PLOS ONE: Enterococcus faecalis infection provoque la production Inflammation, intracellulaires OXPHOS-indépendant ROS, et l'ADN humain dommages cancer gastrique Cells

Résumé

Contexte

Achlorhydrie causée par exemple gastrite atrophique permet une prolifération bactérienne, ce qui induit une inflammation chronique et des lésions aux cellules muqueuses des sujets infectés par la conduite de tumeurs malignes et le cancer gastrique. Enterococcus faecalis
( E. Faecalis
) peuvent coloniser l'estomac achlohydric et nous voulions donc d'étudier l'impact de E. infection faecalis
sur la réponse inflammatoire, les espèces réactives de l'oxygène (ROS) de formation, la respiration mitochondriale et la stabilité génétique mitochondrial dans les cellules de la muqueuse gastrique.

Méthodes

Pour séparer les changements induits par les bactéries de celles des cellules inflammatoires nous avons établi un in vitro E. faecalis
système de modèle d'infection en utilisant la lignée cellulaire de carcinome gastrique MKN74. Totale de ROS et de superoxyde a été mesurée par microscopie à fluorescence. La consommation d'oxygène cellulaire a été caractérisée de manière non invasive en utilisant XF24 microplaque respirométrie base. L'expression des gènes a été examiné par microarray et voies de réponse ont été identifiés par Gene Set Analysis (GSA). transcrits de gènes sélectionnés ont été vérifiées en temps réel par réaction en chaîne par polymérase quantitative (qRT-PCR). mutations mitochondriales ont été déterminées par séquençage.

Résultats

L'infection des cellules MKN74 avec E. faecalis
induit la production intracellulaire de ROS par une voie indépendante de la phosphorylation oxydative (de OXPHOS). En outre, E. faecalis
infection induite mitochondrial l'instabilité de l'ADN. Après l'infection, les gènes codant pour des protéines de réponse inflammatoire étaient transcriptionnelle régulés à la hausse tandis que l'ADN des dommages réparation et cycle cellulaire des gènes de contrôle ont été régulés à la baisse. La croissance des cellules est ralentie lorsqu'ils sont infectés par viables E. faecalis
et a répondu d'une manière dépendante de la dose à E. faecalis
lysat.

Conclusions

L'infection par E. faecalis
induit une réponse intracellulaire ROS OXPHOS-indépendant et endommagé le génome mitochondrial dans la culture de cellules gastriques. Enfin, les bactéries induit une réponse inflammatoire NF-kB, ainsi que compromise réponse aux dommages de l'ADN et de l'expression des gènes de contrôle du cycle cellulaire.

Transcript profilage

Tableau express numéro d'accès E-MEXP-3496.

Citation: Strickertsson JAB, Desler C, Martin-Bertelsen T, Machado AMD, Wadström T, Winther O, et al. (2013) Enterococcus faecalis
infection provoque une inflammation, la production intracellulaire OXPHOS-indépendant ROS et dommages de l'ADN dans les cellules de cancer gastrique humain. PLoS ONE 8 (4): e63147. doi: 10.1371 /journal.pone.0063147

Editeur: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Etats-Unis d'Amérique

Reçu: 28 Août 2012; Accepté: 2 Avril 2013; Publié: 30 Avril 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Strickertsson et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. AMDM est soutenu par une bourse du portugais science, Technology Foundation. LFH est pris en charge par la MRC danoise. JABS est soutenu par la Société danoise du cancer, et de l'Université de Copenhague SUND. TMB et OW sont pris en charge par une subvention de la Fondation Novo Nordisk au Centre de bioinformatique. CD et LJR sont pris en charge par NORDEA-fonden. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est parmi les dix cancers les plus courants, et avec un taux annuel global de la mort d'environ 700.000, il est la deuxième cause la plus fréquente de la mortalité liée au cancer [1]. Le cancer gastrique de type intestinal se développe à travers une série d'événements pathologiques, en commençant par une inflammation chronique, la gastrite atrophique, une métaplasie intestinale, et enfin le cancer [2].

