PLOS ONE: Honokiol inducerar kalpain-medierad Glukos reglerade protein-94 klyvning och apoptos i mänskliga Gastric cancerceller och minskar tumör Growth

Abstrakt

Bakgrund

Honokiol, en liten molekylvikt naturlig produkten, har visat sig besitta potenta anti-neoplastiska och anti-angiogena egenskaper. Dess molekylära mekanismer och förmågan hos anti-magcancer fortfarande okända. Det har visats att anti-apoptotiska funktionen av glukosreglerade proteiner (GRPS) förutspår att deras induktion i neoplastiska celler kan leda till cancer progression och läkemedelsresistens. Vi utforskade effekterna av honokiol om regleringen av GRP och apoptos i humana gastric cancerceller och tumörtillväxt.

Metodik och viktigaste resultaten

Behandling av olika humana gastriska cancerceller med honokiol ledde till induktion av GRP94 klyvning, men påverkade inte GRP78. Tysta GRP94 av små störande RNA (siRNA) kan inducera cell apoptos. Behandling av celler med honokiol eller kemoterapeutika agent etoposid förbättrade ökningen av apoptos och GRP94 nedbrytning. Den calpain aktivitet och kalpain-II (m-kalpain) protein (men inte calpain-I (μ-kalpain)) nivå skulle också kunna ökas genom honokiol. Honokiol-inducerad GRP94 nedreglering och apoptos i gastric cancerceller kan reverseras genom siRNA inriktning kalpain-II och kalpainhämmare. Dessutom visade resultaten av immunofluorescens färgning och immunfällning en specifik interaktion mellan GRP94 med kalpain-II i celler efter honokiol behandling. Vi observerade nästa att tumören GRP94 överuttryck och tumörtillväxt i BALB /c nakna möss, som ympades med humana gastric cancerceller MKN45, markant minskat med honokiol behandling.

Slutsatser och betydelse

Dessa resultat ger det första beviset att honokiol-inducerad kalpain-II-medierad GRP94 klyvning orsakar human magcancer cell apoptos. Vi föreslår vidare att honokiol kan vara en möjlig terapeutiskt medel för att förbättra det kliniska resultatet av magcancer

Citation. Sheu ML, Liu SH, Lan KH (2007) Honokiol inducerar kalpain-medierad Glukos reglerade protein-94 Cleavage och apoptos i Human Gastric cancerceller och minskar tumörtillväxt. PLoS ONE 2 (10): E1096. doi: 10.1371 /journal.pone.0001096

Academic Redaktör: Hany El-Shemy, Kairo-universitetet, Egypten

Mottagna: 26 juni, 2007; Accepteras: 10 oktober, 2007; Publicerad: 31 oktober, 2007

Copyright: © 2007 Sheu et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av forskningsanslag från National Science råd Taiwan (NSC95-2320-B040-005). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer är den näst vanligaste dödsorsaken i cancer i världen [1]. Nästan två tredjedelar av de fallen inträffar i utvecklingsländerna och 42% enbart i Kina [1], [2]. De molekylära mål och mekanismer som ligger bakom dålig prognos är inte väl förstått. Behandling av lokalt avancerad magsäckscancer är fortfarande en stor utmaning. Trots den senaste tidens framsteg inom behandling, det kliniska utfallet för gastric cancerpatienter förblir dålig. Bortsett från kirurgi, förblir obevisat rollen av adjuvant terapi [2], [3]. Därmed behovet att identifiera potentiella nya terapeutiska och kemopreventiva medel är uppenbar.

Honokiol, en aktiv komponent isoleras och renas från Magnolia officin
, har visat sig besitta effekterna av anti-oxidation [4], mot lipidperoxidering [5] och anti-inflammatorisk in vitro Mössor och in vivo
[6], [7]. Honokiol har också visat sig vara ett systemiskt tillgängliga och icke-toxisk hämmare av angiogenes [8]. De senaste studierna rapporterade att honokiol framkallar kaspas-beroende apoptos i kronisk lymfatisk leukemi celler och övervinner konventionell läkemedelsresistens i human multipel myelom genom induktion av kaspas-beroende och -oberoende apoptos [9], [10]. Även om en fullständig bedömning av den kliniska potentialen av föreningarna är ännu inte möjligt, farmakokinetik honokiol har undersökts grundligt, avslöjar att honokiol finns tillgänglig på klinisk cancerterapi. Fler naturprodukter som innehåller en mängd olika terapeutiska föreningar som är användbara för att förhindra utvecklingen av maligniteter fortsätta att upptäckas; dock mycket lite är känt om deras underliggande verkningsmekanismer eller deras molekylära mål.

