PLoS ONE: Enterococcus фекальный Инфекция вызывает воспаление, внутриклеточный Oxphos-Independent ROS производства и повреждения ДНК в рака желудка человека Cells

Абстрактный

Фон
<р> ахлоргидрией, вызванное, например, атрофический гастрит позволяет избыточного бактериального роста, который вызывает хроническое воспаление и повреждение клеток слизистой оболочки инфицированных людей вождения опухолей желудка и рака. Enterococcus фекальный
( E. Фекальный
) могут колонизировать achlohydric желудки, и поэтому мы хотели изучить влияние E. фекальный
инфекции на воспалительной реакции, активные формы кислорода (ROS) образование, митохондриального дыхания и митохондриальная генетическая стабильность в слизистой желудка клеток.

Методы
<р> Чтобы отделить изменения, вызванные бактериями из те из воспалительных клеток, мы установили экстракорпорального E. фекальный
модельной системы инфекции в желудке с использованием клеточной линии карциномы MKN74. Всего РОС и супероксид измеряли с помощью флуоресцентной микроскопии. Клеточная потребление кислорода характеризовался неинвазивным использованием респирометрии на основе XF24 микропланшетов. экспрессии генов исследовали микрочипов, и пути реагирования были идентифицированы с помощью генной Set Analysis (GSA). Отобранные транскриптов генов были проверены с помощью количественной ПЦР в реальном времени (QRT-PCR). Митохондриальные мутации определяли с помощью секвенирования.

Результаты
<р> Заражение клеток MKN74 с E. фекальный
индуцированная продукция внутриклеточная ROS через тропу, не зависящей от окислительного фосфорилирования (oxphos). Кроме того, E. фекальный
инфекция индуцированной митохондриальной ДНК нестабильности. После заражения, гены, кодирующие белки воспалительных ответных были транскрипционно повышается, тогда как гены контролируют репарации повреждений и клеточного цикла ДНК понижающей регуляции. Рост клеток замедляется при инфицировании жизнеспособного E. фекальный
и ответил в зависимости от дозы до E. фекальный
лизат.

Выводы
<р> Заражение E. фекальный
индуцировали oxphos независимый ответ внутриклеточного ROS и повредили митохондриального генома в культуре клеток желудка. Наконец бактерии индуцируется воспалительной реакции NF-кВ, а также нарушение реакции повреждения ДНК и экспрессию генов контроля клеточного цикла.

