PLoS ONE: Enterococcus faecalis Infekcija sukelia uždegimą, Intraląstelinė Oxphos nepriklausomas ROS gamybą ir DNR žalą žmogaus skrandžio vėžys Cells

Anotacija

Fonas

achlorhidrija sukelia pvz atrofinė gastritas leidžia bakterijų užaugimo, kuri indukuoja chronišką uždegimą ir sugadinti gleivinės ląstelių užsikrėtusių asmenų vairavimo skrandžio navikų ir vėžį. , Enterococcus faecalis
( El. Faecalis
) gali kolonizuoti achlohydric skrandžius ir todėl norėjome ištirti E poveikį. faecalis
infekcijos uždegimine reakcija, reaktyvių deguonies formų (ROS) formavimas, mitochondrijų kvėpavimo ir mitochondrijų genetinis stabilumas skrandžio gleivinės ląsteles.

Metodai

Jei atskirti pokyčius, kuriuos sukelia bakterijų tiems iš uždegiminių ląstelių mes sukūrėme vitro E. faecalis
infekcijos modelio sistemą, naudojant skrandžio karcinoma ląstelių linijos MKN74. Bendras ROS ir superoksido buvo matuojamas pagal fluorescencijos mikroskopijos. Mobilieji deguonies suvartojimas buvo būdingas neinvaziniu naudojant XF24 mikroplokšteles respirometrijos. Genų ekspresiją išnagrinėjo microarray ir reagavimo keliai buvo identifikuoti geną analizė (GSA). Pasirinkti genų nuorašai buvo patikrintas kiekybinio realaus laiko polimerazės grandinine reakcija (KRL-PGR). Mitochondrijų mutacijos

Rezultatai

Infekcija MKN74 ląstelių su E lėmė sekos.. faecalis
sukeltas ląstelėje ROS gamyba per kelią, nepriklausomai nuo oksidacinio fosforilinimo (oxphos). Be to, El. faecalis
infekcija sukelta mitochondrijų DNR nestabilumą. Po infekcijos, genų kodavimas ir uždegiminio atsako baltymų buvo transkripciškai iki reguliuojama, o DNR pažeidimai remonto ir ląstelės ciklo kontrolės genai buvo žemyn reguliuojama. Ląstelių augimas sulėtėjo kai užkrėstas perspektyvaus E. faecalis parsisiųsti ir atsakė priklausomai nuo dozės iki E. faecalis
lizato.

Išvados

Infekcija El. faecalis
pasiţymėjo oxphos nepriklausomas ląstelėje ROS reakciją ir apgadino mitochondrijų genomo skrandžio ląstelių kultūroje. Galiausiai bakterijos pasižymėjo NF-κB uždegiminis atsakas, taip pat sumažėja DNR pažeidimai atsaką ir ląstelės ciklo kontrolės genų ekspresiją.

stenograma profiliavimas

prisijungimas masyvas Express "numeris El MEXP-3496.

nurodomoji dalis: Strickertsson JAB, Desler C Martin Bertelsen T Machado AMD Wadstrøm T Winther p et al. (2013), Enterococcus faecalis
Infekcija sukelia uždegimą, Ląstelės viduje Oxphos-Nepriklausomas ROS gamybos ir DNR žalą žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. PLoS ONE 8 (4): e63147. Doi: 10,1371 /journal.pone.0063147

redaktorius: Shree Ram Singh Nacionalinio vėžio instituto, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo rugpjūčio 28, 2012 m Priėmė: Balandžio 2, 2013 m Paskelbta: Balandžio 30, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Strickertsson et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. AMDM yra remia stipendijos iš Portugalijos mokslo, technologijų fondas. LFH remia Danijos MRC. Jabs remia Danijos Cancer Society, ir Kopenhagos universiteto SUND. TKK ir AIP palaiko dotacijos iš Novo Nordisk Foundation į Bioinformatikos centras. Kompaktinių diskų ir LJR palaiko NORDEA-Fonden. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra tarp dešimties labiausiai paplitusių vėžio formų, ir su pasaulinio metinio mirtingumo maždaug 700.000, tai yra antra labiausiai paplitusi priežastis, dėl vėžio mirtingumo [1]. Žarnyno tipas skrandžio vėžys išsivysto per patologinių renginių, pradedant su lėtiniu uždegimu, atrofinį gastritu, žarnyno metaplazijos, ir galiausiai vėžio [2].