Glukos reglerade protein (GRP) 94 är en vanligast förekommande glykoprotein i endoplasmatiskt retikulum (ER) och endast identifieras i ryggradsdjur. Överuttryck antisense och ribozym metoder i vävnader kultursystem direkt visat att GRP78 och GRP94 kunde skydda cellerna mot död [11] - [13]. Den skyddande funktion GRP har också observerats i motståndskraft mot strålning i livmoderhalscancer [14]. Den anti-apoptotiska funktionen för den GRP förutspår också att deras induktion i neoplastiska celler kan leda till cancer progression och läkemedelsresistens [15] - [18]. Patologiska tillstånd såsom tumörtillväxt och malignitet har föreslagits för att korrelera med cellskyddande protein GRP94 överuttryck [19]. I metastaserande maligniteter modellen har en signifikant effekt av GRP94 baserade gen /immun strategi visas när den kombinerades med strålbehandling [20]. ER spelar en direkt roll i aktivering av en undergrupp av kaspas under aktivering av apoptos som inträffar under ER påfrestning [21]. Å andra sidan, calpains är en familj av Ca ^{2 + -beroende intracellulära cysteinproteaser. Ubiquitously uttryckt kalpain-I (μ-kalpain) och calpain-II (m-kalpain) proteaser är inblandade i utvecklingen av apoptos. En färsk studie har visat att ubiquitous calpains främja kaspas-12 och JNK-aktivering under ER stressinducerad apoptos [22]. Det har också påpekats att GRP94 med Ca 2 + -bindande och anti-apoptotiska egenskaper är ett proteolytiskt mål av kalpain under etoposid apoptos [23]. Dessutom i flera experimentella modeller av apoptos, har det visats att den aminoterminala kalpain inhiberande enhet av calpastatin kan klyvas av kaspaser, vilket tyder på klyvning är viktig för regleringen av kalpain aktivitet under celldöd [24] - [28] . Kaspas-7, som rekryteras till akuten i stressade celler, kan också klyva och aktivera kaspas-12 [29] - [31]. Effekterna av honokiol på GRP relaterade signalering och apoptos fortfarande okänd. I den aktuella studien undersökte vi de molekylära mekanismerna för honokiol på människors magcancer cell apoptos och tumörtillväxt In vitro Mössor och In vivo
. Oväntat fann vi att GRP94 genomgår specifik proteolytisk klyvning av kalpain under honokiol apoptos. Dessa observationer kan ge bevis som honokiol är en möjlig terapeutiskt medel för att förbättra det kliniska resultatet av magcancer.}

Resultat

Kinetics of GRP94 proteolytisk klyvning i mänskliga gastric linjer cancercell behandlats med honokiol

Vi undersökte först effekterna av honokiol på uttryck för GRP94 och GRP78 i olika humana magcancer-cellinjer. Honokiol minskar markant nivåerna av GRP94 på ett dos- och tidsberoende sätt, men GRP78 nivåer påverkas inte (fig. 1 och 2). Kinetiken för honokiol-inducerad GRP94 klyvning i olika humana gastriska cancerceller visades i Fig. 2. MKN45 eller SCM-1-celler var mer resistenta mot honokiol-inducerade svar än AGS eller N87 celler; nivåerna av GRP94 reducerades till ca 50% för dubbelt så mycket tid. Nivåerna av GRP78 proteiner förblir oförändrade i alla fyra gastric cancercellinjer. Dessutom finns det lite GRP94 proteinuttryck i normal mus gastric epitel vävnad och humana endotelceller jämfört med gastriska cancerceller (Fig. 1C).

