Plos ONE: Enterococcus faecalis okužba povzroči vnetje, Znotrajcelične Oxphos-Independent ROS proizvodnje in DNA poškodbe v humani Rak želodca Cells

Povzetek

Ozadje

aklorhidrija jih npr povzročil atrofični gastritis omogoča bakterijski zaraščanja, kar povzroči kronično vnetje in poškodbe sluznice celicah okuženih posameznikov voznih želodčni maligna obolenja in raka. Enterococcus faecalis
( E. Faecalis
) lahko naselijo achlohydric želodce, zato smo želeli, da preuči vpliv E. faecalis
okužbe na vnetni odziv, reaktivne kisikove vrste (ROS) ustanovitveni mitohondrijsko dihanje in mitohondrijsko genetske stabilnosti v želodčnih celic sluznice.

Metode

Če želite ločiti spremembe, ki jih povzročajo bakterije, povzročene z tistim iz vnetnih celic smo vzpostavili vitro E. faecalis
modela sistema okužbo s pomočjo želodčne karcinom celične linije MKN74. Skupno ROS in superoksid smo merili s fluorescenčno mikroskopijo. Cellular poraba kisika je bila značilna neinvazivno uporabo XF24 mikroplošči respirometričnim. Izražanje genov je pregledal mikromrež in poti odzivanja so označene z Gene Set analize (GSA). Izbrane gene transkripcije smo preverili s kvantitativnim realnem času verižne reakcije s polimerazo (QRT-PCR). Mitohondrijski mutacije so bile določene sekvenciranje.

Rezultati

Okužba MKN74 celic s E. faecalis
povzroča proizvodnja znotrajcelični ROS po pravi poti, ki niso odvisni od oksidativna fosforilacija (oxphos). Poleg tega, E. faecalis
Okužba inducirane mitohondrijske DNK nestabilnost. Po okužbi, so geni, ki kodirajo vnetnih proteinov odzivanja transkripcijsko reguliran, medtem ko DNA poškodbe popravila in celičnega cikla nadzora geni so navzdol regulirane. Celična rast upočasnila, okuženih z izvedljiva E. faecalis
in se odzvali v odvisnosti od odmerka do E. faecalis
lizat.

Sklepi

Okužba s E. faecalis
povzroča odziv je oxphos-neodvisni intracelularni ROS in poškodovala mitohondrijske genoma v celični kulturi želodca. Nazadnje bakterije je povzročilo NF-κB vnetni odziv, kot tudi oslabljeno odziv poškodbe DNA in celičnega ciklusa nadzor izražanje genov.

Prepis profiliranje

Array Express pristopna številka E-MEXP-3496.

Navedba: Strickertsson JAB, Desler C, Martin-Bertelsen T, Machado AMD, Wadstrøm T, Winther O, et al. (2013) Enterococcus faecalis
okužba povzroči vnetje, znotrajcelične Oxphos-Independent ROS Proizvodnja in DNA poškodbe v Human želodca rakavih celic. PLoS ONE 8 (4): e63147. doi: 10,1371 /journal.pone.0063147

Urednik: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Združene države Amerike

Prejeto: 28. avgust 2012; Sprejeto: 2. april 2013; Objavljeno: 30. april 2013

Copyright: © 2013 Strickertsson et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. AMDM je s štipendijo iz portugalskega znanost, tehnologijo Foundation podpira. LFH podpira dansko MRC. Jabs podpira danska Cancer Society, in Univerza v Kopenhagnu Sund. TMB in OW podpira z nepovratnimi sredstvi Novo Nordisk Fundaciji centra bioinformatiko. CD in LJR podpirajo NORDEA-FONDEN. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je eden najpogostejših rakov desetih, in z globalno letno umrljivost približno 700.000, je drugi najpogostejši vzrok smrtnosti zaradi raka povezanih [1]. rak želodca črevesna tipa razvija skozi vrsto patoloških dogodkov, začenši s kroničnim vnetjem, atrofičnega gastritisa, intestinalno metaplazijo in končno raka [2].