Стенограмма профилирование
<р> Массив Экспресс инвентарный номер E-Mexp-3496. <Бр> <р> Цитирование: Strickertsson ОАС, Desler C, Martin-Bertelsen T, Мачадо AMD, Wadstrøm T, Винтер O и др. (2013) Enterococcus фекальный
Инфекция вызывает воспаление, внутриклеточный Oxphos-РОС Независимое производство, и повреждения ДНК в клетках человека рак желудка. PLoS ONE 8 (4): e63147. DOI: 10.1371 /journal.pone.0063147
<р> Редактор: Shree Рам Сингх, Национальный институт рака, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 28 августа 2012 года; Принято: 2 апреля 2013 года; Опубликовано: 30 апреля 2013
<р> Copyright: © 2013 Strickertsson и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Финансирование:. AMDM является при поддержке стипендии от португальской науки, технологии Foundation. LFH поддерживается датской MRC. Уколов поддерживается онкологическим обществом датского и Университет Копенгагена sünd. TMB и OW поддерживаются за счет гранта от Novo Nordisk Foundation в Центр биоинформатики. CD и LJR поддерживаются NORDEA-Fonden. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является одним из десяти наиболее распространенных видов рака, а также с глобальной годовой смертности приблизительно 700.000, это второй наиболее распространенной причиной смертности, связанной с раком [1]. Рак желудка кишечного типа развивается через ряд патологических событий, начиная с хроническим воспалением, атрофический гастрит, кишечная метаплазия и, наконец, рака [2].
<Р> Хроническое воспаление и рак был связан в нескольких исследованиях пациентов, и генетически модифицированных мышей, и, как полагают, участвует в патогенезе около 25% всех случаев рака во всем мире [2] - [4]. Характеристики воспаления, связанной с раком включают наличие хемокинов и цитокинов в опухолевых тканях, имеющих потенциал, чтобы стимулировать пролиферацию опухолевых клеток и выживаемость злокачественных клеток [5], [6]. Хроническое воспаление также способствует перепроизводство повреждающих ДНК активных форм кислорода (ROS), производство которых может быть случайным для окислительного фосфорилирования (oxphos) реакций в митохондриях (oxphos-зависимой) или получен из-за пределов митохондрий, наиболее часто с помощью никотинамид аденин динуклеотид фосфата ( NADPH) оксидазы (oxphos-независимый) (для обзора см [7] - [9]). Хроническое производство повреждения ROS причиной ДНК, что позволяет накопление мутаций, которые в свою очередь, может активировать онкогены и /или инактивировать гены-супрессоры опухолей, тем самым увеличивая риск развития рака [3].
<Р> Наиболее распространенным фактором риска для развития рак желудка является хроническая бактериальная инфекция желудка с хеликобактерной
( H. пилори
) [10]. Хроническая инфекция желудка с помощью H. пилори
влияют на желудочную рН баланс и может привести к ахлоргидрией или гиперхлоргидрия [11]. Хотя эта бактерия классифицируется как класс один канцероген, это не всегда связано с повышенным риском развития рака желудка. Например, Н. пилори
инфицированных больных с двенадцатиперстной кишки и высоким уровнем кислотности желудочного сока имеют пониженный риск развития рака желудка по сравнению с теми, от общей популяции [11] - [13]. В противоположность этому, у больных с атрофическим гастритом и секреции желудка кислоты пониженной имеют повышенный риск развития рака желудка [11], [13], [14]. Повышенный риск рака у ахлоргидрия лиц может быть связано с бактериального роста других бактерий в просвете желудка [15]. В обоих ахлоргидрия людей и животных моделях избыточного бактериального роста причиной хронического гастрита, который развивается в кишечной метаплазией и раком желудка, наконец, [16] - [18]. Среди бактерий, найденных в желудке ахлоргидрия мышей энтерококков
видов, которые являются грамположительные кокки способны выжить в среде с рН, как низко как 4,5 [19], [20]. Enterococcus фекальный
( E. Фекальный
) является членом человеческого комменсальной микробиоты и один из наиболее распространенных бактерий в желудочно-кишечном тракте [19]. Несмотря на это, E. фекальный
может выступать в качестве человеческого патогена [21], и было установлено в значительно увеличилось количестве в полости рта раковых поражений и рака толстой кишки человека [22], [23]. В связи с этим E. фекальный
способна производить N-нитрозаминов и индуцировать генетическую нестабильность в ободочной эпителиальных клеток путем окислительного повреждения ДНК [24], [25].
<р> Гастрит связан с инфильтрацией иммунных клеток в Китайской ткани, что затрудняет рассекать действие иммунных клеток от подкладки клеток слизистой оболочки в естественных условиях
. Поэтому мы использовали витро
ткани модель культуры в том, что позволило нам исследовать, как изолированные клетки слизистой оболочки реагируют на бактерии и молекулярные механизмы, с помощью которых кишечные бактерии, такие как E. фекальный
вызвать повреждения в эпителиальных клеток желудка. Используя эту модель, мы изучили влияние E. фекальный
инфекции желудка культур клеток аденокарциномы на ROS производства, клеточного дыхания, роста, ДНК повреждения /ремонта и воспалительных реакций.

Материалы и методы

Культура клеток, E. фекальный
и условий роста
<р> Человеческие MKN74 культуры желудка аденокарциномы из японской коллекции банка клеток Исследования биоресурсам (JCRB # JCRB0255) поддерживали в среде RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (Invitrogen), 100 мкг /мл стрептомицина и 100 ед /мл пенициллина (Invitrogen), при 37 ° С и 5% СО <суб> 2 увлажненной атмосфере. Инфекции были выполнены с помощью E. фекальный
штамм (АТСС 29212). Бактерии выращивали в 5% чашках с кровяным агаром при температуре 37 ° С. Оптическая плотность (ОП) бактерий, выращенных в среде RPMI 1640 среде измеряли при 550 нм на УФ-спектрофотометре 1601 (Shimadzu, Kyoto, Japan) (рис S1). E. фекальный
лизат получают путем замораживания /оттаивания бактериальной суспензии в три раза, в то время как обработка ультразвуком суспензии между каждым циклом.