Lėtinis uždegimas ir vėžys buvo susijęs keliuose tyrimuose pacientų bei genetiškai modifikuotas peles, ir yra manoma, kad būti dalyvauja apie 25% visų vėžio atvejų patogenezės visame pasaulyje [2] - [4]. Charakteristikos su vėžiu susijusios uždegimas apima chemokinus ir citokinų navikų audiniuose, buvimą, galinti skatinti naviko-ląstelių proliferaciją ir išgyvenimą piktybinių ląstelių [5], [6]. Lėtinis uždegimas suteikia pirmenybę DNR perprodukcija kenkia reaktyvių deguonies formų (ROS), kurio gamyba gali būti atsitiktinis oksidacinio fosforilinimo (oxphos) reakcijų mitochondrijas (oxphos priklausomas) arba kurie yra pagaminti ne iš mitochondrijų dažniausiai iki nicotinamid dinukleotido fosfatas ( NADPH) oksidazės (oxphos nepriklausomas) (peržiūrėti pamatyti [7] - [9]). Lėtinis gamyba ROS priežastis DNR pažeidimus, leidžianti mutacijų kaupimosi, kuris savo ruožtu gali aktyvuoti onkogenų ir /arba juos nukenksminti auglio slopinamojo genus ir taip padidinti vėžio išsivystymo riziką [3].

Dažniausiai rizikos veiksnys kuriant skrandžio vėžys yra lėtinis bakterinė infekcija, skrandžio su Helicobacter pylori
( H. pylori
) [10]. Lėtinis infekcija H skrandį. pylori
įtakos skrandžio pH balansą ir gali sukelti achlorhidrija ar hyperchlorhydria [11]. Nors ši bakterija yra klasifikuojamas kaip klasės vieno kancerogenas, tai ne visada susijęs su padidėjusia rizika skrandžio vėžio vystymąsi. Pavyzdžiui, h. pylori
infekuotiems pacientams, kuriems dvylikapirštės žarnos opos ir aukšto lygio skrandžio rūgšties turi sumažintą rizika susirgti skrandžio vėžiu, palyginti su tų, iš bendro gyventojų [11] - [13]. Priešingai, pacientai, sergantys atrofinį gastritas ir sumažinti skrandžio rūgšties sekrecijos yra padidėjusi rizika susirgti skrandžio vėžiu [11], [13], [14]. Padidėjęs vėžio rizika achlorhydric asmenims gali būti dėl bakterinės užaugimo kitų bakterijų skrandžio spindį [15]. Abiem achlorhydric ir gyvūnų modelių bakterijų superinfekcija priežastis lėtinis gastritas, kuris vystosi į žarnyno metaplazijos ir pagaliau skrandžio vėžio [16] - [18]. Tarp rastus achlorhydric pelių skrandžio bakterijos buvo , enterokokai
rūšys, kurios yra gramteigiamų kokų galėtų išgyventi aplinkoje, kurių pH mažiau kaip 4,5 [19], [20]. , Enterococcus faecalis
( El. Faecalis
) yra žmogaus simbiotinėje mikrofloros narys ir vienas iš labiausiai paplitusių bakterijų virškinimo trakto [19]. Nepaisant to, El. faecalis
gali veikti kaip žmogaus patogenas [21], ir buvo rasta žymiai padaugėjo į burnos vėžinių pakitimų ir žmogaus gaubtinės žarnos vėžio [22], [23]. Atsižvelgiant į šio E. faecalis
yra pajėgi gaminti N-nitrozoaminų ir indukuoti genetinę nestabilumą storosios žarnos epitelio ląstelių per oksidacinio pažeidimo DNR [24], [25].

Gastritas yra susijęs su infiltracija imuninių ląstelių audinys, todėl sunku perpjauti į imuninių ląstelių veiksmus nuo kitų pamušalas gleivinės ląstelių in vivo
. Todėl mes naudojome in vitro
audinių kultūroje modelį, kuris leido mums išsiaiškinti, kaip izoliuota gleivinės ląstelės reaguoja į bakterijų ir molekulinius mechanizmus, kuriais žarnyno bakterijos, pavyzdžiui, E. faecalis
sukelti žalą skrandžio epitelinių ląstelių. Naudojant šį modelį mes išnagrinėjo E poveikį. faecalis
infekcijos skrandžio adenokarcinoma ląstelių kultūrose apie ROS gamybą, ląstelių kvėpavimą, augimui, DNR pažeidimas /remonto ir uždegiminių reakcijų.

Medžiagos ir metodai

Mobilusis Kultūra El. faecalis
ir augimo sąlygas

Žmogaus MKN74 skrandžio adenokarcinoma ląstelių kultūras iš Japonijos rinkimas Tyrimų Bioresources ląstelių banko (JCRB # JCRB0255) buvo išlaikytas RPMI 1640 terpė (Invitrogen, Karlovi Varai, Kalifornija), papildyta 10% vaisiaus jaučio serumo (FBS) (Invitrogen), 100 mikrogramų /ml streptomicino, ir 100 V /ml penicilino (Invitrogen), esant 37 ° C, ir 5% CO _{2 sudrėkintas atmosfera. Infekcijos buvo atliekami su E. faecalis
padermės (ATCC 29212). Bakterijos buvo auginamos 5% kraujo agaro lėkštelėse 37 ° C temperatūroje. Optinis tankis (OT), auginamų RPMI 1640 terpė bakterijų buvo matuojamas esant 550 nm bangos ilgiui dėl UV-1601 spektrofotometru (Shimadzu, Kioto, Japonija) (S1 paveiksle). El. faecalis
lizatas parengė freeze /atšildymo bakterijų suspensija tris kartus, o ultragarsu sustabdymą tarp kiekvieno ciklo metu.}

