PLoS ONE: hypoxia-induceerbare factor 1α Bepaalt maagkanker chemogevoeligheid via modulatie van p53 en NF-κB

De abstracte

Achtergrond

Minder chemosensitivity van vaste kankercellen vormt een cruciale obstakel in klinische oncologie . Vandaar dat de moleculaire karakterisering van pathways reguleren chemogevoeligheid is een absolute voorwaarde voor kankerbehandeling. De hypoxia-induceerbare factor HIF-1α is gekoppeld aan chemosensitivity terwijl de onderliggende moleculaire mechanismen grotendeels ongrijpbaar. Daarom hebben we uitvoerig geanalyseerd rol van HIF-1α in het bepalen van chemosensitivity gericht op verantwoorde moleculaire pathways.

Methodologie en belangrijkste bevindingen

RNA interferentie werd toegepast op HIF-1α of p53 inactiveren in het menselijk maagkanker cellijnen AGS en MKN28. De chemotherapeutische middelen 5-fluoruracil en cisplatine werden gebruikt en chemosensitivity werd beoordeeld door celproliferatie assays en bepaling van celcyclusverdeling en apoptose. Expressie van p53 en p53 doeleiwitten werd geanalyseerd door western blot. NF-KB-activiteit werd gekarakteriseerd door middel van elektroforetische mobiliteit verschuiving assay. Inactivering van HIF-1α bij maagkanker cellen resulteerde in robuuste verhoging van chemosensitivity. Dienovereenkomstig weergegeven HIF-1α-competente cellen een significante afname van chemotherapie-geïnduceerde senescentie en apoptose. Opvallend dit fenotype was volledig afwezig in p53
mutant cellen terwijl inactivatie van p53 per se
had geen invloed op chemosensitivity. HIF-1α duidelijk onderdrukt door chemotherapie geïnduceerde activering van p53 en p21 en de retinoblastoma eiwit, waardoor uiteindelijk de celcyclus. Verminderde vorming van reactieve zuurstof species in HIF-1α-competente cellen werd geïdentificeerd als het moleculaire mechanisme van HIF-1α-gemedieerde remming van p53. Verder verlies van HIF-1α ingetrokken, in een p53-afhankelijke wijze, door chemotherapie geïnduceerde DNA-binding van NF-KB en expressie van anti-apoptotische NF-KB doelgenen. Dienovereenkomstig, reconstructie van de NF-KB-subunit p65 omgekeerd de toegenomen chemosensitivity van HIF-1α-deficiënte cellen.

Conclusie en betekenis

Kortom, we geïdentificeerd HIF-1α als een krachtige regulator van p53 en NF-KB-activiteit onder omstandigheden van genotoxische stress. We concluderen dat
p53-mutaties in humane tumoren kunnen potentieel de effectiviteit van HIF-1-remmers verwarren bij kankertherapie

Citation:. Rohwer N, C Dame, Haugstetter A, B Wiedenmann , Detjen K, Schmitt CA, et al. (2010) hypoxia-induceerbare factor 1α Bepaalt maagkanker chemogevoeligheid via modulatie van p53 en NF-KB. PLoS ONE 5 (8): e12038. doi: 10.1371 /journal.pone.0012038

Editor: Deb Fox, The Research Institute for Children in het Children's Hospital New Orleans, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 28 april 2010; Aanvaard: 19 juli 2010; Gepubliceerd: 10 augustus 2010

Copyright: © 2010 Rohwer et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de) naar TC (CR 133 /2-1, 133 /2-2 en 133 /2-3), en NR (Graduiertenkolleg 276/4 - "Signalerkennung und -umsetzung"). TC werd ook gesteund door een subsidie ​​van de Berliner Krebsgesellschaft e.V. (Http://www.berliner-krebsgesellschaft.de, CRFF200804). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Intrinsieke en verworven resistentie zijn de belangrijkste oorzaken van beperkte effectiviteit van chemotherapie bij de meeste gastrointestinale maligniteiten, met inbegrip van maagkanker [1], [2]. Geneesmiddelenresistentie is een complex fenomeen multifactorieel betrekking tot tumor micro, b.v. hypoxie, acidose en ontsteking en de neoplastische cellen zelf [3]. Cellulaire resistentie kan samen met het specifieke genetische achtergrond van de tumor cel of het gevolg zijn van mutaties en epigenetische veranderingen na antiproliferatieve therapie [4], [5].