Honokiol inducerar GRP94 klyvning associerade apoptotisk respons

såsom visas i fig. 3, ökade honokiol poly (ADP-ribos) polymeras (PARP) klyvning och DNA-skada inducerbar gen CHOP /GADD153 (ett protein har identifierats att mediera ER stressinducerad apoptos) nivåer i MKN45-celler på ett dos- och tidsberoende sätt. Honokiol 20 och 40 M utlöste också uttryck för klyvs caspase-12 och kaspas-7 (p20), som omfattningen av ökningen var proportionellt till tidpunkten (Fig. 3B). Dessutom, för att förstå om GRP94 klyvning var inblandad i human magcancer cell apoptos, var apoptos detekterades i GRP94-siRNA-transfekterade celler. Tysta GRP94 genom siRNA inducerad cell apoptos (Fig. 4A) och minskade GRP94 proteinuttryck (Fig. 4B-a). Vi jämförde också effekterna av honokiol på apoptos och GRP94 nedbrytning i mänskliga gastric cancerceller med kemoterapi agent etoposid. Resultaten visade att behandling av celler med honokiol eller etoposid förstärkt ökningen av apoptos (Fig. 4A) och GRP94 nedbrytning (fig. 4B-b). När cellerna samtidigt behandlades med 40 M etoposid och 20 M honokiol, en större ökning av GRP94 nedbrytning än de gjorde visades (Fig 4B-b.); Dessa resultat antyder att kombinationen av honokiol med andra läkemedel mot cancer kan vara en potentiell terapeutisk strategi.

kalpain krävs för honokiol medierad cell apoptos

Vi nästa avgöras huruvida aktiviteten av kalpain (kalcium -beroende tiolproteaser) skulle framkallas av honokiol i fyra gastric cancercellinjer. Såsom visas i fig. 5A, ökad honokiol 20 M calpain aktivitet i ett tidsberoende sätt, som började öka i 15 minuter, och nådde en topp på 60 minuter, och sedan sjönk ner till en lägre nivå på fyra timmar. Celler förblev vidhäftande över tidsförloppet, utan förlust av viabilitet (data ej visade). I Fig. 5B, visade resultaten att ökningen av calpain aktivitet som svar på honokiol (20 och 40 M) under 60 minuter i fyra gastric cancercellinjer. Vidare kalpainhämmare, N-acetyl-leu-leu-norleucinal (AllN), N-acetyl-leu-leu-methioninal (ALLM), och Z-Leu-Leu-CHO, effektivt hämmas ökningen av kalpain-aktivitet inducerad av honokiol i N87 och SCM-1-celler (Fig. 5C).

Vi testade vidare om minskad calpain aktivitet skulle kunna äventyra möjligheten för honokiol på apoptos induktion. Såsom visas i fig. 6A, honokiol (40 M) inducerad cell apoptos i SCM-1-cell, som skulle kunna reverseras genom kalpainhämmare (AllN eller ALLM). Dessutom honokiol förbättrade kalpain-II-protein men inte calpain-I-protein uttryck i SCM-1-celler (Fig. 7A). Med hjälp av en siRNA strategi för knockdown kalpain-II-aktivitet lett till en betydande minskning av honokiol (20 M) -inducerad apoptos i humana gastriska cancerceller efter 4 h behandling (Fig. 6B). SiRNA-kalpain-I påverkade inte honokiol apoptos (Fig. 6B).

Lokalisering och interaktion av kalpain-II och GRP94 efter honokiol behandling

Nästa steg var att belysa den roll av kalpain-II i honokiol-inducerad GRP94 nedbrytning. I laser konfokal mikroskopisk studie lokaliseringen av kalpain-II-protein bestäms av grön fluorescens, medan lokaliseringen av GRP94 bestämdes genom röd fluorescens. Såsom visas i fig. 7B, både kalpain-II och GRP94 detekterades i cytoplasman med samlokalisering i humana gastriska cancerceller. Fluorescensen av kalpain-II ökades gradvis, men fluorescens GRP94 gradvis minskat i humana gastriska cancerceller i honokiol behandling. För att ytterligare bekräfta resultaten från immunocytokemisk färgning att kalpain-II interagerar med GRP94 gjordes testerna samarbets immunprecipitation och Western blotting i gastric cancerceller utförs. Såsom visas i fig. 7C, kalpain-II var specifikt associerad med GRP94 i olika gastriska cancerceller i närvaro av honokiol (20 och 40 M) jämfört med IgG-kontroll. Dessutom testade vi om de proteolytiska aktiviteter kaspas, proteasom eller cathepsin var inblandade i klyvningen av GRP94. Våra resultat visar att behandling av celler med caspase-hämmare (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK och Z-DEVD-FMK, 50 M) vid hög dos delvis blockerade klyvning av GRP94 under honokiol apoptos (Fig. 8A ) jämfört med kalpainhämmare ALLM 25 M, som helt kan blockera GRP94 klyvning. Förbehandling av celler med cathepsin B-hämmare CA-074-Me 25 och 50 M och katepsin L-hämmare cathepsin L inhibitor II 25 och 50 M och proteasomhämmaren MG132 0,1-10 M kunde inte blockera GRP94 klyvning (Fig. 8B och 8C) . Vidare kunde observeras den specifika klyvningen av GRP94 av kalpain användning av cellysat framställda från humana magcancer-celler (data visas ej).

