PLoS One: Enterococcus faecalis fertőzés gyulladást okoz, intracelluláris Oxphos független ROS termelés, és DNS károsodás humán gyomorkarcinóma Cells

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

achlorhydria okozta pl atrófiás gasztritisz lehetővé teszi a bakteriális túlszaporodás, amely indukálja a krónikus gyulladás és a kár, hogy a nyálkahártya-sejtek a fertőzött egyének vezetési gyomor rosszindulatú betegségek és a rák. Enterococcus faecalis katalógusa ( E. Faecalis katalógusa) is megtelepedhet achlohydric gyomor és ezért akarta, hogy tanulmányozza a hatását E. faecalis katalógusa fertőzés a gyulladásos válasz, a reaktív oxigén gyökök (ROS) képződését, a mitokondriális légzést, valamint a mitokondriális genetikai stabilitás gyomornyálkahártya-sejtek. katalógusa

Módszerek katalógusa

Hogy szétválassza a változások által indukált baktériumok ezek a gyulladásos sejtek hoztunk létre egy in vitro E. faecalis katalógusa fertőzés modell rendszer segítségével a gyomor karcinóma sejtvonal MKN74. Összesen ROS és a szuperoxid mértük fluoreszcens mikroszkópiával. Cellular oxigénfogyasztás jellemezte a nem-invazív segítségével XF24 microplate módszeren alapuló respirometria. Génexpresszió megvizsgálta microarray, és a válasz utak azonosítottuk Gene Set Analysis (GSA). Kiválasztott gén transzkriptumokat igazoltuk kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (QRT-PCR). Mitokondriális mutációk határoztuk szekvenálás. Katalógusa

Eredmények katalógusa

Fertőzés MKN74 sejtek E. faecalis katalógusa indukált ROS termelést egy olyan útvonalon keresztül független oxidatív foszforiláció (oxphos). Továbbá, E. faecalis katalógusa fertőzés okozta mitokondriális DNS instabilitás. A fertőzést követően kódoló gének gyulladásos válasz fehérjék voltak transzkripcionálisan felülszabályozott míg DNS sérülés javítására és a sejtciklus-szabályozás géneket alulszabályozott. A sejtek növekedése lelassul, ha fertőzött életképes E. faecalis katalógusa, és válaszolt dózisfüggő módon E. faecalis katalógusa lizátumból.

Következtetések katalógusa

A fertőzés E. faecalis katalógusa indukált oxphos független ROS válasz és a sérült mitokondriális genom gyomor sejttenyészetben. Végül a baktériumok okozta NF-kB gyulladásos választ, valamint a károsodott DNS-károsodás válasz és a sejtciklus szabályozása génexpresszió. Katalógusa

transzkripciós profil katalógusa

Array Express hozzáférési szám E-MEXP-3496.

bevezető hivatkozás: Strickertsson Jab, Desler C, Martin-Bertelsen T, Machado AMD, Wadstrøm T, Winther O et al. (2013) Enterococcus faecalis katalógusa fertőzés gyulladást okoz, intracelluláris Oxphos független ROS termelés, és DNS-károsodást emberi gyomorban a rákos sejteket. PLoS ONE 8 (4): e63147. doi: 10,1371 /journal.pone.0063147 katalógusa

Szerkesztő: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: augusztus 28, 2012; Elfogadva: április 2, 2013; Megjelent: április 30, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Strickertsson et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: AMDM van által támogatott ösztöndíjat portugál Science, Technology Foundation. LFH támogatja a dán MRC. JABS támogatja a dán Cancer Society, és a University of Copenhagen SUND. TMB és OW által támogatott támogatás a Novo Nordisk Alapítvány a Bioinformatikai Központ. CD és LJR támogatja NORDEA-FONDEN. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák a tíz leggyakoribb rák, és a teljes éves halálozási arány mintegy 700.000, ez a második leggyakoribb oka a rák összefüggő halálozás [1]. Az intesztinális típusú gyomorrák alakul át egy sor kóros események kezdődő krónikus gyulladás, atrófiás gasztritisz, az intesztinális metaplázia, és végül a rák [2].

