PLOS ONE: Honokiol Induit calpaïne-Mediated Glucose-Regulated Protein-94 Clivage et Apoptose dans les cellules humaines du cancer gastrique et réduit la croissance tumorale

Résumé

Contexte

Honokiol, un petit poids moléculaire produit naturel, a été montré pour posséder des propriétés anti-néoplasiques et anti-angiogéniques. Ses mécanismes moléculaires et la capacité de l'anti-cancer gastrique restent inconnus. Il a été démontré que la fonction anti-apoptotique des protéines régulée par le glucose (PEB) prédit que leur induction dans des cellules néoplasiques peut conduire à la progression du cancer et de la résistance aux médicaments. Nous avons exploré les effets de honokiol sur la régulation des PEB et de l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques humaines et la croissance tumorale.

Traitement de

Méthodologie et principales conclusions de diverses cellules cancéreuses gastriques humaines avec honokiol a conduit à la induction de GRP94 clivage, mais n'a pas affecté GRP78. Silencing de GRP94 par petits ARN interférents (siRNA) pourrait induire l'apoptose des cellules. Le traitement des cellules avec des agents chimiothérapeutiques ou honokiol étoposide amélioré l'augmentation de l'apoptose et GRP94 dégradation. L'activité de la calpaïne et calpaïne-II (m-calpaïne) protéine (mais pas calpaïne-I (μ-calpaïne)) niveau pourraient également être augmentées par honokiol. GRP94 régulation à la baisse et de l'apoptose induite par honokiol dans les cellules cancéreuses gastriques peuvent être inversées par siRNA ciblant la calpaïne II et d'inhibiteurs de calpaïne. En outre, les résultats d'une coloration par immunofluorescence et immunoprécipitation ont révélé une interaction spécifique de la calpaïne avec GRP94-II dans des cellules après un traitement honokiol. Nous avons ensuite observé que la tumeur GRP94 surexpression et la croissance tumorale dans BALB /c des souris nues, qui ont été inoculées avec des cellules cancéreuses gastriques humaines MKN45, sont nettement diminuée par le traitement honokiol.

Conclusions et importance

Ces résultats fournissent la première preuve que l'honokiol induite calpaïne II induite par le clivage de la GRP94 gastrique provoque l'apoptose des cellules cancéreuses humaines. Nous suggérons en outre que honokiol peut être un agent thérapeutique possible d'améliorer les résultats cliniques du cancer gastrique

Citation:. Sheu ML, Liu SH, Lan KH (2007) Honokiol Induit calpaïne-Mediated Glucose-Regulated Protein-94 Clivage et les cellules cancéreuses gastriques apoptose dans Human et réduit la croissance tumorale. PLoS ONE 2 (10): E1096. doi: 10.1371 /journal.pone.0001096

Academic Editor: Hany El-Shemy, l'Université du Caire, Egypte

Reçu le 26 Juin 2007; Accepté 10 Octobre 2007; Publié le 31 Octobre, 2007

Droit d'auteur: © 2007 Sheu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par des subventions de recherche du Conseil national des sciences de Taiwan (NSC95-2320-B040-005). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est la deuxième cause la plus fréquente de décès par cancer dans le monde [1]. Près des deux tiers des cas surviennent dans les pays en développement et 42% en Chine à elle seule [1], [2]. Les cibles et les mécanismes moléculaires sous-jacents mauvais pronostic ne sont pas bien comprises. Le traitement du cancer gastrique localement avancé reste un défi majeur. Malgré les progrès récents dans le traitement, les résultats cliniques pour les patients atteints de cancer gastrique reste faible. En dehors de la chirurgie, le rôle de la thérapie adjuvante n'a pas été prouvée [2], [3]. Ainsi, la nécessité d'identifier des agents thérapeutiques et de chimioprévention nouveaux potentiels est évidente.

