas kaip stipriai induktorių p53 ir dalyvauti p53 aktyvavimo chemoterapiniais vaistais [45]. Mitochondrijos atstovauti svarbiausias šaltinis ląstelėje ROS [46], ir HIF-1α greičiausiai neutralizuoja ROS gamybą mitochondrijų lygyje per keletą mechanizmų, įskaitant slopinimo mitochondrijų biogenetyczne ir piruvato shuttling į mitochondrijas, sumažinti mitochondrijų veiklos dėl glaudesnio panaudojimo glikolizės ir aktyvacijos mitochondrijų autofagija [29], [30], [47], [48]. Anksčiau, mes sukūrėme funkcinį ryšį tarp HIF-1α kontroliuojamų mažinimo ROS ir tvirtinimo nepriklausomybės skrandžio vėžio ląstelių [22], implicating HIF-1α į skrandžio vėžio patogenezės į hipoksijos nėra. Mes dabar mano, kad HIF-1α capacitiy apriboti ROS gamybą skrandžio vėžio ląsteles, taip pat suteikia atsparumą chemoterapiniais preparatais, Veikimas per aktyvavimo p53 (6E pav.) Įdomu tai, kad vis poveikis atsparumo terapijos per moduliavimo p53 ir ROS taip pat buvo pranešta apie HIF-2α [49]. Į HIF-alfa izoformų 1 ir 2 rodo platų persipynimą tariamų HIF tikslus ir įpareigojantis hipoksinės reagavimo elementų ir tikrą paskirstymo hipoksijos sukeltos poveikių arba izoformos yra ne visada įvykdomas [50]. BERTOUT , et al.,
Parodė, kad slopina HIF-2α didina spinduliuotės sukeltos apoptozės per ROS kaupimo ir tolesnio padidinimo p53 veiklos [49]. Be to, Roberts , et al.,
Parodė, kad pasipriešinimas chemoterapijos dalinai keisdamas HIF-2α sąlygojamą slopinimo p53 inkstų ląstelių karcinomai ląstelių [51]. Taigi, tuo pačiu pranešta pastabos garantuojate tyrimą dėl galimo vaidmens HIF-2α, užduotį, kurią šiuo metu vyksta mūsų laboratorijoje.

Atsižvelgiant į klinikinį poreikį nustatyti reagavimo prognostinius galimų gydymo būdų, mūsų rezultatai potencialiai gali tiesiogiai jį apdorojant sprendimai: viena vertus, žinios apie HIF-1α raiškos galėtų nukreipti narkotikų, kad daugiausia veikia per p53 nepriklausomas mados pasirinkimas. Kita vertus, tam tikras nauda gali būti gaunama iš derinant HIF-1-inhibitorių ir DNR žalingų medžiagų (pvz 5-FU) ir vėžio ryšys su funkcine p53. Ir atvirkščiai, gali Numatoma sumažinta veiksmingumas HIF-1-inhibitoriais reikia gydyti p53 trūkumais navikų, aspektą, kurie gali būti stulbinantis veiksnys klinikinių tyrimų HIF-1α slopina apdorojimo režimus.

Medžiagos ir metodai

Mobilusis kultūra ir chemikalai

AGS (CRL-1739, ATCC, Rokvilis, Merilandas, JAV) ir MKN28 (JCRB Mobilusis bankas, Tokijas, Japonija) ląstelės buvo auginamos kaip monomolekulinių sluoksnių kultūrų standartinio vidutinio , Karta AGS ir MKN28 ląstelių stabiliai išreiškiančius arba siRNR konkrečiai skirta HIF-1α (triuškinantis "KD") arba neapibrėžtas kontrolė siRNR (plakta "MKR) buvo paskelbtas anksčiau [22]. 5-fluorouracilu (5-FU), CIS-Diammineplatinum (II) dichlorido (cisplatinos) ir superoksido anijonas inhibitoriai diphenyleneiodonium chloridas (dpi) ir apocynin buvo įsigytas iš Sigma-Aldrich (Vokietija) ir ištirpinama DMSO. PRIMA-1 (už p53-atgaivinimui ir indukcijos masyvi apoptozės) buvo gauta iš Tocris biomokslų (ELLISVILLE, Misūris, JAV) ir ištirpinama steriliu vandeniu. Automobilio valdymo tirpiklių buvo įtrauktas į visų eksperimentų.

ląstelių proliferacija tyrimas

nustatymui ląstelių augimą, 3 × 10 ^{4 ląstelės buvo pasėjamos trimis egzemplioriais į 24-duobučių lėkštelėse, leidžiama pridėti 16 valandų ir tada apdoroti, kaip nurodyta pagal normoxic arba hipoksinių sąlygomis. Po gydymo, ląstelės buvo tripsinizuojamos ir gyvybingos ląstelės buvo skaičiuojami naudojant hemocitometru.}

nustatymas ląstelių ciklo skirstymo ir apoptozės tėkmės citometrijos pervežimas

ląstelės ciklo paskirstymo įskaitant pasirengimo G _{1 frakcija buvo nustatytas iš DNR histogramos, kaip aprašyta [52]. Apoptozė taip pat buvo kiekybiškai nuo aptikimo aktyvus, suskaldyti kaspazės-3 tėkmės citometrijos naudojant Alexa Fluor® 488 konjuguoto antikūno (Mobilusis Signalizacijos technologija, Danvers, Masačusetsas, JAV).}

kiekybinis senėjimo

senescence susijęs β-galaktozidazė veikla buvo vertinama cytospin preparatų taip, kaip aprašyta [53].