kronična vnetja in raka je bil povezan v številnih študijah bolnikov ter gensko spremenjene miši, in se domneva, da so vključene v patogenezo približno 25% vseh primerov raka po svetu [2] - [4]. Značilnosti vnetja, povezanih z rakom, vključujejo prisotnost kemokinov in citokinov v tumorskih tkivih, ki imajo potencial za spodbujanje tumorsko proliferacijo in preživetje malignih celic [5] [6]. Kronično vnetje podpira tudi hiperprodukcijo DNK poškoduje reaktivnih kisikovih vrst (ROS), katerih proizvodnja je lahko postranskega pomena oksidativna fosforilacija (oxphos) reakcij v mitohondrijih (oxphos odvisna) ali proizvedena zunaj mitohondrije najpogosteje z nicotinamid adenin dinukleotid fosfata ( NADPH) oksidaze (oxphos neodvisen) (za pregled glej [7] - [9]). Kronična proizvodnja škode ROS vzrok DNA, ki omogoča kopičenje mutacij, ki lahko posledično aktivira onkogeni in /ali inaktivacijo zaviralnih genov s čimer se poveča tveganje za razvoj raka [3].

Najpogostejši dejavnik tveganja za razvoj rak želodca je kronična bakterijska okužba želodca s Helicobacter pylori
( H. pylori
) [10]. Kronično vnetje želodca, ki ga H. pylori
vpliva na želodcu pH ravnovesje in lahko povzroči aklorhidrija ali hyperchlorhydria [11]. Čeprav je ta bakterija razvrščen kot razred ene rakotvorna, ni vedno povezana s povečanim tveganjem za razvoj raka želodca. Na primer, H. pylori PODJETJA
okuženi bolniki z razjedami dvanajstnika in visoko stopnjo želodčne kisline imajo manjše tveganje za razvoj raka želodca v primerjavi s tistimi iz splošne populacije [11] - [13]. V nasprotju s tem so bolniki s atrofični gastritis in zmanjšano izločanje želodčne kisline imajo povečano tveganje za razvoj raka želodca [11], [13] [14]. Povečano tveganje za nastanek raka v achlorhydric posameznikih lahko posledica bakterijske razraščanje drugih bakterij v želodcu svetlino [15]. V obeh achlorhydric ljudeh in živalskih modelih bakterijske zaraščanje vzrok kronični gastritis, ki se razvije v intestinalno metaplazijo in rakom na koncu želodca [16] - [18]. Med bakterije najdemo v želodcu achlorhydric miših so enterokokov
vrste, ki so gram-pozitivni koki sposobni preživeti v okolju s pH tako nizko, kot 4,5 [19], [20]. Enterococcus faecalis
( E. Faecalis
) je član komenzalne mikrobiote ljudi in eden od najpogostejših bakterij v prebavnem traktu [19]. Kljub temu, E. faecalis
lahko deluje kot človeški patogen [21], in je bilo ugotovljeno v močno povečanih številke v ustnih rakavih poškodb in človeških raka na debelem črevesu [22], [23]. V zvezi s tem E. faecalis
je sposobna proizvajati N-nitrozaminov in induciranje genetske nestabilnosti kolona epitelnih celic skozi oksidativno poškodbo DNA [24], [25].

gastritis je povezana z infiltracijo imunskih celic v uporabniškem tkiva, zaradi česar je težko razčleniti delovanje imunskih celic, od tistega podloga sluzničnih celic in vivo
. Zato smo uporabili vitro
tkivne kulture model, ki nam je omogočil preuči, kako izoliran sluznice celice odzivajo na bakterije in molekularne mehanizme, s katerimi črevesne bakterije, kot so E. faecalis
povzroči škodo v epitelijskih celic želodca. S tem modelom smo preverjali vpliv E. faecalis
okužbo želodca adenokarcinom celičnih kultur za proizvodnjo ROS, celično dihanje, rast, DNA škode /popravilo in vnetnih odzivov.

Materiali in metode

Cell Culture, E. faecalis
in rasti Pogoji

Human MKN74 želodca adenokarcinom celičnih kultur iz japonskega zbirke celične banke Raziskovalne BioResources (JCRB # JCRB0255) so bile v RPMI vzdržuje 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), dopolnjena z 10% fetalni goveji serum (FBS) (Invitrogen), 100 ug /ml streptomicina in 100 U /ml penicilina (Invitrogen), pri 37 ° C, 5% CO _{2 navlaženi atmosferi. Okužbe so bile izvedene s E. faecalis
sev (ATCC 29212). Bakterije gojimo v 5% agar krvi ploščah pri 37 ° C. Optične gostote (OD) bakterij, ki rastejo v RPMI 1640 mediju smo izmerili pri 550 nm na UV-1601 spektrometra (Shimadzu, Kyoto, Japonska) (slika S1). E. faecalis
lizat smo pripravili z zamrznitvijo /tajanje bakterijsko suspenzijo trikrat, medtem ko obdelamo z ultrazvokom prekinitev med vsakim ciklom.}