Honokiol, un composant actif isolé et purifié à partir de la Magnolia officinalis
, a démontré posséder les effets des anti-oxydation [4], contre la peroxydation lipidique [5] et anti-inflammatoire in vitro
et in vivo
[6], [7]. Honokiol a également été montré comme un inhibiteur de l'angiogenèse [8], disponible par voie systémique et non toxiques. Les études récentes ont indiqué que l'honokiol induit l'apoptose dépendante de la caspase dans des cellules lymphocytaires la leucémie chronique à cellules B et surmonte la résistance aux médicaments classiques dans le myélome multiple humain par induction de la caspase-dépendante et indépendante de l'apoptose [9], [10]. Bien qu'une évaluation complète du potentiel clinique des composés est pas encore possible, la pharmacocinétique de honokiol a été soigneusement étudié, révélant que honokiol est disponible sur le traitement du cancer clinique. D'autres produits naturels contenant une variété de composés thérapeutiques utiles pour prévenir le développement de tumeurs malignes continuent d'être découverts; cependant, on sait très peu sur leurs mécanismes sous-jacents de l'action ou de leur cible moléculaire.

protéine glucose-régulée (GRP) 94 est une glycoprotéine le plus abondant dans le réticulum endoplasmique (RE) et seulement être identifiés chez les vertébrés. Sur-expression anti-sens et ribozymes approches dans les systèmes de culture de tissus directement démontré que GRP78 et GRP94 pourraient protéger les cellules contre la mort [11] - [13]. La fonction protectrice des indices d'audience a également été observé dans la résistance aux radiations dans le cancer du col [14]. La fonction anti-apoptotique de la GRPs prévoit également que leur induction dans des cellules néoplasiques peut conduire à la progression du cancer et de la résistance aux médicaments [15] - [18]. des états pathologiques tels que la croissance de la tumeur maligne et ont été proposées pour mettre en corrélation avec la protéine GRP94 cytoprotecteur surexpression [19]. Dans le modèle métastatique des tumeurs malignes, une efficacité significative du gène de stratégie /immunothérapie à base de GRP94, a été montrée lorsqu'elle est combinée avec la radiothérapie [20]. L'ER joue un rôle direct dans l'activation d'un sous-ensemble de la caspase lors de l'activation de l'apoptose qui se produit pendant le stress ER [21]. D'autre part, les calpaïnes sont une famille de Ca ^{2 + -dépendantes des cystéine-protéases intracellulaires. Ubiquitaire protéases calpaïne-I (μ-calpaïne) et calpaïne-II (m-calpaïne) sont impliqués dans le développement de l'apoptose. Une étude récente a montré que calpaïnes ubiquitaires promouvoir caspase-12 et l'activation de JNK pendant ER stress induit par l'apoptose [22]. Il a également été indiqué que GRP94 avec Ca 2 + et les propriétés de liaison d'anti-apoptotiques est une cible protéolytique de la calpaïne pendant l'apoptose induite par l'étoposide [23]. En outre, dans plusieurs modèles expérimentaux d'apoptose, il a été démontré que l'unité d'inhibition de la calpaine amino-terminale de la calpastatine peut être clivée par des caspases, ce qui suggère le clivage est essentiel pour la régulation de l'activité de la calpaïne lors de la mort cellulaire [24] - [28] . Caspase-7, qui est recruté à l'ER dans les cellules stressées, peut également cliver et activer la caspase-12 [29] - [31]. Les effets de honokiol sur la signalisation et de l'apoptose liée à l'GRPs restent encore inconnus. Dans la présente étude, nous avons exploré les mécanismes moléculaires de honokiol sur gastrique apoptose des cellules cancéreuses humaines et la croissance tumorale in vitro
et in vivo
. De façon inattendue, nous avons découvert que GRP94 subit un clivage protéolytique spécifique de la calpaïne lors de l'apoptose induite par l'honokiol. Ces observations peuvent donner des preuves que honokiol est un agent thérapeutique possible d'améliorer les résultats cliniques du cancer gastrique.}

Les de

Résultats Cinétique de GRP94 clivage protéolytique dans des lignées cellulaires de cancer gastrique humains traités avec honokiol

tout d'abord examiné les effets de l'honokiol sur les expressions de GRP94 et GRP78 dans diverses lignées cellulaires de cancer gastrique humain. Honokiol diminue fortement les taux de GRP94 et d'une manière dose-dépendante du temps, mais les niveaux GRP78 ne sont pas affectés (fig. 1 et 2). Induite par la cinétique de l'honokiol, GRP94 clivage dans diverses cellules de cancer gastrique humain ont été représentés sur la Fig. 2. MKN45 ou SCM-1 cellules étaient plus résistantes aux réponses induites par honokiol-que les cellules AGS ou N87; les niveaux de GRP94 a été réduit à environ 50% pour deux fois plus de temps. Les niveaux de protéines GRP78 restent inchangées dans toutes les quatre lignées cellulaires de cancer gastrique. De plus, il y a peu d'expressions de la protéine GRP94 dans le tissu de l'épithélium gastrique de souris normales et des cellules endothéliales humaines par comparaison avec des cellules de cancer de l'estomac (Fig. 1c).

