PLOS ONE: Enterococcus faecalis La infección causa inflamación, la producción intracelular de ROS Oxphos-Independiente, y daño del ADN en el cáncer gástrico humano Cells

Extracto

Antecedentes

Aclorhidria causada por ejemplo gastritis atrófica permite el sobrecrecimiento bacteriano, que induce la inflamación crónica y daño a las células de la mucosa de los individuos infectados de conducción neoplasias gástricas y cáncer. Enterococcus faecalis gratis ( E. Faecalis
) pueden colonizar estómagos achlohydric y por lo tanto hemos querido estudiar el impacto de E. infección faecalis
en la respuesta inflamatoria, las especies reactivas de oxígeno (ROS) de formación, la respiración mitocondrial y la estabilidad genética mitocondrial en las células de la mucosa gástrica.

Métodos

Para separar los cambios inducidos por las bacterias de los de las células inflamatorias que estableció un E. faecalis
sistema modelo in vitro de infección usando la línea celular de carcinoma gástrico MKN74. Total de ROS y superóxido se midió por microscopía de fluorescencia. el consumo de oxígeno celular se caracteriza de forma no invasiva mediante respirometría basado XF24 microplaca. La expresión de genes se examinó mediante microarray, y las vías de respuesta se identificaron por análisis conjunto de genes (GSA). transcripciones de genes seleccionados se verificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). mutaciones mitocondriales se determinaron mediante secuenciación.

Resultados

La infección de células MKN74 con E. faecalis
indujo la producción de ROS intracelulares a través de una vía independiente de la fosforilación oxidativa (OXPHOS). Por otra parte, E. faecalis
infección induce la inestabilidad del ADN mitocondrial. Después de la infección, los genes que codifican para proteínas de respuesta inflamatoria eran transcriptionally hasta reguladas mientras que el ADN genes de control de reparación de daños y del ciclo celular fueron regulados hacia abajo. El crecimiento celular se ralentizó cuando están infectadas con E viable. faecalis
y ha respondido de una manera dependiente de la dosis de E. faecalis
lisado.

Conclusiones

La infección por E. faecalis
induce una respuesta intracelular de ROS fosforilación oxidativa independiente y dañó el genoma mitocondrial en cultivo de células gástricas. Finalmente las bacterias inducen una respuesta inflamatoria NF-kB y han menoscabado respuesta al daño del ADN y la expresión de genes de control del ciclo celular.

Transcripción de perfiles

Array número de acceso electrónico exprés MEXP-3496.

Visto: Strickertsson JAB, Desler C, Martin-T Bertelsen, Machado AMD, Wadström T, Winther O, et al. (2013) Enterococcus faecalis
La infección causa inflamación, la producción intracelular de ROS Oxphos-Independiente, y daño del ADN en células de cáncer gástrico humano. PLoS ONE 8 (4): e63147. doi: 10.1371 /journal.pone.0063147

Editor: Shree Ram Singh, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América

Recibido: 28 Agosto, 2012; Aceptado: April 2, 2013; Publicado: 30 de abril 2013

Derechos de Autor © 2013 Strickertsson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. AMDM es apoyado por una beca de Ciencia portugués, Fundación Tecnología. LFH es apoyado por el danés MRC. JABS está apoyado por la Sociedad Danesa del Cáncer, y la Universidad de Copenhague SUND. TMB y OW son apoyados por una donación de la Fundación Novo Nordisk al Centro de Bioinformática. CD y LJR son apoyados por NORDEA Fonden. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico es uno de los diez cánceres más comunes, y con una tasa de mortalidad anual global de aproximadamente 700.000, que es la segunda causa más común de mortalidad relacionada con el cáncer [1]. El cáncer gástrico de tipo intestinal se desarrolla a través de una serie de eventos patológicos de comenzar con la inflamación crónica, gastritis atrófica, la metaplasia intestinal, y, finalmente, el cáncer [2].