Okužba želodčne celice za RNK in DNK izolacije

Za 24 okužb h je bilo 80% Strnjena MKN74 celice speremo s PBS in inkubiramo v antibiotika prostem mediju. Čez noč zrasla kolonije E. faecalis
dodamo celični kulturi MKN74 na multipliciteto infekcij (MOI) 50 bakterij na celico. 5 okužbe dan so bile izvedene z obdelavo 65% Strnjena MKN74 celice s E. faecalis
pri MOI 10 ali koncentracijo lizat proteinov 40 ug /ul. Vsakih 24 ur, smo celice izperemo s PBS in svež medij in dodamo bakterije ali lizat. Kontrolne celice so bili obdelani podobno v odsotnosti bakterije ali bakterijskega lizat. vitro
študije so bile izvedene z uporabo želodčne raka celične linije za testiranje škodljiv učinek E. faecalis
na adenokarcinomom želodca celic. Te celice se razlikujejo od normalnih želodčnih epitelnih celic z izvedbo več kromosomske nepravilnosti, vendar nudijo prednost, da je ponovljiv model, sistem, ki v mnogočem podvaja dogodke, ki se pojavljajo v želodcu. Primerjava okužene celice neokuženih celic, zanesljivo sliko škode in spremembe v izražanju genov, ki jih povzroča okužba.

RNA in DNA izolacija

Po okužbi, RNA in DNA so bili pridobljeni z dodajanjem TRIzola Reagent (Invitrogen) za vsako kulture bučko. RNA smo izolirali po proizvaja protokol. Vmesna faza, ki vsebuje DNK smo oborili z dodatkom 100% etanola. Vzorce smo centrifugirali pri 4 ° C, 3500 g na 6 minut. fenol-etanol Supernatant smo odstranili in preostalo ekstrakcijo DNA smo naredili z uporabo NucleoSpin tkiva kit (Macherey-Nagel, Düren, Nemčija). RNA in DNA koncentracije so bile izmerjene na NanoDrop ND-1000 spektrometra. številke celovitost RNA smo izmerili na 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, v Santa Clara, Kalifornija), glede na proizvaja protokol.

Merjenje ROS in Superoksid

Dva dni pred okužbo 8 × 10 ^{4 MKN74 celice zasadimo v vsako vdolbino Lab-Tek TM prekatov Coverglas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). MKN74 celice smo obarvali dve uri pred okužbo z 2-kompleksnimi mešanici detekcijo. ROS in superoksid obarvanje je bila narejena z ROS /Detection Kit RNS (Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York), v skladu z navodili proizvajalca. MKN74 celice so bile okužene na MOI 50 30 minut in analizirajo po Zeiss LSM 510 konfokalnim mikroskopom z uporabo programske opreme LSM 510 (Zeiss, Oberkochen, Nemčija). Neokuženih obarvajo MKN74 celic smo uporabili kot negativni kontroli.}

Lokalizacija E. faecalis
med okužbo

8 × 10 ^{4 MKN74 celic /dobro smo posejali v 8-komorni steklenim dnom drsnika (Thermo Fisher Scientific), 24 ur pred barvanjem. Da bi ugotovili lokalizacije E. faecalis
po okužbi smo ločeno obarvajo plazemsko membrano z CellMask TM Deep Red plazemske membrane madež (C10046, Invitrogen) in celične stene bakterij s pomočjo BacLight TM Green bakterijska madež (sonde B-35000, Molecular, Invitrogen) po dveh protokolih oz. Celice in bakterije speremo 3-krat v PBS pred okužbo. Celice so bile okužene na MOI 100 za 4 ure in analizirajo po Zeiss LSK 510 konfokalnim mikroskopom z uporabo programske opreme LSM 510 (Zeiss). Ta poskus smo ponovili trikrat in 8 champers so bili pregledani vsakič.}

