De abstracte
Achtergrond
Achloorhydrie veroorzaakt door bijv. atrofische gastritis zorgt voor bacteriële overgroei, waarbij chronische ontsteking en beschadiging induceert de mucosale cellen van geïnfecteerde individuen rijden maag maligniteiten en kanker. Enterococcus faecalis Methods Om de veranderingen veroorzaakt door bacteriën uit te scheiden die van de ontstekingscellen we bouwde een in vitro E. faecalis Infectie van MKN74 cellen met E. faecalis Conclusies Infectie met E. faecalis Array Express toegangsnummer E-MEXP-3496. Visum: Strickertsson JAB, Desler C, Martin-Bertelsen T, Machado AMD, Wadstrøm T, Winther O, et al. (2013) Enterococcus faecalis Editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, de Verenigde Staten van Amerika Ontvangen: 28 augustus 2012; Aanvaard: 2 april 2013; Gepubliceerd: 30 april 2013 | Copyright: © 2013 Strickertsson et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Financiering:. AMDM is ondersteund door een beurs van de Portugese Science, Technology Foundation. LFH wordt gesteund door de Deense MRC. JABS wordt gesteund door de Deense Cancer Society, en de Universiteit van Kopenhagen SUND. TMB en OW worden ondersteund door een subsidie van de Novo Nordisk Foundation om de Bioinformatics Centre. CD en LJR worden ondersteund door Nordea-Fonden. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan Introductie Maagkanker is een van de tien meest voorkomende kankers, en met een totale jaarlijkse sterftecijfer van ongeveer 700.000, is de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte [1]. Type de intestinale maagkanker ontstaat door een reeks pathologische gebeurtenissen beginnen met chronische ontsteking, atrofische gastritis, intestinale metaplasie en tenslotte kanker [2]. Chronische ontsteking en kanker is gekoppeld in verscheidene studies van patiënten en genetisch gemodificeerde muizen, en wordt aangenomen dat het betrokken bij de pathogenese van ongeveer 25% van alle kankergevallen wereldwijd [2] - [4]. Kenmerken van kanker-gerelateerde ontsteking omvatten de aanwezigheid van chemokinen en cytokinen in tumorweefsels, met de potentie om tumorcel proliferatie en overleving van kwaadaardige cellen te stimuleren [5], [6]. Chronische ontsteking bevordert ook een overproductie van DNA-beschadigende reactive oxygen species (ROS), waarvan de productie kan in verband met oxidatieve fosforylering (OXPHOS) reacties in de mitochondriën (OXPHOS-afhankelijk) of geproduceerd van buiten de mitochondriën meestal door nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (be NADPH) oxidasen (OXPHOS-onafhankelijke) (zie voor een overzicht [7] - [9]). Chronische productie van ROS veroorzaakt DNA beschadiging, waardoor de accumulatie van mutaties die op hun beurt oncogenen kunnen activeren en /of te inactiveren tumorsuppressorgenen waardoor het risico op kankerontwikkeling verhogen [3]. De meest voorkomende risicofactor voor het ontwikkelen maagkanker is een chronische bacteriële infectie van de maag met Helicobacter pylori Gastritis wordt geassocieerd met infiltratie van immuuncellen in de weefsel, waardoor het moeilijk is om de werking van de immuuncellen ontleden van die van de voering mucosale cellen in vivo Materialen en methoden Cell Culture, E. faecalis Human MKN74 adenocarcinoom celculturen van de Japanse Inzameling van Research Bioresources celbank (JCRB # JCRB0255) werden in RPMI 1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (Invitrogen), 100 ug /ml streptomycine en 100 U /ml penicilline (Invitrogen) bij 37 ° C en 5% CO 2 vochtige atmosfeer. Infecties werden uitgevoerd met E. faecalis Infectie van maag Cellen voor RNA en DNA-isolatie Voor 24 uur infecties , 80% confluente MKN74 cellen werden gewassen met PBS en geïncubeerd in antibioticumvrij medium. Overnight-gegroeid kolonies van E. faecalis Na infectie, RNA en DNA werd geëxtraheerd door het toevoegen van Trizol Reagent (Invitrogen) aan elke kolf. RNA werd geïsoleerd volgens het protocol produceert. De DNA-bevattende intermediaire fase werd neergeslagen door toevoeging van 