PLOS ONE: Enterococcus faecalis Infektion orsakar inflammation, intracellulära Oxphos-oberoende ROS produktion, och DNA-skador i Human Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Bakgrund

aklorhydri orsakas av t.ex. atrofisk gastrit möjliggör bakteriell överväxt, som inducerar kronisk inflammation och skador på slemhinnor celler i infekterade individer driver mag maligniteter och cancer. Enterococcus faecalis
( E. Faecalis
) kan kolonisera achlohydric magar och vi ville därför undersöka effekterna av E. faecalis
infektion på inflammatoriskt svar, reaktiva syreradikaler (ROS) bildande, mitokondriell andning och mitokondriell genetisk stabilitet i magslemhinnan celler.

Metoder

För att separera förändringar inducerade av bakterier från de av inflammatoriska celler vi etablerat en in vitro E. faecalis
infektionsmodell systemet med magcancer-cellinjen MKN74. Totala ROS och superoxid uppmättes genom fluorescensmikroskopi. Cellulär syreförbrukningen präg icke-invasivt med hjälp XF24 mikrobaserad respiration. Gene expression undersöktes av microarray, och svarsvägar identifierades genom genuppsättning Analysis (GSA). Utvalda gentranskript verifierades genom kvantitativ realtids-polymeraskedjereaktion (QRT-PCR). Mitokondriella mutationer bestämdes genom sekvensering.

Resultat

Infektion av MKN74 celler med E. faecalis
inducerad intracellulär ROS produktion genom en väg oberoende av oxidativ fosforylering (oxphos). Vidare E. faecalis
infektion inducerad mitokondrie-DNA instabilitet. Efter infektion, gener som kodar för inflammatorisk respons proteiner transkription uppregleras medan DNA skada reparation och cellcykelkontroll gener nedregleras. Celltillväxt avtog när infekterade med livskraftig E. faecalis Köpa och svarade på ett dosberoende sätt till E. faecalis
lysat.

Slutsatser

Infektion av E. faecalis
inducerade en oxphos oberoende intracellulär ROS respons och skadat mitokondriella genomet i gastric cellkultur. Slutligen bakterierna inducerade en NF-kB inflammatoriskt svar samt försämrad DNA-skada svar och cellcykelkontroll genuttryck.

avskrift profilering

Array Express nummer E-MEXP-3496.

Citation: Strickertsson JAB, Desler C, Martin-Bertelsen T, Machado AMD, Wadström T, Winther O, et al. (2013) Enterococcus faecalis
Infektion orsakar inflammation, intracellulära Oxphos-oberoende ROS produktion, och DNA-skador i Human Gastric cancerceller. PLoS ONE 8 (4): e63147. doi: 10.1371 /journal.pone.0063147

Redaktör: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA

emottagen: 28 augusti 2012; Godkända: 2 april 2013, Publicerad: 30 April, 2013

Copyright: © 2013 Strickertsson et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. AMDM är med stöd av ett stipendium från portugisisk Science, Technology Foundation. LFH stöds av den danska MRC. JABS stöds av den danska Cancerfonden och Köpenhamns Universitet SUND. TMB och OW stöds av ett bidrag från Novo Nordisk Foundation till Bioinformatics Centre. CD och LJR stöds av Nordea-fonden. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer är bland de tio vanligaste cancer och med en global årlig dödlighet på cirka 700.000, är ​​den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad dödlighet [1]. Magsäckscancer tarm typ utvecklas genom en serie av patologiska händelser som börjar med kronisk inflammation, atrofisk gastrit, intestinal metaplasi och slutligen cancer [2].