Honokiol induit GRP94 réponse apoptotique clivage associée

comme on le voit sur la Fig. 3, honokiol a augmenté la poly (ADP-ribose) polymérase (PARP) clivage et dommages à l'ADN gène inductible CHOP /GADD153 (une protéine a été identifiée à la médiation ER stress induit par apoptose) niveaux dans MKN45 cellules dans une dose et dépendant du temps manière. Honokiol 20 et 40 M a également déclenché l'expression de la caspase-12 clivée et caspase-7 (p20), que l'ampleur de l'augmentation est proportionnelle à la distribution (Fig. 3B). Par ailleurs, afin de comprendre si le clivage GRP94 a été impliqué dans l'apoptose gastrique des cellules cancéreuses humaines, l'apoptose a été détectée dans les cellules GRP94-ARNsi-transfectées. GRP94 silençage par l'ARNsi l'apoptose cellulaire induite (Fig. 4A) et une diminution de l'expression de la protéine GRP94 (Fig. 4B-a). Nous avons également comparé les effets de l'honokiol sur l'apoptose et la dégradation des GRP94 dans les cellules de cancer gastrique humain avec un agent d'étoposide chimiothérapeutiques. Les résultats ont montré que le traitement des cellules avec ou honokiol étoposide amélioré l'augmentation de l'apoptose (Fig. 4A) et la dégradation des GRP94 (Fig. 4B-b). Lorsque les cellules ont été traités simultanément avec 40 M étoposide et 20 M honokiol, une augmentation plus importante de la dégradation GRP94 qu'ils n'a été montré (figure 4B-b.); ces résultats impliquent que la combinaison de honokiol avec d'autres médicaments anticancéreux peut être une stratégie thérapeutique potentielle.

calpaïne est nécessaire pour honokiol médiée par l'apoptose des cellules

Nous avons ensuite déterminé si l'activité de la calpaïne (calcium thiol proteases dépendantes) seraient induites par honokiol dans quatre lignées cellulaires de cancer gastrique. Comme on le voit sur la Fig. 5A, honokiol 20 M augmentation de l'activité de la calpaïne d'une manière dépendant du temps, qui a commencé à augmenter à 15 min, et a culminé à 60 min, puis a chuté à un niveau inférieur à 4 h. Les cellules sont restées adhérentes au cours du temps, sans perte de viabilité (données non présentées). Fig. 5B, les résultats ont montré que l'augmentation de l'activité de la calpaïne, en réponse à l'honokiol (20 et 40 M) pendant 60 min dans quatre lignées cellulaires de cancer gastrique. En outre, les inhibiteurs de la calpaïne, la N-acétyl-leu-leu-norleucinal (ALLN), le N-acétyl-leu-leu-methioninal (ALLM), et Z-Leu-Leu-CHO, inhibe efficacement l'augmentation de l'activité de la calpaïne induite par honokiol en N87 et SCM-1 cellules (Fig. 5C).

Nous avons testé en outre si diminution de l'activité de la calpaïne pourrait compromettre la capacité de honokiol sur induction de l'apoptose. Comme on le voit sur la Fig. 6A, honokiol (40 M) induit l'apoptose des cellules dans le SCM-1 cellules, ce qui pourrait être renversée par les inhibiteurs de la calpaïne (de AllN ou ALLM). De plus, honokiol améliorée protéine calpaine-II, mais pas calpaïne I expressions de protéines dans SCM-1 cellules (Fig. 7A). En utilisant une approche d'ARNsi pour knockdown activité calpaïne II a conduit à une réduction significative de l'honokiol (20 M) induite par l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques humaines après 4 heures de traitement (Fig. 6B). ARNi-calpaïne-I n'a pas d'incidence sur l'apoptose induite par honokiol (Fig. 6B).