100% ethanol. Monsters werden gecentrifugeerd bij 4 ° C, 3500 g gedurende 6 minuten. De fenol-ethanol supernatant werd verwijderd en de resterende DNA-extractie werd uitgevoerd met behulp van een tissue NucleoSpin kit (Macherey-Nagel, Düren, Duitsland). RNA en DNA concentraties werden gemeten op een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer. RNA integriteit aantallen werden gemeten op een 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Californië) volgens de fabrikanten protocol. Twee dagen voorafgaand aan infectie 8 x 10 4 MKN74 cellen werden in elk putje van een Lab-Tek TM Chambered Coverglas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). MKN74 cellen werden gekleurd gedurende twee uur voor infectie met 2-plex detectie mix. ROS en superoxide kleuring werd uitgevoerd met de ROS /RNS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York) volgens de instructies van de fabrikant. MKN74 cellen werden geïnfecteerd bij MOI van 50 gedurende 30 min en onder een Zeiss LSM 510 confocale microscoop met de LSM 510 software (Zeiss, Oberkochen, Duitsland) geanalyseerd. Geïnfecteerde gekleurde MKN74 cellen werden gebruikt als negatieve controles. 8 × 10 4 MKN74 cellen /putje werden gezaaid in een 8-kamer met glazen bodem slide (Thermo Fisher Scientific) 24 uur voorafgaand aan de kleuring. Om de lokalisatie van E identificeren. faecalis respirometrietest van MKN74 cellen werd uitgevoerd met behulp van een XF24 extracellulaire Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA ). De helft van de geïllustreerde MKN74 cellen werden geïnfecteerd met E. faecalis De frequentie van mutaties in de D-loop regio mitochondriaal DNA, werden bepaald door PCR-amplificatie met behulp van primers C6-CA5 (tabel S1 ). De geamplificeerde fragmenten werden gekloneerd in de pCR2.1 vector (Invitrogen) en inserties van 328 kolonies werden geamplificeerd met de primers VectorD-lus (tabel S1). De geamplificeerde fragmenten werden gezuiverd en gesequenced met behulp van de ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit en een ABI Prism 3730 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts). Mutaties te bepalen, werden de sequenties gebruikt als queries tegen de Cambridge referentie sequentie verkregen uit MitoMap (http://www.mitomap.org. Betreden februari 9. 2012). RNA met een RNA integriteit aantal van 8 of hoger uit drie controle en drie infectie monsters (met levensvatbare E. faecalis golfreizen of met E. faecalis cDNA werd gesynthetiseerd onder toepassing SuperScript First-Strand III Synthese SuperMix voor qPCR (Invitrogen). Gen-expressie werd geanalyseerd door qRT-PCR met behulp van SYBR groener q-PCR SuperMix voor ABI PRISM (Invitrogen). Primers werden ontworpen met de primer-Blast software NCBI [29]. De reacties werden uitgevoerd op een ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (SDS) van Applied Biosystems. Data werd genormaliseerd voor GAPDH mRNA-expressie. 8000 cellen werden aan elke putje van zes 24-putjes platen en geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO 2 voor twee dagen voor de behandeling. De cellen werden in viervoud als volgt behandeld; 4 putjes van geïnfecteerde controlecellen, 4 putjes behandeld met 400 ug /ul E. faecalis Single indeling variantieanalyse (ANOVA) werd gebruikt om verschillen in maximale ademhalingscapaciteit testen , ATP omzet en OXPHOS-onafhankelijke zuurstofverbruik. ANOVA werd bovendien gebruikt om de verschillen in de celgroei tijdens de verschillende behandelingen met E testen. faecalis Identificatie van gereguleerde pathways werd gedaan door een GSA werkwijze GAGE [30] verbeterde de beschikbare inductie-repressie te exploiteren (voor uitgebreide en berekeningen zie File S2). Wegen werden vertegenwoordigd door lijsten van genen (gen sets) gedownload van de moleculaire signaturen Database (MSigDB) 3,0 [31]. C2 collectie van gecureerd gen sets (canonieke paden en gene expression handtekeningen van genetische en chemische verstoringen) met behulp van gen-symbolen identifiers. Gene set p-waarden werden gecorrigeerd voor meerdere