L'inflammation chronique et le cancer a été lié dans plusieurs études sur des patients et de des souris génétiquement modifiées, et l'on croit être impliqué dans la pathogenèse d'environ 25% de tous les cas de cancer dans le monde [2] - [4]. Caractéristiques de l'inflammation liée au cancer comprennent la présence de chimiokines et de cytokines dans les tissus tumoraux, ayant le potentiel de stimuler la prolifération des cellules tumorales et la survie des cellules malignes [5], [6]. L'inflammation chronique est également favorable à une surproduction de endommageant l'ADN des espèces réactives de l'oxygène (ROS), dont la production peut être accessoire par rapport à la phosphorylation oxydative (de la phosphorylation oxydative) des réactions dans les mitochondries (OXPHOS-dépendant) ou produite à partir de l'extérieur de la mitochondrie le plus souvent par Nicotinamid adénine dinucléotide phosphate ( NADPH) oxydases (OXPHOS indépendant) (pour revue voir [7] - [9]). production chronique des dommages à l'ADN de la cause ROS, permettant l'accumulation de mutations qui à son tour peut activer les oncogènes et /ou inactiver des gènes suppresseurs de tumeurs, augmentant ainsi le risque de développement du cancer [3].

Le facteur de risque le plus courant pour le développement le cancer gastrique est une infection bactérienne chronique de l'estomac avec Helicobacter pylori
( H. pylori
) [10]. L'infection chronique de l'estomac par H. pylori
affecte l'équilibre du pH gastrique et peut causer des achlorhydria ou hyperchlorhydria [11]. Bien que cette bactérie est classée en tant que classe une substance cancérigène, il est pas toujours associée à un risque accru de développement du cancer gastrique. Par exemple, H. pylori
patients infectés avec des ulcères duodénaux et des niveaux élevés d'acide gastrique ont un risque réduit de développer un cancer gastrique par rapport à ceux de la population générale [11] - [13]. En revanche, les patients atteints de gastrite atrophique et la réduction de la sécrétion d'acide gastrique ont un risque accru de développer un cancer gastrique [11], [13], [14]. Le risque accru de cancer chez des individus achlorhydriques pourrait être due à une prolifération bactérienne d'autres bactéries dans la lumière gastrique [15]. Chez les humains achlorhydriques et des modèles animaux de surcroissance bactérienne cause de gastrite chronique qui se développe en une métaplasie intestinale et le cancer gastrique finalement [16] - [18]. Parmi les bactéries présentes dans l'estomac de souris achlorhydriques étaient entérocoques de espèces, qui sont cocci gram-positif capable de survivre dans des environnements avec un pH aussi bas que 4,5 [19], [20]. Enterococcus faecalis
( E. Faecalis
) est un membre du microbiote commensal humaine et l'une des bactéries les plus courantes dans le tractus gastro-intestinal [19]. En dépit de cela, E. faecalis
peut agir comme un agent pathogène humain [21], et a été trouvé dans une augmentation significative dans le nombre des lésions cancéreuses orales et dans les cancers du côlon humain [22], [23]. Par rapport à cette E. faecalis
est capable de produire des N-nitrosamines et d'induire une instabilité génétique dans les cellules épithéliales du colon par des dommages oxydatifs de l'ADN [24], [25].

Gastrite est associée à l'infiltration de cellules immunitaires dans le tissus, ce qui le rend difficile à disséquer l'action des cellules du système immunitaire de celui des cellules qui tapissent la muqueuse
in vivo. Nous avons donc utilisé un in vitro modèle de culture tissulaire qui nous a permis d'examiner comment isolé les cellules muqueuses répondent aux bactéries et les mécanismes moléculaires par lesquels les bactéries intestinales telles que E. faecalis
induire des dommages dans les cellules épithéliales gastriques. En utilisant ce modèle, nous avons examiné l'impact de E. faecalis
infection de cultures de cellules d'adénocarcinome gastrique sur la production de ROS, la respiration cellulaire, la croissance, l'ADN des dommages /réparation et les réponses inflammatoires.

Culture cellulaire Matériaux et méthodes, E. faecalis
et Conditions
croissance

MKN74 humain cultures de cellules d'adénocarcinome gastrique de la collection japonaise de bioressources recherche banque de cellules (JCRB # JCRB0255) ont été maintenues dans du milieu RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), complétées par des 10% de sérum bovin fœtal (FBS) (Invitrogen), 100 ug /ml de streptomycine et 100 U /ml de pénicilline (Invitrogen) à 37 ° C et 5% de CO _{2 atmosphère humidifiée. Les infections ont été réalisées avec E. faecalis
souche (ATCC 29212). Les bactéries ont été cultivées dans 5% des plaques de gélose au sang à 37 ° C. La densité optique (DO) de bactéries cultivées dans un milieu RPMI 1640 a été mesurée à 550 nm sur un spectrophotomètre UV-1601 (Shimadzu, Kyoto, Japon) (figure S1). E. faecalis
lysat a été préparé par congélation /décongélation de la suspension bactérienne à trois reprises, tandis que sonication la suspension entre chaque cycle.}