A krónikus gyulladás és a rák már kapcsolódik több vizsgálatban a betegek és az genetikailag módosított egerek, és úgy vélik, hogy részt vesz a patogenezisében mintegy 25% -a az összes rákos esetek világszerte [2] - [4]. Jellemzői a rákkal kapcsolatos gyulladás tartalmazzák jelenlétében kemokinek és citokinek a tumor szövetekben, amelyek potenciálisan serkentik a tumor-sejt-proliferációt és a túlélést a rosszindulatú sejtek [5], [6]. A krónikus gyulladás is kedvez túltermelést DNS-károsító reaktív oxigén gyökök (ROS), amelynek termelése lehet véletlen, hogy az oxidatív foszforiláció (oxphos) reakciók a mitokondriumokban (oxphos-függő) vagy abból előállított kívül mitokondriumok leggyakrabban a nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát ( NADPH) oxidázok (oxphos független) (áttekintését lásd [7] - [9]). Krónikus ROS-termelés DNS-károsodást okoznak, amely lehetővé teszi a felhalmozódása a mutációk, amelyek viszont aktiválja onkogének és /vagy inaktiválására tumorszuppresszor gének ezáltal növeli a kockázata a rák kialakulásának [3].

A leggyakoribb kockázati tényező a fejlődő gyomorrák krónikus bakteriális fertőzés a gyomor Helicobacter pylori katalógusa ( H. pylori katalógusa) [10]. Krónikus fertőzés a gyomor H. pylori
befolyásolja a gyomor pH-egyensúlyát, és okozhat achlorhydria vagy hyperchlorhydria [11]. Bár ez a baktérium van besorolva, mint egy osztály egyik rákkeltő, ez nem mindig jár a fokozott kockázata gyomorrák fejlődés. Például, H. pylori
fertőzött betegekben nyombélfekély és a magas szintű gyomorsav van egy csökkentett kialakulásának kockázata gyomorrák képest azok az általános populációban [11] - [13]. Ezzel szemben, a betegek sorvadásos gyomorhurut és csökkentett gyomorsav-szekréció fokozott kialakulásának kockázata gyomorrák [11], [13], [14]. A megnövekedett rák kockázatát achlorhydric egyének lehet az oka, hogy a baktériumok elszaporodását más baktériumok a gyomor lumen [15]. Mindkét achlorhydric emberek és állatkísérletekben a baktériumok elszaporodása okozza a krónikus gyomorhurut amely fejleszti a intestinalis metaplasia és végül gyomorrákban [16] - [18]. Között a baktériumok a gyomorban található a achlorhydric egerek Enterococcusok
fajok, amelyek Gram-pozitív coccusok képesek túlélni olyan környezetekben, amelynek a pH olyan alacsony, mint 4,5 [19], [20]. Enterococcus faecalis katalógusa ( E. Faecalis
) tagja az emberi kommenzalista mikrobióta és az egyik leggyakoribb baktériumok a gyomor-bél traktusban [19]. Ennek ellenére a E. faecalis
működhet, mint egy emberi kórokozó [21], és azt találták, jelentősen megnövelt számok orális rákos elváltozások és a humán vastagbélrák [22], [23]. Ezzel kapcsolatban E. faecalis
képes előállítani N-nitrozaminok és indukálni genetikai instabilitás vastagbél epiteliális sejtekben keresztül oxidatív károsodás a DNS [24], [25].

Gastritis társul infiltráció az immunsejtek a szövet, ami megnehezíti, hogy elemezzék az intézkedés az immunrendszer sejtjeit, hogy a bélés nyálkahártya sejtek in vivo katalógusa. Ezért használják egy in vitro
szövettenyészet modellt, amely lehetővé tette számunkra, hogy vizsgálja meg, hogy hogyan izolált nyálkahártya sejtek, reagálnak a baktériumok és a molekuláris mechanizmusok, amelyek bélbaktériumok, például E. faecalis
indukál kárt gyomornyálkahártya-sejtek. A modell segítségével megvizsgáltuk a hatását E. faecalis katalógusa fertőzés gyomor adenokarcinóma sejt kultúrák ROS termelés, sejtlégzés, a növekedés, a DNS-károsodás /javítás és a gyulladásos reakciókat. katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Cell Culture, E. faecalis
, és tenyésztési körülmények

Emberi MKN74 gyomor adenokarcinóma sejttenyészeteket a japán Collection of Research Bioresources cell bank (JCRB # JCRB0255) tartottunk fenn RPMI 1640 tápközegben (Invitrogen, Carlsbad, CA) kiegészített 10% magzati borjúszérumot (FBS) (Invitrogen), 100 ug /ml sztreptomicint és 100 egység /ml penicillinnel (Invitrogen), 37 ° C-on, 5% CO _{2 nedvesített atmoszférában. Fertőzések végeztünk E. faecalis katalógusa törzs (ATCC 29212). A baktériumokat növesztjük 5% vér agar lemezeket 37 ° C-on. Az optikai sűrűséget (OD) baktériumok RPMI 1640 közegben mértük 550 nm-en UV-1601 spektrofotométerrel (Shimadzu, Kyoto, Japán) (ábra S1). E. faecalis katalógusa lizátumot fagyasztva /felolvasztás baktérium szuszpenzió háromszor, míg szonikálására a felfüggesztés között minden ciklusban. katalógusa}