Infekcija skrandžio ląstelių RNR ir DNR išskyrimo pervežimas

24 h infekcijų , 80% Susiliejančio MKN74 ląstelės buvo išplauti su PBS ir inkubuojami antibiotinėje neturinčioje terpėje,. Nakvynė auginami kolonijų E. faecalis
buvo įtraukta į MKN74 ląstelių kultūrą infekcijos gausos (MOI) 50 bakterijų vienoje ląstelėje. 5 dienų infekcijos buvo atlikta gydant 65% susiliejantis MKN74 ląsteles E. faecalis
ne mažiau kaip 10 MOI arba su lizatas baltymų koncentracijos 40 mikrogramų /mikrol. Kas 24 val, ląstelės buvo išplauti su PBS ir šviežią terpę ir buvo pridėta bakterijos arba lizatas. Kontrolės ląstelės buvo apdoroti panašiai bakterijų arba bakterinės lizato nesant. in vitro buvo atlikti
tyrimai naudojant skrandžio vėžio ląstelių linijos išbandyti žalingą poveikį, El. faecalis
skrandžio adenokarcinoma ląsteles. Šios ląstelės skiriasi nuo įprastų skrandžio epitelinių ląstelių, atlikdama keletą chromosomų aberacijas, tačiau siūlome būdamas atkuriamas modelis sistema, kuri daugeliu atžvilgių atkartoja įvykius, vykstančius į skrandį pranašumą. Lyginant užkrėsti ląsteles sveikų ląstelių suteikia patikimą vaizdą žalos ir keisti genų ekspresijos, kurią sukelia infekcija.

RNR ir DNR išskyrimas

Po infekcijos, RNR ir DNR buvo paimti pridedant Trizol reagentas (Invitrogen) kiekvienam kultūros kolbą. RNR buvo išskirtas pagal gamina protokolą. DNR, kurių sudėtyje yra tarpinis etapas buvo nusodintas pridedant 100% etanolio. Mėginiai buvo centrifuguojamas, esant 4 ° C, 3500 g, 6 min. Fenolis-etanolis supernatantas buvo nuimamos ir likę DNR išskyrimas buvo daroma naudojant NucleoSpin audinių rinkinį (Macherey-Nagel, Düren, Vokietija). RNR ir DNR koncentracija buvo matuojama NanoDrop ND-1000 spektrometras. RNR vientisumo numeriai buvo išmatuotas 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija) pagal gamina protokolą.

Matavimo ROS ir Superoksido

Dvi dienas prieš infekcijos 8 × 10 ^{4 MKN74 ląstelės buvo padengtas kiekvienoje laboratorijoje-Tek TM Chambered Coverglas ( "Thermo Fisher Scientific", Waltham, Masačusetsas) šulinio. MKN74 ląstelės buvo nudažomi dvi valandas iki infekcijos su 2-plex aptikimo mišinio. ROS ir superoksido dažymo atlikta naudojant ROS /RNS aptikimo rinkinį (ENZO Gyvosios gamtos mokslai, Farmingdale, New York) pagal gamina instrukcijas. MKN74 ląstelės buvo užsikrėtę MOI 50 30 min ir analizuojami pagal Zeiss "LSM 510 mikroskopas naudojant LSM 510 programinę įrangą (Zeiss, Oberkochen, Vokietija). Sveikų tamsintas MKN74 ląstelės buvo naudojamas kaip neigiamos kontrolės.}

lokalizacija E. faecalis
infekcijos metu

8 × 10 ^{4 MKN74 ląstelių /gerai buvo pasėjamos į 8 kamerų stiklo dugno skaidrės (Thermo Fisher Scientific) prieš 24 valandas iki dažymo. Siekiant identifikuoti E lokalizacija. faecalis
po užsikrėtimo mes atskirai tamsintas plazminės membranos su CellMask TM sodriai raudona plazminės membranos nusidažo (C10046, Invitrogen) ir bakterijų ląstelės sienelės naudojant BacLight TM Žalioji bakterijų dėmių (b-35000, Molekulinė zondai, Invitrogen) pagal prie dviejų protokolų atitinkamai. Ląstelės ir bakterijos buvo plaunamos 3 kartus per PBS prieš infekcijos. Ląstelės buvo užsikrėtę MOI 100 4 valandas ir analizuojami pagal Zeiss "LSK 510 mikroskopas naudojant LSM 510 programinę įrangą (Zeiss). Šis eksperimentas buvo pakartotas tris kartus ir 8 Champers buvo išnagrinėti kiekvieną kartą.}