XF24 mikroplošči respirometrija

respirometričnim od MKN74 celic smo izvedli z uporabo XF24 zunajcelični Flux Analyzer (SEAHORSE bioznanosti, Severna Billerici, MA ). Polovica prevlečene MKN74 celice so bili okuženi z E. faecalis
pri MOI 50 4, 8 ali 24 ur, medtem ko je bila druga polovica pustili neokuženih. Po inkubaciji smo bakterije odstraniti s 4% penicilin /streptomicin (5 U /ml) in 4% cefotaksim (100 mg /ml) (ACS Dobfar Generics S.A., Luksemburg, Belgija). Celice inkubiramo v CO _{2 proste inkubator pri 37 ° C 1 uro, da se omogoči temperature in pH ravnotežje. Mikroplošči s celicami smo nato naložijo v XF24 in stopnja kisika poraba vsako jamico smo izmerili v obdobju 100 minut. Droge oligomycin (0,5 um), FCCP (0,3 pM) in antimycin A (2,0 um) so bile v vrsti in dodamo v vsako. Več podrobnosti je na voljo v S1 datotek.}

mitohondrijska DNK Nestabilnost

Pogostnost mutacij v D-loop regije mitohondrijske DNK, so bile določene s PCR pomnoževanja uporabo primerji C6-CA5 (tabela S1 ). Pomnožene fragmente smo klonirali v pCR2.1 vektor (Invitrogen) in vložki iz 328 kolonij smo pomnožili z uporabo VectorD zanke temeljni premazi za (tabela S1). V pomnoženi fragmenti so bili očiščeni in zaporedje z ABI Prism BigDye Terminator Cycle sekvenciranje in za ABI Prism 3730 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts). Za določitev mutacije, so zaporedja uporabljajo kot poizvedbe nad referenčno zaporedje Cambridge pridobljeni iz MitoMap (http://www.mitomap.org. Accessed februar 9. 2012).

Mikromrežni in GSA

RNA s številnimi integritete RNA z dne 8. ali več od treh nadzora in tri vzorce okužb (s izvedljive E. faecalis
ali E. faecalis
lizat 40 g /ul) za 24 ur in 5 dni eksperimenti so bili predloženi RH mikromrež centru v Univerzitetni bolnišnici v Københavnu. RNA smo pomnožili in označen s "IVT Express komplet 3 (Affymetrix, Santa Clara, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. 250 ng skupaj RNA je bila uporabljena kot surovina. So označeni vzorci so bili hibridizirali GeneChip genoma U133 plus 2 nize (Affymetrix). V nizi speremo in obarvajo z phycoerytrin konjugirano streptavidin uporabo Affymetrix Fluidics Station® 450, in nizi so bili skenirani v Affymetrix GeneArray® 2500 skener za ustvarjanje fluorescenčne slike, kot je opisano v protokolu Affymetrix GeneChip®. 24 raw datoteke intenzivnosti celic (CEL-datoteke) so bile ustvarjene v GeneChip® Command Console® programske opreme (AGCC) (Affymetrix). Surove CEL-files so javno dostopni na ArrayExpress s pristopom številko E-MEXP-3496. Predobdelava za mikromrež za gen set analize (GSA) je bilo storjeno z R /Bioconductor [26], [27]. Prilagoditev ozadje, kvantil normalizacija in končno povzetka, da sonda iz izražanje intenzivnosti je opravila GCRMA algoritem [28] za vsako preskusno napravo, ločeno (File S2).

Kvantitativna Reverse prepis PCR

cDNA smo sintetizirali s pomočjo nadpisano III Prva sinteza traku SuperMix za qPCR (Invitrogen). Izražanje genov smo analizirali s QRT-PCR z uporabo SYBR bolj zelena q-PCR SuperMix za ABI PRISM (Invitrogen). Temeljni premazi so namenjeni uporabi programske opreme Primer-Blast iz NCBI [29]. Reakcije so bile teče na sistemu za ABI PRISM 7900HT Sequence Detection (SDS) iz Applied Biosystems. Podatki so bili normalizirajo GAPDH mRNA izražanja.