Kronisk inflammation och cancer har kopplats i flera studier av patienter och av genetiskt modifierade möss, och tros vara inblandad i patogenesen av ca 25% av alla cancerfall i världen [2] - [4]. Kännetecken för cancerrelaterad inflammation inkluderar närvaron av kemokiner och cytokiner i tumörvävnad, som har potential att stimulera tumörcelltillväxt och överlevnad av maligna celler [5], [6]. Kronisk inflammation gynnar också en överproduktion av DNA-skadande reaktiva syreradikaler (ROS), vars produktion kan vara av underordnad betydelse för oxidativ fosforylering (oxphos) reaktioner i mitokondrier (oxphos beroende) eller har framställts av utanför mitokondrierna är vanligast hos nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat ( NADPH) oxidaser (oxphos oberoende) (för översikt se [7] - [9]). Kronisk produktion av ROS orsaka DNA-skador, vilket gör att ansamling av mutationer som i sin tur kan aktivera onkogener och /eller inaktivera tumörsuppressorgener därmed ökar risken för cancerutveckling [3].

Den vanligaste riskfaktorn för att utveckla magcancer är kronisk bakteriell infektion i magen med Helicobacter pylori
( H. pylori
) [10]. Kronisk infektion i magen av H. pylori
påverka mag pH-balans och kan orsaka aklorhydri eller hyperchlorhydria [11]. Även om denna bakterie är klassificerad som en klass ett cancerframkallande ämne, är det inte alltid förknippade med en ökad risk för gastrisk cancerutveckling. Till exempel, H. pylori
infekterade patienter med duodenalsår och höga nivåer av magsyra har en minskad risk att utveckla magcancer i jämförelse med dem från den allmänna befolkningen [11] - [13]. I motsats har patienter med atrofisk gastrit och reducerad utsöndring av magsyra har en ökad risk att utveckla magcancer [11], [13], [14]. Den ökade risken för cancer i aklorhydri individer kan bero på bakteriell överväxt av andra bakterier i magsäckens lumen [15]. I båda aklorhydri människor och djurmodeller bakteriell överväxt orsaka kronisk gastrit som utvecklas till intestinal metaplasi och slutligen magcancer [16] - [18]. Bland de bakterier som finns i magen av aklorhydri möss Enterokocker
arter, som är grampositiva kocker kunna överleva i miljöer med ett pH så lågt som 4,5 [19], [20]. Enterococcus faecalis
( E. Faecalis
) är en medlem av den mänskliga kommenfloran och en av de vanligaste bakterierna i mag-tarmkanalen [19]. Trots detta, E. faecalis
kan fungera som en human patogen [21], och har påträffats i signifikant ökade antal i orala cancerous lesions och i humana koloncancer [22], [23]. I samband med detta E. faecalis
är kapabel att producera N-nitrosaminer och att inducera genetiska instabilitet i kolonepitelceller genom oxidativ skada av DNA [24], [25].

Gastrit är associerad med infiltration av immunceller i vävnad, vilket gör det svårt att dissekera verkan av immunceller från de foder slemhinneceller in vivo
. Vi använde därför en In vitro
vävnadskultur modell som tillät oss att undersöka hur isolerade slemhinneceller svara på bakterier och de molekylära mekanismer genom vilka tarmbakterier som E. faecalis
framkalla skador i gastric epitelceller. Med hjälp av denna modell undersökte vi effekten av E. faecalis
infektion av adenocarcinom cellkulturer på ROS produktion, cellandning, tillväxt, DNA-skador /reparation och inflammatoriska svar.

Material och metoder

cellodling, E. faecalis
och tillväxtbetingelser

Human MKN74 adenocarcinom cellkulturer från den japanska Insamling av forsknings bioresurser cellbank (JCRB # JCRB0255) hölls i RPMI 1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA), kompletterad med 10% fetalt bovint serum (FBS) (Invitrogen), 100 | ig /ml streptomycin och 100 U /ml penicillin (Invitrogen) vid 37 ° C och 5% CO _{2 fuktad atmosfär. Infektioner utfördes med E. faecalis
stam (ATCC 29212). Bakterier odlades i 5% blodagarplattor vid 37 ° C. Optisk densitet (OD) av bakterier som odlats i RPMI 1640-medium mättes vid 550 nm på en UV-1601-spektrofotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan) (Figur S1). E. faecalis
lysat framställdes genom frysning /upptining bakteriesuspensionen tre gånger, medan sonikering suspensionen mellan varje cykel.}