XF24 mikroplokšteles respirometrija

RESPIROMETRIJOS iš MKN74 ląstelių buvo atliktas naudojant XF24 tarpląstelinio Flux analizatoriumi (Seahorse biologijos, Šiaurės BILLERICA, MA ). Pusė nepadengtų MKN74 ląstelių buvo užsikrėtę E. faecalis
esant 50 MOI 4, 8 arba 24 valandas, o kita pusė buvo paliktas Neinfekuotiems. Po inkubacijos, bakterijos buvo ištrintas naudojant 4% penicilinui /streptomicino (5 V /ml) ir 4% cefotaxim (100 mikrogramų /ml) (ACS Dobfar Generics S.A., Liuksemburgas, Belgija). Ląstelės buvo inkubuojami CO _{2 laisvas inkubatorių 37 ° C temperatūroje 1 valandą, kad temperatūros ir pH pusiausvyrai. Mikroplokštelės su ląstelėmis tada buvo pakrauta į XF24 ir deguonies sunaudojimo norma kiekvieną šulinėlį buvo matuojamas per 100 minučių laikotarpį. Į oligomycin vaistai (0,5 mkm), FCCP (0,3 mkm) ir antimycin A (2.0 mkm) buvo eilė įtraukta į kiekvieną duobutę. Daugiau informacijos galima gauti Failų S1.}

Mitochondrijų DNR nestabilumas

mutacijų in D-kilpos regiono mitochondrijų DNR dažnis buvo nustatytas PGR amplifikacijos naudojant Gruntai C6-CA5 (lentelė S1 ). Amlifikuoti fragmentai buvo klonuoti į pCR2.1 vektoriaus (Invitrogen) ir įdėklai nuo 328 kolonijų buvo papildyta naudojant VectorD ciklo pradmenis (lentelė S1). Amlifikuoti fragmentai buvo valytas ir sekos naudojant ABI PRISM BigDye Terminatorius ciklas Sequencing Kit ir ABI PRISM 3730 DNR sequencer (Perkino-Elmer, Waltham, Masačusetsas). Norėdami nustatyti mutacijas, sekos buvo naudojami kaip užklausomis prieš Kembridžo kontroline seka, gauta iš MitoMap (http://www.mitomap.org. Prisijungta vasaris 9. 2012).

mikrogardeliq ir GSA

RNR su RNR vientisumo skaičius 8 arba aukščiau trijų kontrolės ir trijų infekcijos pavyzdžių (su perspektyviu E. faecalis
arba El. faecalis
lizatas 40 g /pl) už 24 valandą ir 5 dienos eksperimentai buvo pateiktas RH mikrogardeliq centro Kopenhagos universitetinės ligoninės. RNR buvo išplėstos ir ženklinami naudojant 3 "IVT Express komplektas (Affymetrix, Santa Clara, CA, JAV) pagal gamina instrukcijas. 250 ng, kad bendras RNR buvo naudojamas kaip įvesties. Tokius mėginiai buvo kryžminosi į GeneChip genomo U133 plius 2 matricos (Affymetrix). Masyvų buvo plaunami ir tamsintas su phycoerytrin konjuguoto streptavidino naudojant Affymetrix Fluidics Station® 450, o matricas buvo nuskaitomi į Affymetrix GeneArray® 2500 skenerio generuoti liuminescencines vaizdus, ​​kaip aprašyta Affymetrix GeneChip® protokolą. 24 žaliavos ląstelių intensyvumo failus (CEL-failai) buvo susidarę GeneChip® komandų Console® Programinė įranga (AGCC) (Affymetrix). Pirminiai CEL-failai buvo viešai prieinami ArrayExpress su inventorinį numerį E-MEXP-3496. Išankstinis apdorojimas mikrogardelių dėl genų rinkinio analizė (GSA) buvo padaryta su R /Bioconductor [26], [27]. Fono korekcija, kvantilio normalizavimas ir galutinis santraukos zondas nustatytus raiškos intensyvumą

Kiekybiniai atvirkštinės transkripcijos PGR

kDNR buvo atlikta pagal GCRMA algoritmas [28] kiekvienam eksperimento sąlygos, atskirai (Failų S2). buvo susintetintas naudojant viršuje III Pirmosios grandinės sintezei SUPERMIX už qPCR (Invitrogen). Genų ekspresija buvo analizuojami KRL-PGR naudojant SYBR Greener Q-PGR SUPERMIX už ABI PRISM (Invitrogen). Gruntai buvo sukurta naudojant Gruntas-Blast programinę įrangą iš NCBI [29]. Reakcija buvo paleisti ABI PRISM 7900HT Sequence Detection sistemos (DVS) nuo taikomosios Biosystems. Duomenys buvo normalizuoti pagal GAPDH mRNR išraiška.