De transcriptiefactor hypoxia-induceerbare factor 1 (HIF-1 ) is een cruciale regulator van cellulaire aanpassing aan hypoxie en is betrokken bij resistentie [6] - [8]. HIF-1-eiwit is een heterodimeer bestaande uit een constitutief tot expressie β-subeenheid (ARNT (arylkoolwaterstofreceptor nucleaire translocator)) en een hypoxia-induceerbare α-subeenheid [9]. Onder normoxische omstandigheden, kan HIF-1α activiteit wordt geïnduceerd door verschillende groeifactoren, cytokines, geactiveerde oncogenen of loss-of-function gemuteerde tumorsuppressorgenen [10]. HIF-1α is een centrale rol in verschillende aspecten van tumorigenese waaronder tumorcel proliferatie, angiogenese, metastase, en de respons op chemo- en radiotherapie [11]. HIF-1α overexpressie in een groot aantal vaste tumoren en tumorale HIF-1α expressie wordt vaak geassocieerd met een slechte prognose [12] - [15]. Bovendien remming van HIF-1α via RNA interferentie of farmacologische samenstelling heeft bewezen antitumorale werkzaamheid bij verschillende murine modellen van kanker [16]. Een bijdrage van HIF-1α om chemoresistance van neoplastische cellen is waargenomen in een breed spectrum van solide tumoren, waaronder maagkanker [6] - [8], [17] - [20]. De onderliggende moleculaire mechanismen en de rol van HIF-1α voor geneesmiddelresistentie onder normoxische omstandigheden blijven grotendeels ongrijpbaar [8], [18], [21]. Hier brengen we onderdrukking van p53 en bevordering van de kernfactor KB (NF-KB) activiteit als centrale mechanismen HIF-1α de gevoeligheid bepalende rol tegen 5-fluorouracil (5-FU) en cisplatine in menselijke maagkanker cellen.

Resultaten

HIF-1α bepaalt gevoeligheid van maagkanker cellen in de richting van de chemotherapeutica 5-FU en cisplatine

Functionele inactivatie van HIF-1α werd bereikt door lentivirale transductie van AGS en MKN28 cellen met kleine interfererende RNA (siRNA) specifiek gericht HIF-1α. Deze experimentele benadering leverde een zeer efficiënte knockdown aangetoond door een bijna volledige mislukking van getransduceerde cellen om HIF-1α induceren als reactie op hypoxie zoals eerder [22] gepubliceerd. Om het belang van HIF-1α de gevoeligheid van menselijke maagkanker cellen gedraagt ​​naar de chemotherapeutische middelen te evalueren, vergeleken we de effecten van 5-FU en cisplatine in HIF-1α-competent (scrambled "SCR") en HIF-1α-deficiënte (knock-down, "KD") AGS cellen. Functionele inactivering van HIF-1α verplaatste de dosisafhankelijkheid van groeiremming naar lagere concentraties van het geneesmiddel (Figuur 1A en Figuur S1), wat suggereert dat HIF-1α kan chemotherapie gevoeligheid van maagkanker cellen verminderen onder normoxische omstandigheden. Overeenkomstig eerdere verslagen [6] - [8], [17], [18], blootstelling aan hypoxie verhoogde resistentie tegen 5-FU in AGS cellen echter inactivering van HIF-1α resulteerde in robuuste verhoging van chemosensitivity onder hypoxische omstandigheden ( figuur S2). Complementair benadering hebben we de gevolgen van overexpressie HIF-1α (pcDNA HIF-1α) voor de chemische gevoeligheid van AGS cellen. AGS overexpressie HIF-1α waren aanzienlijk meer resistent tegen behandeling met 5-FU (Figuur 1B). Stabiele HIF-1α expressie werd bevestigd door HRE (hypoxia responsief element) luciferase reporter assay (figuur 1C). Deze resultaten suggereren sterk dat HIF-1α beperkt de cytotoxische werking van 5-FU en cisplatine bij menselijke maagkanker cellen en inactivering van HIF-1α kan gunstige effecten op chemogevoeligheid hebben.