Imunoblotingas

Sveikos ląstelių fragmentai buvo parengta kaip aprašyta anksčiau [52], tada nutarė ant 10% natrio laurilsulfatas-poliakrilamido gelyje ir perkelti ant nitroceliuliozės (Amersham Biosciences, Freiburg, Vokietija). Dėmės buvo tyrinėjo su antikūnų prieš p53 ir CDK2 (Santa Cruz Biotechnologijos, Santa Cruz, Kalifornija, JAV), P21 (onkogeno RESEARCH produktai, Bad Soden, Vokietija), cikloniniai A (Šiaurinė, Temecula, Kalifornija, JAV), PRB (BD Pharmingen Heidelberg, Vokietija), MDM2 (Calbiochem, San Diegas, Kalifornija, JAV), 65 psl (Mobilusis Signalizacijos technologijos) ir aktino (Sigma-Aldrich). Antriniai antikūnai, konjuguoto su krienų peroksidazės (Dianova, Hamburgas, Vokietija) ir peroksidazės aktyvumo buvo ryškinamos naudojant Vakarų Žaibas cheminės liuminescencijos reagentų Plus (Perkino Elmer Gyvosios gamtos mokslai, Bostonas, Masačusetsas, JAV).

Kiekybiniai realaus laiko PGR analizė

realaus laiko PGR metodu, bendras ląstelių RNR buvo ekstrahuojamas Trizol reagento (Invitrogen, Karlsruhe, Vokietija). Pirma dalis kDNR buvo susintetintas su oligo (dT) gruntas ir viršutinis indeksas ™ First Strand sintezė sistemos (Invitrogen). Kiekybinis realaus laiko PGR analizė buvo atlikta naudojant TaqMan PGR Universal pagrindinio mišinio (už beta-aktino) arba SYBR GREEN PCR Master Mix (už A20 ir cIAP1 Taikomoji BIOSYSTEMS, Darmstadt, Vokietija). Gruntas sekos yra tiekiamas S1 lentelėje. Normalizuoti įvesties RNR kiekį, PGR reakcijos buvo padaryta su zondu ir gruntai beta-aktino.

Laikina transfekcija ir žurnalistė liuciferazė tyrimas

laikini transfekcija apie AGS ląstelių buvo atliekami naudojant Effectene transfekcijq reagentas (Qiagen, Hilden, Vokietija) pagal gamintojo protokolą. Dėl raiškos tyrimus, ląstelės buvo pasėtos ne 3 × 10 ^{4 ląstelių /24-gerai ir perkeltų su 100 ng pcDNR HIF-1α ar pcDNR 65 psl (pagal Wanja Bernhardt Universitätsklinikum Erlangen, Erlangen, Vokietija maloniai numatyta) (maloniai jei iki Hiroyasu Nakano, Jutendo universiteto, Tokijas, Japonija), atitinkamai. Dėl HRE arba NF-κB liuciferazės testą, 3 × 10 4 ląstelių /24-pat buvo bendrai Transfekuoti 100 ng pHRE-Luc (dovana Randall S. Johnson, UCSD, San Diego, Kalifornija, JAV) arba IgκB-Luc (dovana Florian R. Greten Technische Universität München, München, Vokietija) ir 30 ng phRL null (Promega, Manheimas, Vokietija). Liuciferazė aktyvumas buvo matuojamas su Dual liuciferazės reporterio testą sistemos (Promega), kaip aprašyta [54]. Norint pasiekti trumpalaikį p53 slopinimas, AGS ląstelės buvo pernešta esant 30% santakos su 75 arba 150 nmol /L si p53, ( Duslintuvas
Pasirinkite siRNA, Taikomosios BIOSYSTEMS) ir analizuojami 48 val po transfekciją. Nespecifinis siRNR (SI SCR, Eurogentec, Sereno miesto, Belgija) buvo naudojama kaip kontrolė.}

elektroforeziniai mobilumas perėjimas analizė (EJSA)

Branduolinės baltymų ekstraktai paruoštas kaip aprašyta [54]. EJSA buvo atliktas anksčiau aprašytas [55], naudojant 8 mikrogramai branduolinės baltymų ir 100 fmol /l galutinio radioaktyvaus 22 bp dvigubo dideles NF-κB sutarimas oligonucelotide (pirmyn skyrius: 5'-AGT TGA ggg GAA TTT BMK AGG C- 3 "; E3292, Promega). Mėginiai buvo elektroforezės būdu ant ne-denatūravimo 5% poliakrilamido gelyje.

• PLoS ONE: Tegul-7 MicroRNA Šeimos selektyviai išskiriamas į tarpląstelinio Aplinkos per Exosomes į skrandžio vėžiui ląstelių linija
• PLoS ONE: Aukštas įvairovė Vaca CagA Helicobacter pylori genotipų Pacientai su ir be Skrandžio Cancer