Fertőzés Gyomor sejtek RNS és DNS izolálás katalógusa

24 h fertőzések , 80% konfluens MKN74 sejteket PBS-sel mostuk, és inkubáljuk az antibiotikum mentes közegben. Overnight-kinőtt telepeket a E. faecalis
adunk a MKN74 sejttenyészetbe olyan fertőzési multiplicitással (MOI) 50 baktérium sejtenként. 5 napos fertőzést úgy végezzük, hogy 65% ​​-os összefolyó MKN74 sejtek E. faecalis
MOI 10 vagy egy lizátum fehérjekoncentrációját 40 ug /ul. Minden 24 órában, a sejteket PBS-sel mostuk, és friss közeggel és a baktériumokat vagy lizátumot adunk hozzá. Kontroll sejteket feldolgoztuk Hasonlóképpen hiányában baktériumok vagy bakteriális lizátumból. In vitro katalógusa vizsgálatokat végeztünk a gyomorrák sejtvonal, hogy teszteljék a káros hatását E. faecalis katalógusa a gyomor adenokarcinóma sejtekben. Ezek a sejtek különböznek a normális gyomor hámsejteket amelyek számos kromoszóma-rendellenességeket, de megvan az az előnye, hogy egy reprodukálható modell rendszer, amely sok tekintetben megismétli a bekövetkezett események a gyomorban. Összehasonlítva a fertőzött sejteket nem fertőzött sejtek megbízható képet nyújt a sérülések és elváltozások génexpresszió okozta a fertőzést. Katalógusa

RNS és DNS izolálás katalógusa

A fertőzés után az RNS és DNS nyerték hozzáadásával Trizol reagens (Invitrogen), hogy minden egyes lombikban. RNS-t izoláltunk szerint gyárt protokollt. A DNS-t tartalmazó köztes fázist hozzáadásával kicsaptuk 100% -os etanollal. A mintákat centrifugáltuk 4 ° C hőmérsékleten, 3500 g-vel 6 percig. A fenol-etanol felülúszót eltávolítottuk, és a maradék DNS-extrakció végeztük segítségével NucleoSpin szöveti reagenskészlet (Macherey-Nagel, Düren, Németország). RNS és DNS-koncentrációk mértük NanoDrop ND-1000 spektrofotométer. RNS integritását számok mértük 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, California) szerint a gyártók protokoll. Katalógusa

mérése ROS és szuperoxid katalógusa

Két nappal a fertőzés előtt 8 × 10 ^{4 MKN74 sejteket minden lyukban egy Lab-Tek TM Chambered Coverglas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts). MKN74 sejteket festettük előtt két órával a fertőzés és 2-Plex detektáló eleggyel. ROS és a szuperoxid-festést végeztünk a ROS /RNS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York) alkalmazásával a gyártó utasításait. MKN74 sejteket fertőztünk MOI 50 30 percig és elemzett egy Zeiss LSM 510 konfokális mikroszkóppal az LSM 510 szoftver (Zeiss, Oberkochen, Németország). A nem fertőzött foltos MKN74 sejteket használtunk negatív kontrollként. Katalógusa}

lokalizálása E. faecalis
fertőzés során

8 × 10 ^{4 MKN74 sejt /lyuk oltottunk egy 8 kamra üvegaljú csúszda (Thermo Fisher Scientific) 24 órával a festés előtt. Annak érdekében, hogy meghatározzák a lokalizáció E. faecalis
fertőzés után mi külön festettük a plazma membrán CellMask TM Deep Red plazmamembrán folt (C10046, Invitrogen) és a bakteriális sejtfal segítségével BacLight TM Zöld bakteriális folt (B-35000, Molecular Probes, Invitrogen) szerint a két protokoll volt. A sejteket és a baktériumokat 3-szor mostuk PBS-ben, a fertőzés előtt. A sejteket fertőztük MOI 4 óra hosszat 100 és elemzett Zeiss LSK 510 konfokális mikroszkóp alkalmazásával LSM 510 szoftver (Zeiss). Ezt a kísérletet háromszor megismételjük, és a 8. Champers vizsgáltunk minden egyes alkalommal.}