Localisation et de l'interaction de la calpaïne-II et GRP94 après traitement honokiol

L'étape suivante a consisté à élucider le rôle de la calpaïne-II dans la dégradation de GRP94 induite honokiol. Dans l'étude microscopique confocale laser, la localisation de la protéine calpaïne II a été déterminée par fluorescence verte, tandis que la localisation de GRP94 a été déterminée par fluorescence rouge. Comme on le voit sur la Fig. 7B, à la fois la calpaïne II et GRP94 ont été détectées dans le cytoplasme avec une co-localisation dans les cellules cancéreuses gastriques humaines. La fluorescence de la calpaïne II a été progressivement augmentée, mais la fluorescence de GRP94 a été progressivement diminuée dans les cellules cancéreuses gastriques humaines sous traitement honokiol. Pour confirmer davantage les résultats de la coloration immunocytochimique qui calpaïne II interagit avec GRP94, les tests de co-immunoprécipitation et transfert de Western dans des cellules de cancer de l'estomac ont été effectuées. Comme on le voit sur la Fig. 7C, la calpaïne II est spécifiquement associé à GRP94 dans diverses cellules cancéreuses gastriques en présence d'honokiol (20 et 40 M) par rapport au contrôle d'IgG. De plus, nous avons vérifié si les activités protéolytiques de caspase, protéasome ou cathepsine ont été impliqués dans le clivage de GRP94. Nos résultats ont montré que le traitement des cellules avec des inhibiteurs de caspase (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK et Z-DEVD-FMK, 50 M) à la dose élevée partiellement bloqué le clivage de GRP94 pendant l'apoptose induite par l'honokiol (Fig. 8A ) en comparaison avec un inhibiteur de la calpaïne ALLM 25 M, ce qui pourrait bloquer complètement GRP94 clivage. Le prétraitement des cellules avec l'inhibiteur de la cathepsine L inhibiteur inhibiteur de la cathepsine B CA-074-Me 25 et 50 M et de la cathepsine L II 25 et 50 M et protéasome inhibiteur MG132 0,1-10 M a été incapable de bloquer GRP94 clivage (Fig. 8B et 8C) . En outre, le clivage spécifique de GRP94 par la calpaïne a pu être observée en utilisant des lysats cellulaires préparés à partir de cellules de cancer gastrique humain (données non montrées).

Nous avons ensuite cherché à déterminer si l'activation de la calpaïne est nécessaire pour les cellules de l'apoptose induite par l'honokiol. Fig. 9, l'augmentation de l'expression calpaïne-II protéines et la dégradation des GRP94 et de la caspase-7 et de la caspase-12 activation induites par honokiol (40 M) ont été empêchés par des inhibiteurs de calpaïne pharmacologiques et transfection transitoire de siRNA-calpaïne-II dans le SCM-1 cellules.

honokiol atténue GRP94 tumorale surexpression et la croissance tumorale in

souris nues de la souris nude ont été inoculés avec 4 x 10 ^{6 cellules non différenciées adénocarcinomes MKN45 et traité avec de l'honokiol 0,5 et 1,5 mg /kg ou du véhicule lorsque la tumeur est devenue évidente. analyse par transfert de Western et immunohistochimique a montré que GRP94 surexpression et accumulé dans la région de la tumeur, mais pas dans le tissu gastrique (fig. 10A et 10A-a-b) normale. Honokiol diminue nettement l'accumulation de GRP94 dans les tumeurs par comparaison avec le contrôle du véhicule (fig. 10A et 10A-a-b). L'expression de la GRP78 n'a pas été affectée (données non représentées). Pour déterminer si l'honokiol peut supprimer la croissance tumorale
in vivo, les tumeurs solides ont été établies chez la souris et l'effet anti-tumoral de façon répétée honokiol injecté a été étudiée. Comme on le voit sur la Fig. 10B, l'administration de honokiol 0,5 et 1,5 mg /kg a montré une activité anti-tumorale significative.}