La inflamación crónica y el cáncer se ha relacionado en varios estudios de pacientes y de los ratones modificados genéticamente, y se cree que está involucrado en la patogénesis de alrededor de 25% de todos los casos de cáncer en todo el mundo [2] - [4]. Características de la inflamación relacionada con el cáncer incluyen la presencia de citocinas y quimiocinas en tejidos tumorales, que tiene el potencial de estimular la proliferación de células del tumor y la supervivencia de las células malignas [5], [6]. La inflamación crónica también favorece una sobreproducción de ADN dañar especies reactivas de oxígeno (ROS), cuya producción puede ser incidental a la fosforilación oxidativa (OXPHOS) reacciones en la mitocondria (OXPHOS-dependiente) o producidos desde fuera de la mitocondria más comúnmente por Nicotinamid adenina dinucleótido fosfato ( NADPH) oxidasas (fosforilación oxidativa-independiente) (para una revisión ver [7] - [9]). la producción crónica de causa daño del ADN ROS, lo que permite la acumulación de mutaciones que a su vez puede activar los oncogenes y /o inactivar genes supresores tumorales, aumentando así el riesgo de desarrollo de cáncer [3].

El factor de riesgo más común para el desarrollo cáncer gástrico es la infección bacteriana crónica del estómago con Helicobacter pylori gratis ( H. pylori
) [10]. La infección crónica del estómago por H. pylori
afectan el equilibrio del pH gástrico y puede causar aclorhidria o hiperclorhidria [11]. Aunque esta bacteria se clasifica como una clase de un carcinógeno, no siempre se asocia con un mayor riesgo de desarrollo de cáncer gástrico. Por ejemplo, H. pylori
pacientes infectados con úlceras duodenales y altos niveles de ácido gástrico tienen un riesgo reducido de desarrollar cáncer gástrico en comparación con los de la población general [11] - [13]. Por el contrario, los pacientes con gastritis atrófica y la secreción de ácido gástrico reducido tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer gástrico [11], [13], [14]. El mayor riesgo de cáncer en individuos aclorhídricos podría ser debido a la proliferación bacteriana de otras bacterias en la luz gástrica [15]. En los seres humanos y modelos animales aclorhídricos bacteriana crecimiento excesivo causa gastritis crónica que se desarrolla en la metaplasia intestinal y cáncer gástrico finalmente [16] - [18]. Entre las bacterias que se encuentran en el estómago de los ratones fueron aclorhídricos Enterococos
especies, que son cocos gram-positivos capaces de sobrevivir en ambientes con un pH tan bajo como 4,5 [19], [20]. Enterococcus faecalis gratis ( E. Faecalis
) es un miembro de la microbiota comensal humana y una de las bacterias más comunes en el tracto gastrointestinal [19]. A pesar de esto, E. faecalis
puede actuar como un patógeno humano [21], y se ha encontrado en un aumento significativo de los números en lesiones cancerosas orales y en cánceres de colon humano [22], [23]. En relación con este E. faecalis
es capaz de producir N-nitrosaminas y de inducir inestabilidad genética en las células epiteliales del colon a través de daño oxidativo del ADN [24], [25].

Gastritis está asociado con la infiltración de células inmunes en el tejido, lo que hace que sea difícil para diseccionar la acción de las células inmunes de la de las células de revestimiento de la mucosa in vivo
. Por ello, utilizó un in vitro de tejidos
modelo de cultura que nos permitió examinar lo aislado células de la mucosa responden a las bacterias y los mecanismos moleculares por los cuales las bacterias intestinales, como E. faecalis
inducir daño en las células epiteliales gástricas. Usando este modelo se analizó el impacto de E. faecalis
infección de cultivos de células de adenocarcinoma gástrico en la producción de ROS, la respiración celular, el crecimiento, dañan el ADN /reparación y las respuestas inflamatorias.