test Rast

8000 celice so bile razdeljene na vsako vdolbino šestih 24 jamicami in inkubirali pri 37 ° C in 5% CO _{2 za dva dni pred zdravljenjem. Celice smo obdelali v quadruplicates, kot sledi; 4 vodnjaki iz neokuženih kontrolnih celic, 4 vodnjaki zdravljenih s 400 pg /ul E. faecalis
lizat, 4 vodnjaki, zdravljenih z 40μg /ul lizata, 4 vodnjaki, zdravljenih s 4 pg /ul lizat in 4 vodnjaki, zdravljenih z izvedljiva E. faecalis
pri MOI 10. Ena plošče celic smo fiksirani vsak dan. Fiksiranje je bila opravljena s spiranjem s PBS in fiksirno z 1 ml 10% formalinu 10 minut. Fiksirani Celice smo obarvali z 1 ml 0,1% kristal vijoličnim (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), in plošče smo stresali 30 minut. Celice smo oprali, posušili in kristal vijolično smo ekstrahirali s 500 ul 10% ocetno kislino. Absorbanco smo izmerili pri 620 nm na POWERWAVE XS (BioTek Instruments, WINOOSKI, Vermont).}

Statistična analiza

analiza Enotna klasifikacija variance (ANOVA) smo uporabili za testiranje razlik v maksimalni dihal zmogljivosti , ATP promet in oxphos neodvisen poraba kisika. ANOVA je bila nadalje uporabljena za testiranje razlike v rasti celic med različnimi zdravljenja s E. faecalis
. Ko je ANOVA navedeno velike razlike med zdravljenje, je purani pošteno pomembna metoda, uporabljena za testiranje razlik med stopnjami porabe kisika ali število celic. mutacij frekvence mtDNA so bili ocenjeni s hi-kvadrat in Fisherjev test. Rezultati ROS so izražene kot povprečne vrednosti vsaj dvajset neodvisnih meritev in analizira brez para dve zimske t
-test. Rezultati QRT-PCR so izražene kot povprečne vrednosti najmanj treh neodvisnih poskusov, izmerjeno v treh tehničnih ponovitev, in analizira brez para dve zimske t
-test. Razlike med podatkovnih nizov so bile upoštevane značilne pri p vrednostih ≤0.05. Napaka palice = ± SEM, razen če ni drugače navedeno.

Identifikacija urejenih poti je bilo izvedeno po metodi GSA, GAGE ​​[30], povečani za izkoriščanje razpoložljivih informacij indukcija-zatira (za obsežne podatke in izračune glej S2 datotek). Poti so predstavljali seznami genov (genskih kompleti) prenesli iz baze podatkov Molekularna podpisov (MSigDB) 3,0 [31]. C2 zbirka kurator genskih sklopov (cerkvene poti in izražanja genov podpisov genskih in kemijskih motenj) z uporabo genske simbole identifikatorje. Gene set p-vrednosti so bile popravljene za večkratno testiranje z ocenjevanjem lažno stopnjo odkrivanja in stopnja pomembnosti je bila določena na 1%.

Rezultati

E. faecalis
okužba povzroči znotrajcelično ROS in superoksid proizvodnja

Drugo in smo že pokazali, da je imel achlorhydric gastrin KO miška bakterijske zaraščanje z enterokoki
, ki običajno niso del želodca rastlinskih vrst [ ,,,0],20]. Čeprav enterokokov
na splošno so mislili, da so nizke patogenosti, trajna Rastlinje v achlorhydric miših je povezana z vnetnim odzivom in na koncu te miši razvoj raka želodca [20], [32]. Okarakterizirati patološkega procesa v želodčnih celic smo pregledali, kako so bakterije vplivale na želodčne epitelijskih celic. Uporaba sonde za spremljanje intracelularno proizvajanje ROS, smo ugotovili, da je 30 minut okužbe spodbudil znatno povečanje znotrajcelične ROS tvorbe (slika 1A). Z sond, specifičnih za proizvodnjo superoksid smo pokazali, da je ROS v glavnem sestavljena iz superoksid v MKN74 celic (Slika 1A). Intenziteta fluorescence je količinsko z uporabo programske opreme LSM 510 in statistično pomembno povečanje intraceličnega ROS in superoksida v okuženih celicah v primerjavi z neokuženih kontrolnih celicah, smo opazili (slika 1B). Ugotovili smo, ni dokazov, da predlagano invazijo celic, ki jih bakterije zato sklepamo, da je intracelularni ROS proizvajajo okuženih celicah in ne ponotranjeni E. faecalis
(Slika 1 C-D).

okužba zmanjša mitohondrijsko aktivnost in povečuje oxphos neodvisen od porabe kisika