augimo tyrimas

8000 ląstelės buvo siunčiami į kiekvieną šešių 24-duobučių lėkštelėse šulinio ir inkubuojamos 37 ° C, o 5% CO _{2 už dvi dienas iki gydymo pradžios. Ląstelės buvo elgiamasi quadruplicates taip; 4 šuliniai sveikų kontrolinių ląstelių, 4 šuliniai gydomi 400 mikrogramų /mikrol E. faecalis
lizatas, 4 šuliniai gydomi 40μg /mikrol lizate, 4 šuliniai gydomi 4 mikrogramų /mikrol lizate ir 4 šulinių gydomiems perspektyvaus El. faecalis
po 10 Vienas plokštės ląstelių MOI buvo fiksuojami kiekvieną dieną. Fiksacija buvo padaryta plaunant PBS ir fiksuojančio su 1 ml 10% formalinu 10 min. Užfiksuotas ląstelės buvo tamsintas su 1 ml 0,1% violetinei (Sigma-Aldrich, St. Louis, Misūris), ir plokštelės buvo purtomas 30 min. Ląstelės buvo išplaunama, išdžiovinama, ir metilvioletinio buvo ekstrahuojamas 500 mikrol, 10% acto rūgšties. Optinių buvo matuojamas 620 nm ant POWERWAVE XS (BioTek instrumentų, WINOOSKI, Vermont).}

Statistinė analizė

Vienas klasifikacija dispersinė analizė (ANOVA) buvo naudojama patikrinti skirtumus maksimalus kvėpavimo pajėgumas , ATP apyvarta ir oxphos nepriklausomas deguonies suvartojimas. Be to, ANOVA buvo naudojamas per bandymą įvairių gydymo su E skirtumus ląstelių augimą. faecalis
. Kai ANOVA parodė, reikšmingų skirtumų tarp gydymo, Tukeys sąžiningai reikšmingas metodas buvo naudojamas siekiant patikrinti skirtumus tarp deguonies suvartojimo normas ar ląstelių skaičių. mtDNA mutacijų dažniai buvo įvertintas chi kvadrato ir tikslios Fišerio testą. ROS rezultatai buvo išreikšta vidutinėmis vertėmis mažiausiai dvidešimt nepriklausomų matavimų ir analizuojami neporiniai du-tailed , T
-test. KRL-PGR rezultatai buvo išreikšta vidutinėmis vertėmis mažiausiai trijų nepriklausomų eksperimentų, išmatuotas tris techninius kartotinių ir analizuojami neporiniai du-tailed , T
-test. p vertybių ≤0.05 buvo laikoma reikšminga tarp duomenų rinkinių skirtumų. Klaida barai = ± SEM jeigu nenurodyta kitaip.

Cheminės reguliuojamose kelius buvo daroma GSA metodą, GAGE ​​[30], didesnio išnaudoti turimą indukcija-represijų informacija (ekstensyvaus detalės ir skaičiavimai pamatyti Failo S2). Būdai atstovavo sąrašus genų (genų rinkiniai) atsisiųsti iš molekulinio Parašai bazės (MSigDB) 3,0 [31]. C2 kolekcija pritaikytų genų rinkiniai (kanoninių kelius ir genų ekspresijos parašų genetinių ir cheminių pasipiktinimas), naudojant genų simboliai identifikatorius. Genų rinkinys p-reikšmės buvo Koreguota daugeliui bandymų įvertinant klaidingą atradimas greitį ir reikšmingumo lygmuo buvo nustatytas 1%.

Rezultatai

El. faecalis
infekcija sukelia viduląstelinis ROS ir superoksido gamybai

Kiti ir mes anksčiau parodė, kad achlorhydric gastrinas KO pelės turėjo bakterijų sąžalynus su , enterokokai
, kad paprastai nėra dalis skrandžio floros apsaugos [ ,,,0],20]. Nors , enterokokų
apskritai yra manoma, kad mažo patogeniškumo, patyrė superinfekcija į achlorhydric pelių yra susijusi su uždegimine reakcija ir galiausiai šios pelės plėtoti skrandžio vėžiu [20], [32]. Norėdami apibūdinti patologinį procesą per skrandžio ląstelių Mes išnagrinėjome, kaip bakterijos įtakos skrandžio epitelio ląsteles. Naudojant zondus ląstelėje ROS gamybos kontrole, mes nustatėme, kad 30 minučių infekcijos skatino gerokai padidinti ląstelėje ROS susidarymo (1a pav.) Su konkrečiais už superoksido gamybai zondai mes parodėme, kad ROS daugiausia sudarė superoksido į MKN74 ląstelių (1a pav.) Fluorescencijos intensyvumas buvo įvertintas naudojant LSM 510 programinę įrangą ir statistiškai reikšmingą padidėjimą ląstelėje ROS ir superoksido užkrėstų ląstelių, palyginti su sveikų kontrolinių ląstelių buvo pastebėtas (1B pav.) Mes nerado įrodymų, kad siūlomą invazija į bakterijos ląstelių, kad galime daryti išvadą, kad ląstelėje ROS buvo gaminamas infekuotų ląstelių, o ne internalizuoti El. faecalis
(1 pav, C-D).