Materiales y Métodos

Cell Culture, E. faecalis
, y condiciones de crecimiento

MKN74 humano cultivos celulares de adenocarcinoma gástrico de la colección japonesa de banco de células de Recursos Biológicos de investigación (JCRB # JCRB0255) se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Invitrogen), 100 mg /ml de estreptomicina y 100 U /ml de penicilina (Invitrogen) a 37 ° C, y 5% de CO _{2 atmósfera humidificada. Las infecciones se realizaron con E. faecalis
cepa (ATCC 29212). Las bacterias se cultivaron en placas de agar sangre al 5% a 37 ° C. La densidad óptica (OD) de las bacterias cultivadas en medio RPMI 1640 se midió a 550 nm en un espectrofotómetro UV-1601 (Shimadzu, Kyoto, Japón) (Figura S1). E. faecalis
lisado fue preparado por congelación /descongelación de la suspensión bacteriana tres veces, mientras que la sonicación de la suspensión entre cada ciclo.}

La infección de las células gástricas para el aislamiento de ADN y ARN

Durante 24 h infecciones , las células MKN74 confluentes 80% se lavaron con PBS y se incubaron en medio libre de antibiótico. colonias de E-noche a la mañana crecido. faecalis
se añadieron al cultivo de células MKN74 a una multiplicidad de infección (MOI) de 50 bacterias por célula. 5 infecciones día se llevaron a cabo mediante el tratamiento de células MKN74 confluentes 65% con E. faecalis
a una MOI de 10 o con una concentración de proteína de lisado de 40 g /l. Cada 24 h, las células se lavaron con PBS y medio fresco y se añadieron bacterias o lisado. Las células de control se procesaron de manera similar en la ausencia de bacterias o de lisado bacteriano. in vitro se realizaron estudios
usando una línea celular de cáncer gástrico para probar el efecto perjudicial de los E. faecalis
en células de adenocarcinoma gástrico. Estas células difieren de las células epiteliales gástricas normales mediante la realización de varias aberraciones cromosómicas, pero ofrecen la ventaja de ser un sistema modelo reproducible que en muchos aspectos replica los eventos que se producen en el estómago. La comparación de las células infectadas a las células no infectadas da una imagen fiable de daños y alteraciones en la expresión génica causada por la infección.

ARN y ADN aislamiento

Después de la infección, el ARN y el ADN se extrajeron mediante la adición de reactivo Trizol (Invitrogen) a cada matraz de cultivo. El ARN se aisló de acuerdo con los fabricantes de protocolo. La fase intermedia que contiene ADN se precipitó mediante la adición de 100% de etanol. Las muestras se centrifugaron a 4 ° C, 3,500 g de 6 min. El sobrenadante de fenol-etanol se retiró y la extracción de ADN restante se realiza utilizando un kit NucleoSpin tejido (Macherey-Nagel, Düren, Alemania). las concentraciones de ARN y ADN se midieron en un NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro. números de la integridad del ARN se midieron en un 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, California) de acuerdo con los fabricantes de protocolo.

Medición de ROS y superóxido

Dos días antes de la infección 8 × 10 ^{4 MKN74 células se sembraron en cada pocillo de una Lab-Tek TM Septadas Coverglas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). células MKN74 se tiñeron durante dos horas antes de la infección con la mezcla de detección de 2-plex. ROS y superóxido tinción se realizó usando el ROS /RNS kit de detección (Enzo Life Sciences, Farmingdale, Nueva York) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. células MKN74 se infectaron a MOI de 50 durante 30 min y se analizaron con un microscopio confocal Zeiss LSM 510 usando el software LSM 510 (Zeiss, Oberkochen, Alemania). No infectado manchado se utilizaron células MKN74 como controles negativos.}

La localización de E. faecalis
durante la infección

8 × 10 ^{4 MKN74 células /pocillo se sembraron en un portaobjetos con fondo de vidrio de 8 cámaras (Thermo Fisher Scientific) 24 horas antes de la tinción. Con el fin de identificar la localización de E. faecalis
después de la infección teñidas por separado con la membrana plasmática CellMask TM color rojo oscuro de la membrana plasmática de manchas (C10046, Invitrogen) y la pared celular bacteriana usando Baclight TM verde de la mancha bacteriana (sondas B-35000, Molecular, Invitrogen) de acuerdo con los dos protocolos, respectivamente. Las células y las bacterias se lavaron 3 veces en PBS antes de la infección. Las células se infectaron a una MOI de 100 durante 4 horas y se analizaron con un microscopio confocal Zeiss TSI 510 usando el software LSM 510 (Zeiss). Este experimento se repitió tres veces y 8 champán se examinaron cada vez.}