XF24 Microplate alapú respirometria

respirometria a MKN74 sejtek alkalmazásával hajtottuk végre egy XF24 Extracelluláris Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA ). Fele a bevont MKN74 sejteket fertőzött E. faecalis
MOI 50, 4, 8 vagy 24 óra, míg a másik fele maradt nem fertőzött. Az inkubálás után a baktériumokat eltávolítjuk 4% penicillin /sztreptomicint (5 U /ml), és 4% -os cefotaxim (100 ng /ml) (ACS Dobfar Generics S.A., Luxemburg, Belgium). A sejteket egy CO _{2 szabad inkubátorban 37 ° C-on 1 órán keresztül, hogy a hőmérséklet és a pH-ekvilibrációs. A mikrotiter sejtekkel ezután betöltve a XF24 és az oxigén fogyasztás mértéke az egyes üregekben mérjük alatt 100 perc. A gyógyszerek oligomicin (0,5 nM), FCCP (0,3 uM) és antimycin (2,0 uM) volt viszont adunk az egyes lyukakhoz. További részletek a Fájl S1. Katalógusa}

A mitokondriális DNS instabilitása katalógusa

A frekvencia a mutációk a D-loop régió mitokondriális DNS alapján határoztuk meg PCR-primereket használva C6-CA5 (Table S1 ). Az amplifikált fragmenseket klónoztuk pCR2.1 vektorba (Invitrogen), és betéteket 328 kolóniákat amplifikáltuk VectorD hurkú primereket (táblázat S1). Az amplifikált fragmenseket tisztítottuk, és szekvenáltuk az ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit és egy ABI Prism 3730 DNS Sequencer (Perkin-Elmer, Waltham, Massachusetts). Annak meghatározására, mutációk, a szekvenciákat használták lekérdezéseket a Cambridge referencia szekvencia nyert MitoMap (http://www.mitomap.org. Hozzáfért február 9. 2012).

Microarray és GSA

RNS RNS integritását száma 8 vagy annál három kontroll és három fertőzés minta (életképes E. faecalis katalógusa vagy E. faecalis katalógusa lizátum 40 mg /ml) 24 órán 5 napos kísérleteket benyújtották a RH Microarray Központ a koppenhágai egyetemi kórház. Az RNS-t amplifikáltuk, és jelzett a 3 'IVT Express készlet (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) a gyártó utasításai szerint. 250 ng teljes RNS-t használjuk bemenetként. A jelölt mintákat hibridizáltuk GeneChip Genome U133 plusz 2 tömbök (Affymetrix). A tömbök mostuk és megfestettük phycoerytrin konjugált sztreptavidinnel alkalmazásával Affymetrix Fluidics Station® 450, valamint a tömbök szkenneltük egy Affymetrix GeneArray® 2500 szkenner generálni fluoreszcens képeket, ahogy az a Affymetrix GeneChip® protokollt. 24 nyers sejt intenzitás fájlokat (CEL-fájlok) hoztunk létre a GeneChip® Command Console® szoftver (AGCC) (Affymetrix). A nyers CEL-fájlok nyilvánosan elérhető ArrayExpress a csatlakozási szám E-MEXP-3496. Elofeldolgozására microarray a gén készlet elemzés (GSA) végeztük R /Bioconductor [26], [27]. Háttér beállítás, quantile normalizálása és a végső összegzés szonda meghatározott kifejezés intenzitását végeztük a GCRMA algoritmus [28] az egyes kísérleti körülményekre, külön (File S2). Katalógusa

kvantitatív reverz transzkripciós PCR katalógusa

cDNS szintetizáltuk SuperScript III First-Strand szintézis SuperMix qPCR (Invitrogen). Génexpresszió elemeztük qRT-PCR SYBR zöldebb q-PCR SuperMix az ABI PRISM (Invitrogen). Primereket terveztünk a Primer-Blast szoftver az NCBI-nél [29]. A reakciót futtatunk egy ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (SDS) az Applied Biosystems. Adatok normalizáltuk GAPDH mRNS expressziót.