testen door het schatten van de valse ontdekking tarief en het belang werd vastgesteld op 1%. E. faecalis Anderen en we hebben eerder aangetoond dat de achloorhydrie gastrine KO muis had bacteriële overgroei met enterokokken Infection vermindert mitochondriale activiteit en verhoogt OXPHOS-onafhankelijke zuurstofverbruik De bron van ROS gevonden volgende bacteriële infectie kan zowel worden gegenereerd door extracellulaire bacteriën [33] en /of geproduceerd in de cellen [34], [35]. Intracellulaire ROS kan zowel in een OXPHOS-afhankelijke of onafhankelijke wijze worden opgewekt. Om te onderzoeken en vervolgens karakteriseren de mogelijke intracellulaire ROS productie in verband met E. faecalis E. faecalis We hebben eerder aangetoond dat besmetting met pathogene H. Infectie een NFKB gedomineerd ontstekingsreactie en ROS reactie Om verder biologisch inzicht in de cellulaire reacties in de maag cellen naar E. faecalis De route bleek dat de expressie van genen betrokken bij DNA schade herstel significant neerwaarts gereguleerd in vergelijking met niet-geïnfecteerde celculturen na 24 uur na infectie (figuur 5A). qRT-PCR bevestigde dat de expressie van verschillende mismatch repair (MMR) genen werden down-gereguleerd na zowel 24 uur en 5 dagen van de E. faecalis Infectie met E. faecalis Om de veranderingen in de celgroei geïnduceerd door E evalueren. faecalis microbiële pathogenen schatting veroorzaken ongeveer 1,2 miljoen gevallen van kanker per jaar [5]. Menselijke studies en verscheidene diermodellen aangetoond dat achloorhydrie zorgt voor bacteriële overgroei van de maag, waarbij chronische maagontsteking kan veroorzaken, die zich ontwikkelt in maagkanker [20], [53], [54]. Ondersteuning van de etiologische rol van andere bacteriën in de maag maligniteiten, zijn uitroeiing studies van H. pylori We hebben vastgesteld dat infectie met E. faecalis
( E. Faecalis
) achlohydric magen kunnen koloniseren en we daarom wilden de impact van de E bestuderen. faecalis
infectie op inflammatoire respons, reactive oxygen species formatie (ROS), mitochondriale ademhaling, en mitochondriale genetische stabiliteit in maagslijmvlies cellen.
infectie model dat gebruik maakt van het maagcarcinoom cellijn MKN74. Totaal ROS en superoxide werd gemeten door fluorescentie microscopie. Cellulaire zuurstofverbruik werd gekenmerkt niet-invasief gebruik XF24 microplaat respirometrie. Gen-expressie werd onderzocht door microarray, en de reactie paden werden geïdentificeerd door Gene Set Analysis (GSA). Geselecteerde gen transcripten werden geverifieerd door kwantitatieve real-time polymerase-kettingreactie (qRT-PCR). Mitochondriale mutaties werden bepaald door sequencing.
Resultaten
geïnduceerde intracellulaire ROS productie door middel van een traject onafhankelijk van oxidatieve fosforylering (OXPHOS). Bovendien, E. faecalis
infectie veroorzaakte mitochondriaal DNA instabiliteit. Na infectie, genen die coderen voor eiwitten ontstekingsreactie waren transcriptioneel up-gereguleerd, terwijl DNA-schade herstel en de celcyclus controle genen werden down-gereguleerd. Celgroei vertraagd wanneer besmet met levensvatbare E. faecalis Kopen en reageerde op een dosis-afhankelijke manier om E. faecalis
lysaat.
veroorzaakte een OXPHOS-onafhankelijke intracellulaire ROS reactie en beschadigde het mitochondriaal genoom in de maag celkweek. Tenslotte is de bacterie veroorzaakte een NF-KB ontstekingsreactie evenals verminderde DNA schade respons en de celcyclus controle genexpressie.
transcriptprofilering
infectie veroorzaakt een ontsteking, intracellulaire OXPHOS-Onafhankelijke ROS productie, en DNA-schade in Human Gastric kankercellen. PLoS ONE 8 (4): e63147. doi: 10.1371 /journal.pone.0063147
( H. pylori
) [10]. Chronische infectie van de maag door de H. pylori
invloed op de maag pH-balans en kan achloorhydrie of hyperchlorhydria [11] veroorzaken. Hoewel deze bacterie is geclassificeerd als een klasse een kankerverwekkende stof, is het niet altijd geassocieerd met een verhoogd risico op kankerontwikkeling maag. Bijvoorbeeld, H.