XF24 basado en una microplaca de respirometría

Respirometría de las células MKN74 se realizó utilizando un analizador de flujo XF24 extracelular (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA ). La mitad de los MKN74 células cultivadas en placas estaban infectados con E. faecalis
a una MOI de 50 durante 4, 8 ó 24 horas, mientras que la otra mitad se dejó sin infectar. Después de la incubación, las bacterias se retiraron usando 4% de penicilina /estreptomicina (5 U /ml) y 4% cefotaxima (100 mg /ml) (ACS Dobfar Generics S.A., Luxemburgo, Bélgica). Las células se incubaron en un CO _{2 incubadora libre a 37 ° C durante 1 hora para permitir que la temperatura y el pH equilibrado. La microplaca con células luego se cargó en el XF24 y la tasa de consumo de oxígeno de cada pocillo se midió durante un período de 100 minutos. Los fármacos oligomicina (0,5 M), FCCP (0,3 M) y antimicina A (2,0 M) fueron a su vez a cada pocillo. Más detalles están disponibles en S1 Archivo.}

La inestabilidad del ADN mitocondrial

La frecuencia de mutaciones en la región D-loop del ADN mitocondrial, se determinaron mediante PCR utilizando los cebadores de amplificación C6-CA5 (Tabla S1 ). Los fragmentos amplificados se clonaron en el vector pCR2.1 (Invitrogen) y los insertos de 328 colonias fueron amplificados utilizando los cebadores VectorD de bucle (Tabla S1). Los fragmentos amplificados se purificaron y secuenciaron usando el kit de secuenciación del ciclo ABI Prism BigDye Terminator y un ABI Prism 3730 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts). Para determinar las mutaciones, se utilizaron las secuencias como las consultas en la secuencia de referencia obtenido de Cambridge MITOMAP (http://www.mitomap.org. Consultado febrero 9. 2012).

microarrays y GSA

ARN con un número integridad del ARN de 8 o superior de control de tres y tres muestras de infección (con e viable. faecalis
o con e. faecalis
lisado de 40 g /l) para 24 horas y 5 experimentos día se presentaron a la Microarray Centro de RH en el hospital Universitario de Copenhague. El ARN se amplifica y se marcó utilizando el "kit de 3 IVT Express (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. 250 ng de ARN total fue utilizado como entrada. Se hibridaron las muestras marcadas con GeneChip Genome U133 más 2 arrays (Affymetrix). Los arrays se lavaron y se tiñeron con estreptavidina conjugada con ficoeritrina utilizando un Affymetrix Fluidics Station® 450, y de los arrays se escanearon en un escáner Affymetrix GeneArray® 2500 para generar imágenes fluorescentes, como se describe en el protocolo de Affymetrix GeneChip®. 24 intensidad archivos celular primas (CEL-archivos) se generaron en el Comando Console® software GeneChip® (AGCC) (Affymetrix). El CEL-archivos en bruto se pusieron a disposición del público en ArrayExpress con el número E-MEXP-3496. Preprocesamiento de microarrays para el análisis conjunto de genes (GSA) se hizo con R /Bioconductor [26], [27]. Ajuste de fondo, cuantil normalización y resumen final para sondear establecidos intensidades de expresión se llevó a cabo mediante el algoritmo GCRMA [28] para cada condición experimental, por separado (S2 Archivo).

Quantitative PCR de transcripción inversa

ADNc fue sintetizado utilizando superíndices III primer capítulo de síntesis Supermix para qPCR (Invitrogen). La expresión génica se analizó mediante qRT-PCR utilizando SYBR más verde q-PCR SuperMix para ABI PRISM (Invitrogen). Los cebadores fueron diseñados utilizando el Primer-explosiva de software de NCBI [29]. Las reacciones se llevaron a cabo en un sistema ABI PRISM 7900HT de detección de secuencias (SDS) de Applied Biosystems. Los datos se normalizó a la expresión de ARNm de GAPDH.