Заражение клетки желудка для РНК и ДНК изоляции
<р> в течение 24 ч инфекций , 80% сплошности MKN74 клетки промывали PBS и инкубировали в антибиотической среде, свободной. Ночь выращенных колоний E. фекальный
были добавлены к клеточной культуре MKN74 при множественности инфекции (MOI) 50 бактерий на клетку. 5 день инфекции проводили путем обработки 65% сплошности MKN74 клеток с E. фекальный
при MOI 10 или с концентрацией лизат белка 40 мкг /мкл. Каждые 24 ч, клетки промывали PBS и с свежей средой и были добавлены бактерии или лизат. Контрольные клетки были обработаны аналогичным образом в отсутствие бактерий или бактериального лизата. В пробирке исследования
были проведены с использованием желудочный линии раковых клеток, чтобы испытать повреждающее действие E. фекальный
на желудочных клеток аденокарциномы. Эти клетки отличаются от нормальных эпителиальных клеток желудка путем проведения нескольких хромосомных аберраций, но имеют то преимущество, будучи воспроизводимой модели системы, которая во многом дублирует события, происходящие в желудке. Сравнение инфицированных клеток к неинфицированным клеткам дает достоверную картину повреждений и изменений в экспрессии генов, вызванное инфекцией.

РНК и ДНК изоляция
<р> После заражения, РНК и ДНК экстрагировали путем добавления тризола Реагент (Invitrogen), в каждую культуральную колбу. РНК выделяли в соответствии с протоколом изготовителей. ДНК-содержащий промежуточная фаза осаждали добавлением 100% этанола. Образцы центрифугировали при 4 ° С, 3500 г в течение 6 мин. Супернатант фенол-этанол удаляли, а оставшаяся выделения ДНК было сделано с использованием набора тканей NucleoSpin (Macherey-Nagel, Дюрен, Германия). концентрации РНК и ДНК были измерены на NanoDrop ND-1000 спектрофотометра. Номера целостности РНК были измерены на 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния) в соответствии с протоколом изготовляет.

Измерение РОС и супероксид
<р> За два дня до заражения 8 × 10 ^{4 MKN74 клетки высевали в каждую лунку Lab-Tek TM Chambered Coverglas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, штат Массачусетс). MKN74 клетки окрашивали в течение двух часов до инфицирования с 2-Plex смеси обнаружения. ROS и супероксид окрашивание проводили с использованием ROS /RNS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Farmingdale, Нью-Йорк) в соответствии с инструкциями изготовителей. MKN74 клетки инфицировали при MOI 50 в течение 30 мин и анализировали под Цейсс LSM 510 конфокальной микроскопии с использованием LSM 510 программного обеспечения (Цейс, Оберкохене, Германия). Незараженных окрашивали MKN74 клетки были использованы в качестве отрицательного контроля.}

Локализация E. фекальный
при заражении
<р> 8 × 10 4 MKN74 клеток /лунку высевали в 8-камеры со стеклянным дном слайде (Thermo Fisher Scientific) за 24 часа до окрашивания. Для того чтобы определить локализацию E. фекальный
после заражения мы отдельно окрашивали плазматическую мембрану с CellMask TM Deep Red плазмалеммы пятно (C10046, Invitrogen) и стенки бактериальной клетки с помощью BacLight TM Зеленый бактериальная пятно (B-35 000, молекулярных зондов, Invitrogen), в соответствии с двумя протоколами соответственно. Клетки и бактерии промывали 3 раза в PBS до заражения. Клетки инфицировали при MOI 100 в течение 4 часов и анализировали под Цейсс ЛСК 510 конфокальной микроскопии с использованием программного обеспечения LSM 510 (Zeiss). Этот эксперимент был повторен три раза и 8 Champers исследовали каждый раз.

