PLoS ONE: Honokiol Skatina kalpainas tarpininkaujant Gliukozė reguliuojama Baltymų-94 Įskilimai ir apoptozę žmogaus skrandžio vėžio ląsteles ir sumažina naviko augimą

Anotacija

Fonas

Honokiol, maža molekulinė masė natūralus produktas, buvo įrodyta, kad turėti stiprus antinavikiniais ir antiangiogeninis savybes. Jos molekuliniai mechanizmai ir anti-skrandžio vėžio galimybė likti nežinoma. Ji buvo parodyta, kad anti-aprotoninis funkcija iš gliukozės-reguliuojama baltymų (GRP) prognozuoja, kad jų indukcija neoplastinių ląstelių gali sukelti vėžio progresavimo ir atsparumo vaistams. Mes tyrinėjo honokiol poveikį pagal GRP reguliavimo ir apoptozę žmogaus skrandžio vėžio ląstelių ir navikų augimą.

metodologija ir pagrindinė
išvados

Gydymas įvairių žmogaus skrandžio vėžio ląstelių su honokiol atvedė į indukcija GRP94 skilimo, bet neturėjo įtakos GRP78. Triukšmo slopinimo ir GRP94 iki sirnr (siRNA) gali sukelti ląstelių apoptozę. Gydymas ląstelių su honokiol arba chemoterapiniai agentas etopozido sustiprino į apoptozė ir GRP94 degradacijos padidėjimą. Kalpainas veikla ir kalpainas II (M-kalpainas) baltymų (bet ne kalpainas-man (μ-kalpainas)) lygis taip pat gali būti padidintas honokiol. Honokiol sukeltos GRP94 žemyn reguliavimas ir apoptozė skrandžio vėžio ląstelių galima atstatomi siRNA nukreipti kalpainas-II ir kalpainas inhibitorius. Be to, iš imunofluorescenciniam ir Imunoprecipitacijos rezultatai atskleidė tam tikrą sąveiką GRP94 su kalpainas-II ląstelėse šią honokiol gydymą. Mes šalia pastebėjo, kad navikas GRP94 per saviraiškos ir naviko augimo BALB /c nuogas pelėmis, kurios buvo užkrėstų žmogaus skrandžio vėžio ląstelių MKN45, yra ženkliai sumažėjo honokiol gydymą.

Išvados ir reikšmė

Šie rezultatai teikia pirmasis įrodymas, kad honokiol sukeltos kalpainas II tarpininkaujant GRP94 skaldymas sukelia žmogaus skrandžio vėžio ląstelių apoptozę. Mes taip pat rodo, kad honokiol gali būti įmanoma Terapinis agentas pagerinti klinikinei baigčiai skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Sheu ML Liu SH Lan KH (2007) Honokiol Skatina kalpainas tarpininkaujant Gliukozė reguliuojama Baltymų-94 Įskilimai ir apoptozę žmogaus skrandžio vėžio ląsteles ir sumažina naviko augimą. PLoS ONE 2 (10): e1096. Doi: 10,1371 /journal.pone.0001096

Akademinė redaktorius: Hany al Shemy, Kairas universitetas, Egiptas

Įstojo: birželio 26, 2007; Priimta 10 Spalio, 2007 m Paskelbta: Vasaris 31, 2007

Visos teisės saugomos: © 2007 Sheu et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė mokslinių tyrimų dotacijų iš Nacionalinės mokslo tarybos Taivanas (NSC95-2320-B040-005). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra antra labiausiai paplitusi priežastis, dėl vėžio mirties pasaulyje [1]. Beveik du trečdaliai atvejų įvyksta besivystančiose šalyse ir 42% vien Kinijoje [1], [2]. Molekuliniai tikslai ir mechanizmus, sukeliančius blogą prognozę nėra gerai suprantama. Lokaliai išplitusiu skrandžio vėžiu, gydymas išlieka labai svarbus uždavinys. Nepaisant pastaraisiais pažangos gydymo klinikinė rezultatas skrandžio vėžiu sergantiems pacientams lieka prasta. Vienas nuo kito iš operacijos, adjuvanto terapijos vaidmuo vis dar nėra įrodyta [2], [3]. Taigi poreikis nustatyti galimus naujus terapinius ir cheminių profilaktikos agentai yra akivaizdus.