ensayo de crecimiento

8000 células se distribuyeron a cada pocillo de seis placas de 24 pocillos y se incubaron a 37 ° C y 5% de CO _{2 para dos días antes del tratamiento. Las células se trataron por cuadruplicado de la siguiente manera; 4 pozos de las células de control no infectadas, 4 pozos tratados con /l E 400 mg. faecalis
lisado, 4 pozos tratados con 40μg /l de lisado, 4 pozos tratados con 4 mg de lisado /l y 4 pozos tratados con viables E. faecalis
a una MOI de 10. Una placa de las células fue fijado todos los días. La fijación se realiza por lavado con PBS y fijar con 1 ml 10% de formalina durante 10 min. células fijado se tiñeron con 1 ml de 0,1% de cristal violeta (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), y las placas se agitaron durante 30 min. Las células se lavaron, se secaron, y violeta cristal se extrajo con ácido acético 500 l 10%. Se midió la absorbancia a 620 nm en un Power Wave XS (BioTek Instruments, Winooski, Vermont).}

Análisis estadístico

Se utilizó el análisis de clasificación individual de la varianza (ANOVA) para poner a prueba las diferencias en la capacidad respiratoria máxima , el recambio de ATP y el consumo de oxígeno de la fosforilación oxidativa-independiente. ANOVA se utilizó además para probar las diferencias en el crecimiento celular durante diferentes tratamientos con E. faecalis
. Cuando el ANOVA indicó diferencias significativas entre los tratamientos, se utilizó el método de Tukey honestamente significativa para probar las diferencias entre las tasas de consumo de oxígeno o número de células. las frecuencias de mutación del ADN mitocondrial se evaluaron mediante chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher. resultados de ROS se expresaron como valores medios de al menos veinte mediciones independientes y se analizaron por desapareado de dos colas t-test
. QRT-PCR resultados se expresaron como valores medios de al menos tres experimentos independientes medidos en tres repeticiones técnica, y se analizaron por no pareada de dos colas t-test
. se consideraron significativas las diferencias entre los conjuntos de datos en los valores de p ≤ 0,05. Las barras de error = ± SEM a menos que se indique lo contrario.

Identificación de las vías reguladas hecho por un método de GSA, GAGE ​​[30], mejorado para explotar la información de inducción de la represión disponibles (para los detalles extensos cálculos y ver S2 Archivo). Vías estaban representados por las listas de genes (conjuntos de genes) descargados de la base de datos de firmas moleculares (MSigDB) 3.0 [31]. C2 colección de conjuntos de genes (comisariados vías canónicas y firmas de expresión génica de perturbaciones genéticas y químicas) usando los símbolos de genes identificadores. los valores de p conjunto de genes fueron corregidos para múltiples pruebas mediante la estimación de la tasa de falso descubrimiento y el nivel de significación se fijó en 1%.

Resultados

E. faecalis
infección inducir intracelular de ROS y la producción de superóxido

Otros y hemos demostrado anteriormente que la gastrina aclorhidria KO ratón tenía sobrecrecimiento bacteriano con enterococos Windows que normalmente no son parte de la flora gástrica [ ,,,0],20]. Aunque Los enterococos
en general se cree que son de baja patogenicidad, sostenido crecimiento excesivo en ratones aclorhidria se asocia con una respuesta inflamatoria y en última instancia, estos ratones desarrollan cáncer gástrico [20], [32]. Para caracterizar el proceso patológico dentro de las células gástricas hemos examinado cómo las bacterias afectadas las células epiteliales gástricas. El uso de sondas de monitorización de la producción de ROS intracelular, se encontró que 30 minutos de infección estimularon un aumento significativo en la formación de ROS intracelulares (Figura 1A). Con sondas específicas para la producción de superóxido se demostró que el ROS consistía principalmente de superóxido en células MKN74 (Figura 1A). La intensidad de fluorescencia se cuantificó con el software LSM 510 y un aumento estadísticamente significativo en intracelular de ROS y superóxido en las células infectadas en comparación con células de control no infectadas se observó (Figura 1B). No se encontraron pruebas que sugiere invasión de las células de las bacterias por lo que se concluye que la intracelular de ROS fue producido por las células infectadas y no por interiorizado E. faecalis gratis (Figura 1 C-D).