HIF-1α grenzen chemotherapie-geïnduceerde celcyclus en apoptose via onderdrukking van p53

We begonnen met een karakterisering van de waargenomen groeiremming door het analyseren van de celcyclus distributie patronen na chemotherapie. G _{1-gesynchroniseerde, serum uitgehongerde cellen werden AGS vrijgelaten uit G 0 /G 1 fase door toevoeging van serum en celcyclus profielen werden bepaald na toevoeging van 5-FU. Vrijgegeven kweken van onbehandelde AGS gemakkelijk doorliep G 1 in S en G 2 /M fasen [22], terwijl 5-FU-behandelde cellen in G 1 fase (niet getoond) bleef. Interessant is dat de 5-FU-afhankelijke retentie van cellen in G 1 fase aanzienlijk verhoogd in vergelijking met AGS KD AGS SCR cellen, consistent met G 1 celcyclus (Figuur 2A). Irreversibele celcyclus voren gekomen als een belangrijke werkingswijze van antiproliferatieve middelen en wordt gekenmerkt door cellulaire kenmerken van senescentie [7], [23]. Dienovereenkomstig, de fractie van verouderde cellen werd bepaald. Inderdaad, behandeling met 5-FU leidt tot een robuuste inductie van senescentie bij AGS cellen. Deze respons was significant verhoogd in cellen met gelijktijdig verlies van HIF-1α (figuur 2B). Bovendien inductie van apoptose werd voorgesteld door een verhoogd pre G 1 fractie DNA histogrammen van 5-FU behandelde AGS KD cellen (niet getoond). Daarom is een kwantitatieve analyse van de apoptotische celfractie werd verkregen gebaseerd op de detectie van gesplitst caspase-3 (Figuur 2C). Consistent met de gegevens op celcyclusverdeling, werd de 5-FU-geïnduceerde apoptotische fractie aanzienlijk toegenomen in HIF-1α-deficiënte AGS KD cellen in vergelijking met HIF-1α-competente cellen.}

-chemotherapie geïnduceerde senescentie en apoptosis zowel zijn nauw verbonden met de tumor suppressor p53
. Zo hebben we de hypothese dat p53 kan bijdragen tot verhoging van de cytotoxiciteit van 5-FU bij verlies van HIF-1α. Na 5-FU behandeling p53 proteïne geleidelijk verzameld in AGS cellen een effect dat opvallend werd verhoogd in HIF-1α-deficiënte AGS-cellen (Figuur 2D). Deze stabilisatie van p53 geassocieerd met verhoogde niveaus van het cycline-afhankelijke kinase (CDK) inhibitor p21, een gevestigde transcriptioneel doel en stroomafwaartse effector van p53 met functies in de celcyclus, inductie senescentie en apoptose (figuur 2D). Nogmaals, HIF-1α-deficiënte AGS cellen vertoonden een aanzienlijk sterkere toename van p21 dan HIF-1α-bedreven AGS cellen. Sterke inductie van p21 wordt verwacht dat de activiteit van G _{1 cycline /CDK complexen, waardoor hypophosphorylation van retinoblastoomeiwit (pRb) en niet-S-fase induceren cyclinen, b.v. remmen cycline A. Inderdaad, zowel pRb hypophosphorylation verkleinde cycline A werden bevestigd in 5-FU-behandelde cellen AGS KD en - in mindere mate - ook AGS SCR-cellen (Figuur 2D). Deze wijzigingen bevestigen de G 1 fase retentie waargenomen bij DNA histogrammen en zijn consistent met de onomkeerbare G 1 arrestatie waargenomen in chemotherapie-geïnduceerde senescentie. Dus de verschillende biologische uitkomsten van 5-FU behandeling HIF-1α-deficiënte en -proficient AGS cellen ontstaan ​​door differentiële regulatie van p53 en p21 downstream doelgenen.}

Inactivatie van p53 pareerde de rol van HIF-1α voor chemosensitivity

Om experimenteel bewijs te verkrijgen voor de voorgestelde rol van p53 in-HIF-1α gemedieerde regulering van de chemosensitivity in AGS cellen, we functioneel geïnactiveerd p53 door RNA interferentie met behulp van voorbijgaande transfectie van anti-p53 siRNA (si p53) , of een vervormd controle siRNA (si scr). P53 was efficiënt neergeslagen, zoals aangegeven door het falen van de getransfecteerde cellen aan de effectors p53 p21 en MDM2 in induceren tot 5-FU behandeling (Figuur 3A). Interessant AGS KD cellen getransfecteerd met p53 si waren significant minder gevoelig voor groeiremming door 5-FU dan AGS KD cellen getransfecteerd met controle-siRNA (figuur 3B). Overeenkomstig deze bevindingen, G _{1 celcyclus en apoptose retentie van 5-FU behandelde AGS KD cellen werden verminderd met p53 knockdown in vergelijking met cellen die met controle siRNA (Figuur 3D en 3E). In scherp contrast, werd chemosensitivity van HIF-1α-bedreven AGS cellen niet beïnvloed door inactivatie van p53 (figuur 3C).}