XF24 микропланшет на основе респирометрии
<р> респирометрии клеток MKN74 проводили с использованием XF24 внеклеточного Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA ). Половина из посеянных MKN74 клетки были инфицированы E. фекальный
при MOI 50 в течение 4, 8 или 24 часов в то время как другая половина была оставлена ​​неинфицированных. После инкубации бактерии были удалены с использованием 4% пенициллина /стрептомицина (5 ед /мл) и 4% цефотаксима (100 мкг /мл) (ACS Dobfar Generics S.A., Люксембург, Бельгия). Клетки инкубировали в CO <суб> 2 свободный инкубатор при температуре 37 ° С в течение 1 ч, чтобы температура и рН уравновешивание. Микропланшет с клетками затем загружали в XF24 и скорость потребления кислорода в каждой лунке измеряли в течение 100 минут. Препараты олигомицином (0,5 мкМ), FCCP (0,3 мкМ) и Антимицина А (2,0 мкМ) в свою очередь, добавляли в каждую лунку. Более подробная информация доступна в файле S1.

митохондриальной ДНК Нестабильность
<р> Частота мутаций в области D-петли митохондриальной ДНК, определяли с помощью ПЦР-амплификации с использованием праймеров С6-CA5 (таблица S1 ). Усиленные фрагменты были клонированы в вектор pCR2.1 (Invitrogen) и вставки из 328 колоний амплифицировали с использованием праймеров VectorD-петли (таблица S1). Усиленные фрагменты были очищены и секвенировали с использованием набора для циклического секвенирования ABI PRISM BigDye Terminator и ABI PRISM 3730 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts). Для определения мутации, последовательности были использованы в качестве запросов к эталонной последовательности, полученной из Кембриджского MitoMap (http://www.mitomap.org. Достигано 9. февраль 2012).

микрочипов и GSA
<р> РНК с числом целостности РНК 8 или выше от трех управления и трех образцов инфекции (с жизнеспособного E. фекальный
или E. фекальный
лизат 40 мкг /мкл) в течение 24 ч и 5 дней эксперименты были представлены RH Microarray центра в больнице Копенгагенского университета. РНК амплифицировали и маркируется с помощью "IVT Экспресс набор 3 (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния, США) в соответствии с инструкции производителя. 250 нг тотальную РНК использовали в качестве входных данных. Меченые образцы гибридизуют GeneChip Геном U133 плюс 2 массивов (Affymetrix). Массивы отмывали и окрашивали конъюгированным стрептавидином phycoerytrin использованием Affymetrix Флюидика Station® 450, а массивы сканировали в сканере Affymetrix GeneArray® 2500 для генерации флуоресцентные изображения, как описано в протоколе Affymetrix GeneChip®. 24 файлов необработанных клеток интенсивности (CEL-файлы) были созданы в GeneChip® Command Console® Software (AGCC) (Affymetrix). Сырьевые Cel-файлы были доступны общественности на ArrayExpress с номером доступа E-Mexp-3496. Препроцессирование микрочипов для набора генов анализа (GSA) было сделано с R /Bioconductor [26], [27]. Регулировка фона, квантиль нормализация и окончательное реферирования, чтобы исследовать установленные интенсивности экспрессии проводили с помощью алгоритма GCRMA [28] для каждого условия эксперимента, отдельно (S2) Файл.

Количественные обратной транскрипции PCR
<р> кДНК синтезировали с использованием SuperScript III для синтеза первой цепи Синтез СУПЕРМИКС для кПЦР (Invitrogen). Экспрессия гена анализировали с помощью QRT-PCR с использованием SYBR зеленее, Q-PCR SuperMix для ABI PRISM (Invitrogen). Праймеры были разработаны с использованием Primer-Blast программное обеспечение от NCBI [29]. Реакции проводились на системе ABI PRISM 7900HT последовательности обнаружения (SDS) от Applied Biosystems. Данные нормализовали на экспрессию мРНК GAPDH.