növekedési vizsgálat

8000 sejteket elosztva az egyes lyukakhoz, hat, 24-lyukú lemezeken, és inkubáljuk 37 ° C-on és 5% CO _{2 két nappal a kezelés előtt. A sejteket kezeltük négyszeresen az alábbiak szerint; 4 kutak nem fertőzött kontroll sejtek, 4 kutak kezelt 400 ug /ul E. faecalis
lizátumot 4 lyukat kezeltük 40 ug /ul lizátumot 4 lyukat kezeltük 4 ug /ul lizátumot és 4 üreget kezeljük életképes E. faecalis
MOI 10. Az egyik lemez sejtet fixated minden nap. Rögzítés végeztük mosással PBS-sel és fixálása 1 ml 10% -os formaiinban 10 percen át. Fixált sejteket megfestettük 1 ml 0,1% -os kristályibolya (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), és a lemezeket rázatjuk 30 percig. A sejteket mossuk, szárítjuk, és a kristály ibolya extraháljuk 500 ul 10% -os ecetsavban. Az abszorbanciát mérjük 620 nm-en egy PowerWave XS (BioTek Instruments, Winooski, Vermont).}

Statisztikai elemzés

egységes osztályozási varianciaanalízist (ANOVA) használtuk, hogy teszteljék különbségek maximális légzési kapacitása ATP forgalom és oxphos független oxigénfogyasztás. ANOVA-t, továbbá használt teszt különbségek sejtnövekedést során különböző kezelést E. faecalis katalógusa. Amikor az ANOVA jelzett szignifikáns különbségek a kezelések között, Tukeys őszintén jelentős módszert használt teszt közötti különbségek oxigénfogyasztás aránya vagy a cellák száma. mtDNS mutációs gyakoriság értékelték chi-négyzet és Fisher-féle egzakt tesztet. ROS eredményeket átlag értéke legalább húsz független mérés és elemezni páratlan kétfarkú t katalógusa próba. QRT-PCR eredményeket átlag értékek legalább három független kísérlet mért három műszaki ismétlésben, és elemeztük páratlan kétfarkú T
-próba. A különbség adatsorok tekintettük szignifikánsnak p értékek ≤0.05. Hibasávok = ± SEM, hacsak másképp nincs feltüntetve. Katalógusa

azonosítása szabályozott útvonalak végezte a GSA módszerrel Gage [30], a fokozott kihasználására elérhető indukciós elnyomás információk (részletes adatokat és számításokat lásd Fájl S2). Utak képviselte listák gének (gén-készletek) letölthető a Molecular aláírások Database (MSigDB) 3.0 [31]. C2 gyűjteménye a válogatott gén-készletek (kanonikus utak és génexpressziós genetikai és kémiai zavarok) alkalmazásával gén szimbólumok azonosítók. Gene set p-értékeket korrigáltuk többszörös tesztelés becslésével téves elfogadási arány és szignifikanciaszint 1%. Katalógusa

Eredmények katalógusa

E. faecalis katalógusa fertőzés indukáló intracelluláris ROS és szuperoxid termelés katalógusa

Egyéb ezért már korábban kimutatták, hogy a achlorhydric gasztrin KO egér volt a baktériumok elszaporodása a enterococcus katalógusa, amelyek általában nem része a gyomor flóra [ ,,,0],20]. Bár enterococcus katalógusa általában úgy gondolják, hogy az alacsony patogenitású, tartós elszaporodása achlorhydric egerek társul egy gyulladásos választ, és végül ezek az egerek fejleszteni gyomorrák [20], [32]. Jellemezni a kóros folyamatot a gyomor sejtek megvizsgáltuk, hogy a baktériumok hatással a gyomornyálkahártya-sejtek. A szondák nyomon intracelluláris ROS-termelés, azt találtuk, hogy 30 perc alatt a fertőzés stimulált jelentős növekedését intracelluláris ROS képződés (1a ábra). A specifikus próbákkal szuperoxid termelés azt mutatta, hogy a ROS főleg abból állt, szuperoxid MKN74 sejtek (1A). A fluoreszcencia intenzitás számszerűsítésére a LSM 510 szoftver és egy statisztikailag szignifikáns növekedést az intracelluláris ROS és a szuperoxid a fertőzött sejtekben, mint a nem fertőzött kontroll sejtekhez volt megfigyelhető (1B). Nem találtunk bizonyítékot arra, hogy azt invázió a sejtek baktériumok, így arra a következtetésre jutunk, hogy a ROS állította elő a fertőzött sejtek és nem internalizált E. faecalis katalógusa (1. ábra C-D). katalógusa

Fertőzés csökkenti a mitokondriális aktivitást és növeli oxphos független oxigénfogyasztás katalógusa