HIF-1α niet aan chemosensitivity in p53
mutant cellen

de HIF-1α-afhankelijke regulatie van 5-FU reactiviteit te bevestigen en verder te karakteriseren de bijdrage van p53 onderzochten wij een tweede menselijke maagkanker cellijn (MKN28), die een missense mutatie draagt ​​in TP53
codon 251. Interessant deletie van HIF-1α in MKN28 cellen niet de groeiremming na blootstelling aan 5-FU (Figuur 4A) versterken. Op dezelfde 5-FU-geïnduceerde G _{1 accumulatie en apoptose van MKN28 cellen werden niet beïnvloed door het verlies van HIF-1α (Figuur 4B en 4C). In lijn met deze bevindingen, het eiwit niveaus van p53 en pRb bleef onveranderd in 5-FU behandelde MKN28 cellen gedurende de 24 uur periode, en p21 inductie afwezig was (figuur 4D). Echter, wanneer p53 functie werd hersteld door voorbehandeling met de chemische verbinding PRIMA-1 [24] HIF-1α knockdown vertaald in een aanzienlijk verbeterde 5-FU cytotoxiciteit (figuur S3). Overeenstemming zijn met de rol van p53 in chemotherapie-geïnduceerde cytotoxische /cytostatische effecten, behandeling met PRIMA-1 zodanig
enigszins verminderde de proliferatie van cellen en MKN28 aanzienlijk verbeterd de effectiviteit van 5-FU in MKN28 cellen (Fig S3).}

NF-KB is een belangrijke mediator van de rol van HIF-1α in chemosensitivity

Activering van NF-KB wordt geassocieerd met bescherming tegen door chemotherapie geïnduceerde apoptose en omgekeerd inhibitie van NF -κB kan de effectiviteit van anti-neoplastische middelen te verbeteren, zowel in vivo Kopen en in vitro
[25] - [27]. Daarom bepaalden wij NF-kB DNA-bindingsactiviteit van HIF-1α-deficiënte en -proficient AGS cellen na behandeling met 5-FU door elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA). Behandeling met 5-FU krachtig geactiveerde NF-KB DNA-binding in AGS SCR cellen met piekniveaus wordt 6 h na blootstelling aan 5-FU (Figuur 5A). Behandeling met TNFa gedurende 4 uur diende als positieve controle voor de activering van NF-KB. Verder werd een supershift geïnduceerd door een anti-p65 antilichaam bevestigde dat 5-FU geïnduceerde NF-KB complexen bevatte de 65 kDa subeenheid (p65). Verlies van HIF-1 remde significant activatie van NF-kB als reactie op 5-FU en TNFa (figuur 5A). In overeenstemming met deze waarneming, 5-FU behandeling ook nagelaten om de NF-KB-target genen cIAP1 en A20 in AGS KD cellen te induceren, terwijl ze gemakkelijk werden geïnduceerd in AGS SCR-cellen (Figuur 5B).

Om het adres functionele betekenis van NF-KB voor 5-FU geïnduceerde groeiremming, overexpressie we p65 (p65 pcDNA) in AGS KD cellen. Transfectie van pcDNA p65, maar niet de lege controlevector, resulteerde in een significante inductie van p65 eiwit en NF-KB transcriptionele activiteit in AGS KD cellen (figuur S4). We merken op HIF-1α-deficiënte AGS KD overexpressie p65 waren aanzienlijk beter bestand tegen 5-FU behandeling vergeleken met AGS KD cellen die met de controlevector (figuur 5C), consistent met een essentiële rol van NF-KB bij het mediëren chemoresistentie richting 5-FU bij maagkanker cellen. Tezamen een gelijktijdige activering van p53 en remming van NF-KB in 5-FU-behandelde, HIF-1α-deficiënte AGS cellen waargenomen. Om te verduidelijken, of beide gebeurtenissen van elkaar afhankelijk zijn, bestudeerden we 5-FU-geïnduceerde NF-KB activering in MKN28 cellen met gemuteerde p53.
Beide 5-FU en TNFa geactiveerd NF-KB DNA-binding in een tijd- afhankelijke manier, wat aangeeft p53-onafhankelijke mechanismen van NF-KB-activering door 5-FU (figuur 5D). Echter, anders dan de vaststelling in AGS cellen, deze NF-KB-activering in de p53
mutant cellijn werd niet afgestompt door HIF-1α inactivatie. Aldus kan HIF-1α-chemotherapie-geïnduceerde NF-KB-activering ondersteunen door het tegengaan van p53-afhankelijke remmende mechanismen.