Анализ роста
<р> 8000 клеток были распределены в каждую лунку шесть 24-луночных планшетов и инкубировали при 37 ° С и 5% CO <суб> 2 для за два дня до начала лечения. Клетки обрабатывали в quadruplicates следующим образом; 4 скважины неинфицированных контрольных клеток, 4 скважины обрабатывали 400 мкг /мкл E. фекальный
лизат, 4 скважины, обработанных 40μg /мкл лизата, 4 лунки обрабатывали 4 мкг /мкл лизата и 4 лунок, обработанных жизнеспособного E. фекальный
при УМВД 10. Одна из пластины клеток фиксировали каждый день. Фиксирование было сделано путем промывки PBS с и закрепляющий с 1 мл 10% -ного формалина в течение 10 мин. Зациклившись клетки окрашивали 1 мл 0,1% кристаллическим фиолетовым (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури), и планшеты встряхивали в течение 30 мин. Клетки промывают, сушат, и кристаллический фиолетовый экстрагируют 500 мкл 10% -ной уксусной кислоты. Оптическую плотность измеряли при 620 нм на PowerWave XS (BioTek Instruments, Winooski, Вермонт).

Статистический анализ
<р> Один классификационный анализ дисперсии (ANOVA) использовался для проверки различий в максимальной дыхательной способности АТФ оборот и oxphos независимый от потребления кислорода. ANOVA Кроме того, было использовано для того чтобы испытать различия в росте клеток во время различных обработок с E. фекальный
. Когда ANOVA показали значительные различия между процедурами, Tukeys честно значимый метод был использован для проверки различий между скоростями потребления кислорода или количества клеток. частоты мутаций мтДНК оценивали с помощью критерия хи-квадрат и точный критерий Фишера. Были выражены результаты ROS в виде средних значений по крайней мере, двадцати независимых измерений и анализировали с помощью непарного двумя хвостами т
-test. Результаты QRT-PCR были выражены в виде средних значений, по меньшей мере, трех независимых экспериментов, измеренных в трех технических повторах и анализировали с помощью непарного двумя хвостами т
-test. Различия между наборами данных считались достоверными при р значениях ≤0.05. Усы = ± SEM, если не указано иное.
<р> Определение регулируемых путей было сделано методом GSA, Гейдж [30], расширенной использовать имеющуюся информацию индукции репрессии (за обширные сведения и расчеты см S2 File). Подготовка были представлены списки генов (наборы генов), загруженные из базы данных молекулярной Подписи (MSigDB) 3.0 [31]. Коллекция С2 Куратор наборов генов (канонических путей и экспрессии генов подписями генетических и химических возмущений) с использованием идентификаторов генов символов. набор генов р-значения были скорректированы для многократного тестирования путем оценки частоты ложных обнаружения и уровень значимости был установлен на уровне 1%.

Результаты

E. фекальный
инфекции вызывают внутриклеточные ROS и супероксид производство

Другие и ранее мы показали, что ахлоргидрия гастрин KO мыши имели избыточный рост бактерий с энтерококки
, которые обычно не являются частью желудка флоры [ ,,,0],20]. Несмотря на то, энтерококки
в целом, как считается низкой патогенностью, устойчивый избыточный рост в ахлоргидрия мышей связано с воспалительной реакцией и в конечном счете, эти мыши развивается рак желудка [20], [32]. Чтобы охарактеризовать патологический процесс в клетках желудка, которые мы исследовали, как бактерии, затронуло эпителиальных клеток желудка. С помощью зондов, производить мониторинг внутриклеточного производства ROS, мы обнаружили, что 30 минут инфекции стимулировало значительное увеличение внутриклеточной ROS пласта (фиг.1А). С помощью зондов, специфичных для производства супероксид мы показали, что ROS в основном состоял из супероксида в MKN74 клеток (Рис. 1А) Интенсивность флуоресценции количественно определяли с помощью программного обеспечения LSM 510 и статистически значимое увеличение внутриклеточной ROS и супероксида в инфицированных клетках по сравнению с неинфицированных контрольных клеток наблюдалось (Фигура 1В). Мы не нашли никаких доказательств того, что предложенное вторжение клеток бактериями, так мы приходим к выводу, что внутриклеточная РОС был произведен инфицированных клеток и не усвоены E. фекальный
(Рисунок 1 C-D).