La infección disminuye la actividad mitocondrial y aumenta la fosforilación oxidativa independiente del consumo de oxígeno

La fuente de ROS encontró después de una infección bacteriana o bien podría ser generada por bacterias extracelulares [33] y /o producirse a partir de dentro de las células [34], [35]. ROS intracelulares o bien se puede generar de una manera OXPHOS-dependiente o independiente. Para examinar y posteriormente caracterizar la posible producción de ROS intracelular asociada con E. faecalis
la infección; que mide cómo la infección bacteriana afecta la respiración mitocondrial mediante la medición de recambio de ATP, la capacidad respiratoria y el consumo de oxígeno de la fosforilación oxidativa-independiente (Figura 2). Para asegurar que los resultados reflejan la respiración de sólo las células MKN74, todas las bacterias se eliminaron antes de las mediciones. No hubo diferencia significativa en el volumen de negocios ATP de las células de control cultivadas durante 4-24 horas, mientras que una disminución significativa de 2 y 4 veces (p < 0,001) de la facturación ATP estaban presentes entre las células de control y las células infectadas se incubaron durante 8 y 24 horas respectivamente (Figura 2A). Una correlación correspondiente se encuentra en la capacidad respiratoria, donde las capacidades de las células infectadas también fueron significativamente de 2 y 4 veces redujo (p < 0,01) en comparación con células de control después de 8 y 24 horas de la infección (Figura 2B). El consumo de oxígeno de la fosforilación oxidativa-independiente de las células de control no fue modificado para las células cultivadas durante 4-24 horas. En contraste, el consumo de oxígeno de la fosforilación oxidativa-independiente de las células infectadas con bacterias aumentó de ~ 50% de la absorción total de oxígeno después de 4 horas de infección para convertirse en el utilizador de oxígeno primario (p < 0,001) (Figura 2C). Esto sugiere que E. faecalis
interactuar con las células epiteliales inducen la formación de ROS y el consumo de oxígeno por otros sistemas enzima intracelular que la fosforilación oxidativa. La expresión de NOX1-5 y Duox1-2 se examinó en la línea celular gástrica; sin embargo, la expresión no se vio afectada por la infección (Tabla S2).

E. infección faecalis
causado inestabilidad ADN mitocondrial

Hemos demostrado anteriormente que la infección con patógenos H. pylori
cepas indujeron mutaciones en el genoma mitocondrial en cultivo de células humanas [36]. Dado que la infección por E. faecalis
aumentar intracelular de ROS examinamos si también causó la inestabilidad genómica ADNmt. La frecuencia global de eventos mutacionales mitocondrial región D-loop fue significativamente mayor en los cultivos de células infectadas con MKN74 E. faecalis
(45,5%) que en cultivos de células de control no infectadas (23,0%; p < 0,01) (Figura 3). Además, las células infectadas mostraron un mayor número de transiciones (36,4%) que las células de control (21,8%; p < 0,05). Las deleciones (control 0% /3,9% infectada), las inserciones (control 1,1% /2,6% infectada), y transversiones (control 0% /2,6% infectado), este último típicamente visto como consecuencia de la ROS, se detectaron con más frecuencia en infectada Células. De este modo la infección por E. faecalis
induce mutaciones en las células gástricas (Figura 3).