Discussion

Nous avons signalé ici pour la première fois que la calpaïne, un Ca nonlysosomal ^{2 + cystéine protéase -activated, en particulier calpaïne II, joue un rôle clé dans le clivage de la GRP94, mais GRP78 n'a pas été affectée, et dans la régulation de l'apoptose induite par l'honokiol dans les cellules cancéreuses gastriques humaines. En particulier, nous avons fourni des preuves fonctionnelles que le clivage de GRP94 sur des actes de traitement honokiol comme un bénéfice thérapeutique, l'inhibition de la croissance tumorale dans le modèle murin de carcinome gastrique humain. A notre connaissance, ce rapport est le premier à montrer que honokiol peut manipuler calpaïne-inductible protéine chaperonne dégradation des GRP94 être la cible lors de l'apoptose.}

Études de plusieurs laboratoires ont souligné l'ER comme un compartiment cible par des agents thérapeutiques impliqués dans l'exécution de l'apoptose. Cytosolique Ca ^{2 + a été impliqué comme un second messager de proapoptosis impliqué dans l'apoptose à la fois le déclenchement et caspases ou des calpaïnes de régulation [32] - [34]. Une étude récente a montré que la calpaïne est un médiateur important de resvératrol (un polyphénol végétal naturel) l'apoptose induite par le cancer du sein [35]. Ils ont trouvé que le resvératrol peut provoquer une augmentation de concentration intracellulaire de Ca 2+, et active l'apoptose médiée par la calpaïne, ce qui conduit à la dégradation de la membrane plasmatique de Ca 2 + -ATPase isoforme 1 et fodrine dans la caspase-3 déficient MCF- 7 cellules. Honokiol a également été signalé à induire Ca 2+ mobilisation neurones corticaux de rat et neuroblastome humain SH-SY5Y, probablement par l'activation de la phospholipase C et IP _{3 récepteurs [36]. Dans la présente étude, nous avons constaté que l'honokiol est capable d'augmenter l'activité de la calpaïne et l'expression des protéines calpaïne II, mais pas calpaïne I pendant gastrique apoptose de cellules cancéreuses induite par honokiol. De plus, les inhibiteurs de la calpaïne et le silençage de calpaïne-II par siRNA inversés de manière significative l'apoptose induite honokiol. Ces résultats impliquent que Ca 2 + -triggered activation calpaïne-II peut jouer un rôle potentiel dans l'apoptose induite par honokiol.}}

GRP94 /gp96 est le membre de résident ER de la famille HSP90. GRP94 joue un rôle important dans le maintien de l'homéostasie cellulaire. Ce concept classique de GRP94 comme chaperon de repliement des protéines est mis à jour par les découvertes qui GRPS favoriser la prolifération de la tumeur, les métastases, la résistance aux médicaments, et l'immunothérapie, qui ont d'importantes implications cliniques dans le pronostic et le traitement du cancer [3]. GRP94 a été démontré être associé à tumorigène dans des lignées de cellules cancéreuses, des modèles de rongeur et des biopsies de tumeurs cancéreuses humaines [37] - [39]. Ceci est cohérent avec les résultats que l'induction de GRPs provoque une fonction de protection que les réponses de survie à la privation de nutriments, l'acidose, et les conditions d'hypoxie, qui sont communs dans les tumeurs solides vascularisées mal [11], [40]. Il a été également apparu que la plupart des indices d'audience dans les cellules tumorales est engagé dans les complexes multi-chaperon, alors qu'il se trouve pas dans les cellules normales [41]. La vaccination des souris avec des protéines de stress dérivées de tumeurs, GRP94, peut induire des réponses immunitaires antitumorales, ce qui donne une suppression marquée de la croissance tumorale et les métastases. L'activité des inhibiteurs de Hsp90 a bien été validée dans des modèles de cancer du sein pré-cliniques, à la fois dans les études en monothérapie et en combinaison avec la chimiothérapie conventionnelle [41]. En outre, il a été suggéré que GRP94 est un substrat physiologique de la calpaïne [23]. Calpaïne a été démontrée pour être activé sur la membrane ER, où elle interagit avec GRP94, ce qui entraîne son clivage protéolytique spécifique que les cellules subissent une apoptose provoquée par l'étoposide [23]. Dans l'étude actuelle, nous avons constaté que induit honokiol-GRP94 clivage et l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques humaines peuvent être complètement inversés par calpaïne inhibiteurs et silencieux de la calpaïne-II par siRNA. les inhibiteurs de caspases à haute dose inversé partiellement le GRP94 clivage induit par honokiol. Le prétraitement des cellules avec le cathepsine B et les inhibiteurs de L et inhibiteur du protéasome a été incapable de bloquer induite honokiol-GRP94 clivage. Nous avons également démontré que l'inhibition de la GRP94 par l'ARNsi peut induire l'apoptose des cellules gastriques du cancer. En outre, les résultats de la coloration immunocytochimique et d'immunoprécipitation ont montré une interaction spécifique avec des GRP94 calpaïne II dans des cellules de cancer gastrique après un traitement honokiol. Le clivage spécifique de la calpaïne par GRP94 peut également être observée en utilisant des lysats cellulaires préparés à partir de cellules de cancer gastrique humain. Ces découvertes, par conséquent, donnent à penser que la calpaïne II induite par le clivage de la GRP94 joue un rôle important dans l'estomac de l'apoptose des cellules cancéreuses de l'honokiol déclenché.