undersökte vi nästa huruvida kalpain aktivering krävs för honokiol-inducerad cell apoptos. I Fig. 9, ökningen av kalpain-II proteinuttryck och GRP94 nedbrytning och kaspas-7 och kaspas-12 aktivering induceras av honokiol (40 M) förhindrades av farmakologiska kalpainhämmare och övergående transfektion av siRNA-kalpain-II i SCM-1-celler.

honokiol dämpar tumör GRP94 överuttryck och tumörtillväxt i nakna möss

nakna möss inokulerades med 4 x 10 ^{6 odifferentierade adenokarcinomceller MKN45 och behandlades med honokiol 0,5 och 1,5 mg /kg eller fordonet när tumören blev uppenbar. Immunhistologisk och Western blotting-analys visade att GRP94 överuttryck och ackumuleras i tumörområdet, men inte i normal gastrisk vävnad (fig. 10A-a och 10A-b). Honokiol minskade markant ansamling av GRP94 i tumörer jämfört med vehikelkontroll (fig. 10A-a och 10A-b). Expressionen av GRP78 påverkades inte (data visas ej). För att avgöra om honokiol kunde undertrycka tumörtillväxt In vivo
var solida tumörer etablerade i möss och anti-tumöreffekten av upprepade tillfällen injiceras honokiol studerades. Såsom visas i fig. 10B, förvaltning av honokiol 0,5 och 1,5 mg /kg uppvisade en signifikant antitumöraktivitet.}

Diskussion

Vi rapporterade här för första gången som kalpain, en icke-lysosomala Ca ^{2 + -activated cystein proteas, speciellt kalpain-II, spelar en nyckelroll i klyvning av GRP94, men GRP78 påverkas inte, och i regleringen av apoptos inducerad av honokiol i humana gastriska cancerceller. I synnerhet, förutsatt att vi funktionella bevis att klyvningen av GRP94 på honokiol behandling fungerar som en terapeutisk fördel, hämma tumörtillväxt i musmodell av human magsäckscancer. Såvitt vi vet är detta den första rapporten som visar att honokiol kan manipulera calpain-inducerbara chaperon protein GRP94 nedbrytning är målet under apoptos.}

Studier från flera laboratorier pekade på ER som mål facket genom terapeutiska medel inblandade i utförandet apoptos. Cytosoliska Ca ^{2 + har varit inblandad som en andra budbärare av proapoptosis involverad i både utlösa apoptos och reglerar kaspaser eller calpains [32] - [34]. En färsk studie har visat att kalpain är en viktig förmedlare av resveratrol (en naturlig växt polyfenoler) -inducerad apoptos i bröstcancer [35]. De fann att resveratrol kan orsaka en ökning av intracellulär Ca 2 +, och aktiverar calpain-medierad apoptos, vilket leder till nedbrytning av plasmamembranet Ca 2 + -ATPas isoform 1 och fodrin i kaspas-3 bristfällig MCF- 7-celler. Honokiol har också rapporterats inducera Ca 2 + mobilisering i råtta kortikala neuroner och humana neuroblastom SH-SY5Y-celler, förmodligen genom aktivering av fosfolipas C och IP _{3-receptorer [36]. I den aktuella studien fann vi att honokiol kan öka calpain aktivitet och kalpain-II-proteinuttryck men inte calpain-I under honokiol-inducerad magsäckscancer cell apoptos. Dessutom kalpainhämmare och tysta kalpain-II av siRNA vände honokiol apoptos signifikant. Dessa fynd tyder på att Ca 2 + -triggered kalpain II aktivering kan spela en potentiell roll i honokiol apoptos.}}