Honokiol, aktyvus komponentas izoliuoti ir išgrynintasis iš Magnolia officinalis pervežimas, buvo įrodyta, kad užvaldys poveikį anti-oksidacijos [4], nuo lipidų peroksidacijos [5] ir priešuždegiminių in vitro parsisiųsti ir vivo
[6], [7]. Honokiol taip pat buvo įrodyta, kad būti į kraujotaką ir netoksiškas inhibitorius angiogenezės [8]. Naujausi tyrimai parodė, kad honokiol skatina kaspaze priklauso apoptozę lėtinė limfoleukemija ląsteles ir įveikia įprastus atsparumo vaistams į žmogiškąjį daugine mieloma taikant indukcijos kaspazės priklausomas ir -independent apoptozės [9], [10]. Nors visapusiškai įvertinti klinikinę potencialo junginių dar nėra įmanoma, iš honokiol farmakokinetika buvo kruopščiai ištirti, atskleisti, kad honokiol yra klinikiniu vėžio gydymo. Daugiau natūralūs produktai, kurių sudėtyje yra gydomųjų junginių naudingų užkertant kelią plėtrą piktybinių navikų ir toliau būti atrasta įvairias; Tačiau labai mažai žinoma apie jų pagrindinius veikimo mechanizmais ar jų molekulinio taikinį.

Gliukozės reguliuojama baltymų (GRP) 94 yra labiausiai paplitęs glikoproteinas Endoplazminis tinklas (ER) ir pažymėti stuburinių tik. Per išraiškos Priešprasminis ir ribozimą požiūrių audinių kultūros sistemas, tiesiogiai parodė, kad GRP78 ir GRP94 gali apsaugoti ląsteles nuo mirties [11] - [13]. Apsauginė funkcija GRP taip pat buvo pastebėtas atsparumas radiacijai gimdos kaklelio vėžio [14]. Anti-aprotoninis funkcija GRP taip pat prognozuoja, kad jų indukcija navikinių ląstelių gali sukelti vėžio progresavimo ir atsparumas vaistams [15] - [18]. Patologiniai sąlygos, tokios kaip naviko augimui ir piktybinių navikų buvo siūloma susieti su apsaugančių baltymų GRP94 per saviraiškos [19]. Metastazių piktybinių navikų modelį, buvo parodyta didelė veiksmingumas ir GRP94 pagrindu genų /imunoterapija strategija, kai jis buvo kartu su radioterapija [20]. ER vaidina tiesioginį vaidmenį įjungiant kaspazės pogrupį aktyvavimo apoptozės, kuri atsiranda per ER streso [21] metu. Kita vertus, calpains yra Ca šeimos ^{2 + -dependent viduląstelinių cisteino proteazės. Ubiquitously išreiškė kalpainas-man (μ-kalpainas) ir kalpainas-II (M-kalpainas) proteazės yra susijęs plėtros apoptozės. Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad visur calpains skatinti kaspazę-12 ir JNK aktyvinimo metu ER streso sukeltos apoptozės [22]. Ji taip pat buvo nustatyta, kad GRP94 su Ca 2 + -binding ir anti-apoptoziniu savybės yra proteolitinis tikslas kalpainas metu etopozido sukeltos apoptozės [23]. Be to, keletas eksperimentinių modelių apoptozės, ji buvo parodyta, kad amino-terminalas kalpainas slopinantis vienetas calpastatin gali būti suskaldyta su kaspazių tai rodo, kad skilimo yra būtina, kad kalpainas veiklos reguliavimu, per ląstelių mirtis [24] - [28] , Kaspazės-7, kuris yra samdomas į ER kirčiuotuose ląsteles, gali taip pat skilti ir aktyvuoti kaspazės-12 [29] - [31]. Į honokiol poveikis GRP-susijusią signalizacijos ir apoptozės vis dar nežinoma. Šioje studijoje, mes ištirti molekulinius mechanizmus honokiol žmogaus skrandžio vėžio ląstelių apoptozę ir naviko augimą in vitro, parsisiųsti ir vivo
. Netikėtai, mes nustatėme, kad GRP94 dalyvautų specifiniame proteolitinę skaldymas kalpainas metu honokiol sukeltos apoptozės. Šios pastabos gali suteikti įrodymų, kad honokiol yra įmanoma Terapinis agentas pagerinti klinikinei baigčiai skrandžio vėžio.}

Rezultatai

kinetika GRP94 proteolitus skilimo žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų gydomiems honokiol

Pirma išnagrinėjo honokiol poveikį jos GRP94 ir GRP78 išraiškos įvairių žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas. Honokiol ženkliai sumažėja su GRP94 lygį nuo dozės ir laiko priklausomu būdu, bet GRP78 lygiai neturi įtakos (1 2 pav. Ir). Kinetika honokiol sukeltas GRP94 skilimo įvairiose žmogaus skrandžio vėžio ląstelių buvo parodyta Fig. 2. MKN45 arba SPP-1 ląstelės buvo labiau atsparūs honokiol sukeltos atsakymų nei AGS arba N87 ląstelių; Iš GRP94 lygiai buvo sumažintas iki maždaug 50% du kartus per tiek laiko,. Į GRP78 baltymų kiekis išlieka nepakitęs visose keturiose skrandžio vėžio ląstelių linijas. Be to, yra mažai GRP94 baltymų išraiškos įprastą pelę skrandžio epitelio audinių ir žmogaus endotelio ląstelių, palyginti su skrandžio vėžio ląstelių (1C pav.).