calpaïnes et les caspases sont deux familles de protéases à cystéine qu'ils sont impliqués dans la régulation cellulaire pathologique la mort [22], [31]. Ces protéases partagent plusieurs substrats liés à la mort, y compris les caspases eux-mêmes, les protéines du cytosquelette, Bax et Bid [42]. Calpaïne à médiation par le produit de protéolyse d'une manière limitée, mais ne nécessite pas un résidu d'acide aminé spécifique comme celle des caspases. Bien que les deux calpaïne et caspase ont été proposées pour jouer un rôle important dans la régulation de la mort cellulaire pathologique, les interactions de ces deux familles de protéases dans des conditions pathologiques ne sont pas claires. Dans la présente étude, knockdown et inhibiteurs pharmacologiques approches ont contribué de manière significative à notre connaissance de la calpaïne biologie, notamment en ce qui concerne sa fonction spécifique sur l'apoptose cellulaire, ce qui est possible que caspases 7 et 12 sont en aval de la calpaïne dans la médiation de cancer gastrique induite honokiol- l'apoptose des cellules.

médicaments de produits naturels ont été proposées à jouer un rôle dominant dans les soins pharmaceutiques [43]. Les produits naturels sont l'une des sources importantes de chimiothérapie du cancer potentiel et agents de chimioprévention [43]. Honokiol a été largement utilisé dans la médecine traditionnelle chinoise et japonaise depuis plusieurs milliers d'années, principalement, pour le traitement des effets anti-thrombocytaires, anti-bactérien, anti-inflammatoires, et anxiolytiques. Des rapports antérieurs ont démontré que l'honokiol est également possédant des propriétés antinéoplasiques et anti-angiogéniques [6], [19], [38]. Cependant, le mécanisme moléculaire précis de l'activité anti-tumorale présentée par l'honokiol est mal comprise. Ainsi, les résultats de cette étude fournissent des preuves pour l'activité anti-tumorale de l'honokiol dans le cancer gastrique, et plus important encore, la base moléculaire de son effet. Nous avons constaté que l'honokiol induit l'activation de la calpaïne, GRP94 clivage, et l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques humaines. En outre, après l'administration de honokiol dans un joli nu implanté avec des cellules tumorales gastriques MKN45 ont montré une activité anti-tumorale significative. Cette étude préclinique peut servir de cadre et représente une nouvelle approche ciblée prometteuse. En outre, les composés naturels ont été montrés pour se combiner avec des agents cytotoxiques classiques peuvent être clinique bénéfique avec des médicaments anticancéreux. Cet avantage, plus les preuves émergentes de ses mécanismes anti-tumoraux font honokiol l'application clinique en cours pour être un agent efficace et sécuritaire anti-tumorale.