Altered ROS vorming verantwoordelijk voor HIF-1α geïnduceerde modificatie van p53 activiteit

To verduidelijken de onderliggende moleculaire mechanisme p53 superinductie in 5-FU-behandelde HIF-1α-deficiënte cellen, met het kenmerk we de rol van reactieve zuurstofverbindingen (ROS). ROS vormen een kandidaat verbinding (i) ROS zijn krachtige activatoren van p53 functie en als belangrijke factoren bij de inductie van p53 door verschillende chemotherapeutische middelen [28], en (ii) HIF-1α kan ROS generatie onderdrukken door het verminderen van mitochondriale activiteit en biogenese [22], [29], [30]. Dienovereenkomstig werden AGS KD cellen voorbehandeld met de ROS-remmers diphenyleneiodonium chloride (DPI) of apocynin. Beide remmers verleende significante bescherming tegen 5-FU geïnduceerde groeiremming in AGS KD cellen (Figuur 6A en 6B). Verder DPI en apocynin bijna volledig verhinderd de inductie van p53 en p21 downstream doelgenen in 5-FU-behandelde cellen (figuur 6C en 6D). Deze resultaten suggereren een kruispunt van HIF-1α signalering met de p53-gemedieerde respons op 5-FU op het niveau van ROS productie. Een causale rol van HIF-1α stellen voor de redoxpotentiaal van AGS cellen na 5-FU behandeling werden intracellulaire ROS levels in AGS KD en SCR cellen bepaald met flowcytometrie. We vonden dat de intracellulaire superoxide niveaus 5-FU behandelde AGS KD cellen 2,5-voudig hoger dan die 5-FU behandelde AGS SCR cellen (figuur S5) dat aangeeft dat functionele inactivering van HIF-1α in AGS cellen resulteerde in significant en functionele verhoging van de intracellulaire oxidatieve stress, zelfs onder chemotherapeutische behandeling

Discussie

De transcriptiefactor HIF-1α is opgericht als belangrijke mediator van hypoxie-gemedieerde chemoresistance [6] - [8]. , [17], [18], [20]. Hier identificeren we HIF-1α als krachtige determinant van chemosensitivity bij maagkanker cellen onder normoxische omstandigheden. Door een lentivirus gebaseerde siRNA systeem tonen we aanzienlijk verbeterd 5-FU en cisplatine toxiciteit bij HIF-1α-deficiënte cellen maagkanker. Beschikbare gegevens over de rol van HIF-1α de chemische gevoeligheid van kankercellen onder normoxische omstandigheden conflicteren. Hoewel HIF-1α-deficiënte fibrosarcoomcellen (HT1080) weergegeven significant verhoogde gevoeligheid voor etoposide onder omgevingslucht, colonkanker (HCT116) en hepatoma (Hepa-1) cellen niet gedaan [6]. Unruh et al.
Gemelde verhoogde gevoeligheid van HIF-1α-deficiënte muis embryonale fibroblasten carboplatine en etoposide onder normoxische en hypoxische condities [8]. Wat maagkanker, verhoogde werkzaamheid van 5-FU en vincristine werd aangetoond onder normoxie in vitro
[18]. Welnu, in lijn met onze resultaten, zowel studies concludeerde een centrale rol voor HIF-1α in het bemiddelen chemoresistance onder normoxische omstandigheden. Interessant is dat een recente studie uit Japan toonde lagere effectiviteit van 5-FU-gebaseerde chemotherapie in HIF-1α-expressie humane gastrische adenocarcinomen, versterking van de waarneming van HIF-1 als een belangrijke factor bij het bepalen van maagkanker chemoresistance [31].

Controle progressie van kanker door chemotherapie gebaseerd tenminste gedeeltelijk op de inductie van cellulaire senescentie. Onlangs, verlies van HIF-1α bleek voortijdige veroudering van geïmmortaliseerde muriene embryonale fibroblasten onder normoxische omstandigheden [32] veroorzaken. Onze huidige gegevens suggereren dat HIF-1α op dezelfde manier bewaakt maagkanker cellen tegen chemotherapie-geïnduceerde senescence onder normoxische omstandigheden. Dit vormt het eerste verslag van de verhoogde chemotherapie-geïnduceerde senescence via functionele inactivatie van HIF-1α in een bestaande kanker bij de mens cellijn. In HIF-1α-deficiënte cellen, we waargenomen verbeterde inductie van apoptose in respons op 5-FU. Vorige studies reactivering van de pro-apoptotische factor Bid [6], of een verandering van het evenwicht van pro- en anti-apoptotische Bcl-2 familieleden verantwoordelijk voor verhoogde apoptose tarieven na inactivering van HIF-1α in met geneesmiddel behandelde maagkanker cellen [ ,,,0],. 18]