Honokiol sukelia GRP94 skėlimo-susijęs aprotoninį atsaką

kaip parodyta Fig. 3, honokiol padidino poli (ADP ribozės) polimerazė (PARP) skaldymas ir DNR pažeidimai indukuojamąją genas CHOP /GADD153 (baltymas buvo nustatyta tarpininkauti ER streso sukeltos apoptozės) lygiai MKN45 ląsteles nuo dozės ir laiko priklauso būdas. Honokiol 20 ir 40 su M taip pat sukėlė su suskaldyti kaspazės-12 ir kaspazės-7 (P20) išraiškos, kurioje padidėjimas, buvo proporcingas laiko (3B pav.). Be to, siekiant suprasti, ar GRP94 skaldymas buvo įtrauktas į žmogaus skrandžio vėžys ląstelių apoptozę, apoptozės buvo aptikta GRP94-siRNR-transfekuotų ląstelių. Triukšmo slopinimo iš GRP94 pagal siRNA sukeltos ląstelių apoptozę (4A pav.) Ir sumažėjo GRP94 baltymo ekspresiją (pav. 4B-a). Mes taip pat palygino honokiol poveikį apoptozės ir GRP94 degradacijos žmogaus skrandžio vėžio ląstelių su chemoterapiniai agentas etopozido. Rezultatai parodė, kad gydymas ląstelių, turinčių honokiol arba etopozido sustiprintas į apoptozės padidėjimą (4A pav.) Ir GRP94 degradaciją (pav. 4B-b). Kai ląstelės buvo vienu metu gydomi 40 m etopozido ir 20 m honokiol, didesnio padidinimo GRP94 degradacijos nei jie buvo parodyta (pav 4B-B.); Šie rezultatai rodo, kad sujungus honokiol su kitais priešvėžiniais vaistais gali būti potencialus terapinis strategija.

kalpainas reikalingas honokiol tarpininkaujant ląstelių apoptozė

Kitas nustatoma, ar kalpainas veikla (kalcio -dependent tiolio proteazės) būtų sukeltas honokiol keturių skrandžio vėžio ląstelių linijas. Kaip parodyta Fig. 5A, honokiol 20 M padidėjo kalpainas veiklą priklausomai nuo laiko, tokiu būdu, kuris prasidėjo padidinti, esant 15 min, ir pasiekė 60 min, o po to nukrito iki žemesnio lygio per 4 val. Ląstelės liko prilipusios per dieną, žinoma, be gyvybingumo praradimo (duomenys neparodyti). Fig. 5B, rezultatai parodė, kad kalpainas veiklos padidėjimas reaguojant į honokiol (20 ir 40 m) 60 min keturių skrandžio vėžio ląstelių linijų. Be to, kalpainas inhibitoriai, N-acetil-Leu-Leu-norleucinal (ALLN), N-acetil-Leu-Leu-methioninal (ALLM), ir Z-Leu-Leu-CHO, veiksmingai slopino kalpainas veiklos padidėjimą, kurį sukelia honokiol į N87 ir SPP-1 ląstelių (pav. 5C).

Mes taip pat išbandyti, ar sumažėjo kalpainas veikla gali pakenkti honokiol sugebėjimą apie apoptozė indukcija. Kaip parodyta Fig. 6A, honokiol (40 M), sukeltos ląstelių apoptozė SCM-1 ląstelės, kurios galėtų būti atstatomi kalpainas inhibitorių (ALLN arba ALLM). Be to, honokiol sustiprintas kalpainas-II baltymų, bet ne kalpainas-I baltymų posakių SPP-1 ląstelių (. 7A pav). Naudojant siRNA požiūrį į triuškinantis kalpainas-II veiklą lėmė gerokai sumažinimas honokiol (20 m) indukuotų apoptozę žmogaus skrandžio vėžio ląstelių po 4 h gydymo (6B pav.). SiRNA-kalpainas-aš neturėjo įtakos honokiol sukeltos apoptozės (6b pav.).