Vir ROS odkril bakterijske okužbe lahko bodisi ustvari zunajceličnih bakterij [33] in /ali pridelanih znotraj celic [34], [35]. Intracelularni ROS se lahko bodisi ustvari v oxphos odvisni ali neodvisen način. Preučiti in nato opredelitev morebitnega znotrajcelično proizvodnjo ROS, povezane s E. faecalis
okužbe; smo izmerili, kako bakterijska okužba vpliva na mitohondrijsko dihanje z merjenjem ATP promet, dihalne zmogljivosti in porabe kisika oxphos neodvisen (slika 2). Da se zagotovi, da rezultati odražajo dihanje z le celic MKN74 so vse bakterije odstranjene pred meritev. Ni bilo bistvene razlike v ATP prometa kontrolnih celic, gojenih za 4-24 ur, ker se znaten 2- in 4 zmanjšanja kratno (p < 0,001) prometa ATP bili prisotni med kontrolnimi celicami in okuženih celic inkubiranih za 8 in 24 ur oz (slika 2A). Ustrezna korelacija bil najden v respiratornem zmogljivosti, kjer so tudi kapacitete okuženih celic znatno 2- in 4-krat zmanjšala (P 0,01) v primerjavi s kontrolnimi celicami po 8 in 24 urah po okužbi (slika 2b). Poraba oxphos neodvisen kisika kontrolnih celic je bilo nespremenjeno za celice, gojene za 4-24 ur. V nasprotju s tem je poraba kisika oxphos neodvisna celic, okuženih z bakterijo povečal s ~50% celotne porabe kisika po 4 urah okužbe postane glavni kisik utilizer (p < 0,001) (slika 2C). To pomeni, da E. faecalis
interakcijo z epitelijskih celic indukcijo ROS oblikovanje in porabo kisika z drugimi znotrajcelični encimskih sistemov kot oksidativna fosforilacija. Izražanje NOX1-5 in Duox1-2 je bila preučena v celični liniji želodca; Vendar pa izraz ni vplivala okužbe (tabela S2).

E. faecalis
okužba povzročena mitohondrijska DNK nestabilnost

smo že pokazale, da okužba z patogene H. pylori
sevi povzročajo mutacije v mitohondrijski genom v celični kulturi prehrano [36]. Glede na to, da je okužba z E. faecalis
poveča znotrajcelično ROS smo pregledali, če je povzročil tudi genomsko mtDNK nestabilnost. Skupna pogostnost mitohondrijev D-loop regije mutacijskih dogodkov je bila bistveno višja MKN74 celičnih kulturah, okuženih s E. faecalis
(45,5%) kot pri zunaj okuženih nadzor celičnih kultur (23,0%; p < 0,01) (slika 3). Poleg tega so okužene celice pokazala večje število prehodov (36,4%) kot kontrolnih celicah (21,8%; p < 0,05). Delecije (0% kontrola /3,9% okuženih), vstavkov (1,1% kontrola /2,6% okuženih) in transverzije (0% kontrola /2,6% okuženih), slednji običajno pojavi kot posledica ROS so v okuženih pogosteje Zaznali celice. Tako je okužba z E. faecalis
inducira mutacije v želodčnih celic (slika 3).