Infekcija mažėja mitochondrijų aktyvumą ir didina oxphos nepriklausomas deguonies suvartojimas

ROS šaltinis rado po bakterinės infekcijos gali būti arba generuoja ekstraląsteliniuose bakterijų [33] ir /ar pagaminti iš ląstelėse [34], [35]. Ląstelės viduje ROS gali būti arba generuoja į oxphos priklausomas arba nepriklausomai. Išnagrinėti ir vėliau apibūdinti galimą ląstelėje ROS gamybą, susijusią su, El. faecalis
infekcijos; mes matuojamas kaip bakterinė infekcija įtakos mitochondrijų kvėpavimą matuojant ATP apyvartą, kvėpavimo gebėjimus ir oxphos nepriklausomas deguonies suvartojimą (2 paveikslas). Siekiant užtikrinti, kad rezultatai atspindi kvėpavimas tik MKN74 ląsteles, visos bakterijos buvo pašalinti prieš matavimus. Nebuvo didelio skirtumo ATP apyvartos kontrolės ląstelių, auginamų 4-24 valandų, o gerokai 2- ir 4 kartus sumažėjo (p < 0,001) ATP apyvartos dalyvavo tarp kontrolinių ląstelių ir infekuotų ląstelių inkubuojami 8 ir 24 val atitinkamai (2A pav). Atitinkamas koreliacija buvo nustatyta, kvėpavimo našumą, kai užkrėstų ląstelių pajėgumai taip pat buvo daug 2- ir 4 kartus sumažėjo (p < 0,01), lyginant su kontroline ląsteles po to, kai 8 ir 24 valandas nuo infekcijos (2b pav). Oxphos nepriklausomas deguonies suvartojimas kontrolinių ląstelių buvo nepakeisti auginamų 4-24 val ląsteles. Priešingai oxphos-nepriklausoma deguonies suvartojimas užkrėstos bakterijomis, padidėjo nuo ~50% viso suvartoto deguonies po 4 valandų infekcijos ląstelių tapti pagrindinis deguonies utilizer (p < 0,001) (2C pav). Tai rodo, kad El. faecalis
bendrauti su epitelio ląstelių skatinančiais ROS susidarymą ir deguonies suvartojimą kitų ląstelėje fermentų sistemos nei oksidacinio fosforilinimo. Išraiška NOX1-5 ir Duox1-2 buvo nagrinėjamas skrandžio ląstelių linijos; Tačiau išraiška neturi įtakos infekcijos (lentelė S2).

El. faecalis
infekcija, kurią sukelia mitochondrijų DNR nestabilumas

Mes jau anksčiau parodė, kad infekcija su patogeniškumo H. pylori
atmainos sukeltas mutacijas mitochondrijų genomo žmogaus ląstelių kultūros [36]. Atsižvelgiant į tai, kad infekcija, El. faecalis
padidinti ląstelėje ROS mes išanalizavome, jei jis taip pat sukelia genomo mtDNA nestabilumą. Bendras dažnis mitochondrijų D-kilpos regiono mutacijų įvykių buvo reikšmingai didesnis MKN74 ląstelių kultūrų užsikrėtusių E. faecalis
(45,5%) nei neužkrečiama kontrolė ląstelių kultūrose (23,0%; p < 0,01) (3 pav.) Be to, infekuotų ląstelių parodė didesnį skaičių perėjimai (36,4%) negu kontrolinių ląstelių (21,8%; p < 0,05). Išbrauktas (0% kontrolė /3,9% užkrėstų), intarpai (1,1% kontrolė /2,6% užkrėstų) ir transversions (0% kontrolė /2,6% užkrėstų), pastaroji paprastai vertinamas kaip ROS to, buvo aptikta dažniau užkrėstų ląstelės. Taigi infekcija E. faecalis
sukelia mutacijas skrandžio ląstelėse (3 paveikslas).