La infección provocó un NFkB dominado respuesta inflamatoria y una respuesta ROS

Para obtener una mayor comprensión biológica en las respuestas celulares en las células gástricas a E. faecalis
la infección se realizó un análisis de microarrays examinar los cambios globales en la expresión génica en las células infectadas con el E viable. faecalis
o tratados con E. faecalis
lisado. En lugar de centrarse en la expresión de los genes individuales que utilizamos GSA [30] para identificar las vías y procesos activados o inhibidos por la infección. Centrándose en conjuntos de genes en lugar de genes individuales aumenta la robustez, la sensibilidad y la relevancia biológica incluso para conjuntos de genes regulados moderadamente. Esto se consigue al aumentar la relación señal a ruido, por lo que es posible interpretar cambios modestos en genes individuales [37]. La GSA 2403 probó conjuntos de genes y resultó en 484 vías reguladas siendo estadísticamente significativa tanto para las infecciones en vivo y /o estímulos lisado (Figura S2). Centrándose en aquellas vías estadísticamente significativas para las infecciones en vivo, algunos de los conjuntos de genes juzgados para caracterizar mejor el presente estudio se dividieron en tres grupos de forma manual (Figuras 4, 5 y 6a). El examen de la inflamación y ROS, E. infección faecalis
causó una significativa regulación de varias vías de señalización implicadas en las respuestas inmunes, incluyendo grupos de receptores de quimioquinas y genes de señalización de quimioquinas, genes implicados en la G-proteína ligando de receptor acoplado a la unión, y NFkB la activación de genes (Figura 4, parte superior de seis conjuntos de genes). Además dos conjuntos de genes que comprenden los genes que responden a fosfolípidos oxidados proinflamatorios fueron fuertemente hasta reguladas. fosfolípidos oxidados son producidos por ROS y la función de una manera pro-inflamatoria [38], [39] (Figura 4, conjunto de genes siete y ocho). El apoyo a la presencia de ROS, se activa un conjunto de genes de 30 genes que se sabe están expresadas en respuesta a los ROS (Figura 4, conjunto de genes abajo). Se sabe que las ROS son importantes para el lipopolisacárido (LPS) de producción impulsada de varias citocinas pro-inflamatorias [40] Sin embargo, las bacterias gram-positivas tales como E. faecalis
no expresan LPS. tanto, nuestro estudio de cómo la expresión de genes individuales que codifican para citocinas y quimiocinas pro-inflamatorias se efectúa en respuesta a una no-LPS estimulada infección durante 24 horas y 5 infecciones día (Tabla 1). Numerosos genes implicados en la vía inflamatoria NFkB fueron significativamente hasta reguladas durante la E. faecalis
infección, incluyendo la interleuquina-1β (IL-1ß), interleucina-1 quinasa asociada al receptor 2 (Irak2), VEGF, IL-8, IL-23α, IL-11, y factor de necrosis tumoral-α (TNF α) mayoría de los cuales se pueden propagar aún más la respuesta de activación de NF-kappa B [41] - [44]. Entre ellas había varias citoquinas previamente identificados en H. pylori
infecciones mediadas, tales como IL-8 y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ambos asociados con la angiogénesis y con cáncer avanzado gástrico, IL-1ß que es un potente inhibidor de la secreción de ácido, y también TNF-α, una regulador de la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis [43] - [45]. Además, la citocina IL-23α que promueve la incidencia de tumores y el crecimiento [46] y es altamente produce en H. pylori
mucosa colonizado [47] fue hasta reguladas junto con, IL-11, que es una citoquina de las células parietales que bloquea la secreción de ácido gástrico, promueve la gastritis atrófica y la tumorigénesis gástrico [48], [49]. Entre otros genes que se encuentran para mostrar niveles altos expressional, y significativas durante la infección eran IL-1α, IL-32, factor de diferenciación de crecimiento 15 (GDF15) y, quimiocina (motivo C-C) ligando 22 (CCL22). Además, una regulación de la superóxido dismutasa 2 (SOD2), que convierte el superóxido en peróxido de hidrógeno, fue visto. IL-8, factor regulador de interferón 1 (IRF-1) y TNF fueron validados por QRT-PCR (Figura 4 B).

reparación de daños en el ADN están regulados hacia abajo durante E. faecalis
infección

La vía de análisis indicó que la expresión de genes implicados en la reparación del daño en el ADN fue significativamente reducido regulado en comparación con cultivos de células no infectadas después de 24 horas de la infección (Figura 5A). QRT-PCR confirmó que la expresión de los genes de reparación desajuste varios (MMR) se redujeron regulado después de que ambos 24 h y 5 días de E. faecalis
infección (Figura 5, B). En las 24 h las células infectadas PMS1 y MSH6 fue significativamente las reguladas (4 veces y 1,8 veces, respectivamente; p < 0,001). A baja regulación significativa de MSH2 (3 veces), MSH3 (1,9 veces), MSH6 (2 veces), y PMS1 (3 veces) (p < 0,05) (Figura 5, B) se observó en células 5 días después de la infección. Los expressional los factores de cambio de genes de reparación del daño en el ADN seleccionados después de la infección se muestran en la Tabla S3. Estos resultados sugieren que E. faecalis
infección regula a la baja las principales vías de reparación del ADN resultantes en la inestabilidad genómica similar a las infecciones con H. pylori
[36], [50], [51].