Lokalizavimas ir sąveika kalpainas-II ir GRP94 po honokiol gydymo

Kitas žingsnis buvo išsiaiškinti, kokį vaidmenį iš kalpainas-II honokiol sukeltos GRP94 degradacija. Lazerinio konfokalinės mikroskopinio tyrimo duomenimis, kalpainas-II baltymų lokalizacijos buvo nustatomas pagal žaliosios fluorescencijos, kadangi GRP94 lokalizacijos buvo nustatomas pagal raudona fluorescencija. Kaip parodyta Fig. 7B, tiek kalpainas-II ir GRP94 buvo aptikta citoplazmos su bendraautoriais lokalizacijos žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Iš kalpainas-II fluorescencija buvo palaipsniui didinama, bet fluorescencija GRP94 buvo palaipsniui mažėjo žmogaus skrandžio vėžio ląsteles pagal honokiol gydymą. Siekiant dar labiau patvirtina rezultatus imunocitocheminiam dažymą kad kalpainas II sąveikauja su GRP94, buvo atliekami CO-Imunoprecipitacijos ir imunoblotingo testai skrandžio vėžio ląsteles. Kaip parodyta Fig. 7C, kalpainas-II buvo konkrečiai susijęs su GRP94 įvairiose skrandžio vėžio ląstelių į honokiol (20 ir 40 M) buvimą, palyginti su IgG kontrolės. Be to, mes patikrinome, ar Proteolitiniai veikla kaspazės, proteasomos ar katepsino buvo dalyvauja GRP94 skaldymu. Mūsų rezultatai parodė, kad gydymas ląstelių su kaspazės inhibitorių (AC-DEVD-cho, Z-VAD-FMK ir Z-DEVD-FMK, 50 m) didelės dozės iš dalies blokavo GRP94 skilimo metu honokiol sukeltos apoptozės (Pav. 8A ), palyginti su kalpainas inhibitorių ALLM 25 m, kuris gali visiškai blokuoti GRP94 skilimo. Pirminis ląstelių su katepsino B inhibitorius CA-074-Me 25 ir 50 m, ir katepsino L inhibitoriaus katepsino L inhibitoriaus II 25 ir 50 M proteosomos inhibitorius MG132 0,1-10 m nesugebėjo blokuoti GRP94 skilimo (pav. 8B ir 8C) , Be to, konkretus skaldymas GRP94 iki kalpainas galima stebėti naudojant ląstelių fragmentai, pagamintus iš žmogaus skrandžio vėžio ląstelių (duomenys neparodyti).

Kitas ištirti, ar kalpainas aktyvavimo reikia honokiol sukelta ląstelių apoptozę. Fig. 9, iš kalpainas-II baltymų ekspresijos ir GRP94 degradacijos ir kaspaze 7 ir kaspazės-12 aktyvinimo padidėja sukeltų honokiol (40 m) buvo išvengta farmakologinių kalpainas inhibitorių ir trumpalaikis transfekciją siRNA-kalpainas-II SCM-1 ląstelių.

honokiol sumažina auglio GRP94 per saviraiškos ir naviko augimo nuogas Pelės

Nude pelių buvo pasėta 4 × 10 ^{6 neišrūšiuotos adenokarcinoma ląstelių MKN45 ir gydomiems honokiol 0,5 ir 1,5 mg /kg transporto priemonėje, kai auglys tapo akivaizdus. Immunohistological ir imunoblotingu analizė parodė, kad GRP94 per-išraiškos ir sukaupta naviko regione, bet ne įprastu skrandžio audinių (Fig. 10A-A ir 10A-b). Honokiol žymiai sumažino GRP94 susikaupimas navikuose, palyginti su transporto priemonės valdymo (Fig. 10A-A ir 10A-b). Iš GRP78 išraiška nebuvo paveiktas (duomenys neparodyti). Norėdami nustatyti, ar honokiol gali slopinti auglio augimą in vivo
, kietos navikai buvo įkurta pelių ir priešnavikinis poveikis pakartotinai švirkšti honokiol tirtas. Kaip parodyta Fig. 10B, iš honokiol 0,5 ir 1,5 mg administravimas /kg, parodė reikšmingą Priešnavikinio veiklą.}

Diskusijos

pranešė čia pirmą kartą, kad kalpainas A nonlysosomal Ca ^{2 + -aktyvuoto cisteino proteazės, ypač kalpainas-II, vaidina svarbų vaidmenį GRP94 skilimo, bet GRP78 neturi įtakos, ir apoptozės reguliavimo sukeltos honokiol žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Visų pirma, mes su sąlyga, funkcinius įrodymus, kad GRP94 skilimo ant honokiol gydymo veikia kaip terapinę naudą, gydymui, auglio augimo slopinimui, pelių modelį žmonių skrandžio karcinoma. Mūsų žiniomis, tai yra pirmoji ataskaita rodo, kad honokiol gali manipuliuoti kalpainas-indukuojamąją šaperonas baltymų GRP94 degradacija yra jos apoptozės metu taikinys.}