Infection des cellules gastriques pour l'ARN et l'ADN isolement

Pour 24 h infections , 80% de cellules MKN74 confluentes ont été lavées avec du PBS et incubées dans un milieu sans antibiotique. colonies de E Nuit adulte.
faecalis ont été ajoutés à la culture de cellules MKN74 à une multiplicité d'infection (MOI) de 50 bactéries par cellule. 5 Les infections par jour ont été effectuées par le traitement de 65% de cellules MKN74 confluentes avec E. faecalis
à une MOI de 10 ou avec une concentration de protéine de lysat de 40 ug /ul. Toutes les 24 heures, les cellules ont été lavées avec du PBS et du milieu frais et les bactéries ou lysat ont été ajoutés. Les cellules témoins ont été traitées de manière similaire en l'absence de bactéries ou d'un lysat bactérien. In vitro
études ont été effectuées en utilisant une lignée cellulaire de cancer gastrique pour tester l'effet néfaste de E. faecalis
sur les cellules d'adénocarcinome gastrique. Ces cellules se distinguent des cellules épithéliales gastriques normales en réalisant plusieurs aberrations chromosomiques, mais ils offrent l'avantage d'être un système modèle reproductible de nombreuses façons de reproduire les événements qui se produisent dans l'estomac. En comparant les cellules infectées à des cellules non infectées donne une image fiable des dommages et des altérations de l'expression génique causée par l'infection.

ARN et l'ADN isolement

Après l'infection, l'ARN et l'ADN ont été extraits en ajoutant le réactif Trizol (Invitrogen) à chaque flacon de culture. L'ARN a été isolé selon le protocole de fabrique. La phase intermédiaire contenant de l'ADN a été précipité par addition d'éthanol à 100%. Les échantillons ont été centrifugés à 4 ° C, 3500 g pendant 6 min. Le surnageant de phénol-éthanol a été éliminé et l'extraction d'ADN restant a été effectué en utilisant un kit NucleoSpin de tissu (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne). Les concentrations d'ARN et d'ADN ont été mesurés sur un NanoDrop ND-1000 spectrophotomètre. numéros d'intégrité de l'ARN ont été mesurés sur une Bioanalyseur 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, Californie) selon le protocole fabrique.

Mesure de ROS et superoxyde

Deux jours avant l'infection 8 × 10 ^{4 MKN74 cellules ont été étalées dans chaque puits d'un Lab-Tek TM Chambered Coverglas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). cellules MKN74 ont été colorées pendant deux heures avant l'infection avec un mélange de détection 2-plex. ROS et superoxyde coloration a été réalisée en utilisant le ROS /Kit de détection RNS (Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York) selon les instructions du fabricant. MKN74 cellules ont été infectées à une MOI de 50 pendant 30 minutes et analysées sous un microscope confocal Zeiss LSM 510 en utilisant le logiciel LSM 510 (Zeiss, Oberkochen, Allemagne). Non infectées colorées MKN74 cellules ont été utilisés comme témoins négatifs.}

Localisation de E. faecalis
lors de l'infection

8 × 10 ^{4 MKN74 cellules /puits ont été ensemencées dans un fond de verre coulissant 8-chambre (Thermo Fisher Scientific) 24 heures avant la coloration. Afin d'identifier la localisation de E. faecalis
après l'infection, nous tachés séparément la membrane plasmique avec CellMask TM Deep Red membrane plasmique tache (C10046, Invitrogen) et la paroi de la cellule bactérienne en utilisant Baclight TM tache bactérienne vert (sondes B-35000, moléculaire, Invitrogen) selon les deux protocoles, respectivement. Les cellules et les bactéries ont été lavées 3 fois dans du PBS avant l'infection. Les cellules ont été infectées à une MOI de 100 pendant 4 heures et analysées sous un microscope confocal Zeiss LSK 510 en utilisant le logiciel LSM 510 (Zeiss). Cette expérience a été répétée trois fois et 8 champers ont été examinés à chaque fois.}