pylori geïnfecteerde patiënten die darmzweren en hoge niveaus van maagzuur een verlaagd risico op maagkanker in vergelijking met die van de algemene populatie [11] - [13]. Daarentegen patiënten met atrofische gastritis en verminderde maagzuursecretie hebben een verhoogd risico op maagkanker [11], [13], [14]. Het verhoogde risico op kanker achloorhydrie personen kan worden veroorzaakt door bacteriële overgroei van andere bacteriën in de maag lumen [15]. Zowel achloorhydrie mensen en diermodellen bacteriële overgroei oorzaak chronische gastritis die zich ontwikkelt in intestinale metaplasie en uiteindelijk maagkanker [16] - [18]. Onder de bacteriën in de maag van achloorhydrie muizen waren enterokokken
soorten, die gram-positieve kokken in staat zijn om te overleven in een omgeving met een pH-waarde zo laag als 4.5 [19], [20]. Enterococcus faecalis
( E. Faecalis
) is een lid van de humane commensale microbiota en een van de meest voorkomende bacteriën in het maagdarmkanaal [19]. Desondanks, E. faecalis
kan fungeren als een menselijke pathogeen [21], en is gevonden in aanzienlijk grotere aantallen in orale kankerachtig laesies en in humane darmkanker [22], [23]. In verband met deze E. faecalis
kan produceren N-nitrosamines en induceren genetische instabiliteit in colonic epitheliale cellen door oxidatieve schade aan het DNA [24], [25].
. We hebben daarom gebruik gemaakt van een In vitro
weefselkweek model dat liet ons toe om te onderzoeken hoe geïsoleerde mucosale cellen reageren op bacteriën en de moleculaire mechanismen die darmbacteriën zoals E. faecalis
veroorzaken schade in de maag epitheelcellen. Met behulp van dit model hebben we onderzocht de impact van de E. faecalis
infectie van de maag adenocarcinoom celculturen op ROS productie, cellulaire ademhaling, groei, DNA-schade /reparatie en ontstekingsreacties.
en groei voorwaarden
stam (ATCC 29212). Bacteriën werden gekweekt in 5% agarplaten bij 37 ° C. Optische dichtheid (OD) van bacteriën gekweekt in RPMI 1640 medium werd gemeten bij 550 nm op een UV-1601 spectrofotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan) (figuur S1). E. faecalis
lysaat werd gemaakt door te vriezen /ontdooien van de bacteriële suspensie drie keer, terwijl sonicating de schorsing tussen elke cyclus.
werden toegevoegd aan de MKN74 celkweek bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 50 bacteriën per cel. 5 dagen infecties werden uitgevoerd door het behandelen van 65% confluent MKN74 cellen met E uitgevoerd. faecalis
bij een MOI van 10 met een lysaat of eiwit concentratie van 40 ug /ul. Elke 24 uur werden de cellen gewassen met PBS en vers medium en bacteriën of lysaat toegevoegd. Controlecellen werden op soortgelijke wijze behandeld in afwezigheid van bacteriën of bacteriële lysaat. In vitro
studies werden uitgevoerd met behulp van een maagkanker cellijn om het schadelijke effect van de E testen. faecalis
op adenocarcinoom van de maag cellen. Deze cellen verschillen van normale maagepitheelcellen door middel van verschillende chromosomale afwijkingen, maar biedt het voordeel dat een reproduceerbaar modelsysteem dat in veel opzichten herhaalt de gebeurtenissen in de maag. Vergeleken geïnfecteerde cellen niet-geïnfecteerde cellen een betrouwbaar beeld van de schade en veranderingen in genexpressie veroorzaakt door de infectie.
RNA en DNA isolatie
Meting van ROS en superoxide
Localization van E. faecalis
tijdens infectie
na infectie we afzonderlijk gekleurd het plasmamembraan met CellMask TM Deep Red plasmamembraan vlek (C10046, Invitrogen) en de bacteriële celwand met behulp van BacLight TM Green bacteriële vlek (B-35000, Molecular probes, Invitrogen) volgens de twee protocollen respectievelijk. De cellen en de bacteriën werden 3 keer gewassen met PBS voorafgaand aan infectie. De cellen werden geïnfecteerd bij MOI van 100 gedurende 4 uur en onder een Zeiss LSK 510 confocale microscoop met de LSM 510 software (Zeiss) onderzocht. Dit experiment werd herhaald drie keer en 8 champagne werden telkens onderzocht.