okužba povzročila NFκB prevladujejo vnetni odziv in ROS odgovor

Da bi pridobili dodatno biološko vpogled v celičnih odzivov v želodčnih celic s E. faecalis
okužba smo izvedli analizo mikromrež preučila globalne spremembe v izražanju genov v celicah, okuženih z izvedljiva E. faecalis
ali obdelani s E. faecalis
lizat. Namesto da se osredotoča na izražanje posameznih genov smo uporabili [30] GSA opredeliti poti in postopkov aktivirajo ali zavirajo okužbo. Osredotočanje na sklope genov namesto posameznih genov poveča robustnost, občutljivost in biološki pomen tudi za zmerno urejene sklopov genov. To se doseže s povečanjem razmerja med signalom in šumom, kar je mogoče razlagati skromnih sprememb v posameznih genih [37]. GSA testirali 2403 genskih sklopov, kar je povzročilo 484 urejene poti statistično značilne bodisi za žive okužb in /ali lizat dražljajev (Slika S2). Poudarkom na tistih poteh statistično pomembnih za žive okužb, nekateri genskih sklopov, ki se zdijo najbolj značilni za sedanje študije so ročno razdelimo v tri skupine (sliki 4, 5 A in 6 A). Proučevanje vnetje in ROS, E. faecalis
infekcija povzročila znatno regulacijo navzgor več poti, vključenih v imunskih odzivov, vključno z grozdi kemokine receptorjev in signalnih kemokine geni, geni, vključenih v G-protein pripojen receptor ligand vezavo in aktiviranje NFκB geni (slika 4, zgornji šest genski kompleti). Poleg tega dva gena kompleti, ki vsebujejo gene, ki se odzivajo na pro-vnetnih oksidirani fosfolipidi močno so se regulirane. Oksidirani fosfolipidi so izdelani z ROS in funkcijo v pro-vnetne način [38], [39] (slika 4, gen nastaviti sedem in osem). Podpiranje prisotnost ROS je bil gen sklop 30 genov je znano, da se izrazi v odziv na ROS aktivirana (slika 4, spodaj gen set). Znano je, da so ROS pomembni za lipopolisaharid (LPS) -driven proizvodnjo različnih vnetnih citokinov [40] pa Grampozitivna bakterija kot E. faecalis
ne izražajo LPS. Zato smo preverili, kako je bilo izražanje posameznih genov, ki kodirajo pro-vnetnih citokinov in Kemokini izvede kot odgovor na ne-LPS spodbujati okužbe med 24. uro in 5 okužb dan (tabela 1). Številni genov, ki sodelujejo pri NFκB vnetno poti so precej up-urejena v E. faecalis
okužbe, vključno interlevkin-1β (IL-1SS), interlevkin-1-receptorskega povezan kinaze 2 (IRAK2), VEGF, IL-8, IL-23α, IL-11, in faktor tumorske nekroze-α (TNF α), večina, ki lahko še dodatno širi za aktivacijo odziv NF-κB [41] - [44]. Med njimi je bilo več citokini predhodno ugotovljene v H. pylori
prenašajo okužbe, kot so IL-8 in vaskularni endotelijski faktor rasti (VEGF), tako povezano z angiogenezo in napredovalega raka želodca, IL-1SS, ki je močan inhibitor izločanja kisline, ter tudi TNF-a, ki je regulator celično proliferacijo, diferenciacijo in apoptozo [43] - [45]. Poleg tega je citokin IL-23α ki spodbuja pojavnost tumorjev in rast [46] in je zelo proizvaja v H. pylori
kolonizirali sluznica [47] je bil pripravljen regulirano skupaj z IL-11, ki je parietalnih celica citokinov, ki zavira izločanje želodčne kisline, pospešuje atrofični gastritis in želodčne tumorigeneze [48], [49]. Med drugimi geni ugotovljeno, da se prikaže visoke in velike izrazne ravni med okužbo so IL-1α, IL-32, razlikovanje rastnega faktorja 15 (GDF15) in kemokin (C-C motiv) ligand 22 (CCL22). Poleg tega up-ureditev superoksidno dismutazo 2 (SOD2), ki pretvarja superoksida z vodikovim peroksidom, smo opazili. IL-8, interferon regulativni faktor 1 (IRF-1) in TNF so bili potrjeni s QRT-PCR (slika 4 B).

popravilo poškodb DNA so navzdol urejeno v E. faecalis
okužba

Analiza je pot pokazala, da je izražanje genov, ki sodelujejo pri poškodb DNA popravilo občutno navzdol urejena v primerjavi z neokuženih celičnih kultur po 24 urah po okužbi (slika 5A). QRT-PCR potrdili, da so izraz več neusklajenost popravila (MMR) genov navzdol urejeno po tako 24 ur in 5 dni E. faecalis
okužba (slika 5, B). V 24 urah okužene celice PMS1 in MSH6 je bila precej navzdol urejeno (4-krat in 1,8-krat oziroma, P < 0,001). Pomemben navzdol ureditev MSH2 (3-krat), MSH3 (1,9-krat), MSH6 (2-krat) in PMS1 (3-krat) (p 0.05) (slika 5, B) smo opazili pri celicah 5 dni po okužbi. V izraznih zložljiv spremembe izbranih DNK genov škoda popravila po okužbi, so prikazani v tabeli S3. Ti rezultati kažejo, da je E. faecalis
okužba navzdol ureja glavne poti za popravilo DNA, ki izhajajo iz genomske nestabilnosti podoben okužb z H. pylori
[36] [50] [51].