Infektion av Gastric celler för RNA och DNA-isolering

För 24 h infektioner , var 80% konfluenta MKN74-celler tvättades med PBS och inkuberades i antibiotikafritt medium. Övernattning odlade kolonier av E. faecalis
sattes till MKN74 cellkulturen vid en multiplicitet av infektion (MOI) av 50 bakterier per cell. 5 dagars infektioner utfördes genom att behandla 65% sammanflytande MKN74 celler med E. faecalis-delar på en MOI av 10 eller med ett lysat proteinkoncentration av 40 mikrogram /l. Var 24 h tvättades cellerna med PBS och färskt medium och bakterier eller lysatet tillsattes. Kontrollceller behandlades på liknande sätt i frånvaro av bakterier eller bakteriella lysat. In vitro
studier utfördes med hjälp av en magcancer cellinje för att testa den skadliga effekten av E. faecalis
magsäcksceller. Dessa celler skiljer sig från normala gastric epitelceller genom att flera kromosomavvikelser, men har fördelen av att vara ett reproducerbart modellsystem som på många sätt replikerar händelser som inträffar i magen. Jämföra infekterade celler till oinfekterade celler ger en tillförlitlig bild av skador och förändringar i genuttryck som orsakas av infektion.

RNA och DNA-isolering

Efter infektion, RNA och DNA extraherades genom att tillsätta Trizol Reagens (Invitrogen) till varje odlingskolv. RNA isolerades enligt tillverkarens protokoll. Den DNA-innehållande intermediära fasen utfälldes genom tillsats av 100% etanol. Prover centrifugerades vid 4 ° C, 3500 g under 6 min. Fenol-etanol supernatanten avlägsnades och den kvarvarande DNA-extraktion gjordes genom att använda en NucleoSpin vävnads kit (Macherey-Nagel, Duren, Tyskland). RNA- och DNA-koncentrationer mättes på en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer. RNA integritet nummer mättes på en 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornien) enligt tillverkarens protokoll.

Mätning av ROS och superoxid

Två dagar före infektion 8 × 10 ^{4 MKN74-celler ströks ut i varje brunn i en Lab-Tek TM Chambered Coverglas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). MKN74 celler färgades under två timmar före infektion med 2-Plex detekterings mix. ROS och superoxid-färgning utfördes med användning av ROS /RNS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York) enligt tillverkarens instruktioner. MKN74-celler infekterades vid MOI av 50 under 30 minuter och analyserades under ett Zeiss LSM 510 konfokalmikroskop med användning av LSM 510 programvara (Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Oinfekterade färgade MKN74 celler användes som negativa kontroller.}

Lokalisering av E. faecalis
under infektion

8 × 10 ^{4 MKN74 celler /brunn såddes i en 8-kammare med glasbotten slid (Thermo Fisher Scientific) 24 timmar före färgning. För att identifiera lokaliseringen av E. faecalis
efter infektion vi separat färgade plasmamembranet med CellMask TM Deep Red plasmamembran fläck (C10046, Invitrogen) och bakteriecellväggen med hjälp av BacLight TM Grön bakteriell fläck (B-35000, Molecular Probes, Invitrogen) i enlighet med de två protokollen respektive. Cellerna och bakterier tvättades 3 gånger i PBS före infektion. Cellerna infekterades vid MOI av 100 i 4 timmar och analyseras under ett Zeiss LSK 510 konfokalmikroskop använder LSM 510 programvara (Zeiss). Detta experiment upprepades tre gånger och 8 champers undersöktes varje gång.}