XF24 microplaat respirometrie
bij een MOI van 50 gedurende 4, 8 of 24 uur, terwijl de andere helft werd uninfected gelaten. Na incubatie werden de bacteriën verwijderd met 4% penicilline /streptomycine (5 U /ml) en 4% cefotaxim (100 ug /ml) (ACS Dobfar Generics S.A., Luxemburg, België). De cellen werden geïncubeerd in een CO 2 vrije incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur om de temperatuur en pH equilibratie mogelijk. De microplaat met cellen werd vervolgens geladen in de XF24 en zuurstof verbruik van elk putje werd gemeten over een periode van 100 minuten. De geneesmiddelen oligomycin (0,5 uM), FCCP (0,3 uM) en antimycin A (2,0 uM) werden op hun beurt aan elk putje toegevoegd. Meer details zijn beschikbaar in S1 Bestand.
mitochondriaal DNA Instabiliteit
Microarray en GSA
lysaat 40 ug /ul) voor 24 uur per dag en 5 dagen experimenten werden aan de Copenhagen University Hospital aan de RH Microarray Center ingediend. RNA werd geamplificeerd en gelabeld met het 3 'IVT Express Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. 250 ng totale RNA werd gebruikt als input. De gemerkte monsters werden gehybridiseerd met GeneChip Genome U133 plus 2 arrays (Affymetrix). De arrays werden gewassen en gekleurd met phycoerytrin geconjugeerd streptavidine met een Affymetrix Fluidics Station® 450 en de arrays werden gescand in een Affymetrix GeneArray® 2500 scanner fluorescerende beelden te genereren, zoals beschreven in de Affymetrix GeneChip® protocol. 24 ruwe cel intensiteit-bestanden (CEL-bestanden) werden gegenereerd in de GeneChip® Command Console® Software (AGCC) (Affymetrix). De rauwe CEL-bestanden zijn openbaar gemaakt op ArrayExpress met de toetreding nummer E-MEXP-3496. Voorbewerking van microarrays voor het gen set analyse (GSA) werd gedaan met R /Bioconductor [26], [27]. Achtergrond aanpassing, kwantiel normalisatie en de uiteindelijke samenvatting te stellen expressie intensiteiten sonde werd uitgevoerd door de GCRMA algoritme [28] voor elke experimentele conditie, afzonderlijk (File S2).
Kwantitatieve reverse transcriptie PCR
Groei assay
lysaat, 4 putjes behandeld met 40 ug /ul lysaat, 4 putjes behandeld met 4 ug /ul lysaat en 4 putjes behandeld met levensvatbare E. faecalis
bij een MOI van 10. Een plaat van cellen werd elke dag gefixeerd. Bevestiging werd uitgevoerd door wassen met PBS en fixeren met 1 ml 10% formaline gedurende 10 min. Gefixeerde cellen werden gekleurd met 1 ml 0,1% kristalviolet (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), en de platen werden 30 minuten geschud. Cellen werden gewassen, gedroogd en kristalviolet werd geëxtraheerd met 500 pl 10% azijnzuur. De absorptie werd gemeten bij 620 nm op een PowerWave XS (BioTek Instruments, Winooski, Vermont).
Statistische analyse
. Wanneer de ANOVA aangegeven significante verschillen tussen de behandelingen werd Tukeys eerlijk belangrijke methode om te testen op verschillen tussen zuurstofverbruik of het aantal cellen. mtDNA mutatie frequenties werden beoordeeld door chi-kwadraat en Fisher's exact test. ROS resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde waarden van minstens twintig onafhankelijke metingen en geanalyseerd door ongepaarde tweezijdige t
-test. qRT-PCR-resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde waarden van ten minste drie onafhankelijke experimenten gemeten drie technische replicaten en geanalyseerd door ongepaarde tweezijdige
t-test. De verschillen tussen de datasets werden significant beschouwd bij p-waarden ≤0.05. Foutbalken = ± SEM tenzij anders aangegeven.
Resultaten
infectie veroorzaken intracellulaire ROS en superoxide productie
die normaal gesproken geen deel uitmaken van de maag flora [ ,,,0],20]. Hoewel enterokokken
in het algemeen gedacht lage pathogeniteit bij, aanhoudend overgroei achloorhydrie muizen wordt geassocieerd met een ontstekingsreactie en uiteindelijk deze muizen ontwikkelen maagkanker [20], [32]. Het ziekteproces karakteriseren binnen de maag cellen onderzochten we hoe de bacteriën beïnvloedde de maagepitheelcellen. Gebruik probes controle intracellulaire ROS productie, vonden we dat 30 minuten gestimuleerd infectie een aanzienlijke toename van intracellulair ROS vorming (Figuur 1A). Met probes specifiek voor superoxideproductie toonden wij aan dat de ROS voornamelijk uit superoxide in MKN74 cellen (Figuur 1A). Fluorescentie-intensiteit werd gekwantificeerd met behulp van de LSM 510 software en een statistisch significante toename van intracellulair ROS superoxide en in de geïnfecteerde cellen in vergelijking met niet-geïnfecteerde controlecellen werd waargenomen (Figuur 1B). We vonden geen bewijs dat de invasie van de cellen door bacteriën voorgesteld zodat we concluderen dat de intracellulaire ROS werd geproduceerd door de geïnfecteerde cellen en niet door geïnternaliseerde E. faecalis
(figuur 1 C-D).