Studijos iš kelių laboratorijose nurodė ER kaip tikslinės skyrelį gydomaisiais preparatais padariusiu į apoptozė vykdymą. Citozolinių Ca ^{2 + buvo susijęs, kaip antrosios Messenger proapoptosis dalyvauja tiek sukeliant apoptozę ir reguliavimo kaspazių ar calpains [32] - [34]. Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad kalpainas yra svarbus tarpininkas resveratrolio (natūralus augalas polifenolio) indukuotų apoptozę krūties vėžio [35]. Jie nustatė, kad resveratrolis gali sukelti į ląstelėje Ca 2 + padidėjimas, ir aktyvina kalpainas tarpininkaujant apoptozę, todėl prie plazminės membranos Ca 2 + -ATPazė izoformos 1 ir fodrin į kaspaze 3 nepakankamo MCF- degradacijos 7 ląstelės. Honokiol taip pat buvo pranešta, kad sukelti Ca 2 + mobilizacija žiurkės smegenų žievės neuronų ir žmogaus neuroblastoma SH-SY5Y ląstelių, matyt per fosfolipaze C ir TL aktyvavimo _{3 receptorius [36]. Šioje studijoje, mes nustatėme, kad honokiol yra pajėgi vis kalpainas veiklos ir kalpainas-II baltymų raiškos, bet ne kalpainas-aš per honokiol sukelta skrandžio vėžio ląstelių apoptozę. Be to, kalpainas inhibitoriai ir triukšmo slopinimo ir kalpainas-II, siRNA žymiai pasikeitė honokiol sukeltos apoptozės. Šie duomenys leidžia manyti, kad Ca 2 + -triggered kalpainas II aktyvavimo gali žaisti galimą vaidmenį honokiol sukeltos apoptozės.}}

GRP94 /gp96 yra ER gyventojas narys HSP90 šeima. GRP94 vaidina svarbų vaidmenį išlaikant ląstelių homeostazę. Tai tradicinis koncepcija GRP94 kaip baltymų lankstymo palydovas atnaujina atradimų, kad GRP skatinti naviko proliferaciją, metastazes, atsparumą vaistams ir imunoterapija, kurie turi pagrindines klinikines pasekmes į prognozes ir gydymą vėžiu [3]. GRP94 buvo įrodyta, kad būti susijęs su tumorogeniš- vėžio ląstelių linijų, graužikų navikų modelių ir žmogaus vėžio biopsijos [37] - [39]. Tai dera su išvadomis, kad GRP indukcija sukelia apsauginę funkciją kaip išgyvenimo atsakymų į maistinių medžiagų bado, acidozę ir hipoksiją sąlygomis, kurios yra dažna blogai vascularized solidinių navikų [11], [40]. Jis taip pat buvo pasirodė, kad dauguma GRP auglio ląstelėse užsiima kelių šaperono kompleksų, o tai nėra normalios ląstelės [41]. Skiepijimas pelėms su naviko kilmės streso baltymų, GRP94, gali sukelti antinavikinį imuninį atsaką, taip gaunant žymiai slopinti auglio augimas ir metastazės. Iš Hsp90 inhibitorių veikla buvo gerai patvirtinta Ikiklinikinių krūties vėžio modelių, tiek vieno preparato tyrimais ir kartu su tradicine chemoterapija [41]. Be to, buvo pasiūlyta, kad GRP94 yra fiziologinis substratas kalpainas [23]. Kalpainas buvo įrodyta, kad būti aktyvuota ER membranos, kur jis sąveikauja su GRP94, todėl specifinio proteolitus skilimo kaip ląstelės pasitikrinti apoptozę paskatino etopozido [23]. Be dabartinio tyrimo, mes nustatėme, kad honokiol sukeltos GRP94 skaldymas ir apoptozė žmogaus skrandžio vėžio ląstelių gali būti visiškai atstatomi kalpainas inhibitoriai ir nutildymo iš kalpainas-II iki siRNA. Kaspazės inhibitoriai dideliu dozės iš dalies pasikeitė honokiol sukeltos GRP94 skilimo. Pirminis ląstelių su katepsino B ir L inhibitorių ir proteasomos inhibitorių nesugebėjo blokuoti honokiol sukeltos GRP94 skilimo. Mes taip pat parodė, kad triukšmo slopinimo ir GRP94 iki siRNA gali sukelti skrandžio vėžio ląstelių apoptozę. Be to, iš imunocitocheminiam dažymo ir Imunoprecipitacijos rezultatai atskleidė tam tikrą sąveiką GRP94 su kalpainas-II skrandžio vėžio ląstelių šią honokiol gydymą. Konkretus skaldymas GRP94 iki kalpainas taip pat gali būti pastebėti naudojant ląstelių fragmentai, pagamintus iš žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Šie duomenys, todėl teigti, kad kalpainas II tarpininkaujant GRP94 skaldymas vaidina svarbų vaidmenį honokiol-sukėlė skrandžio vėžio ląstelių apoptozę.