de huidige studie identificeert een nieuw mechanisme waarbij HIF-1α neutraliseert zowel chemotherapie geïnduceerde senescentie en apoptose: We presenteren overtuigend bewijs voor het vermogen van HIF-1α aan de inductie van de tumorsuppressor p53 onderdrukken in reactie op 5-FU onder normoxische omstandigheden. P53 is een belangrijke determinant lot van de cel vanwege zijn rol bij het reguleren van celcyclus progressie en apoptose in reactie op cellulaire stress en vormt het meest gemuteerde gen bij menselijke kanker [33]. Een grote verscheidenheid van chemotherapeutische middelen bleken p53 stabiliseren en, omgekeerd, het verlies van p53 is een voornaamste resistentiemechanisme kanker chemotherapie richting [33], [34]. De interactie van p53 en HIF-1α is onderwerp van langdurige debatten zowel positieve als negatieve rapporten [35] is gepubliceerd. De gehele vroegere publicaties gericht op p53-HIF-1α-interacties onder hypoxische (of zuurstofloze) omstandigheden. Om het beste van onze kennis, onze experimenten voor het eerst het bewijs leveren voor de onderdrukking van de p53-activiteit door HIF-1α onder normoxische omstandigheden. Als gevolg van p53 opregulatie in HIF-1α-deficiënte cellen zagen we veranderingen effectoren die gekoppeld zijn aan de onomkeerbare celcyclus kenmerk van senescentie, b.v. p21 stabilisatie en hypophosphorylation van pRb. Verschillende van onze waarneming, heeft recent werk op chemoresistance richting etoposide in HIF-1α-deficiënte muizen vereeuwigd embryonale fibroblasten geen inductie van p21 [36] in acht nemen. Ook HIF-1α gestabiliseerd p21 en p27 evenals leidden tot hypophosphorylation van pRb tijdens hypoxie-geïnduceerde groeistop van vereeuwigd muizen embryonale fibroblasten en primaire milt B-lymfocyten [37]. Deze contrasterende resultaten zijn het meest waarschijnlijk te verklaren door de onderzochte celtypes: Terwijl Goda et al
. kenmerk een fysiologische respons op hypoxia in niet-getransformeerde celtypen, analyseerden we de reactie op een ernstige DNA schade in gevestigde kankercellijnen.

Terwijl p53 herhaaldelijk aangetoond dat NF-KB-functie [38], [39 tegengaan ] onze huidige gegevens wijzen op een rol van het tumor suppressor in de regulatie van HIF-1α afhankelijke NF-KB activering. Afgezien van p53, is NF-KB naar voren gekomen als een tweede, centrale determinant van resistentie tegen chemotherapeutische middelen [40]. Verschillende studies hebben functionele verbanden tussen NF-kB en HIF-1α vastgesteld, hoewel zij variabele plaatsen HIF-1α upstream van NF-KB of vice versa. Bijvoorbeeld, door hypoxia geïnduceerde stabilisatie van HIF-1α in gladde spiercellen onder transcriptionele controle van NF-KB [41]. Evenzo resultaten van voorwaardelijke IKK-β knockout muizen bevestigde de sleutelrol van NF-KB bij het beheersen basale hypoxia-geïnduceerde expressie van HIF-1α In vivo
[42]. Omgekeerd genexpressie van de NF-kB p65 subeenheid werd aangetoond worden gecontroleerd door HIF-1α in de context van hypoxie onderdrukt apoptose van neutrofielen [43]. Onze bevinding van een aanzienlijk verminderde NF-KB-activiteit in HIF-1α-deficiënte cellen na behandeling met 5-FU conclusie is dan ook in overeenstemming met dit laatste rapport. Interessant zagen we ook significant verminderd DNA bindingsactiviteit van NF-kB subeenheden in HIF-1α-deficiënte cellen na stimulatie met TNFa, een gevestigde inductor van NF-KB-activiteit [44]. Dit roept de vraag pertinente waaronder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden HIF-1α kan NF-KB-activering reguleren. HIF-1α en NF-KB delen vitaal belang voor verschillende processen zoals ontsteking, microbiële doding en tumorigenese. De precieze moleculaire aard en de hiërarchie van hun interactie is zeer waarschijnlijk cel- en contextafhankelijk en kan niet worden gegeneraliseerd.