infectie; maten we hoe de bacteriële infectie getroffen mitochondriale respiratie door meting van ATP omzet ademhalingscapaciteit en OXPHOS onafhankelijk zuurstofverbruik (figuur 2). Om te verzekeren dat de resultaten van gereflecteerde ademhaling alleen MKN74 cellen, werden alle bacteriën vóór de metingen verwijderd. Er was geen significant verschil in ATP omzet controlecellen gekweekt gedurende 4-24 uur, terwijl een aanzienlijk 2- en 4-voudige vermindering (p < 0,001) omzet ATP aanwezig is tussen controlecellen en geïnfecteerde cellen gedurende 8 en 24 uur waren respectievelijk (Figuur 2A). Een overeenkomstige correlatie gevonden in de luchtwegen, indien de capaciteit van geïnfecteerde cellen waren ook significant 2- en 4 keer minder (p < 0,01) in vergelijking met controlecellen na 8 en 24 uur na infectie (figuur 2B). De OXPHOS-onafhankelijke zuurstofverbruik van controlecellen was onveranderd op cellen gekweekt gedurende 4-24 uur. (Figuur 2C); daarentegen de OXPHOS-onafhankelijke zuurstofverbruik van cellen geïnfecteerd met bacteriën verhoogd van -50% van de totale zuurstofopname na 4 uur infectiegevaar voor de primaire zuurstof utilisatoren (0,001 p lt) worden. Dit suggereert dat E. faecalis
wisselwerking met de epitheliale cellen induceren ROS vorming en zuurstofverbruik door andere intracellulaire enzymsystemen dan oxidatieve fosforylering. Expressie van NOX1-5 en Duox1-2 werd in de maag cellijn onderzocht; Echter, expressie werd niet beïnvloed door de infectie (tabel S2).
infectie veroorzaakt mitochondriaal DNA instabiliteit
pylori stammen geïnduceerde mutaties in het mitochondriale genoom humane celkweek [36]. Gezien het feit dat infectie met E. faecalis
verhogen intracellulaire ROS we onderzocht of het ook veroorzaakt genomische mtDNA instabiliteit. De totale frequentie van mitochondriale D-loop regio mutatie gebeurtenissen was significant hoger in MKN74 celkweken geïnfecteerd met E. faecalis
(45,5%) dan bij niet-geïnfecteerde controle celkweken (23,0%; p < 0,01) (Figuur 3). Bovendien geïnfecteerde cellen vertoonden een groter aantal overgangen (36,4%) dan controlecellen (21,8%; p < 0,05). Deleties (0% control /3,9% geïnfecteerde), inserties (1,1% control /2,6% geïnfecteerde) en transversies (0% control /2,6% geïnfecteerde), deze laatste treedt met name op als gevolg van ROS, vaker aangetroffen in geïnfecteerde cellen. Zo infectie met E. faecalis
induceert mutaties in de maag cellen (Figuur 3).