Matériel et méthodes

Cellules, conditions de culture et réactifs

lignées de cellules humaines, y compris les lignes caucasiennes gastriques de cellules cancéreuses (les AGS, une lignée cellulaire modérément mal différencié adénocarcinome, et N87, une lignée de cellules de carcinome bien différencié) et les lignes asiatiques de cellules cancéreuses gastriques (MKN45 et SCM-1, le les cellules d'adénocarcinome indifférenciées) ont été obtenus à partir de la banque de cellules dans le centre du cancer de Taipei vétérans hôpital général (Taiwan). Les cellules ont été maintenues dans un milieu RPMI 1640 contenant 10% inactivé par la chaleur FCS (Life Technologies) et de la streptomycine /pénicilline (Life Technologies) dans un humidifié à 5% de CO _{2 atmosphère. Honokiol a été obtenu à partir de Wako Chemical Company (Japon), et sa pureté a été déterminée à un minimum de 99% par chromatographie en phase liquide à haute performance.}

lysats de cellules entières
Western Blot et analyse immunoprécipitations ont été préparées comme décrit précédemment [44]. Les protéines ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS précoulé 8-20%, puis transférées par électrophorèse sur du gel sur des membranes de difluorure de polyvinylidène. Après le blocage, buvards ont été mis en incubation avec l'anti-GRP94, anti-GRP78, anti-caspase 12, anti-caspase 7, anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), anti-calpaïne I (μ-calpaïne), anti calpaïne II (m-calpaïne) (Santa Cruz Biotechnology), et anti-β actine (Sigma) à des anticorps dans du PBS à 0,1% de Tween 20 pendant 1 h, suivie par trois lavages de 10 min dans du PBS à 0,1% de Tween 20. La Les membranes ont ensuite été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort pendant 60 min. Dans immunoprécipitation des protéines (500 g) ont été incubées avec des anticorps spécifiques et immobilisées sur des billes de protéine A-Sépharose. Les billes ont été lavées abondamment avec le tampon immunoprecipitative Bacco, bouillies et microcentrifuges. Entrée 10% du lysat cellulaire pour IP et 50 g de protéines ont été analysées par Western Blot. La détection a été réalisée avec un réactif Western blot ECL (Amersham), et la chimioluminescence a été exposé par les films Kodak X-Omat.

Essais d'activité calpaïne

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC est un substrat de protéase calpaine. La quantification de l'acide 7-amino-4-méthylcoumarine (AMC), une fluorescence permet la surveillance de l'hydrolyse enzymatique du conjugué peptide-AMC et peut être utilisé pour mesurer l'activité enzymatique. Les cellules ont été préparées et traitées sur 24 puits des plaques Corning /Costar. Avant l'addition des cellules inhibiteurs ont été chargés avec 40 M Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) et traité avec de l'honokiol pour la synchronisation indiquée à 37 ° C dans un humidifiée de 5% de CO _{2 incubateur. Protéolyse de la sonde fluorescente a été surveillée en utilisant un système de lecture de plaque fluorescente (HTS 7000 Plus Series BioAssay, Perkin Elmer) avec les paramètres de filtre de 360 ​​± 20 nm pour l'excitation et 460 ± 20 nm pour l'émission.}

ARNi et transfection les essais

ARNsi duplex spécifiques pour l'inhibition de la calpaïne I (μ-calpaïne) et la calpaïne II (m-calpaïne) expressions dans les cellules humaines ont été obtenues auprès de Santa Cruz Biotechnology: calpaïne I, n ° de catalogue . sc-29885, un pool de spécifique cible 20-25 nt siRNA 3; calpaïne-II, no de catalogue. sc-41459, un spécifique à la cible 20-25 nt siRNA. Les siRNA de contrôle (catalogue no. Sc-37007) est un non-ciblage 20-25 nt siRNA conçu comme un contrôle négatif. En outre, l'ARNsi duplex spécifiques pour l'inhibition de l'expression GRP94 a été synthétisé commercialement par MWG Biotech (Allemagne). Le sens (haut) et antisens (bas) des séquences du duplex siARN GRP94 étaient les suivantes: 5'-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 '; 3 'TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5'. En tant que témoin non spécifique, un duplex CN ARNsi avec des séquences aléatoires ont été conçues comme suit: 5'-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 '; 3 'TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5'. Les ARNsi ont été utilisés à une concentration de 100 à 200 nm pour la transfection transitoire de cellules avec la lipofectine (Invitrogen) par puits dans une plaque à 6 puits avec du milieu frais. Au bout de 24 h à partir de la transfection initiale et de 24 à 36 h de traitement, les cellules ou les lysats cellulaires ont été recueillis et analysés pour déterminer l'apoptose ou l'expression de la protéine, respectivement.