Calpains ir kaspazių dvi šeimos cisteino proteazės, kad jie dalyvauja reguliuojant patologinių ląstelių mirtis [22], [31]. Šie proteazės pasidalinti keletą mirties susijusių substratai įskaitant kaspazių save, Citoskeletas baltymų, Bax, ir pasiūlymo [42]. Kalpainas-tarpininkaujant proteolizę, vyksta ribotai bet nereikalauja tam tikrą amino rūgščių liekanas, panašaus, kad iš kaspazių. Nors tiek kalpainas ir kaspazės buvo siūloma vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant patologinių ląstelių mirtį, šių dviejų šeimų proteazės pagal patologiniams sąveika nėra aiškios. Šioje studijoje, Klojinius išardomi ir farmakologiniai inhibitoriai požiūriai smarkiai prisidėjo prie mūsų žinių apie kalpainas biologijos, ypač atsižvelgiant į jos specifinį funkciją ląstelių apoptozę, kuri yra įmanoma, kad kaspazių 7 ir 12 yra pasroviui nuo kalpainas tarpininkavimo honokiol sukelta skrandžio vėžiu ląstelių apoptozę.

natūralus produktas narkotikai buvo siūloma žaisti lemiamą vaidmenį farmacijos priežiūros [43]. Natūralūs produktai yra vienas iš svarbiausių šaltinių galimą vėžio chemoterapijos ir cheminių profilaktikos veiksnių [43]. Honokiol buvo plačiai naudojami tradicinės kinų ir japonų medicinoje kelis tūkstančius metų, daugiausia, už anti-thrombocytic, antibakterinis, priešuždegiminių, ir anksiolitinį efektais. Ankstesnius pranešimus parodė, kad honokiol yra taip pat turintis stiprus antinavikiniais ir anti-angiogeninių savybes [6], [19], [38]. Tačiau, tiksli molekulinė mechanizmas eksponavo priešnavikinis poveikis pagal honokiol nėra pakankamai gerai suprantama. Taigi, šio tyrimo rezultatai pateikti įrodymus dėl priešnavikinis aktyvumas honokiol skrandžio vėžio, ir dar svarbiau, molekulinę pagrindą jos poveikis. Mes nustatėme, kad honokiol skatina į kalpainas, GRP94 skilimo ir apoptozės aktyvinimo žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Be to, pavartojus honokiol nuogas Nicos implantuoto su MKN45 skrandžio naviko ląstelių parodė didelį anti-vėžinių veiklą. Tai Ikiklinikinių studijų gali tarnauti kaip pagrindas ir yra perspektyvus romaną tikslinį metodą. Be to, natūralių junginių buvo įrodyta, kad sujungti su įprastinėmis citotoksiniais preparatais gali būti klinikinės naudos su priešvėžiniais vaistais. Šis pranašumas plius atsiranda įrodymų savo anti-vėžinių mechanizmų padaryti honokiol vykstantį klinikinį taikymą už tai, kad veiksmingas ir saugus priešnavikinis agentas.

Medžiagos ir metodai

Ląstelės, auginimo sąlygos ir reagentai

"Žmogaus ląstelių linijas, įskaitant Kaukazo skrandžio vėžio ląstelių linijų (AGS, saikingai-blogai diferencijuota adenokarcinoma ląstelių linijos ir N87, gerai diferencijuotas vėžys ląstelių linija) ir Azijos skrandžio vėžio ląstelių linijas (MKN45 ir SCM-1, The neišrūšiuotos adenokarcinoma ląstelių) buvo gauti iš ląstelių banko vėžio centro Taipėjaus veteranų bendroji ligoninė (Taivanas). Ląstelės buvo prižiūrimi RPMI 1640 terpėje, turinčioje 10% šilumos inaktyvuotų FCS (Life Technologies) ir streptomicino /penicilinui (Life Technologies) drėgnoje 5% CO _{2 atmosferos. Honokiol buvo gauta iš WAKO Chemical Company (Japonija), o jo grynumas buvo nustatyta, kad 99% minimalų efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.}