La infección por E. faecalis
inhibe el control del ciclo celular y el crecimiento de las células MKN74

Para evaluar los cambios en el crecimiento celular inducida por E. faecalis
infección, se determinó la influencia de las bacterias en la expresión de genes de control del ciclo celular y en el crecimiento de células MKN74. Conjuntos de genes que comprenden el control del ciclo celular y los genes de punto de control se redujeron reguladas después de 24 horas de la infección con bacterias viables que sugieren una ralentización significativa en la proliferación celular, sino también un aumento en el riesgo de mutaciones en nuevas células (Figura 6 A). Por el contrario, estas vías son regulados hasta en las células infectadas con el lisado bacteriano lo que sugiere que estas células todavía estaban dividiendo después de 24 horas (Figura 6 A). A continuación mide la proliferación celular durante 5 días y nos pareció que las bacterias viables causaron la proliferación de células MKN74 para ralentizar o detener por completo (Figura 6 B). proliferaciones celulares también fueron afectados cuando se incubaron con lisado bacteriano. Después de 24 horas, las células tratadas lisado se sigue dividiendo (como también se muestra en la Figura 6A), y hasta el día 4 No había distinción entre las células no infectadas y las células infectadas con el lisado. Sin embargo, el día 4 hubo significativamente menos células después de la incubación con lisado bacteriano en comparación con células de control no infectadas. El día 5 se observó una relación dosis-respuesta entre la concentración de lisado y el crecimiento celular (Figura 6 B), que muestra que las infecciones por E. faecalis
interferir con el crecimiento celular. Un resultado similar se ha observado en linfocitos humanos en el que tres días de incubación con E. faecalis
lisado inducido por la detención del ciclo celular [52]. Como este trabajo se realizó en un sistema aislado, la reducción de la proliferación de las células infectadas podría atribuirse a la falta de factor de estimulación del crecimiento por responder las células inmunes.

Discusión

Los patógenos microbianos se estima que causa aproximadamente 1,2 millones de casos de cáncer cada año [5]. Los estudios en humanos y varios modelos animales han demostrado que aclorhidria permite la proliferación bacteriana del estómago, lo que puede causar inflamación gástrica crónica, que se desarrolla en cáncer gástrico [20], [53], [54]. Apoyar el papel etiológico de otras bacterias en las neoplasias malignas gástricas son los estudios de erradicación de H. pylori
infección que permiten la colonización gástrica por bacterias intestinales [55], y un posterior desarrollo del cáncer gástrico [56]. Esto sugiere que los participantes que no sean H. pylori
puede estar implicada en la inflamación impulsado neoplasias gástricas. Los eventos moleculares por los cuales la infección gástrica crónica con estas bacterias afectan a las células cancerosas y causan daño a estas células ha sido mal entendido.

Se encontró que la infección por E. faecalis inducida
una producción intracelular de ROS. La fosforilación oxidativa por la mitocondria era baja después de la infección, lo que demuestra que la producción de ROS se genera principalmente en una forma de la fosforilación oxidativa-independiente dentro de las células infectadas. OXPHOS independiente intracelulares de ROS se puede producir en las células epiteliales por NADPH no fagocíticas (NOX) oxidasas en respuesta a, por ejemplo, la estimulación de citoquinas [57], y son los máximos fuentes no mitocondrial de ROS [58]. Estos NOX enzimas de electrones de transporte a través de membranas de plasma, la generación de superóxido y otra ROS [59]. En las células epiteliales humanas se encuentran dos homóloga de NOX (Nox2 y NOX5) [60]. En nuestro estudio estas enzimas no eran transcriptionally hasta reguladas, sin embargo no se puede descartar que los elevados niveles de ROS fue una consecuencia de una activación de estas enzimas, aunque esto necesita más investigación.

• PLOS ONE: IL-26 promueve la proliferación y supervivencia de células de cáncer gástrico humano mediante la regulación del equilibrio de STAT1 y STAT3 activación
• PLOS ONE: Alta Expresión de la proteína de choque térmico 90 está asociado con tumor agresividad y mal pronóstico en pacientes con cáncer gástrico avanzado