A forrás ROS talált bakteriális fertőzést követően e célra létrehozott extracelluláris baktériumok [33] és /vagy abból előállított, a sejten belül [34], [35]. ROS egyaránt lehet generált egy oxphos-függő vagy független módon. Annak vizsgálata, majd jellemezze a lehető ROS termelés társított E. faecalis katalógusa fertőzés; mértük, hogy a bakteriális fertőzés befolyásolja a mitokondriális légzést mérésével ATP forgalom, a légzőszervi kapacitás és oxphos-független oxigénfogyasztás (2. ábra). Ahhoz, hogy biztosítsuk, hogy az eredmények visszavert légzést a MKN74 sejtek csak az összes baktériumokat előtt eltávolítottuk a méréseket. Nem volt szignifikáns különbség az ATP forgalma kontrollsejtek növesztettük 4-24 órán át, mivel jelentős 2- és 4-szeres csökkenést (p < 0,001) ATP forgalom voltak jelen a kontroll sejtek és a fertőzött sejteket inkubáltuk 8 és 24 óra volt (2A ábra). Egy megfelelő korrelációt találtak a légzési kapacitása, ahol a kapacitások a fertőzött sejtek szintén szignifikánsan 2- és 4-szeres csökkent (p < 0,01), mint a kontroll sejtek után 8 és 24 órával a fertőzés (2b ábra). A oxphos független oxigén fogyasztása kontroll sejtek változatlan maradt sejtek termesztett 4-24 órán át. Ezzel szemben a oxphos független oxigén fogyasztása fertőzött sejtek baktériumok emelkedett -50% -a teljes oxigénfelvétel 4 óra elteltével a fertőzés, hogy az elsődleges oxigén hasznosító (p < 0,001) (2C ábra). Ez arra utal, hogy E. faecalis katalógusa kölcsönhatásba a hámsejtek indukáló ROS képződést, és az oxigén fogyasztás más intracelluláris enzim rendszerek, mint az oxidatív foszforiláció. Expressziója NOX1-5 és Duox1-2 vizsgálták a gyomor-sejtvonal; azonban kifejezés nem befolyásolta a fertőzés (táblázat S2). katalógusa

E. faecalis katalógusa okozott fertőzés mitokondriális DNS instabilitás katalógusa

Korábban már kimutatták, hogy a fertőzés patogén H. pylori
törzsek indukált mutációk a mitokondriális genom, hogy emberi sejttenyészetben [36]. Tekintettel arra, hogy fertőzés E. faecalis
növelése ROS azt vizsgáltuk, hogy ez is okozta genetikai mtDNS instabilitás. Az általános gyakorisága mitokondriális D-loop régió mutációs események szignifikánsan magasabb volt MKN74 fertőzött sejttenyészetek E. faecalis
(45,5%), mint a nem-fertőzött kontroll sejttenyészetekben (23,0%; p < 0,01) (3. ábra). Továbbá, a fertőzött sejteket mutattak nagyobb számú átmenetek (36,4%), mint a kontroll sejtek (21,8%; p < 0,05). Deléciókat (0% kontroll /3,9% fertőzött), inszerciók (1,1% kontroll /2,6% fertőzött), és transzverziók (0% kontroll /2,6% fertőzött), az utóbbiak általában tekintik következtében ROS, kimutatható volt gyakrabban fertőzött sejtekben. Így fertőzés E. faecalis katalógusa indukál mutációk a gyomor sejtek (3. ábra). katalógusa