Инфекция снижает активность митохондриальной и повышает oxphos независимый от потребления кислорода
<р> Источник ROS найдены следующие бактериальные инфекции могут либо быть порождена внеклеточных бактерий [33] и /или получен из внутри клеток [34], [35]. Внутриклеточные РОС может быть сгенерирован в oxphos-зависимой или независимой основе. Для того, чтобы изучить и впоследствии характеризуют возможную внутриклеточной продукции активных форм кислорода, связанный с E. фекальный
инфекции; мы измеряли, как бактериальная инфекция влияет дыхание митохондрий путем измерения АТФ оборота, дыхательную способность и oxphos независимый от потребления кислорода (Рисунок 2). Для того, чтобы гарантировать, что результаты отражают дыхание только клетки MKN74, все бактерии были удалены перед измерениями. Там не было никаких существенных различий в АТФ оборота контрольных клеток, выращенных в течение 4-24 часов, в то время как в значительной 2- и 4 уменьшение кратном (р &л; 0,001) оборота АТФ присутствовали между контрольными клетками и зараженными клетками инкубируют в течение 8 и 24 часов соответственно (Рисунок 2А). Соответствующая корреляция была обнаружена в дыхательной емкости, где возможности инфицированных клеток были также значительно 2- и 4 раза уменьшилась (р ≪ 0,01) по сравнению с контрольными клетками, через 8 и 24 часов после инфицирования (Фигура 2В). Oxphos независимый от потребления кислорода контрольных клеток было неизменным для клеток, выращенных в течение 4-24 часов. В отличие от этого oxphos-независимое потребление кислорода клеток, инфицированных бактериями увеличилась с ~50% от общего потребления кислорода через 4 часа после заражения, чтобы стать основным утилизатор кислорода (р &л; 0,001) (рис 2С). Это говорит о том, что E. фекальный
взаимодействовать с эпителиальных клеток, индуцирующих образование активных форм кислорода и потребление кислорода другими системами внутриклеточного фермента, чем окислительного фосфорилирования. Выражение NOX1-5 и Duox1-2 исследовали в желудочном клеточной линии; Однако выражение не зависит от инфекции (Таблица S2).

E. фекальный
инфекция, вызванная нестабильностью митохондриальной ДНК
<р> Ранее мы показали, что заражение патогенными H. штаммы пилори
индуцированные мутации в митохондриального генома в культуре клеток человека [36]. Учитывая, что инфекция с E. фекальный
увеличить внутриклеточное ROS мы исследовали, если она также вызвала геномную мтДНК нестабильность. Общая частота митохондриальная области D-петли мутационных событий была значительно выше в культурах клеток, инфицированных MKN74 с E. фекальный
(45,5%), чем в неинфицированных контрольных культурах клеток (23,0%; р &л; 0,01) (рисунок 3). Кроме того, инфицированные клетки показали более высокое число переходов (36,4%), чем контрольные клетки (21,8%, р ≪ 0,05). Пропуски (0% контроль /3,9% инфицированный), Вставки (контроль 1,1% /2,6% инфицированный) и трансверсии (0% контроль /2,6% инфицированный), последний, как правило, рассматривается как следствие ROS, были обнаружены чаще у инфицированных клетки. Таким образом, инфекция с E. фекальный
вызывает мутации в клетках желудка (рисунок 3).