XF24 Microplate baserat respiration

respiration av MKN74-celler utfördes med användning av en XF24 Extracellulär Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA ). Hälften av de pläterade MKN74 celler infekterades med E. faecalis-delar på ett MOI av 50 under 4, 8 eller 24 timmar medan den andra hälften lämnades oinfekterad. Efter inkubering bakterier avlägsnades med användning av 4% penicillin /streptomycin (5 U /ml) och 4% cefotaxim (100 jig /ml) (ACS Dobfar Generics S.A., Luxemburg, Belgien). Cellerna inkuberades i en COa _{2 fria inkubator vid 37 ° C under 1 timme så att temperaturen och pH-jämvikt. Mikroplattan med celler laddades sedan in i XF24 och syreförbrukningshastigheten för varje brunn mättes under en period av 100 minuter. Drogerna oligomycin (0,5 | iM), FCCP (0,3 ^ M) och antimycin A (2,0 | iM) var i sin tur sattes till varje brunn. Mer information finns i File S1.}

Mitokondrier Instabilitet

Frekvensen av mutationer i D-loop-regionen av mitokondrie-DNA, bestämdes genom PCR-amplifiering med användning av primers C6-CA5 (Tabell S1 ). De amplifierade fragmenten klonades in i pCR2.1-vektorn (Invitrogen) och skär från 328 kolonier amplifierades med användning av de VectorD-loop primers (Tabell S1). De amplifierade fragmenten renades och sekvenserades med användning av ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit och en ABI Prism 3730 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts). För att bestämma mutationer, var sekvenserna användas som frågor mot Cambridge referenssekvens som erhållits från MitoMap (http://www.mitomap.org. Tagit fram Februari 9. 2012).

microarray och GSA

RNA med en RNA-integritet antal 8 eller högre från tre kontroll och tre infektionsprover (med livskraftig E. faecalis
eller med E. faecalis
lysat 40 mikrogram /l) för 24-timmars och 5 dagars experiment lämnades in till RH microarray Center vid Köpenhamns universitetssjukhus. RNA amplifierades och märktes med användning av 3 'IVT Express kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. 250 ng totalt RNA användes som indata. De märkta proverna hybridiserade till Genechip Genome U133 plus 2 arrayer (Affymetrix). Uppsättningarna tvättades och färgades med phycoerytrin konjugerat streptavidin med användning av en Affymetrix Fluidics Station® 450, och uppsättningarna avsöktes i en Affymetrix GeneArray® 2500 scanner för att generera fluorescerande bilder, som beskrivs i Affymetrix GeneChip®-protokollet. 24 råa cell intensitets filer (CEL-filer) genererades i GeneChip® Command Console® Software (AGCC) (Affymetrix). Rå CEL-filer gjordes tillgängliga för allmänheten på ArrayExpress med åtkomstnummer E-MEXP-3496. Förbehandling av mikroarrayer för genuppsättning analys (GSA) gjordes med R /bioledare [26], [27]. Bakgrunds justering, kvantil normalisering och slutliga sammanfattnings att probuppsättning expressions intensiteter utfördes medelst GCRMA algoritm [28] för varje experimentell betingelse, separat (File S2).

Kvantitativ omvänd transkription PCR

cDNA syntetiserades med användning av Upphöjd III första Strand Syntes SuperMix för qPCR (Invitrogen). Genuttryck analyserades med QRT-PCR med användning av SYBR Greener q-PCR SuperMix för ABI PRISM (Invitrogen). Primers utformades med hjälp av Primer-Blast mjukvara från NCBI [29]. Reaktionerna kördes på en ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (SDS) från Applied Biosystems. Data normaliserades till GAPDH mRNA-uttryck.

tillväxtanalys

8000 celler fördelades i varje brunn av sex 24-brunnsplattor och odlades vid 37 ° C och 5% CO _{2 för två dagar före behandling. Celler behandlades i kvadruplikat enligt följande; 4 brunnar i oinfekterade kontrollceller, 4 brunnar som behandlats med 400 mikrogram /l E. faecalis
lysat, 4 brunnar som behandlats med 40 | ag /l lysat, 4 brunnar som behandlats med 4 mikrogram /l lysat och 4 brunnar som behandlats med livskraftig E. faecalis-delar på en MOI av 10. En platta av celler fixerade varje dag. Fixering gjordes genom tvättning med PBS och fixering med 1 ml 10% formalin under 10 min. Fixerade celler färgades med 1 ml av 0,1% kristallviolett (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri), och plattorna skakades under 30 min. Celler tvättades, torkades och kristallviolett extraherades med 500 | il 10% ättiksyra. Absorbansen mättes vid 620 nm på en Powerwave XS (BioTek Instruments, Winooski, Vermont).}