infekcija, kurią sukelia NFκB dominuoja uždegiminį atsaką ir ROS atsakas

Norėdami gauti papildomos biologinio pažvelgti į korinio atsakymų skrandžio ląstelių iki E. faecalis
infekcija atlikome mikrogardeliq analizę išnagrinėjama pasaulinius pokyčius genų ekspresija užsikrėtusių perspektyvaus E ląsteles. faecalis
arba gydomi E. faecalis
lizato. Užuot sutelkiant dėmesį į vienišų genų, kuriuos mes naudojome GSA [30] nustatyti kelius ir procesus aktyvuotas arba slopina infekcijos išraiška. Dėmesys rinkinių genų, o ne atskirų genų padidina tvirtumą, jautrumas ir biologinę svarbą net už vidutiniškai reguliuojamų rinkinių genuose. Tai pasiekiama skatinant signalo ir triukšmo santykis, kad būtų galima interpretuoti kuklius pokyčius individualių genų [37]. GSA išbandyta 2403 genų rinkinius ir lėmė 484 reguliuojamos keliai yra statistiškai reikšmingas tiek gyvų infekcijos ir /arba lizate dirgiklius (S2 pav). Dėmesys dėl tų kelių statistiškai reikšmingas gyvų infekcijos, kai kurių genų rinkinių įvertinta geriausiai apibūdina dabartinį tyrimą buvo rankiniu padalytas į tris grupes (4 skaičiai, 5 a ir 6 a). Nagrinėjant uždegimą ir ROS El. faecalis
infekcija, kurią sukelia didelį UP-reguliavimą keliomis trasomis dalyvaujančių imuninės reakcijos, įskaitant klasterių chemokino receptorių ir chemokino signalizacijos genų, genų, dalyvaujančių G baltymu sujungto receptoriaus ligando ir NFκB aktyvuoti genai (4 pav, viršutinių šešių genų rinkiniai). Be to du genų rinkiniai, apimantys genus likviduojant PRO-uždegiminių oksiduotų fosfolipidų stipriai buvo iki reguliuojama. Oksiduoto fosfolipidai yra gaminami ROS ir funkcijos pro uždegimo būdu [38], [39] (4 pav, genų nustatyti septyni aštuoni). Parama ROS buvimą, genų rinkinys 30 genų žinomoms išreiškė atsakydamas į ROS buvo aktyvuota (4 pav, apačioje genų rinkinys). Ji yra žinoma, kad ROS yra svarbūs lipopolisacharido (LPS) -driven gamyba iš kelių Pro-uždegiminių citokinų [40] Tačiau yra gram-teigiamas bakterijas, pavyzdžiui, El. faecalis
neteikiame LPS. Todėl buvo nagrinėjama, kaip atskirų genų, koduojančių PRO-uždegiminių citokinų ir chemokinus išraiška buvo vykdomas reaguojant į ne LPS skatino infekcija per 24 valandą ir 5 diena infekcijų (1 lentelė). Daugybė genai, dalyvaujantys NFκB uždegiminės keliu buvo gerokai iki reguliuojama E metu. faecalis
infekcijos, įskaitant interleukiną-1β (IL-1ß), interleukino-1 receptoriaus-susijęs kinazės 2 (IRAK2), VEGF, IL-8, IL-23α, IL-11, ir auglio nekrozės faktoriaus-α (TNF- α) kurių dauguma gali dar labiau propaguoti NF-κB aktyvacijos atsakymą [41] - [44]. Tarp jų buvo keletas citokinai anksčiau nustatytos H. pylori
, kuriuose mediatorius yra infekcijų, pavyzdžiui, IL-8 ir kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF), abi susijusios su angiogeneze ir su progresuojančiu skrandžio vėžio, IL-1ß kuris yra stiprus inhibitorius rūgšties sekrecijos, ir taip pat TNF-alfa, A reguliatorius ląstelių proliferacijos, diferenciacijos ir apoptozės [43] - [45]. Be to, citokinų IL-23α kuri skatina auglių aptikimo ir augimą [46] ir yra labai gaminami H. pylori
kolonizavo gleivinė [47] buvo reguliuojama kartu su IL-11, kuris yra Išorinis ląstelių naviko, kuris blokuoja skrandžio rūgšties sekreciją, skatina gleivinės atrofijos gastritu ir skrandžio tumorigenezei [48], [49]. Tarp kitų rastų rodyti aukštus ir svarbius Išsiskiriantis lygius infekcijos metu genų buvo IL-1α, IL-32, augimo diferenciacija faktorius 15 (GDF15) ir chemokino (C, C motyvas) ligando 22 (CCL22). Be to, up-reguliavimas, superoksido dismutazės 2 (Sod2), kuris konvertuoja superoksido į vandenilio peroksido, buvo pastebėtas. IL-8, interferonas reguliavimo koeficientas 1 (Mafija-1) ir TNF buvo patvirtintas KRL-PCR (4 pav. B skirsnį)

DNR pažeidimai remontas yra žemyn reguliuojama El metu. faecalis
infekcija

kelias analizė parodė, kad genų, dalyvaujančių DNR žalos atlyginimo išraiška buvo gerokai žemyn reguliuojama, palyginti su sveikų ląstelių kultūrose po 24 valandų infekcijos (5a pav.) KRL-PGR patvirtino, kad iš kelių neatitikimas Remontas (MMR) genų išraiška buvo žemyn reguliuojama po tiek 24 val ir 5 dienomis, El. faecalis
infekcija (5 pav B). 24 h infekuotų ląstelių PMS1 ir MSH6 žymiai sumažėjo reguliuojama (4 kartus ir 1,8 karto padidėjusi; P < 0,001). Didelis žemyn-reguliavimas MSH2 (3 kartus), MSH3 (1,9 karto), MSH6 (2 kartų), ir PMS1 (3 kartus) (p < 0,05) (5 pav B) buvo stebimas ląstelių 5 dienų po infekcijos. Į Išsiskiriantis sulankstomomis pokyčiai pasirinktų DNR žala remonto genų po užsikrėtimo rodomi S3 lentelėje. Šie rezultatai rodo, kad El. faecalis
infekcija žemyn reguliuoja svarbiausius DNR reparacijos mechanizmus todėl genomo nestabilumas panašus į infekcijų H. pylori
[36], [50], [51].