XF24 microplaques basé respirométrie

Respirométrie de cellules MKN74 a été réalisée en utilisant un analyseur extracellulaires Flux XF24 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA ). La moitié des MKN74 cellules étalées ont été infectées avec E. faecalis
à une MOI de 50 pendant 4, 8 ou 24 heures tandis que l'autre moitié a été laissée non infecté. Après incubation, les bactéries ont été éliminées à l'aide de 4% Pénicilline /streptomycine (5 U /ml) et 4% céfotaxime (100 pg /ml) (ACS Dobfar Generics S.A., Luxembourg, Belgique). Les cellules ont été incubées dans un groupe CO _{2 incubateur libre à 37 ° C pendant 1 heure pour permettre à la température et au pH équilibration. La microplaque avec des cellules a ensuite été chargé dans le XF24 et le débit de chaque puits de la consommation d'oxygène a été mesurée sur une période de 100 minutes. Les médicaments oligomycine (0,5 uM), FCCP (0,3 M) et antimycine A (2,0 um) ont à leur tour ajoutés à chaque puits. Plus de détails sont disponibles dans S1 Fichier.}

ADN mitochondrial Instabilité

La fréquence des mutations dans la région D-loop de l'ADN mitochondrial, ont été déterminés par PCR amplification en utilisant des amorces C6-CA5 (tableau S1 ). Les fragments amplifiés ont été clones dans le vecteur pCR2.1 (Invitrogen) et des inserts de 328 colonies ont été amplifiés en utilisant les amorces VectorD boucle (tableau S1). Les fragments amplifiés ont été purifiés et séquences en utilisant le kit de séquençage de cycle terminateur BigDye ABI Prism et un ABI Prism 3730 séquenceur d'ADN (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts). Pour déterminer les mutations, les séquences ont été utilisées comme des requêtes sur la séquence de référence obtenue à partir de Cambridge MitoMap (http://www.mitomap.org. Accessed février 9. 2012).

Microarray et GSA

ARN avec un certain nombre d'intégrité de l'ARN de 8 ou au-dessus de trois contrôle et trois échantillons d'infection pendant 24 heures (avec viable E faecalis
ou E. faecalis
lysat 40 pg /pl.) et 5 expériences de jour ont été soumises au RH Microarray Center à l'hôpital universitaire de Copenhague. L'ARN a été amplifié et marqué à l'aide du «kit 3 IVT Express (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) selon les instructions du fabricant. 250 ng d'ARN total a été utilisé comme entrée. Les échantillons marqués ont été hybrides à GeneChip plus 2 Genome U133 réseaux (Affymetrix). Les matrices ont été lavées et colorées avec de la streptavidine conjuguée phycoerytrin en utilisant un Affymetrix fluidiques Station® 450 et les tableaux ont été scannés dans un scanner Affymetrix GeneArray® 2500 pour générer des images fluorescentes, comme décrit dans le protocole d'Affymetrix GeneChip. 24 fichiers d'intensité cellulaire premières (CEL-fichiers) ont été générés dans le Console® logiciel GeneChip Commande (AGCC) (Affymetrix). Le CEL-fichiers bruts ont été rendus publics au ArrayExpress avec le numéro d'accès E-MEXP-3496. Prétraitement de biopuces pour l'analyse du jeu de gènes (GSA) a été fait avec R /Bioconductor [26], [27]. Ajustement fond, la normalisation quantile et la synthèse finale de l'ensemble de sondes intensités d'expression a été réalisée par l'algorithme de GCRMA [28] pour chaque condition expérimentale, séparément (S2 File).

Quantitative transcription inverse
PCR

ADNc a été synthétisé en utilisant SuperScript III synthèse du premier brin SuperMix pour qPCR (Invitrogen). L'expression des gènes a été analysée par qRT-PCR en utilisant SuperMix SYBR Greener de q-PCR pour ABI PRISM (Invitrogen). Les amorces ont été conçues en utilisant le logiciel Primer-Blast from NCBI [29]. Les réactions ont été effectuées sur un système ABI PRISM 7900HT Sequence Detection (SDS) de Applied Biosystems. Les données ont été normalisées par rapport à l'expression de l'ARNm GAPDH.