okozott fertőzés egy NFkB domináló gyulladásos válasz és a ROS válasz katalógusa

Ahhoz, hogy további biológiai betekintést a celluláris válaszokat a gyomor sejtek a E. faecalis katalógusa fertőzés végeztünk microarray vizsgálata a globális génexpressziós változásokat fertőzött sejtekben életképes E. faecalis katalógusa vagy kezelt E. faecalis katalógusa lizátumból. Ahelyett, összpontosítva expresszióját egyetlen gének használtuk GSA [30] azonosítani utak és folyamatok aktivált vagy gátlódik a fertőzést. Összpontosítva készlet gének helyett egyes gének növeli a robusztusság, az érzékenység és biológiai jelentősége még mérsékelten szabályozott készlet géneket. Ez úgy érhető el növelése a jel-zaj arány, így lehet értelmezni szerény változása egyes gének [37]. A GSA vizsgált 2403 gén-készletek, és ennek eredményeként 484 szabályozott utak statisztikailag szignifikáns akár élő fertőzések és /vagy lizátumuk inger (S2 kép). Összpontosító utak statisztikailag szignifikáns az élő fertőzések, néhány, a gén-készletek megítélni, hogy a legjobban jellemezni a jelenlegi tanulmány arra manuálisan megosztjuk három csoportba (4., 5. A és 6 A). Vizsgálva gyulladás és ROS, E. faecalis
okozott fertőzés jelentős up-regulációját számos útvonalban vesz részt immunválasz, beleértve a klaszterek a kemokin receptorok és kemokin jelátviteli gének részt vevő gének a G-fehérjéhez kapcsolt receptor ligandum kötő, és NFkB aktiváló gének (4. ábra, felső hat gén-készletek). Emellett két gén készlet tartalmaz géneket reagál gyulladáskeltő oxidált foszfolipidek határozottan fel szabályozni. Az oxidált foszfolipideket által termelt ROS és a funkció egy pro-gyulladásos módon [38], [39] (4. ábra, a gén meghatározott hét és nyolc). Támogatása ROS jelenlétét, egy gén készlet 30 gén Ismert, hogy válaszul ROS aktiválták (4. ábra, alsó gén készlet). Ismeretes, hogy a ROS fontos lipopoliszacharid (LPS) -driven termelés számos proinflammatorikus citokinek [40] azonban a Gram-pozitív baktériumok, mint például a E. faecalis katalógusa nem kifejezetten LPS. Ezért vizsgálták, hogyan expresszióját egyes gének kódoló pro-gyulladásos citokinek és kemokinek jöttek létre válaszul egy nem-LPS-sel stimulált fertőzés alatt 24 óra és 5 nap fertőzések (1. táblázat). Számos részt vevő gének a NFkB gyulladásos útvonal szignifikánsan felülszabályozott során E. faecalis
fertőzés, beleértve az interleukin-1β (IL-1), interleukin-1 receptor-asszociált kináz 2 (IRAK2), a VEGF, IL-8, IL-23α, IL-11, és a tumor nekrózis faktor-α (TNF α) a legtöbb, ami tovább terjednek az NF-kB aktiválás válasz [41] - [44]. Ezek között volt számos citokin korábban azonosított H. pylori
közvetített fertőzések, mint például az IL-8 és a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), mindkettő az angiogenezissel kapcsolatos és az előrehaladott gyomorrák, IL-1, amely egy erős inhibitora savszekréció, valamint a TNF-α, egy szabályozója sejtproliferáció, differenciálódás és apoptózis [43] - [45]. Ezen felül, a citokin IL-23α, amely elősegíti a tumor incidenciája és a növekedést [46], és erősen előállított H. pylori
kolonizált nyálkahártya [47] volt, akár szabályozott együtt, IL-11, amely egy parietális sejt citokin, amely blokkolja a gyomorsav-szekréciót, elősegíti atrófiás gasztritisz és a gyomorfekély a tumorgenezis [48], [49]. Többek között a gének talált megjelenítésére magas, és szignifikáns expressziós szintek alatt fertőzés volt az IL-1α, IL-32, növekedési differenciálódási faktor 15 (GDF15), és kemokin (C-C motívum) ligandum 22 (CCL22). Ezen túlmenően, egy up-regulációja szuperoxid-diszmutáz 2 (SOD2), amely átalakítja a szuperoxid a hidrogén-peroxid, volt látható. Az IL-8, interferon szabályozó faktor 1 (IRF-1) és TNF hagyta jóvá qRT-PCR (4. ábra B). Katalógusa

DNS sérülés javítására van szabályozva során E. faecalis
fertőzés

Az út elemzés jelezte, hogy a részt vevő gének expresszióját a DNS-sérülés javítására szignifikánsan alulszabályozott összehasonlítva fertőzetlen sejtkultúrák után 24 órával a fertőzés (5A ábra). qRT-PCR megerősítette, hogy a kifejezés több mismatch repair (MMR) géneket leszabályozott után mind 24 óra és 5 nap E. faecalis
fertőzés (5. ábra, B). A 24 h-fertőzött sejtek PMS1 és MSH6 szignifikánsan lecsökkent (4 szeres és 1,8 szeresére; p < 0,001). Jelentős down-regulációja MSH2 (3-szor), MSH3 (1,9-szeres), MSH6 (2-szeres), és PMS1 (3-szor) (p < 0,05) (5. ábra, B) volt megfigyelhető a sejtek 5 nappal a fertőzés után. Az expressziós szeres-változásait kiválasztott DNS károsodás repair gének a fertőzés után táblázatban mutatjuk be S3. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy E. faecalis katalógusa fertőzés leszabályozza fő DNS-javító mechanizmusokat eredményez genetikai instabilitást hasonló fertőzések H. pylori katalógusa [36], [50], [51]. katalógusa

A fertőzés E. faecalis katalógusa gátolja a sejtciklus-szabályozás és a növekedés MKN74 sejtek katalógusa