Infekcija El. faecalis
slopina ląstelės ciklo kontrolės ir augimą MKN74 ląstelių

Norint įvertinti ląstelių augimo sukeltos El pakeitimus. faecalis
infekcijos, mes ištirti bakterijų įtaką ląstelių ciklo kontrolės genų raiškos ir MKN74 ląstelių augimą. Genų rinkiniai, apimantys ląstelės ciklo kontrolės ir Checkpoint genai buvo žemyn reguliuojama po 24 valandų infekcijos su gyvybingų bakterijų, rodantiems didelę lėtėja ląstelių proliferaciją, bet taip pat yra padidėjusi rizika mutacijų naujų ląstelių (6 pav A). Priešingai, šie būdai buvo iki reguliuojama, infekuotų su bakterijų lizatas tai rodo, kad šios ląstelės buvo vis dar dalijant po 24 valandų (6 pav A) ląstelių. Mes šalia matuojamas ląstelių proliferaciją 5 dienas ir nustatė, kad gyvybingos bakterijos sukelia MKN74 ląstelių proliferaciją sulėtinti arba sustabdyti visiškai (6 pav B). Mobilaus ryšio dauginimasis taip pat buvo paveikti kai inkubuojami su bakterijų lizate. Po 24 valandų, lizatas paveiktų ląstelių buvo vis dar dalijant (tai taip pat parodyta 6a paveikslas), ir iki 4-tą dieną nebuvo jokio skirtumo tarp sveikų ląstelių ir ląstelių, infekuotų lizato. Tačiau, 4-tą dieną buvo žymiai mažiau ląstelės po inkubacijos su bakterijų lizato, kai, palyginti su sveikų kontrolinių ląstelių. Gruodžio 5 dieną buvo pastebėtas nuo dozės ir atsako ryšys tarp lizate koncentracijos ir ląstelių augimo (6 pav B), tai rodo, kad infekcijos El. faecalis
trukdyti ląstelių augimą. Panašus rezultatas buvo pastebėtas žmogaus limfocitų, kurioje tris dienas inkubacijos su E. faecalis
lizatas sukeltas ląstelės ciklo suėmimas [52]. Kadangi šis darbas buvo atliktas izoliuotoje sistemoje, sumažinti masinio infekuotų ląstelių, gali būti susiję su augimo faktoriaus stimuliacijos stokos, atsakant imunines ląsteles.

Diskusijos

Mikrobų patogenai yra apskaičiuota, kad sukelti maždaug 1,2 mln vėžio atvejai kasmet [5]. Žmogaus studijų ir keletas gyvūnų modeliais parodė, kad achlorhidrija leidžia bakterijų augti skrandį, kuris gali sukelti lėtinį skrandžio uždegimą, kad perauga į skrandžio vėžio [20], [53], [54]. Parama etiologinis vaidmenį kitų bakterijų skrandžio piktybinių navikų, yra likvidavimo tyrimai H. pylori
infekcija, kuri leidžia skrandžio kolonizavimo žarnyno bakterijų [55], o vėliau skrandžio vėžio vystymąsi [56]. Tai rodo, kad kitų žaidėjų nei H. pylori
gali būti įtraukti į uždegimo varomas skrandžio piktybinių navikų. Molekuliniai renginiai, kuriais lėtinis skrandžio infekcija šių bakterijų turi įtakos vėžio ląsteles ir sukelti žalą šių ląstelių buvo sunkiai suprantamas.

Mes nustatėme, kad infekcija su E. faecalis
pasiţymėjo ląstelėje gamybą ROS. Oksidacinio fosforilinimo pagal mitochondrijas buvo mažas po užsikrėtimo, rodo, kad ROS gamyba daugiausia buvo sukurtas į oxphos nepriklausomas būdu per užkrėstų ląstelių. Intraląstelinė oxphos nepriklausomas ROS gali būti gaminamas epitelinių ląstelių ne fagocitozės NADPH (NOx) oksidazės reaguojant į pvz citokinų stimuliacija [57], ir yra pagrindiniai ne mitochondrijų šaltiniai ROS [58]. Tai NOx fermentų transporto elektronus visoje plazmos membranos, kuriantis superoksido ir kitų ROS [59]. Žmogaus epitelio ląstelių du NOX homologus (NOX2 ir NOX5) randami [60]. Mūsų tyrime šie fermentai nebuvo transkripciškai iki reguliuojama, tačiau ji negali būti atmesta galimybė, kad padidėjęs ROS koncentracija buvo kalbama apie šių fermentų aktyvinimo pasekmė, nors tai turi atlikti papildomus tyrimus.

• PLoS ONE: IL-26 skatina proliferaciją ir Išgyvenimo Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių, reglamentuojančių STAT1 ir stat3 aktyvinimas balansas
• PLoS ONE: Aukštas išraiška Šilumos šoko baltymas 90 yra susijęs su naviko agresyvumas ir blogos prognozės pacientams, sergantiems išplitusiu skrandžio vėžiu