test de croissance

8000 cellules ont été distribués dans chaque puits de six plaques à 24 puits et incubées à 37 ° C et 5% de CO _{2 pour deux jours avant le traitement. Les cellules ont été traitées en quatre exemplaires comme suit: 4 puits de cellules témoins non infectées, 4 puits traités avec 400 ug /ul E. faecalis
lysat, 4 puits traités avec 40 ug /ul de lysat, 4 puits traités avec 4 ug /ul de lysat et 4 puits traités avec la viabilité E. faecalis
à une MOI de 10. Une plaque de cellules était obsédé chaque jour. La fixation a été réalisée par lavage avec du PBS et fixateur avec 1 ml de formol à 10% pendant 10 min. Fixated cellules ont été colorées avec 1 ml de 0,1% de violet cristallisé (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), et les plaques ont été secouées pendant 30 min. Les cellules ont été lavées, séchées et le cristal violet a été extrait avec de l'acide acétique à 500 ul de 10%. L'absorbance a été mesurée à 620 nm sur un PowerWave XS (BioTek Instruments, Winooski, Vermont).}

Analyse statistique

Simple analyse de classification de la variance (ANOVA) a été utilisée pour tester les différences de capacité respiratoire maximale , le chiffre d'affaires de l'ATP et la consommation d'oxygène OXPHOS indépendant. ANOVA a en outre été utilisé pour tester les différences dans la croissance des cellules au cours de différents traitements avec E. faecalis
. Lorsque l'ANOVA a indiqué des différences significatives entre les traitements, Tukeys méthode honnêtement significative a été utilisé pour tester les différences entre les taux de consommation d'oxygène ou le nombre de cellules. ADNmt fréquences de mutation ont été évaluées par chi-carré et le test exact de Fisher. les résultats ROS ont été exprimés en valeurs moyennes d'au moins vingt mesures indépendantes et analysées par apparié à deux queues t
-test. résultats qRT-PCR ont été exprimés en valeurs moyennes d'au moins trois expériences indépendantes mesurées dans trois répétitions techniques, et analysées par apparié à deux queues t
-test. Les différences entre les ensembles de données ont été considérées comme significatives à des valeurs de p ≤ 0,05. Les barres d'erreur = ± SEM, sauf indication contraire.

Identification des voies réglementées a été fait par une méthode GSA, GAGE ​​[30], amélioré pour exploiter les informations disponibles par induction répression (pour de nombreux détails et calculs voir S2 Fichier). Pathways étaient représentés par des listes de gènes (ensembles de gènes) téléchargés à partir de la base de données de signatures moléculaires (MSigDB) 3.0 [31]. C2 collection d'ensembles de gènes curated (voies canoniques et des signatures d'expression génique de perturbations génétiques et chimiques) en utilisant des symboles de gènes identificateurs. ensemble des gènes p-valeurs ont été corrigées pour les tests multiples en estimant le taux de fausses découvertes et le niveau de signification a été fixé à 1%.

Résultats

E. faecalis
infection induisent intracellulaire de ROS et la superoxyde production

Autres et nous avons précédemment montré que la gastrine achlorhydriques KO souris avait une prolifération bactérienne avec entérocoques
qui ne sont normalement pas partie de la flore gastrique [ ,,,0],20]. Bien que entérocoques
en général, sont pensés pour être de faible pathogénicité, soutenue surcroissance chez la souris achlorhydriques est associée à une réponse inflammatoire et, finalement, ces souris développent un cancer gastrique [20], [32]. Pour caractériser le processus pathologique dans les cellules gastriques nous avons examiné comment les bactéries ont affecté les cellules épithéliales gastriques. En utilisant des sondes de contrôle de la production de ROS intracellulaire, nous avons constaté que 30 minutes d'infection ont stimulé une augmentation significative de la formation de ROS intracellulaire (figure 1A). Avec des sondes spécifiques pour la production de superoxyde, nous avons montré que l'ERO principalement composée de superoxyde dans les cellules MKN74 (figure 1A). L'intensité de fluorescence a été quantifiée en utilisant le logiciel LSM 510 et une augmentation statistiquement significative intracellulaire des ROS et superoxyde dans les cellules infectées par rapport aux cellules témoins non infectées a été observée (figure 1B). Nous avons trouvé aucune preuve suggérant l'invasion des cellules par des bactéries que nous concluons que le ROS intracellulaire a été produit par les cellules infectées et non par intériorisé E. faecalis
(Figure 1 C-D).