GRP94 /gp96 är ER bosatt medlem av HSP90 familjen. GRP94 spelar en viktig roll för att upprätthålla cellulär homeostas. Denna konventionella begreppet GRP94 som proteinveckning förkläde uppdateras av upptäckterna som GPRS främja tumörspridning, metastas, läkemedelsresistens, och immunterapi, som har stora kliniska implikationer i prognos och behandling av cancer [3]. GRP94 har visat sig vara associerade med tumörbildning i cancercellinjer, rodent tumörmodeller och humana cancer biopsier [37] - [39]. Detta överensstämmer med resultaten som induktion av GRP orsakar en skyddande funktion som överlevnads svar på näringsämnen svält, acidos, och hypoxi förhållanden, som är vanliga i dåligt vaskulariserade fasta tumörer [11], [40]. Det har också framgått att de flesta av de GRP i tumörceller med multieskorte komplex, även om det inte i normala celler [41]. Vaccination av möss med tumörhärrörande stressproteiner, GRP94, kan framkalla antitumörimmunsvar, vilket ger en markant undertryckande av tumörtillväxt och metastas. Aktiviteten hos Hsp90 hämmare har väl validerad i prekliniska bröstcancer modeller, både i monoterapi studier och i kombination med konventionell kemoterapi [41]. Vidare har det föreslagits att GRP94 är en fysiologisk substrat för kalpain [23]. Kalpain har visats för att aktiveras i ER-membranet, där det interagerar med GRP94, vilket resulterar i dess specifika proteolytisk klyvning som cellerna undergå apoptos utlöses av etoposid [23]. I aktuella studien fann vi att honokiol-inducerad GRP94 klyvning och apoptos i humana gastric cancerceller kan helt omvända genom kalpainhämmare och tysta kalpain-II siRNA. Kaspas-inhibitorer vid hög dos delvis vände honokiol-inducerad GRP94 klyvning. Förbehandling av celler med cathepsin B och L-hämmare och proteasomhämmaren kunde inte blockera honokiol-inducerad GRP94 klyvning. Vi visade också att tysta av GRP94 av siRNA kan inducera magcancer cell apoptos. Dessutom visade resultaten av immunocytokemisk färgning och immunfällning en specifik interaktion mellan GRP94 med kalpain-II i gastriska cancerceller efter honokiol behandling. Den specifika klyvningen av GRP94 av kalpain kan också observeras med hjälp av cellysat framställda från humana gastriska cancerceller. Dessa fynd därför föreslå att kalpain-II-medierad GRP94 klyvning spelar en viktig roll i honokiol-utlöst magcancer cell apoptos.

Calpains och kaspaser är två familjer av cysteinproteaser som de är inblandade i reglering av patologisk cell död [22], [31]. Dessa proteaser delar flera dödsrelaterade substrat inklusive kaspaser själva, cytoskelettala proteiner, Bax och bud [42]. Calpain-medierad proteolys fortskrider på ett begränsat sätt, men kräver inte en specifik aminosyrarest likt kaspaser. Även om både kalpain och kaspas har föreslagits för att spela viktiga roller vid reglering av patologisk celldöd, samverkan mellan dessa två familjer av proteaser enligt patologiska tillstånd är oklart. I den aktuella studien har knockdown och farmakologiska hämmare metoder bidragit avsevärt till vår kunskap om kalpain biologi, särskilt med avseende på dess specifika funktion på cell apoptos, vilket är möjligt att kaspaser 7 och 12 är nedströms från kalpain i medla honokiol-inducerad magcancer cell apoptos.

naturprodukt läkemedel har föreslagits att spela en dominerande roll i farmaceutisk omsorg [43]. Naturliga produkter är en av de viktigaste källorna till potentiella cancer kemoterapeutiska och kemopreventiva medel [43]. Honokiol har använts i stor utsträckning i den traditionella kinesiska och japanska medicin för flera tusen år, främst för behandling av anti-thrombocytic, anti-bakteriell, anti-inflammatoriska, och ångestdämpande effekter. Tidigare rapporter har visat att honokiol också besitter potenta antineoplastiska och anti-angiogena egenskaper [6], [19], [38]. Emellertid är den exakta molekylära mekanismen för uppvisade antitumöraktivitet genom honokiol inte väl förstådd. Således, resultaten av denna studie ger bevis för anti-tumöraktiviteten hos honokiol i magcancer, och ännu viktigare, den molekylära grunden för dess effekt. Vi fann att honokiol inducerar aktiveringen av kalpain, GRP94 klyvning, och apoptos i humana gastriska cancerceller. Dessutom, efter administrering av honokiol i nakna trevligt implanteras med MKN45 gastric tumörceller visade signifikant antitumöraktivitet. Denna preklinisk studie kan fungera som en ram och utgör en lovande ny målinriktad strategi. Dessutom har de naturliga föreningar visat att kombinera med konventionella cytotoxiska medel kan vara kliniskt fördelaktigt med anticancerläkemedel. Denna fördel plus den framväxande bevis för sin anti-tumör mekanismer gör honokiol pågående klinisk tillämpning för att vara en effektiv och säker anti-tumörmedel.