Vakarų dėmė analizė ir Immunoprecipitations

Visa ląstelių fragmentai buvo paruoštas kaip aprašyta anksčiau [44]. Baltymai buvo atskirti blokinis 8-20% SDS-poliakrilamido gelyje, ir tada elektroforezės metodu perkelti iš gelio ant polivinilideno difluoridą membranas. Po blokavimas, dėmės buvo inkubuojami su anti-GRP94 anti-GRP78 anti-kaspazės 12, anti-kaspazės 7, anti-PARP anti-GADD153 (Santa Krusas biotechnologijos), anti-kalpainas-man (μ-kalpainas) prieš kalpainas II (m-kalpainas) (Santa Krusas biotechnologijos), ir anti-β aktino (sigma), antikūnai PBS per 0,1% Tween 20 1 h po trijų 10 min plovyklos PBS per 0,1% Tween 20. tada membranos buvo inkubuojami su krienų peroksidazės-konjuguoto antrinių antikūnų 60 min. Į Imunoprecipitacijos, baltymai (500 g) buvo inkubuojamos su specifinių antikūnų ir imobilizuoti ant baltymų A-Sepharose granulėmis. Karoliukai buvo plačiai nuplauti BACCO anketa immunoprecipitative buferis, kaitinti, ir microcentrifuged. Įvesties 10% ląstelių lizato IP adreso ir 50 g baltymų buvo analizuojami Vakarų blotingo metodu. Aptikimas buvo atliktas su imunoblotingu reagento ECL (Amersham) ir chemiluminescencja buvo veikiami Kodak "X-Omat filmų.

kalpainas Veiklos Bandymai

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC yra kalpainas proteazės substratas. Kiekybinę 7-amino-4-metilkumarino (AMC) fluorescencijos leidžia fermentų hidrolizės peptido-AMC konjugato stebėjimą ir gali būti naudojamas matuoti fermento aktyvumą. Ląstelės buvo parengta ir apdorojimo 24 šulinėlių Corning /Costar plokščių. Prieš pridedant inhibitoriais ląstelių buvo pakrauta su 40 M Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) ir apdorojimo su honokiol kuri nurodyta laiko esant 37 ° C temperatūroje drėgnoje 5% CO _{2 inkubatorių. Proteolysis fluorescencinio zondo buvo stebimas naudojant fluorescencinės plokštės skaitymo sistema (HTS-7000 Plus "serijos biologinio tyrimo metodas, Perkin Elmer) su filtro nustatymus 360 ± 20 nm sužadinimo ir 460 ± 20 nm emisijos.}

siRNA ir transfekcijq Bandymai

siRNR per du aukštus specifinis už kalpainas-I (μ-kalpainas) ir kalpainas-II (m-kalpainas) slopinimo išraiškos žmogaus ląstelės buvo gautos iš Santa Cruz Biotechnology: kalpainas-I, katalogas nėra , SC-29.885, iš 3 į taikinius konkretaus 20-25 nt siRNAs baseinas; kalpainas-II katalogas Nr. SC-41.459, taikinys konkrečių 20-25 NT siRNR. Kontrolės siRNR (katalogas Nr. SC-37007) yra ne nukreipimą 20-25 nt siRNR sukurtas kaip neigiama kontrolė. Be to, siRNR dupleksus pritaikomas tam iš GRP94 išraiškos slopinimas buvo susintetintas komerciškai MWG Biotech (Vokietija). Jausmas (viršuje) ir Priešprasminis (apačioje) sekos GRP94 siRNA dvipusis buvo taip: 5'-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 "; 3'-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 '. Kaip nespecifinio kontrolės, NC siRNR dvipusis su atsitiktinių sekų buvo suprojektuoti taip: 5'-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 "; 3'-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 '. Kad siRNAs buvo naudojamas esant 100-200 nM koncentracijos trumpalaikiam transfekciją ląstelių su Lipofectin (Invitrogen) duobutei A 6-šulinėlių plokštelės su šviežia terpe. Po 24 h nuo pradinės transfekciją ir 24-36 h gydymo, ląstelių ar ląstelių fragmentai buvo renkami ir analizuojami apoptozės ar baltymų raiškos, atitinkamai.