Инфекция вызвала NFκB доминирует воспалительный ответ и ответ ROS
<р> Для того, чтобы получить дальнейшее понимание биологического в клеточных реакций в клетках желудка чтобы E. фекальный
инфекции мы провели анализ микрочипов, исследующих глобальные изменения в экспрессии генов в клетках, зараженных жизнеспособного E. фекальный
или обрабатывают E. фекальный
лизат. Вместо того, чтобы сосредоточиться на экспрессию отдельных генов, которые мы использовали GSA [30] для определения путей и процессов, активизируются или тормозятся инфекцией. Сосредоточение внимания на наборы генов, а не отдельных генов повышает надежность, чувствительность и биологическую значимость даже для умеренно регулируемых наборов генов. Это достигается за счет увеличения отношения сигнал-шум, что позволяет интерпретировать скромные изменения в отдельных генах [37]. GSA испытания 2403 наборов генов и в результате 484 регулируемых путей является статистически значимым для живых либо инфекции и /или лизат раздражители (рис S2). Сосредоточение на этих путей статистически значимых для живых инфекций, некоторые из наборов генов судил, чтобы наилучшим образом охарактеризовать текущее исследование были вручную разбить на три группы (рисунки 4, 5 A и 6 A). Рассматривая воспаление и ROS, E. фекальный
инфекция привела к значительному повышающей регуляции нескольких путей, участвующих в иммунных реакциях, в том числе кластеров рецепторов хемокинов и хемокиновых сигнальных генов, генов, участвующих в G-белком лиганда связывания с рецептором и NFκB активации генов (Рисунок 4, верхний шесть наборы генов). Кроме того, два набора генов, содержащих гены, реагируя на провоспалительных окисленных фосфолипидов были сильно повышающей регуляции. Окисленные фосфолипиды получают ROS и функции в провоспалительных способом [38], [39] (рис 4, набор генов семь и восемь). Поддерживая присутствие ROS, ген набор из 30 генов, которые выражаются в ответ на ROS был активирован (рис 4, нижний набор генов). Известно, что РОС имеют важное значение для липополисахарида (ЛПС), управляемом обществом производство нескольких провоспалительных цитокинов [40] Однако, грамположительные бактерии, такие как <ЕМ> Е. фекальный
не выражают LPS. Поэтому мы исследовали, как экспрессию отдельных генов, кодирующих про-воспалительных цитокинов и хемокинов были осуществлены в ответ на не LPS стимулировал инфекции в течение 24 ч и 5 дней инфекции (таблица 1). Многочисленные гены, вовлеченные в воспалительную пути NFκB были значительно повышающей регуляции во время E. фекальный
инфекция в том числе интерлейкин-1 β (ИЛ-1ß), интерлейкин-1 рецептор-связанный киназы 2 (irak2), VEGF, IL-8, IL-23α, ИЛ-11, и фактор некроза опухоли-α (TNF- α), большинство из которых можно дополнительно распространить ответ NF-kB активации [41] - [44]. Среди них было несколько цитокины ранее были определены в H. пилори
опосредованных инфекций, таких как IL-8 и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), и связанного с ангиогенезом и с раком желудка, IL-1ß который является мощным ингибитором секреции кислоты, а также TNF-a, A регулятор клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза [43] - [45]. Кроме того, цитокин IL-23α, который способствует заболеваемости опухоли и рост [46] и высоко производится в H. Pylori
колонизировали слизистой оболочке [47] была повышающей регуляции наряду с ИЛ-11, который является теменная клеток цитокина, который блокирует секрецию кислоты желудочного сока, способствует атрофический гастрит и желудка туморогенез [48], [49]. Среди других генов, найденных для отображения высокой, и значительные уровни экспрессивного во время инфекции были IL-1α, IL-32, фактор роста дифференциации 15 (gdf15) и хемокина (С-С мотив) лиганда 22 (CCL22). Кроме того, повышающая регуляция супероксиддисмутазы 2 (SOD2), преобразующий супероксида в перекиси водорода, был замечен. IL-8, Интерферон регулирующий фактор 1 (IRF-1) и TNF-alpha были подтверждены QRT-PCR (рис 4 Б).

ремонт повреждений ДНК вниз регулируется во время E. фекальный
инфекция
<р> Анализ пути показал, что экспрессия генов, участвующих в репарации повреждений ДНК была значительно подавляется по сравнению с неинфицированными клеточными культурами после 24 часов инфекции (рис 5, а). QRT-PCR подтвердили, что экспрессия некоторых ремонтных рассогласования (MMR) генов понижающей регуляции после того как 24 ч и 5 дней E. фекальный
инфекция (рис 5, В). Через 24 ч инфицированные клетки PMS1 и MSH6 значительно подавлялась (4 раза и 1,8 раза соответственно; P &л; 0,001). Значительное снижение экспрессии MSH2 (3 раза), MSH3 (1,9 раза), Msh6 (2 раза), а также PMS1 (3 раза) (р ≪ 0,05) (рис 5, В) наблюдалась в клетках 5 дней после заражения. В экспрессивные Наклоняемый изменения выбранных генов репарации повреждений ДНК после инфицирования приведены в таблице S3. Эти результаты свидетельствуют о том, что E. фекальный
инфекция вниз регулирует основные пути репарации ДНК, приводящие к нестабильности генома, подобной инфекции с H. пилори
[36], [50], [51].