Statistisk analys

analys Single klassificering av varians (ANOVA) användes för att testa skillnader i maximal andningsförmåga , ATP omsättning och oxphos oberoende syreförbrukning. ANOVA dessutom användas för att testa skillnader i celltillväxt under olika behandlingar med E. faecalis
. När ANOVA indikerade signifikanta skillnader mellan behandlingarna var Tukeys ärligt betydande metod som används för att testa för skillnader mellan syreförbrukning eller antal celler. mtDNA mutationsfrekvenser bedömdes genom chi-kvadrat och Fishers exakta test. ROS Resultaten uttrycktes som medelvärden av minst tjugo oberoende mätningar och analyserades genom oparat två-tailed t
-testet. QRT-PCR-resultat uttrycktes som medelvärden av minst tre oberoende experiment som mäts i tre tekniska replikat, och analyserades genom oparat två-tailed t
-testet. Skillnaderna mellan datamängder ansågs signifikanta vid p-värden ≤0.05. Felstaplar = ± SEM, om inte annat anges.

Identifiering av reglerade vägar gjordes av en GSA-metoden, GAGE ​​[30], förbättras för att utnyttja tillgängliga induktions repression information (omfattande information och beräkningar se File S2). Vägar representerades av listor över gener (genuppsättningar) hämtat från Molecular signaturer Database (MSigDB) 3,0 [31]. C2 samling handplockade genuppsättningar (kanoniska vägar och genuttryck underskrifter genetiska och kemiska störningar) med hjälp av genen symboler identifierare. Gene set p-värden korrigerades för multipel testning genom att uppskatta den falska upptäckten hastighet och signifikansnivån sattes till 1%.

Resultat

E. faecalis
infektion inducerar intracellulära ROS och superoxidproduktion

Andra och vi har tidigare visat att aklorhydri gastrin KO musen hade bakteriell överväxt med enterokocker
som normalt inte är en del av mag växter [ ,,,0],20]. Även enterokocker
i allmänhet tros ha låg patogenicitet, ihållande överväxt i aklorhydri möss är förknippad med ett inflammatoriskt svar och slutligen dessa möss utvecklar magcancer [20], [32]. För att karakterisera den patologiska processen inom mag celler Vi undersökte hur bakterierna påverkat gastric epitelceller. Använda prober övervakning intracellulär ROS produktion, fann vi att 30 minuter av infektion stimulerade en signifikant ökning i intracellulär ROS bildning (Figur 1A). Med sönder som är specifika för superoxidproduktion vi visade att ROS bestod huvudsakligen av superoxid i MKN74 celler (Figur 1A). Fluorescensintensiteten kvantifierades med användning av LSM 510 programvara och en statistiskt signifikant ökning av intracellulärt ROS och superoxid i de infekterade cellerna jämfört med oinfekterade kontrollceller observerades (Figur 1B). Vi fann inga bevis som tydde invasion av celler från bakterier, så vi dra slutsatsen att den intracellulära ROS producerades av de infekterade cellerna och inte av intern E. faecalis
(Figur 1 C-D).