Material och metoder

Cells, odlingsbetingelser och reagens

humana cellinjer inklusive kaukasiska gastric cancercellinjer (AGS, en måttligt dåligt differentierad adenokarcinom cellinje, och N87, en väl differentierad cancer cellinje) och asiatiska gastric cancercellinjer (MKN45 och SCM-1, den odifferentierade adenokarcinomceller) erhölls från cellbank i cancercentrum i Taipei veterans general Hospital (Taiwan). Celler hölls i RPMI 1640-medium innehållande 10% värmeinaktiverat FCS (Life Technologies) och streptomycin /penicillin (Life Technologies) i en fuktad 5% CO _{2 atmosfär. Honokiol erhölls från Wako Chemical Company (Japan), och dess renhet bestämdes att vara minst 99% av HPLC.}

Western blot-analys och immunoutfällningar

Hela cellysat framställdes såsom beskrivits tidigare [44]. Proteiner separerades genom pre-cast 8-20% SDS-polyakrylamidgel-elektrofores, och sedan överfördes elektro från gelén på polyvinylidendifluorid-membran. Efter blockering, till blottar inkuberades med, anti-GRP94, anti-GRP78, anti-kaspas 12, anti-kaspas 7, anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), anti-kalpain-I (μ-kalpain), anti-kalpain-II (m-kalpain) (Santa Cruz Biotechnology), och anti-β-aktin (Sigma) antikroppar i PBS inom 0,1% Tween 20 under 1 h följt av tre 10 min tvättar i PBS inom 0,1% Tween 20. Den membranen inkuberades sedan med pepparrotsperoxidas-konjugerad sekundära antikroppar för 60 min. I immunoutfällning fördes proteiner (500 g) inkuberades med specifika antikroppar och immobiliserades på protein A-Sepharose-pärlor. Pärlorna tvättades omfattande med Bacco s immunoprecipitative buffert, kokades, och mikrocentrifugerades. Ingång 10% av cell-lysat för IP och 50 g proteinerna analyserades med Western blotting. Detektion utfördes med Western blotting reagens ECL (Amersham), och kemiluminescensen avslöjades av Kodak X-Omat-filmer.

kalpain Aktivitet Analyser

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC är en kalpain proteassubstrat. Kvantifiering av 7-amino-4-metylkumarin (AMC) fluorescens medger övervakning av enzymhydrolysen av peptid-AMC-konjugat och kan användas för att mäta enzymaktivitet. Celler bereddes och behandlades på 24 brunnar Corning /Costar-plattor. Före tillsats av inhibitorer celler laddades med 40 M Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) och behandlades med honokiol för indikerade tidpunkten vid 37 ° C i en fuktad 5% CO _{2 inkubator. Proteolys av den fluorescerande sonden övervakades med hjälp av en fluorescerande platta avläsningssystem (HTS-7000 Plus Series bioanalys, Perkin Elmer) med filterinställningar av 360 ± 20 nm för excitation och 460 ± 20 nm för emission.}

siRNA och transfektionsanalyser

siRNA-duplex specifika för inhibering av kalpain-i (μ-kalpain) och kalpain-II (m-kalpain) uttryck i humana celler erhölls från Santa Cruz Biotechnology: kalpain-i, katalog nr . SC-29885, en pool av tre målspecifika 20-25 nt siRNA; kalpain-II, katalognummer. SC-41459, en målspecifik 20-25 nt siRNA. Styr siRNA (katalog nr. Sc-37007) är en icke-målsökande 20-25 nt siRNA utformad som en negativ kontroll. Dessutom duplexer siRNA specifika för inhibering av GRP94 expression syntetiserades kommersiellt av MWG Biotech (Tyskland). Den meningen (överst) och antisens (nederst) sekvenser av GRP94 siRNA duplex var följande: 5'-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 '; 3'-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 '. Som en icke-specifik kontroll, en NC siRNA duplex med slumpmässiga sekvenser designades enligt följande: 5'-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 '; 3'-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 '. De siRNA användes vid en koncentration av 100 till 200 nM för transient transfektion av celler med Lipofectin (Invitrogen) per brunn i en 6-brunnsplatta med färskt medium. Efter 24 timmar från den ursprungliga transfektion och 24-36 h behandling, cellerna eller cellysaten samlat in och analyserat för apoptos eller proteinuttryck, respektive.