immunofluorescence et microscopie confocale à balayage laser de

Les cellules ont été mises lavé deux fois avec du PBS, fixées dans 4% de paraformaldehyde pendant 30 min, puis bloquées par incubation dans 1% d'albumine de sérum bovin dans du PBS. Les anticorps primaires comme indiqué ont été appliquées sur les lames à une dilution de 1:500 et incubée à 4 ° C pendant la nuit. Les échantillons ont été traités avec des anticorps secondaires conjugués au FITC ou TRITC conjugués (Sigma). Les cellules marquées au FITC ou TRITC marquées ont ensuite été analysées par microscopie à fluorescence. Pour la microscopie laser à balayage, les cellules marquées par immunofluorescence ont été analysés au moyen d'un inversé microscope à balayage laser (Zeiss LSM 410 Invert, Allemagne), équipé à la fois d'ions d'argon (488 nm) et HeNe (543 nm) des lasers. Co-localisation de deux antigènes marqués a été détecté comme une seule image lorsque les images des deux canaux ont été superposées. Les images confocales ont été background-soustraites et fusionnés à l'aide du logiciel adjoint confocale, et traitées avec le logiciel Adobe Photoshop.

Annexin-V FITC et PI Double Coloration

L'annexine V /iodure de propidium (BD Clontech) a été utilisé pour quantifier le nombre de cellules apoptotiques comme décrit précédemment [44]. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et colorées avec l'annexine V et PI pendant 20 min à température ambiante. Le niveau d'apoptose a été déterminée en mesurant la fluorescence des cellules par cytométrie de flux (Becton Dickinson). l'acquisition et l'analyse des données ont été effectuées par le programme CellQuest (Becton Dickinson).

Animaux

Les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices émises par le Comité des expériences animales, Université nationale Chung Hsing, Taichung, Taiwan. BALB /c souris nude Homme ( nu /nu
) ont été achetés chez NLAC Taiwan, Inc., Taipei, Taiwan. Les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes spécifiques, muni d'aliments stérilisés et l'eau ad libitum, et hébergés dans un centre de barrière à 12 h cycles lumière /obscurité. Les procédures expérimentales ont été effectuées sur des souris 6 semaines d'âge. Les animaux ont été euthanasiés quand ils sont apparus moribonds.

croissance tumorale Assay

Cellule tumorigénicité a été examiné en souris BALB /c nu 6 semaines, âgé de sexe masculin. Brièvement, 4 x 10 ^{6 cellules (MKN45) dans une phase de croissance exponentielle ont été mis en suspension dans 1 ml de milieu de culture contenant du sérum bovin fœtal à 10%. Une suspension monocellulaire de MKN45 voie sous-cutanée a été inoculé dans la face dorsale des souris. Les tumeurs ont été établies pendant 14 jours après l'inoculation des cellules MKN45 et suivies par un traitement avec le véhicule, 0,5 et 1,5 mg /kg honokiol chaque jour pendant 10 jours (7 souris /groupe). Le volume de la tumeur implantée dans la face dorsale de la souris a été mesurée deux fois par semaine avec un étrier, en utilisant la formule V
= ( LW
2) pi /6: où V
, volume (mm 3); L
, le plus grand diamètre (mm); W
, le plus petit diamètre (mm).}

immunohistochimie

L'expression de GRP94 chez la souris tumeur solide a été examiné par immunohistochimie. sections tumorales mince (5 um) ont été préparées, fixées à l'acétone froide, bloqué avec 3% de la peroxydase d'hydrogène, et colorées avec des anticorps GRP94 primaire.

Analyses statistiques

Les valeurs données dans cette étude sont présentés sous forme de moyenne ± SEM. Toutes les analyses ont été réalisées par analyse de variance suivie par un test de différence significative de Fisher. P
valeur inférieure à 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

• PLOS ONE: galectine-3 Facilite motilité cellulaire dans le cancer gastrique par Up régulation Protease-Activated Receptor-1 (PAR-1) et Matrix métalloprotéinase-1 (MMP-1)
• PLOS ONE: High Mannose-Binding Antiviral lectine PFL de Pseudomonas fluorescens Pf0-1 Favorise la mort cellulaire des cellules du cancer gastrique MKN28 via Interaction avec-Integrin