Infektion minskar mitokondriell aktivitet och ökar oxphos oberoende syreförbrukning

Källan till ROS fann efter bakterieinfektion kan antingen genereras av extracellulära bakterier [33] och /eller har framställts av i cellerna [34], [35]. Intracellulär ROS kan antingen genereras i en oxphos beroende eller oberoende sätt. För att undersöka och därefter karakterisera möjliga intracellulära ROS produktion i samband med E. faecalis
infektion; mätte vi hur bakteriell infektion påverkas mitokondrie andning genom att mäta ATP omsättning, kapacitet andnings och oxphos oberoende syreförbrukning (Figur 2). För att försäkra att resultaten återspeglade respiration av de MKN74 endast celler, var alla bakterier avlägsnas före mätningarna. Det fanns ingen signifikant skillnad i ATP omsättning av kontrollceller som odlas för 4-24 timmar, medan en signifikant 2- och 4-faldig minskning (p < 0,001) av ATP omsättningen var närvarande mellan kontrollceller och infekterade celler inkuberade för 8 och 24 timmar respektive (Figur 2A). En motsvarande korrelation hittades i lungkapacitet, där kapaciteten hos infekterade celler var också signifikant 2- och 4-faldigt minskade (p 0,01) jämfört med kontrollceller efter 8 och 24 timmar efter infektion (figur 2B). Den oxphos oberoende syreförbrukningen hos kontrollceller var oförändrad för celler som odlas för 4-24 timmar. I kontrast den oxphos oberoende syreförbrukningen hos celler som infekterats med bakterier ökade från ~ 50% av den totala syreupptagningen efter 4 timmars infektion för att bli den primära syre utilizer (p < 0,001) (figur 2C). Detta tyder på att E. faecalis
interagera med epitelcellerna inducerar ROS bildning och syreförbrukning av andra intracellulära enzymsystem än oxidativ fosforylering. Expression av NOX1-5 och Duox1-2 undersöktes i den gastriska cellinje; var dock uttryck påverkas inte av infektion (Tabell S2).

E. faecalis
infektion orsakad mitokondrie-DNA instabilitet

Vi har tidigare visat att infektion med patogena H. pylori
stammar inducerade mutationer i mitokondriella genomet i human cellkultur [36]. Med tanke på att infektion med E. faecalis Review Öka intracellulära ROS undersökte vi om det också orsakas genomisk mtDNA instabilitet. Den totala frekvensen av mitokondrie D-loop region mutationshändelser var signifikant högre i MKN74 cellkulturer infekterade med E. faecalis
(45,5%) än hos icke-infekterade kontrollcellkulturer (23,0%; p < 0,01) (Figur 3). Vidare infekterade celler uppvisade en högre antal övergångar (36,4%) än kontrollceller (21,8%; p < 0,05). Deletioner (0% kontroll /3,9% infekterade), insättningar (1,1% kontroll /2,6% infekterade), och transversioner (0% kontroll /2,6% infekterade), den senare typiskt sett som en konsekvens av ROS, upptäcktes oftare hos infekterade celler. Således infektion med E. faecalis
inducerar mutationer i magsäckens celler (Figur 3).