értékeli a változásokat a sejtek által indukált E. faecalis
fertőzés, megvizsgáltuk a befolyása a baktériumok a kifejezés a sejtciklus ellenőrző gének és a MKN74 sejtek növekedését. Gene készlet, amely tartalmaz a sejtciklus-szabályozás és checkpoint géneket alulszabályozott után 24 órával a fertőzés életképes baktériumok arra utal, jelentős lassulását sejtproliferáció hanem egy fokozott kockázatát mutációk új sejtek (6. ábra A). Ezzel szemben, ezen reakcióutak voltak akár szabályozott fertőzött sejtekben bakteriális lizátum arra utal, hogy ezek a sejtek még osztódó 24 óra után (6. ábra A). Mi a következő mért sejtburjánzást 5 napig, és megállapította, hogy az életképes baktériumok okozta MKN74 sejtburjánzást lassítani vagy megállítani teljesen (6. ábra B). Sejtproliferációiban is érintette, amikor inkubáltuk bakteriális lizátumból. 24 óra elteltével a lizátum kezelt sejteket még osztódó (amint is a 6a ábrán látható), és addig, amíg a 4. napon nem volt különbséget nem fertőzött sejtekben, és a sejtek fertőzött lizátumból. Azonban a 4. napon szignifikánsan kevesebb sejtek inkubáció után baktérium-lizátum, ha összehasonlítjuk a nem fertőzött kontroll sejtek. Az 5. napon a dózis-válasz közötti viszonyt lizátumot koncentráció és a sejtek növekedését figyeltük meg (6. ábra B), azt mutatja, hogy a fertőzések által E. faecalis
zavarják a sejtek növekedését. Hasonló eredményt észlelték humán limfocitákon, ahol három nap inkubálás E. faecalis katalógusa lizátum indukált sejtciklusmegállás [52]. Mivel ez a munka folyt egy elszigetelt rendszer, a csökkentett elterjedése fertőzött sejtek tudható, hogy hiányzik a növekedési faktor stimuláció válaszol immunsejtek. Katalógusa

Vita katalógusa

A mikrobiális kórokozók becslések okoz körülbelül 1,2 millió rákos esetet évente [5]. Humán vizsgálatok és számos állati modellben kimutatták, hogy a achlorhydria lehetővé teszi a bakteriális elszaporodását a gyomor, amely okozhat krónikus gyomor gyulladás, hogy alakul gyomorrák [20], [53], [54]. Támogató etiológiai szerepe más baktériumok a gyomor rosszindulatú, amelyek felszámolása tanulmányok H. pylori fertőzés katalógusa, amely lehetővé teszi a gyomor kolonizáció bélbaktériumok által [55], és az azt követő gyomorrák fejlesztés [56]. Ez arra utal, hogy a többi játékos, mint a H. pylori katalógusa is be lehet vonni a gyulladás hajtott gyomor rosszindulatú. A molekuláris eseményeket, amelyek krónikus gyomor fertőzés ezek a baktériumok a daganatsejteket érinti, és kárt okozhat ezekben a sejtekben már nehezen érthető. Katalógusa

Azt találtuk, hogy fertőzés E. faecalis
indukált intracelluláris ROS-termelés. Az oxidatív foszforiláció a mitokondriumok alacsony volt a fertőzés után, azt mutatja, hogy a ROS termelés elsősorban keletkezett egy oxphos független módon a fertőzött sejteket. Intracelluláris oxphos-független ROS lehet előállítani hámsejtek nem-fagocita NADPH (NOX) oxidázok válaszul például citokinstimuláció [57], és a fő nem-mitokondriális forrásai ROS [58]. Ezek NOX enzimek szállítási elektronok közötti plazmamembrán generál szuperoxid és más ROS [59]. Az emberi hámsejtek két NOX homologus (NOX2 és NOX5) találhatók [60]. Tanulmányunkban ezeket az enzimeket nem voltak transzkripcionálisan up-szabályozott, azonban nem lehet kizárni, hogy az emelkedett ROS szintek következménye volt egy aktivációs Ezen enzimek, bár ez a további vizsgálatot igényel.

• PLoS One: IL-26 Elősegíti a proliferáció és túlélés az emberi gyomorkarcinóma sejtek szabályozásával mérleg STAT1 és STAT3 Activation
• PLoS One: Nagy kifejezése hősokk fehérje 90 társul Tumor agresszivitás és rossz prognózissal előrehaladott gyomorrákban szenvedő betegek Cancer