In de huidige studie konden we ROS lokaliseren als snijpunt van HIF- 1a met de p53-gemedieerde cellulaire stress respons op chemotherapie. Intracellulair ROS zijn bekend als krachtige inductoren van p53 en deelnemen bij de activering van p53 door chemotherapeutische middelen [45]. Mitochondriën vormen de belangrijkste bron van intracellulaire ROS [46], en HIF-1α tegengaat waarschijnlijk ROS productie op het niveau van mitochondriën via meerdere mechanismen, waaronder remming van mitochondriale biogenese en van pyruvaat pendelt in de mitochondriën, de vermindering van mitochondriale activiteit als gevolg van een betere benutting van de glycolyse en activering van mitochondriale autofagie [29], [30], [47], [48]. Eerder hebben we een functioneel verband tussen HIF-1α-gecontroleerde vermindering van ROS en de verankering onafhankelijkheid van maagkanker cellen [22], impliceert HIF-1α in de pathogenese van maagkanker bij afwezigheid van hypoxie. We zien nu dat de capacitiy van HIF-1α aan ROS productie van maagkanker cellen te beperken verleent eveneens resistentie tegen chemotherapeutische middelen die werken via activatie van p53 (figuur 6E). Interessant toenemende effecten op therapieresistentie via modulatie van p53 en ROS zijn ook gemeld voor HIF-2α [49]. HIF-α isovormen 1 en 2 tonen een brede overlap in HIF vermeende doelen en binding aan hypoxische respons elementen en bepaalde verdeling van hypoxie-geïnduceerde effecten ofwel isovorm is niet altijd accomplishable [50]. BERTOUT et al.
Aangetoond dat remming van HIF-2α verhoogt straling geïnduceerde apoptose via ROS accumulatie en de daaropvolgende vergroting van p53 activiteit [49]. Bovendien, Roberts et al.
Gebleken dat resistentie tegen chemotherapie gedeeltelijk gemedieerd door HIF-2α-geïnduceerde inhibitie van p53 in niercelcarcinoom cellen [51]. Vandaar dat de hierbij gemelde waarnemingen rechtvaardigen onderzoek naar de mogelijke rol van HIF-2α, een taak die momenteel aan de gang in ons laboratorium.

In het licht van de klinische noodzaak tot respons voorspellers te identificeren naar beschikbare behandelmogelijkheden, onze resultaten zou kunnen besluiten directe behandeling: enerzijds kennis van HIF-1α overexpressie kan een keuze van geneesmiddelen die voornamelijk werken in een p53-onafhankelijke wijze leiden. Anderzijds kan een bijzonder nuttig resultaat van het combineren van HIF-1-remmers en DNA-beschadigende middelen (bijvoorbeeld 5-FU) bij kankers met functioneel p53. Omgekeerd kan een verminderde werkzaamheid van HIF-1-remmers worden verwacht voor de behandeling van p53 defect tumoren, een aspect dat een verstorende factor in klinische studies van kan vormen HIF-1α-remmende behandeling regimes.

Materialen en Methoden

Celkweek en chemicaliën

AGS (CRL-1739, ATCC, Rockville, Maryland, USA) en MKN28 (JCRB Cell Bank, Tokyo, Japan) cellen werden gekweekt als monolaag culturen in standaardmedium . Generatie AGS en MKN28 cellen die stabiel tot expressie ofwel siRNA specifiek gericht HIF-1α (knockdown, "KD") of onspecifieke control siRNA (scrambled "SCR") werd eerder gepubliceerd [22]. 5-fluorouracil (5-FU), cis-Diammineplatinum (II) dichloride (cisplatine) en superoxide anion remmers diphenyleneiodonium chloride (DPI) en apocynin werden gekocht bij Sigma-Aldrich (Duitsland) en opgelost in DMSO. PRIMA-1 (voor p53-reactivering en inductie van massieve apoptose) werd verkregen van Tocris Biosciences (Ellisville, Missouri, USA) en opgelost in steriel water. Dragercontrole van de oplosmiddelen werd in alle experimenten.

celproliferatie assay

Voor de bepaling van celgroei, 3 x 10 ^{4 cellen werden in drievoud in platen met 24 putjes, toegestaan ​​te hechten gedurende 16 uur en vervolgens behandeld zoals aangegeven in normoxische of hypoxische omstandigheden. Na behandeling werden de cellen getrypsiniseerd en levensvatbare cellen werden geteld met een hemocytometer.}

Bepaling van celcyclusverdeling en apoptose door flowcytometrie

celcyclusverdeling waaronder de pre-G _{1 fractie werd bepaald door DNA-histogrammen beschreven [52]. Apoptose werd gekwantificeerd door detectie van actieve, gesplitst caspase-3 door flowcytometrie met een Alexa Fluor® 488-geconjugeerd antilichaam (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA).}

Kwantificering van senescentie

senescentie-geassocieerde β-galactosidase activiteit werd beoordeeld in cytospinpreparaten zoals beschreven [53].