Infektion orsakade en NFkB dominerade inflammatoriskt svar och en ROS svar

För att få ytterligare biologiska insikter i de cellulära svar i gastric celler till E. faecalis
infektion vi utförde en microarray analys undersöker de globala förändringar i genuttryck i celler infekterade med livskraftiga E. faecalis
eller behandlas med E. faecalis
lysatet. Snarare än att fokusera på uttrycket av enskilda gener som vi använde GSA [30] för att identifiera vägar och processer aktiveras eller hämmas av infektionen. Med fokus på uppsättningar av gener i stället för enskilda gener ökar robusthet, känslighet och biologisk relevans även för måttligt reglerade uppsättningar av gener. Detta uppnås genom att öka signal-till-brus-förhållande, vilket gör det möjligt att tolka blygsamma förändringar i enskilda gener [37]. GSA testade 2403 genuppsättningar och resulterade i 484 reglerade vägar är statistiskt signifikant för antingen levande infektioner och /eller lysat stimuli (Figur S2). Fokusering på de vägar statistiskt signifikanta för de levande infektioner, vissa av genuppsättningar bedöms bäst karaktärisera den aktuella studien var manuellt uppdelades i tre grupper (figur 4, 5 A och 6 A). Undersöka inflammation och ROS, E. faecalis
infektion orsakade en signifikant uppreglering av flera reaktionsvägar som är involverade i immunsvar, inklusive kluster av kemokinreceptorer och kemokin signalering gener, gener som är involverade i G-proteinkopplad receptor-ligand-bindning, och NFkB aktivering generna (Figur 4, övre sex genuppsättningar). Dessutom två genuppsättningar innefattar gener som svarar på proinflammatoriska oxiderade fosfolipider var starkt uppreglerat. Oxiderade fosfolipider produceras av ROS och funktion i en pro-inflammatoriska sätt [38], [39] (Figur 4, genuppsättning sju och åtta). Stöd närvaron av ROS, var en gen uppsättning av 30 gener som är kända för att uttryckas som svar på ROS aktiveras (Figur 4, botten genuppsättning). Det är känt att ROS är viktiga för lipopolysackarid (LPS) -driven produktion av flera pro-inflammatoriska cytokiner [40] dock grampositiva bakterier, såsom E. faecalis
inte uttrycker LPS. Vi undersökte därför hur uttrycket av individuella gener som kodar för pro-inflammatoriska cytokiner och kemokiner utfördes som svar på ett icke-LPS-stimulerade infektion under 24 h och 5 dagars infektioner (tabell 1). Ett stort antal gener som är involverade i NFkB inflammatoriska vägen var betydligt uppregleras under E. faecalis
infektioner inklusive interleukin-1β (IL-1SS), interleukin-1-receptor-associerat kinas 2 (IRAK2), VEGF, IL-8, IL-23α, IL-11, och tumömekrosfaktor-α (TNF-a α) varav de flesta kan ytterligare sprida NF-kB-aktivering svar [41] - [44]. Bland dessa fanns flera cytokiner som tidigare identifierats i H. pylori
medierade infektioner, såsom IL-8 och vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), båda förknippade med angiogenes och med avancerad magsäckscancer, IL-1SS som är en kraftfull inhibitor av syrasekretion, och även TNF-α, en regulator av cellproliferation, differentiering och apoptos [43] - [45]. Dessutom cytokin IL-23α som främjar tumör förekomst och tillväxt [46] och är mycket produceras i H. pylori
koloniserat slemhinna [47] uppreglerades tillsammans med, IL-11, som är en parietal cell cytokin som blockerar magsyrasekretion, främjar atrofisk gastrit och gastrisk tumorgenes [48], [49]. Bland andra gener har hittats för att visa höga och stora uttrycksnivåer under infektion var IL-1α, IL-32, tillväxtdifferentieringsfaktor 15 (GDF15) och kemokin (C-C motiv) ligand 22 (CCL22). Dessutom kan en uppreglering av superoxiddismutas 2 (SOD2), som omvandlar superoxid till väteperoxid, sågs. IL-8, interferon reglerande faktor 1 (IRF-1) och TNFa validerades av QRT-PCR (Figur 4 B).

DNA-skador reparationer nedregleras under E. faecalis
infektion

Vägen analys visade att uttrycket av gener involverade i DNA-skador reparation var betydligt nedregleras jämfört med oinfekterade cellkulturer efter 24 timmars infektion (Figur 5A). QRT-PCR bekräftade att uttrycket av flera mismatch reparation (MMR) gener nedregleras efter både 24 h och 5 dagar E. faecalis
infektion (Figur 5, B). I 24 timmar infekterade celler PMS1 och Msh6 var betydligt nedregleras (4 gånger och 1,8 faldigt respektive; P < 0,001). En betydande nedreglering av MSH2 (3 gånger), MSH3 (1,9-faldigt), Msh6 (2 gånger), och PMS1 (3-faldig) (p < 0,05) (Figur 5, B) observerades i celler 5 dagar efter infektion. De uttrycks fold-förändringar av utvalda DNA-skador reparationsgener efter infektion visas i tabell S3. Dessa resultat tyder på att E. faecalis
infektion nedreglerar stora DNA-reparationsvägar som resulterar i genomisk instabilitet som liknar infektioner med H. pylori
[36], [50], [51].