Infection diminue l'activité mitochondriale et augmente OXPHOS indépendant consommation d'oxygène

La source de ROS trouvée après une infection bactérienne peut être soit générée par des bactéries extracellulaires [33] et /ou produits à partir de l'intérieur des cellules [34], [35]. Intracellulaires ROS peut soit être généré de manière OXPHOS-dépendante ou indépendante. Pour examiner et caractériser ensuite la possible production de ROS intracellulaire associée à E. faecalis
infection; nous avons mesuré l'infection bactérienne affectée par la mesure de la respiration mitochondriale renouvellement de l'ATP, de la capacité respiratoire et la consommation d'oxygène OXPHOS indépendante (figure 2). Pour garantir que les résultats reflètent la respiration des cellules MKN74 seulement, toutes les bactéries ont été éliminés avant les mesures. Il n'y avait pas de différence significative dans le chiffre d'affaires ATP de cellules témoins cultivées pendant 4-24 heures, alors qu'une fois diminution significative de 2 et 4 (p < 0,001) du chiffre d'affaires de l'ATP étaient présents entre les cellules témoins et les cellules infectées ont été incubées pendant 8 et 24 heures respectivement (figure 2A). Une corrélation a été trouvée correspondant à la capacité respiratoire, où les capacités des cellules infectées ont également été significativement 2 et 4 fois plus diminué (p < 0,01) par rapport aux cellules témoins au bout de 8 et 24 heures d'infection (figure 2B). La consommation d'oxygène OXPHOS indépendant de cellules témoins n'a pas été altérée pour des cellules cultivées pendant 4-24 heures. En revanche, la consommation d'oxygène OXPHOS indépendant des cellules infectées par des bactéries est passé de -50% de l'absorption totale d'oxygène au bout de 4 heures d'infection pour devenir le utilizer d'oxygène primaire (p < 0,001) (figure 2C). Ceci suggère que E. faecalis
interagir avec les cellules epitheliales à induire la formation de ROS et la consommation d'oxygène par d'autres systèmes d'enzyme intracellulaire que la phosphorylation oxydative. Expression de NOX1-5 et Duox1-2 a été examinée dans la lignée cellulaire gastrique; Cependant, l'expression n'a pas été affectée par l'infection (tableau S2).

E. infection faecalis
causé l'ADN mitochondrial instabilité

Nous avons précédemment montré que l'infection par le pathogène H. Les souches pylori induites par des mutations dans le génome mitochondrial dans une culture cellulaire humaine [36]. Étant donné que l'infection par E. faecalis
augmenter intracellulaire ROS nous avons vérifié si elle a aussi causé génomique ADNmt instabilité. La fréquence globale des événements mutationnels mitochondriale région D en boucle était significativement plus élevée dans les cultures de cellules infectées par MKN74 E. faecalis
(45,5%) que dans des cultures de cellules de contrôle non infectées (23,0%; p < 0,01) (Figure 3). En outre, les cellules infectées ont montré un plus grand nombre de transitions (36,4%) que dans les cellules témoins (21,8%; p < 0,05). Suppressions (0% de contrôle /3,9% infecté), insertions (contrôle de 1,1% /2,6% infecté) et transversions (0% de contrôle /2,6% infecté), ce dernier généralement vu comme une conséquence de ROS, ont été détectés plus fréquemment infectés cellules. Ainsi l'infection par E. faecalis
induit des mutations dans les cellules gastriques (figure 3).