infectie we voerden een microarray-analyse onderzoek van de wereldwijde veranderingen in genexpressie in cellen geïnfecteerd met levensvatbare E. faecalis golfreizen of behandeld met E. faecalis
lysaat. In plaats van richten op de expressie van enkele genen gebruikten we GSA [30] te wegen en processen van de infectie geactiveerd of geremd identificeren. Gericht op de sets van genen in plaats van individuele genen verhoogt robuustheid, gevoeligheid en biologische relevantie zelfs matig gereguleerde sets van genen. Dit wordt bereikt door het stimuleren van de signaal-ruisverhouding, waardoor bescheiden veranderingen in individuele genen [37] interpreteren. De GSA geteste 2403 genreeksen en resulteerde in 484 gereguleerde pathways statistisch significant voor zowel levende infecties en /of lysaat stimuli (figuur S2). Waarbij vooral de trajecten statistisch significant voor de live infecties, sommige genensets geoordeeld beste karakteriseren de huidige studie werden handmatig verdeeld in drie groepen (figuren 4, 5 en 6 A A). Het onderzoeken van ontsteking en ROS, E. faecalis
infectie veroorzaakte een significante opregulatie van verschillende routes die betrokken zijn bij de immuunrespons, zoals clusters van chemokine receptoren en chemokine signalering genen, genen betrokken bij G-eiwit gekoppelde receptor ligand binding en NFKB activering van genen (figuur 4, bovenste zes gen sets). Bovendien twee gen sets bestaande uit genen reageren op pro-inflammatoire geoxideerde fosfolipiden waren sterk up-gereguleerd. Geoxideerde fosfolipiden door ROS en functie in een pro-inflammatoir wijze [38], [39] (figuur 4, gen stelde zeven en acht). Ondersteuning van de aanwezigheid van ROS, een gen verzameling van 30 bekende genen tot expressie als reactie op ROS geactiveerd (figuur 4, onderste genreeks). Het is bekend dat ROS belangrijk voor lipopolysaccharide (LPS) -driven productie van verscheidene cytokines [40] echter, gram-positieve bacteriën zoals E. faecalis
niet LPS uiten. Daarom onderzochten we hoe de expressie van afzonderlijke genen die coderen voor pro-inflammatoire cytokines en chemokines werden uitgevoerd in reactie op een niet-LPS gestimuleerde infectie gedurende 24 uur en 5 dagen infecties (tabel 1). Talrijke genen betrokken bij de NFKB inflammatoire pathway significant opgereguleerd tijdens E. faecalis
infectie, waaronder interleukine-1β (IL-1ß), interleukine-1 receptor-geassocieerde kinase 2 (IRAK2), VEGF, IL-8, IL-23α, IL-11 en tumornecrosefactor-α (TNF α) waarvan de meeste de NF-KB activering respons verder propageren [41] - [44]. Onder deze waren verschillende cytokines eerder geïdentificeerd in de H.
pylori veroorzaakte infecties, zoals IL-8 en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), beide verbonden met angiogenese en met gevorderde maagkanker, IL-1ß dat is een krachtige remmer van maagzuursecretie, en ook TNF-α, een regulator van celproliferatie, differentiatie en apoptose [43] - [45]. Bovendien, het cytokine IL-23α die tumoren en groei [46] bevordert en is sterk geproduceerd in H. pylori
gekoloniseerd mucosa [47] werd opwaarts gereguleerd met IL-11 wat een pariëtale cel cytokine blokkeert maagzuursecretie, stimuleert atrofische gastritis en tumorigenese [48], [49]. Onder andere genen gevonden die hoog en aanzienlijke expressional niveaus tijdens infectie weer waren IL-1α, IL-32, growth differentiatiefactor 15 (GDF15) en chemokine (C-C motif) ligand 22 (CCL22). Daarnaast is een up-regulatie van superoxide dismutase 2 (SOD2), waarbij superoxide waterstofperoxide omgezet, werd waargenomen. IL-8, Interferon regulerende factor 1 (IRF-1) en TNFa werden gevalideerd door qRT-PCR (figuur 4 B).
DNA schadeherstel zijn vastgelegd gereguleerd tijdens de E. faecalis
infectie
infectie (Figuur 5, B). In 24 uur geïnfecteerde cellen PMS1 en MSH6 was significant neerwaarts gereguleerd (4-voudige en 1,8 vouw respectievelijk P < 0,001). Een significante downregulatie van MSH2 (3 maal), MSH3 (1,9 voudig), MSH6 (2 maal) en PMS1 (3 maal) (p < 0,05) (Figuur 5, B) waargenomen in cellen 5 dagen na infectie. De expressional veelvoudveranderingen van geselecteerde DNA schade herstel genen na infectie worden getoond in tabel S3. Deze resultaten suggereren dat E. faecalis
infectie down-reguleert belangrijke DNA repair pathways resulterend in genomische instabiliteit vergelijkbaar met infecties met H. pylori
[36], [50], [51].