immunofluorescens och laserscanning konfokalmikroskopi

Celler tvättades två gånger med PBS, fixerades i 4% paraformaldehyd under 30 min och blockerades sedan genom inkubering i 1% bovint serumalbumin i PBS. Primära antikroppar som anges applicerades på bilderna vid en utspädning av 1:500 och inkuberade vid 4 ° C över natten. Proven behandlades med FITC-konjugerade eller TRITC-konjugerade sekundära antikroppar (Sigma). De FITC-märkta eller TRITC-märkta cellerna analyserades sedan genom fluorescensmikroskopi. För laserskanningsmikroskop, var immunofluorescens-märkta celler analyseras med en inverterad laserskanningsmikroskop (Zeiss LSM 410 invertera, Tyskland), utrustad med både argon jon (488 nm) och HeNe (543 nm) lasrar. Samlokalisering av två märkta antigener detekterades som en enda bild när bilderna från båda kanalerna belades. Konfokala bilder var bakgrund-korrigerad och slås samman med hjälp av Confocal Assistant programvara och bearbetas med Adobe Photoshop programvara.

Annexin-V FITC och PI Dubbel färgning

annexin V /propidiumjodid (BD Clontech) användes för att kvantifiera antalet apoptotiska celler såsom beskrivits tidigare [44]. Cellerna tvättades två gånger med PBS och färgades med annexin V och PI under 20 min vid rumstemperatur. Nivån av apoptos bestämdes genom att mäta fluorescensen hos cellerna genom flödescytometern (Becton Dickinson). Datainsamling och analys utfördes av Cellquest-programmet (Becton Dickinson).

Djur

Djurförsök utfördes enligt de riktlinjer som utfärdats av kommittén för djurförsöks, National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan. BALB /c nakna möss ( nu /nu
) köptes från NLAC Taiwan, Inc., Taipei, Taiwan. Mössen uppföddes och hölls under specifika patogenfria betingelser, försedd med steriliserad föda och vatten ad libitum, och inrymt i en barriär anläggning med 12 h ljus /mörker-cykler. Försöksförfaranden utfördes på sex veckor gamla möss. Djuren avlivades när de verkade döende.

tumörtillväxt analys

Celltumörbildning undersöktes i sex veckor gamla BALB /c nakna möss. Kortfattat, 4 × 10 ^{6 av celler (MKN45) i en exponentiell tillväxtfas suspenderades i 1 ml odlingsmedium med 10% fetalt bovint serum. En enda cellsuspension av MKN45 subkutant ympades in ryggsidan av mössen. Tumörer etablerades i 14 dagar efter MKN45-celler inokulation och följt av behandling med vehikel, 0,5 och 1,5 mg /kg honokiol varje dag i 10 dagar (7 möss /grupp). Volymen av den implanterade tumören i ryggsidan av möss mättes två gånger i veckan med ett skjutmått, med hjälp av formeln V
= ( LW
2) tt /6: där V
, volym (mm 3); L
, största diameter (mm); W
, minsta diameter (mm).}

Immunohistokemi

Uttrycket av GRP94 i mus solid tumör undersöktes genom immunhistokemi. Tunna tumörsnitt (5 ^ m) framställdes, fixerades med kall aceton, blockerades med 3% väte-peroxidas, och färgades med för primär GRP94 antikropp.

Statistiska analyser

De värden som anges i denna studie presenteras som medelvärde ± SEM. Alla analyser utfördes genom variansanalys följt av ett Fishers minsta signifikanta skillnad test. P
värde på mindre än 0,05 betraktades som statistiskt signifikant.

• PLOS ONE: Galektin-3 Underlättar cellrörlighet i ventrikelcancer genom uppreglering Proteas-aktiverad receptor-1 (PAR-1) och matrix metalloproteinas-1 (MMP-1)
• PLOS ONE: Högt mannosbindande Antiviral Lectin PFL från Pseudomonas fluorescens Pf0-1 Främjar celldöd av Gastric Cancer Cell MKN28 via interaktion med α2-integrin