Imunofluorescentinis ir skenavimo lazeriu confocal mikroskopija

ląstelės buvo plaunama du kartus PBS, nustatyta iš 4% paraformaldehido 30 min ir tada užblokuotas inkubacijos 1% albumino galvijų serumo PBS. Pirminiai antikūnai, kaip nurodyta, yra susiję su skaidres esant 1:500 skiedimo ir inkubuojami esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Mėginiai buvo gydomi FITC konjuguotų arba TRITC-konjuguotų antrinių antikūnų (sigma). Tuomet FITC paženklinti arba TRITC ženklu ląstelės buvo analizuojami fluorescencijos mikroskopija. Dėl lazerinio skenavimo mikroskopu, imunofluorescencines žymėto ląstelės buvo analizuojami naudojant apverstos lazerio skenavimo mikroskopą (Zeiss "LSM 410 invertuotąjį, Vokietija), įrengtas ir argono jonų (488 nm) ir HeNe (543 nm)" lazeriai ". Co-lokalizacijos du etiketėmis paženklintus antigenų buvo aptikta viename vaizde, kai iš abiejų kanalų vaizdai buvo padengta. Confocal vaizdai buvo background-atimama ir sujungtos naudojant confocal asistentas programinę įrangą, ir tvarkomi su Adobe Photoshop programa.

aneksinas-V FITC ir VšĮ Dvivietis Dažymo

aneksinu /propidiumo jodido (BD Klontex) buvo panaudota siekiant kiekybiškai skaičių apoptozinių ląstelių, kaip aprašyta anksčiau [44]. Ląstelės buvo plaunama du kartus PBS ir nudažomi su aneksino V ir PI 20 min, esant kambario temperatūrai. Apoptozės lygis buvo nustatomas matuojant ląstelių fluorescencija tėkmės citometras ( "Becton Dickinson). Duomenų rinkimo ir analizės buvo atlikta pagal CellQuest programos (Becton Dickinson).

Gyvūnai

Gyvūnų eksperimentai buvo atlikti pagal kurią gyvūnų Eksperimentai komiteto, Nacionalinis Chung Hsing universiteto parengtas gaires, Taičungas, Taivanas. Vyras Balb /c nuogas pelėms ( Nu /Nu
) buvo nupirkta iš NLAC Taivanas, Inc., Taipėjus, Taivanas. Pelėms buvo veisiami ir prižiūrimi pagal konkrečias patogenais neužkrėstų sąlygomis, jei su sterilizuoti maisto ir vandens iki soties, ir įdėtas į barjero įrenginio su 12 val šviesumo /tamsumo ciklų. Eksperimentiniai procedūros buvo padaryta 6 savaičių amžiaus pelių. Gyvūnai buvo numarinti tada, kai jie pasirodė gaištančių.

naviko augimą Analizės

Mobilusis tumorogeniškumo buvo išnagrinėtas 6 savaičių amžiaus vyrų BALB /c nuogas pelių. Trumpai tariant, 4 × 10 ^{6 ląstelių (MKN45) Pagal eksponentinio augimo fazėje buvo sustabdytas 1 ml mitybinės terpės su 10% vaisiaus galvijų kraujo serume. Vienas ląstelių sustabdymas MKN45 buvo po oda pasėta į nugaros pusėje pelių. Navikai buvo nustatytas 14 dienų po skiepijimo MKN45 ląsteles ir po gydymo transporto priemonės, 0,5 ir 1,5 mg /kg honokiol kasdien 10 dienų (7 pelėms /grupė). Iš implantuoto naviko nugaros pusėje pelių apimtis buvo matuojama du kartus per savaitę su slankmačiu, naudojant formulę, V
= (, LW
2) π /6: kur V
, apimtis (mm 3); L
, didžiausias skersmuo (mm); W
, mažiausias skersmuo (mm).}

imunohistocheminis

iš GRP94 išraiška pelės kieto auglio buvo nagrinėjama imunohistocheminiu. Plonas naviko skyriai (5 mkm) buvo parengtas, fiksuoto šaltu acetonu, blokavo su 3% vandenilio peroksidazės ir tamsintas su pirminės GRP94 antikūnų.

statistikos Analizuoja

nurodytus šiame tyrime vertybes pateikiami kaip vidurkis ± SEM. Visi tyrimai buvo atlikti dispersinė analizė, po kurio Fišerio jau didelis skirtumas testą. P
vertė mažesnė negu 0,05 buvo žiūrima kaip statistinio reikšmingumo.

• PLoS ONE: Galectin-3 Palengvina Mobilusis judrumą skrandžio vėžio iki reguliavimo proteazės aktyvuota receptoriaus-1 (PAR-1) ir Matrix metaloproteinazės-1 (MMP-1)
• PLoS ONE: Aukštas manozės įrišimas Antivirusinis lėktino PFL iš Pseudomonas fluorescens Pf0-1 Skatina ląstelių mirtis skrandžio vėžio ląstelių MKN28 per Sąveika su α2-Integrin