Immunoblotanalyse

hele cellysaten werden bereid zoals eerder beschreven [52], daarna gescheiden op een 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel en overgebracht op nitrocellulose (Amersham Biosciences, Freiburg, Duitsland). Blots werden onderzocht met antilichamen tegen p53 en CDK2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA), p21 (Oncogene Research Products, Bad Soden, Duitsland), cycline A (Upstate, Temecula, California, USA), pRb (BD Pharmingen , Heidelberg, Duitsland), MDM2 (Calbiochem, San Diego, California, USA), p65 (Cell Signaling Technology) en actine (Sigma-Aldrich). Secundaire antilichamen werden geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (Dianova, Hamburg, Duitsland) en peroxidase activiteit werd gevisualiseerd met behulp van de westerse Lightning chemiluminescentie reagens Plus (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA).

Kwantitatieve real-time PCR analyse

Voor real-time PCR-analyse werd totaal cellulair RNA geëxtraheerd met Trizol reagens (Invitrogen, Karlsruhe, Duitsland). Eerste streng cDNA werd gesynthetiseerd met oligo (dT) primer en een SuperScript ™ First Strand Synthesis System (Invitrogen). Kwantitatieve real-time PCR-analyse werd uitgevoerd met behulp van PCR TaqMan Universal Mastermix (voor β-actine) en SYBR Green PCR Master Mix (A20 en cIAP1, Applied Biosystems, Darmstadt, Duitsland). Primer sequenties worden in Tabel S1. Om het bedrag van de voorbelasting RNA normaliseren, werden PCR-reacties uitgevoerd met een sonde en primers voor β-actine.

voorbijgaande transfectie en reporter luciferase assay

voorbijgaande transfecties van AGS cellen met behulp van Effectene Transfectie werden uitgevoerd Reagent (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens het protocol van de fabrikant. Voor overexpressie studies werden cellen geënt bij 3 x 10 ^{4 cellen /24-putjes en getransfecteerd met 100 ng van pcDNA HIF-1α (vriendelijk verschaft door Wanja Bernhardt, Universitätsklinikum Erlangen, Erlangen, Duitsland) of pcDNA p65 (vriendelijk verschaft door Hiroyasu Nakano, Jutendo University, Tokyo, Japan), respectievelijk. Voor HRE of NF-KB luciferase assay, 3 x 10 4 cellen /24 putjes werden gecotransfecteerd met 100 ng pHRE-Luc (een gift van Randall S. Johnson, UCSD, San Diego, California, USA) of IgκB-Luc (een geschenk van Florian R. Greten, Technische Universität München, München, Duitsland), en 30 ng phRL-nul (Promega, Mannheim, Duitsland). Luciferase-activiteit werd gemeten met de Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) zoals beschreven [54]. Voorbijgaande p53 onderdrukking te bereiken, werden AGS-cellen die bij 30% samenvloeiing met 75 of 150 nmol /L si p53, ( Silencer
Selecteer siRNA, Applied Biosystems) en geanalyseerd 48 uur na transfectie. Een niet-specifiek siRNA (si scr, Eurogentec, Seraing, België) werd gebruikt als controle.}

elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA)

nucleaire eiwitextracten werden bereid zoals beschreven [54]. EMSA werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [55] met 8 ug nucleair eiwit en 100 fmol /l eind radioactief gemerkt 22 bp dubbelstrengs consensus NF-KB oligonucelotide (voorwaartse streng: 5'-TGA GGG AGT GAC TTT CCC AGG C- 3 ', E3292, Promega).

• PLoS ONE: Laat-7 MicroRNA Familie wordt selectief uitgescheiden in de extracellulaire omgeving via exosomes in een Gemetastaseerde maagkanker cellijn
• PLoS ONE: Hoge diversiteit van Vaca en cagA Helicobacter pylori genotypen bij patiënten met en zonder maagkanker