Okužba s E. faecalis
zavira kontrolo celičnega ciklusa in rast MKN74 celic

ovrednotiti spremembe v rasti celic, ki jih E inducirane. faecalis
okužbe, smo raziskovali vpliv bakterij na izražanje kontrolnih genov celičnega ciklusa in na rast MKN74 celic. Gene sklopov, ki obsegajo kontrolo celičnega cikla in checkpoint geni so navzdol urejena po 24 urah okužbe z živih bakterij, ki kažejo znatno upočasnitev v celične proliferacije, ampak tudi na povečano tveganje za mutacije v novih celic (Slika 6 A). Nasprotno, ti načini so bile navzgor regulirano v celicah, okuženih z bakterijskim lizat kažejo, da te celice še vedno delimo po 24 urah (slika 6 A). Mi poleg izmeri proliferacijo celic za 5 dni in ugotovil, da živih bakterij povzroča proliferacijo MKN74 celic upočasni ali ustavi popolnoma (Slika 6 B). Celične proliferacije so bili prizadeti tudi pri inkubiranih z bakterijsko lizat. Po 24 urah, lizat obdelamo Celice smo še deljenjem (kot je prikazano tudi na sliki 6A) in do 4. dan ni bilo nobene razlike med neokuženih celic in celic, okuženih z lizata. Vendar, na dan 4 pa so bile bistveno zmanjšane celice po inkubaciji z bakterijsko lizata v primerjavi z neokuženih kontrolnih celicah. 5. dan opazili razmerja med odmerkom in odzivom med koncentracijo lizata in celične rasti (slika 6 B), kar kaže, da okužbe z E. faecalis
motijo ​​celično rast. Podoben rezultat je bilo navedeno v človeških limfocitih, v kateri so trije dnevi inkubacije s E. faecalis
lizat povzroča zastoj celičnega ciklusa [52]. Kot je bilo to delo v izoliranem sistemu, lahko zmanjša širjenje okuženih celic pripisati pomanjkanju faktorja stimulacije rasti z odzivanjem imunske celice.

Pogovor

Mikrobiološke patogeni se ocenjuje, da povzročajo približno 1,2 milijona primerov raka vsako leto [5]. Študije na ljudeh in več živalskih modelih so pokazale, da aklorhidrija omogoča razbohotenje bakterij v želodcu, ki lahko povzroči kronično vnetje želodca, ki se razvije v raka želodca [20], [53], [54]. Podpora etiološke vloge drugih bakterij v želodcu malignih bolezni, so študije izkoreninjenje H. pylori
okužba, ki omogočajo želodca kolonizacijo s črevesnimi bakterijami [55], in poznejši razvoj želodčnega raka [56]. To kaže, da so drugi igralci kot H. pylori
lahko sodelujejo pri vnetnih poganja želodčnih malignih bolezni. Molekularnih dogodkov, s katerimi kronična želodca okužba s temi bakterijami vplivajo na rakave celice in povzročijo škodo na teh celic je bil slabo razumljen.

Ugotovili smo, da okužba z E. faecalis
povzroča znotrajcelični proizvodnjo ROS. Oksidativna fosforilacija, ki ga mitohondrije je po okužbi z nizko, kar kaže, da je bil ROS proizvodnja v pretežni meri v oxphos neodvisno od znotraj okuženih celic. Znotrajceličnih oxphos neodvisen ROS se lahko proizvaja v epitelijskih celic, ki niso fagocitne NADPH (NOX) oksidaze v odgovoru na primer citokinov stimulacija [57], in so glavni ne-mitohondrijski viri ROS [58]. To NOX encimov prometne elektrone čez plazemskih membranah, ki ustvarjajo superoksid in druga ROS [59]. V epitelijskih celic človeških najdemo dva NOX homologus (NOX2 in NOX5) [60]. V naši raziskavi so ti encimi, ki niso bili transkripcijsko reguliran, vendar ni mogoče izključiti, da so povišane koncentracije ROS posledica aktiviranja teh encimov, čeprav to potrebuje nadaljnje preiskave.

• Plos ONE: IL-26 spodbuja proliferacijo in preživetje človeške želodčne raka celic z uravnavanjem ravnovesja STAT1 in stat3 aktiviranje
• Plos ONE: Visoka Izražanje proteina 90 toplotnega šoka je povezana z tumor agresivnost in slabo prognozo pri bolnikih z napredovalim Rak želodca