Infection a provoqué une NFkB dominée réponse inflammatoire et une réponse ROS

pour mieux comprendre biologique dans les réponses cellulaires dans les cellules gastriques E. faecalis
infection nous avons effectué une analyse des microréseaux d'examiner les changements globaux dans l'expression des gènes dans les cellules infectées par viables E. faecalis
ou traités avec E. faecalis
lysat. Plutôt que de se concentrer sur l'expression des gènes uniques, nous avons utilisé GSA [30] pour identifier les voies et les processus activés ou inhibés par l'infection. En se concentrant sur des ensembles de gènes au lieu des gènes individuels augmente la robustesse, la sensibilité et la pertinence biologique, même pour les ensembles modérément réglementés de gènes. Ce résultat est obtenu en augmentant le rapport signal sur bruit, ce qui permet d'interpréter des changements modestes dans des gènes individuels [37]. La GSA a testé 2403 ensembles de gènes et a donné lieu à 484 voies réglementées étant statistiquement significatif ni pour les infections en direct et /ou stimuli de lysat (Figure S2). En se concentrant sur ces voies statistiquement significatives pour les infections en direct, certains des ensembles de gènes jugés pour mieux caractériser l'étude actuelle ont été partitionné manuellement en trois groupes (figures 4, 5 A et 6 A). Examiner l'inflammation et ROS, E. l'infection faecalis
a provoqué une régulation positive significative de plusieurs voies de signalisation impliquées dans les réponses immunitaires, y compris des groupes de récepteurs de chimiokines et gènes de signalisation des chimiokines, des gènes impliqués dans la protéine G ligand du récepteur couplé à la liaison et NFkB l'activation de gènes (figure 4, supérieur à six ensembles de gènes). En outre deux ensembles de gènes comprenant des gènes répondant aux phospholipides oxydés pro-inflammatoires étaient fortement régulée à la hausse. phospholipides oxydés sont produites par ERO et fonctionnent de manière pro-inflammatoires [38], [39] (Figure 4, le gène de définir sept et huit). Soutenir la présence de ROS, un ensemble de 30 gènes connus pour être exprimés en réponse à ROS du gène a été activé (Figure 4, ensemble de gènes en bas). Il est connu que les ROS sont importants pour le lipopolysaccharide (LPS), la production -Driven de plusieurs cytokines pro-inflammatoires [40] Cependant, les bactéries Gram-positives telles que E. faecalis
n'expriment LPS. Nous avons donc examiné comment l'expression de gènes codant pour des cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines ont été effectués en réponse à un non-stimulé par LPS l'infection pendant 24 heures et 5 infections par jour (tableau 1). De nombreux gènes impliqués dans la voie inflammatoire NFkB étaient significativement régulée à la hausse au cours de E. faecalis
infection, y compris l'interleukine-1β (IL-1ß), l'interleukine-1 receptor-associated kinase 2 (IRAK2), le VEGF, l'IL-8, IL-23α, l'IL-11 et de facteur de nécrose tumorale α (TNF-a α) dont la plupart peuvent en outre propager la réponse d'activation de NF-kB [41] - [44]. Parmi ceux-ci étaient plusieurs cytokines précédemment identifiés dans H.
pylori infection à médiation, comme l'IL-8, et facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF), tous deux associés à l'angiogénèse et le cancer gastrique avancé, l'IL-1ß, qui est un puissant inhibiteur de la sécrétion acide, ainsi que le TNF-α, un régulation de la prolifération cellulaire, la différenciation et l'apoptose [43] - [45]. En outre, la cytokine IL-23α qui favorise l'incidence des tumeurs et la croissance [46] et est fortement produite dans H. La muqueuse colonisé par pylori [47] a été régulée à la hausse en même temps que l'IL-11, qui est une cytokine des cellules pariétales qui bloque la sécrétion d'acide gastrique, la gastrite atrophique et favorise la tumorigenèse gastrique [48], [49]. Parmi les autres gènes trouvés pour afficher les niveaux expressionnelles élevés et importants au cours de l'infection étaient IL-1α, IL-32, facteur de différenciation de croissance 15 (GDF15) et, chimiokine (motif C-C) ligand 22 (CCL22). En outre, une régulation positive de la superoxyde dismutase 2 (SOD2) qui convertit superoxyde en peroxyde d'hydrogène, a été observée. IL-8, Interferon facteur de régulation 1 (IRF-1) et le TNFa ont été validés par qRT-PCR (Figure 4 B).

ADN réparation des dommages sont régulés à la baisse au cours de E. faecalis
infection

L'analyse des voies a indiqué que l'expression de gènes impliqués dans les dommages de réparation de l'ADN est significativement régulée à la baisse par rapport à des cultures de cellules non infectées après 24 heures d'infection (figure 5A). qRT-PCR a confirmé que l'expression de plusieurs réparations mismatch (ROR) gènes ont été régulée à la baisse après que les deux 24 h et 5 jours de E. faecalis
infection (Figure 5, B). En 24 h cellules infectées PMS1 et MSH6 était significativement régulée à la baisse (4 fois et 1,8 pli, respectivement; P < 0,001). Une régulation à la baisse significative de MSH2 (3 fois), MSH3 (1,9 fois), MSH6 (2 fois) et PMS1 (3 fois) (p < 0,05) (Figure 5, B) a été observée dans les cellules 5 jours après l'infection. Les facteurs de variation expressionnelles de certains dommages à l'ADN de réparation des gènes après l'infection sont présentés dans le tableau S3. Ces résultats suggèrent que E. faecalis
infection down-régule les principales voies de réparation d'ADN résultant de l'instabilité génomique similaire aux infections avec H. pylori
[36], [50], [51].