remt de controle van de celcyclus en de groei van cellen MKN74
infectie, onderzochten we de invloed van de bacteriën op de expressie van celcyclus genen en MKN74 celgroei. Genensets omvattende celcyclus en checkpoint genen neerwaarts gereguleerd na 24 uur infectie met levende bacteriën wijzen op een aanzienlijke vertraging van celproliferatie maar ook een verhoogde kans op mutaties in nieuwe cellen (figuur 6 A). Daarentegen werden deze routes opwaarts gereguleerd in cellen geïnfecteerd met bacteriële lysaat suggereert dat deze cellen nog steeds verdelen na 24 uur (figuur 6A). We volgende gemeten celproliferatie voor 5 dagen en vond dat levende bacteriën veroorzaakte proliferatie MKN74 cel te vertragen of te stoppen helemaal (figuur 6 B). Celwoekeringen werden ook beïnvloed wanneer geïncubeerd met bacteriële lysaat. Na 24 uur werden de behandelde cellen nog lysaat delen (zoals ook getoond in figuur 6A), en tot en met dag 4 was er geen verschil tussen geïnfecteerde cellen en cellen geïnfecteerd met lysaat. Echter, op dag 4 waren er aanzienlijk minder cellen na incubatie met bacterieel lysaat in vergelijking met niet-geïnfecteerde controlecellen. Op dag 5 een dosis-respons relatie tussen lysaat concentratie en de celgroei werd waargenomen (Figuur 6 B), waaruit blijkt dat infecties door E. faecalis
interfereren met de celgroei. Een soortgelijk resultaat werd waargenomen in humane lymfocyten waarin drie dagen incubatie met E. faecalis
lysaat geïnduceerde celcyclus [52]. Aangezien dit werk werd uitgevoerd in een geïsoleerd systeem, zou de verminderde proliferatie van geïnfecteerde cellen gebrek aan groeifactor stimulatie toe te schrijven door te reageren immuuncellen.
Discussie
infectie die maag- kolonisatie door darmbacteriën [55] mogelijk te maken, en een daaropvolgende maagkanker ontwikkeling [56]. Dit suggereert dat andere spelers dan H. pylori
worden van inflammatie aangedreven maag maligniteiten. De moleculaire gebeurtenissen waarbij chronische infectie van de maag met deze bacteriën invloed kankercellen en schade aan deze cellen veroorzaken is slecht begrepen.
veroorzaakte een intracellulaire productie van ROS. De oxidatieve fosforylering door de mitochondria laag was na infectie, waaruit blijkt dat ROS productie voornamelijk werd opgewekt in een OXPHOS-onafhankelijke manier binnen de geïnfecteerde cellen. Intracellulaire OXPHOS onafhankelijk ROS kunnen epitheelcellen worden door niet-fagocytische NADPH (NOX) oxidasen reactie op b.v. cytokine stimulatie [57], en zijn de belangrijkste non-mitochondriale bronnen van ROS [58]. De NOX enzymen elektronen transport over plasmamembranen genereren superoxide en andere ROS [59]. In humane epitheelcellen twee NOX homologus (Nox2 en NOX5) worden gevonden [60]. In onze studie werden deze enzymen niet transcriptioneel opgereguleerd, maar het kan niet worden uitgesloten dat de verhoogde ROS levels was een gevolg van een activatie van deze enzymen, maar dit dient nader onderzocht.
Waarom heb ik een colonoscopie nodig?
Schoonmaakproducten kunnen het risico op astma bij kinderen verhogen, blijkt uit onderzoek
Koffie helpt bij het ontwikkelen van gezonde darmmicroben en bevordert de stoelgang
Wetenschappers veranderen bloed van type A in universeel type O,
Mediterraan dieet bevordert gezond ouder worden met gezonder darmmicrobioom
Probiotica kunnen de komende twee decennia helpen ondervoeding te beteugelen,
Hoogtepunten en belangrijkste aandachtspunten van de Boston Bacterial Meeting (BBM) 2019
De Boston Bacterial Meeting (BBM) is een jaarlijkse conferentie die bacteriologie-experts uit de omgeving van Boston en de rest van de wereld samenbrengt. Het is 25 e iteratie vond plaats tussen 6 j
Darmmicrobioom is ook een realiteit in het foetale leven
Een studie gepubliceerd in de Tijdschrift voor klinisch onderzoek laat zien dat zowel bij muizen als bij mensen de foetale darm heeft zijn eigen microbioom, die waarschijnlijk rechtstreeks van het m
Genetica kan de samenstelling van het microbioom meer beïnvloeden dan omgevingsfactoren
Onderzoekers die muizen bestuderen aan het Technion-Israel Institute of Technology hebben ontdekt dat het microbioom veel meer wordt beïnvloed door genetica dan door de geboorteomgeving van de moeder.