Infektion av E. faecalis
hämmar cellcykelkontroll och tillväxt av MKN74 celler

För att utvärdera förändringar i celltillväxt inducerad av E. faecalis
infektion, undersökte vi påverkan av bakterierna på expressionen av cellcykelkontrollgener och på MKN74 celltillväxt. Genuppsättningar innefattar cellcykelkontroll och Checkpoint gener nedreglerade efter 24 timmars infektion med livsdugliga bakterier tyder ned en betydande uppbromsning i cellproliferation men också en ökad risk för mutationer i nya celler (fig 6 A). I motsats var dessa vägar uppreglerat i celler infekterade med bakteriellt lysat vilket tyder på att dessa celler var fortfarande dividera efter 24 timmar (Figur 6 A). Vi mätte nästa cell proliferation i 5 dagar och fann att livskraftiga bakterier orsakade MKN74 celltillväxt att bromsa eller stoppa helt (Figur 6 B). Cell proliferationer påverkades också vid inkubation med bakterielysat. Efter 24 timmar, var lysat behandlade cellerna fortfarande dividera (såsom också visas i fig 6A), och fram till dag 4 fanns det ingen skillnad mellan icke-infekterade celler och celler som infekterats med lysatet. Dock på dag 4 fanns det betydligt färre celler efter inkubation med bakteriellt lysat i jämförelse med icke-infekterade kontrollceller. På dag 5 en dos-responssamband mellan lysat koncentration och celltillväxt observerades (Figur 6 B), visar att infektioner av E. faecalis
störa celltillväxt. Ett liknande resultat har observerats i humana lymfocyter där tre dagars inkubation med E. faecalis
lysat inducerade cellcykelstopp [52]. Eftersom detta arbete gjordes i ett isolerat system kan den minskade spridningen av infekterade celler tillskrivas bristen på tillväxtfaktorstimulering genom att svara immunceller.

Diskussion

patogena mikroorganismer beräknas orsaka cirka 1,2 miljoner fall av cancer varje år [5]. Humanstudier och flera djurmodeller har visat att aklorhydri möjliggör bakteriell överväxt i magen, vilket kan orsaka kronisk gastric inflammation, som utvecklas till magcancer [20], [53], [54]. Stöd till etiologiska roll som andra bakterier i mag maligniteter, är studier av H utrotning. pylori
infektion som tillåter gastric kolonisering av tarmbakterier [55], och en efterföljande magcancer utveckling [56]. Detta tyder på att andra aktörer än H. pylori
kan vara inblandade i inflammation driven gastric maligniteter. De molekylära händelser genom vilken kronisk infektion i ventrikeln med dessa bakterier påverkar cancerceller och orsakar skada på dessa celler har dåligt kända.

Vi fann att infektion med E. faecalis
inducerade en intracellulär produktion av ROS. Den oxidativa fosforyleringen av mitokondrier var låg efter infektion, vilket visar att ROS-produktionen genererades huvudsakligen i en oxphos oberoende sätt inom de infekterade cellerna. Intracellulära oxphos oberoende ROS kan produceras i epitelceller genom icke-fagocytiska NADPH (NOX) oxidaser som svar på t.ex. cytokinstimulering [57], och är de viktigaste icke-mitokondriella källor ROS [58]. Dessa NOX enzymer transport elektroner över plasmamembran, genererar superoxid och andra ROS [59]. I humana epitelceller två NOX homologus (NOX2 och NOX5) finns [60]. I vår studie var dessa enzymer inte transkription uppreglerat, men det kan inte uteslutas att de förhöjda ROS-nivåerna var en följd av en aktivering av dessa enzymer, men detta kräver ytterligare utredning.

• PLOS ONE: IL-26 främjar spridning och överlevnad av mänskliga Gastric cancerceller genom att reglera balans STAT1 och STAT3 aktivering
• PLOS ONE: högt uttryck av värmechockprotein 90 är associerad med tumör aggressivitet och dålig prognos i patienter med avancerad magsäckscancer