Infection par E. faecalis
inhibe le contrôle du cycle cellulaire et la croissance des cellules MKN74

Pour évaluer les changements dans la croissance cellulaire induite par E. faecalis
infection, nous avons étudié l'influence des bactéries sur l'expression des gènes de contrôle du cycle cellulaire et la croissance des cellules MKN74. des ensembles de gène comprenant le contrôle du cycle cellulaire et les gènes de point de contrôle ont été régulés à la baisse après 24 heures d'infection par des bactéries viables suggérant un ralentissement significatif de la prolifération cellulaire, mais aussi un risque accru de mutations dans les nouvelles cellules (figure 6 A). En revanche, ces voies ont été régulés à la hausse dans les cellules infectées par le lysat bactérien suggérant que ces cellules étaient encore divisent après 24 heures (Figure 6 A). Nous avons ensuite mesuré la prolifération des cellules pendant 5 jours et a constaté que les bactéries viables ont causé la prolifération des cellules MKN74 à ralentir ou à arrêter complètement (Figure 6 B). proliférations cellulaires ont également été touchés lors d'une incubation avec lysat bactérien. Au bout de 24 heures, les cellules ont été traitées lysat encore de division (comme le montre également la figure 6A) et jusqu'à ce jour il n'y avait pas 4 distinction entre les cellules non infectées et des cellules infectées par le lysat. Cependant, le jour 4, il y avait beaucoup moins de cellules après incubation avec lysat bactérien par rapport aux cellules témoins non infectées. Le jour 5 une relation dose-réponse entre la concentration de lysat et la croissance cellulaire a été observée (Figure 6 B), montrant que les infections par E. faecalis
interférer avec la croissance cellulaire. Un résultat similaire a été observée dans les lymphocytes humains, dans lequel trois jours d'incubation avec E. faecalis
lysat induit un arrêt du cycle cellulaire [52]. Comme ce travail a été fait dans un système isolé, la prolifération réduite des cellules infectées pourrait être attribué à l'absence de stimulation du facteur de croissance en répondant cellules immunitaires.

Discussion

Les pathogènes microbiens sont estimés à causer environ 1,2 million de cas de cancer chaque année [5]. Les études humaines et plusieurs modèles animaux ont montré que achlorhydria permet une prolifération bactérienne de l'estomac, ce qui peut causer une inflammation chronique de l'estomac, qui se développe en cancer gastrique [20], [53], [54]. Soutenir le rôle étiologique d'autres bactéries dans les tumeurs malignes gastriques, sont des études d'éradication de H. pylori de l'infection qui permettent la colonisation gastrique par les bactéries intestinales [55], et un développement du cancer gastrique ultérieure [56]. Cela donne à penser que d'autres joueurs que H. pylori
peut être impliquée dans l'inflammation entraîné des tumeurs malignes gastriques. Les événements moléculaires par lesquels l'infection chronique gastrique avec ces bactéries affectent les cellules cancéreuses et causer des dommages à ces cellules a été mal compris.

Nous avons trouvé que l'infection par E. faecalis
induit une production intracellulaire de ROS. La phosphorylation oxydative par les mitochondries était faible après l'infection, indiquant que la production de radicaux libres est principalement générée d'une manière indépendante de la phosphorylation oxydative dans les cellules infectées. OXPHOS indépendant ROS intracellulaire peut être produite dans les cellules épithéliales du NADPH non phagocytaire (NO x) en réponse à des oxydases, par exemple la stimulation des cytokines [57], et sont les principales sources non-mitochondriales des ROS [58]. Ces NOX enzymes électrons de transport à travers les membranes de plasma, générant superoxyde et d'autres ROS [59]. Dans les cellules épithéliales humaines de NOX deux homonyme de (de Nox2 et NOX5) se trouvent [60]. Dans notre étude, ces enzymes ne sont pas transcriptionnellement régulé à la hausse, mais il ne peut pas être exclu que les taux de ROS élevés était la conséquence d'une activation de ces enzymes, bien que cela nécessite une enquête plus approfondie.

• PLOS ONE: IL-26 favorise la prolifération et la survie des cellules de cancer gastrique humain par la réglementation de la balance des STAT1 et STAT3 Activation
• PLOS ONE: Haute Expression de Heat Shock Protein 90 est associée à une tumeur Agressivité et de mauvais pronostic chez les patients atteints du cancer avancé de l'estomac