Инфекция E. фекальный
ингибирует контроль клеточного цикла и рост клеток MKN74
<р> Для того, чтобы оценить изменения в росте клеток, вызванной E. фекальный
инфекции, мы исследовали влияние бактерий на экспрессию генов контроля клеточного цикла и роста MKN74 клеток. наборы ген, включающий контроль клеточного цикла и контрольных точек гены понижающей регуляции через 24 часа после заражения с жизнеспособных бактерий, предполагающих значительное замедление пролиферации клеток, но и повышенный риск мутаций в новых клеток (рис 6 А). В противоположность этому, эти пути были повышающей регуляции в клетках, инфицированных бактериальный лизат предполагая, что эти клетки были еще разделив через 24 часа (Рисунок 6 А). Затем мы измеряли пролиферацию клеток в течение 5 дней и обнаружили, что жизнеспособные бактерии, вызывавшие пролиферацию клеток MKN74, чтобы замедлить или остановить полностью (рисунок 6 B). Клеточные разрастаний также были затронуты при инкубации с бактериальной лизата. Через 24 ч лизата Обработанные клетки до сих пор деления (как также показано на рисунке 6, а), и до 4-й день не было никаких различий между неинфицированных клеток и клеток, инфицированных лизатов. Тем не менее, на 4-й день были значительно меньше клеток после инкубации с бактериальной лизата по сравнению с контрольными неинфицированными клетками. На 5-й день наблюдалась зависимость доза-реакция между концентрацией лизата и роста клеток (Рисунок 6 В), показывая, что инфекции, вызванные E. фекальный
препятствуют росту клеток. Аналогичный результат наблюдался в лимфоцитах человека, в которых три дня инкубации с E. фекальный
лизат индуцированного клеточного цикла [52]. Поскольку эта работа была проделана в изолированной системе, снижение пролиферации инфицированных клеток может быть связано с отсутствием фактора стимуляции роста, реагируя иммунные клетки.

Обсуждение
<р> микробные патогены оценкам, причиной приблизительно 1,2 миллиона случаев рака каждый год [5]. Человеческие исследования и несколько моделей на животных показали, что ахлоргидрии позволяет избыточного бактериального роста желудка, что может вызвать хроническое воспаление желудка, которое развивается в рак желудка [20], [53], [54]. Поддержка этиологической роли других бактерий в желудочном злокачественных опухолей, являются эрадикации исследования H. Pylori
инфекция, которая позволяет желудочной колонизацию кишечных бактерий [55], а также последующее развитие рака желудка [56]. Это говорит о том, что другие игроки, чем H. пилори
могут быть вовлечены в воспаление желудка приводом злокачественных опухолей. Молекулярные события, с помощью которых хроническая желудочная инфекция с этими бактериями, влияют на раковые клетки и вызывают повреждение этих клеток было плохо изучено.
<Р> Мы обнаружили, что инфекция E. фекальный
индуцированное внутриклеточное производство ROS. Окислительного фосфорилирования в митохондриях была низкой после заражения, показывая, что производство ROS в основном генерируется в oxphos-независимым образом внутри инфицированных клеток. Внутриклеточные oxphos-независимый РОС может быть получен в эпителиальных клетках не-фагоцитарной NADPH (NOX) оксидазы в ответ на, например, цитокин стимуляции [57], и являются основными, не митохондриальные источники ROS [58]. Эти ферменты NOX транспорта электронов через плазматические мембраны, генерируя супероксида и других ROS [59]. В эпителиальных клетках человека два NOX homologus (NOX2 и NOX5) найдены [60]. В нашем исследовании эти ферменты не были транскрипционно вверх регулируется, однако он не может быть исключено, что повышенные уровни ROS явилось следствием активации этих ферментов, хотя это и требует дальнейшего изучения.

• PLoS ONE: IL-26 способствует пролиферации и выживания клеток человека рака желудка путем регулирования баланса STAT1…
• PLoS ONE: Высокая экспрессия белка теплового шока 90 связан с опухолевой агрессивностью и плохим прогнозом у паци…