PLoS ONE: Honokiol Veroorzaakt Calpain-Mediated Glucose-Gereglementeerde Protein-94 Splitsing en apoptose in menselijke cellen maagkanker en vermindert Tumor Growth

De abstracte

Achtergrond

Honokiol, een klein moleculair gewicht natuurlijke product, is aangetoond dat krachtige anti-neoplastische en anti-angiogene eigenschappen. De moleculaire mechanismen en de capaciteit van anti-maagkanker onopgehelderd. Het is aangetoond dat de anti-apoptotische functie van de glucose-gereguleerde eiwitten (GRP) voorspelt dat hun introductie in neoplastische cellen kunnen leiden tot progressie van kanker en geneesmiddelresistentie. We onderzochten de effecten van honokiol over de regulering van GRP's en apoptose in menselijke maagkanker cellen en tumorgroei.

Methodologie en belangrijkste bevindingen

De behandeling van verschillende menselijke maagkanker cellen met honokiol geleid tot de inductie van GRP94 splitsing, maar had geen invloed GRP78. Silencing van GRP94 door kleine interfererende RNA (siRNA) konden cel apoptose. Behandeling van cellen met honokiol of chemotherapeutische agens etoposide verbeterde de verhoging van apoptose en GRP94 degradatie. De calpaïne activiteit en calpaïne II (m-calpaïne) eiwit (maar niet-calpaïne I (μ-calpaïne)) niveau kan ook worden verhoogd door honokiol. -Honokiol geïnduceerde GRP94 down-regulatie en apoptose bij maagkanker cellen kunnen worden teruggedraaid door siRNA gericht calpaïne-II en calpaïne remmers. Bovendien geven de resultaten van immunofluorescentie kleuring en immunoprecipitatie onthulde een specifieke interactie van GRP94 met calpaïne-II in cellen na behandeling honokiol. We vervolgens vastgesteld dat tumor GRP94 overexpressie en tumorgroei in BALB /c naakt muizen die werden geïnoculeerd met menselijke maagkanker cellen MKN45 wordt duidelijk verminderd door behandeling honokiol.

Conclusies en betekenis

Deze resultaten leveren het eerste bewijs dat honokiol-geïnduceerde calpaïne II-gemedieerde klieving veroorzaakt GRP94 menselijke maagkanker apoptose. Wij stellen verder dat honokiol kan een mogelijk therapeutisch middel zijn om de klinische uitkomst van maagkanker te verbeteren

Visum:. Sheu ML, Liu SH, Lan KH (2007) Honokiol Induceert-Calpain Mediated Glucose-Gereglementeerde Protein-94 Splitsing en apoptose in Human maag kankercellen en vermindert tumorgroei. PLoS ONE 2 (10): E1096. doi: 10.1371 /journal.pone.0001096

Academic Editor: Hany El-Shemy, Universiteit van Caïro, Egypte

Ontvangen: 26 juni 2007; Aanvaard: 10 oktober 2007; Gepubliceerd: 31 oktober 2007

Copyright: © 2007 Sheu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies voor onderzoek van de National Science Raad van Taiwan (NSC95-2320-B040-005). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker overlijden in de wereld [1]. Bijna twee derde van de gevallen komen in ontwikkelingslanden en 42% in China alleen [1], [2]. De moleculaire targets en mechanismen die ten grondslag liggen aan een slechte prognose zijn niet goed begrepen. De behandeling van lokaal gevorderde maagkanker blijft een grote uitdaging. Ondanks de recente vooruitgang in de behandeling, de klinische resultaten voor maagkanker patiënten nog steeds slecht. Naast chirurgie, de rol van adjuvante therapie wordt bewezen [2], [3]. Dus de behoefte om potentiële nieuwe therapeutische en chemopreventieve middelen te identificeren is duidelijk.

Honokiol, een actief bestanddeel geïsoleerd en gezuiverd uit de magnolia officinalis
, is aangetoond dat het effect van anti-oxidatie bezitten [4], tegen lipideperoxidatie [5] en anti-inflammatoire in vitro Kopen en in vivo
[6], [7]. Honokiol is ook aangetoond dat een systemisch beschikbaar en niet-toxische remmers van angiogenese [8] zijn. De recente studies dat honokiol induceert caspase-afhankelijke apoptose in B-cel chronische lymfocytische leukemie cellen en worden gebruikelijke resistentie in menselijk multipel myeloom door inductie van caspase-afhankelijke apoptose en -onafhankelijke [9], [10]. Hoewel een volledige beoordeling van de klinische potentie van de verbindingen nog niet mogelijk is de farmacokinetiek van honokiol grondig onderzocht, waaruit blijkt dat honokiol is op klinische kankertherapie beschikbaar. Meer natuurproducten die diverse therapeutische verbindingen nuttig bij het voorkomen van de ontwikkeling van maligniteiten verder te ontdekken; echter zeer weinig bekend over de onderliggende mechanismen van de actie of hun moleculaire doelwit.

Glucose-gereguleerd eiwit (GRP) 94 is een meest voorkomende glycoproteïne in het endoplasmatisch reticulum (ER) en slechts worden geïdentificeerd in gewervelde dieren. Over-expressie antisense en ribozym benaderingen in weefsels kweeksystemen rechtstreeks aangetoond dat GRP78 en GRP94 cellen kunnen beschermen tegen de dood [11] - [13]. De beschermende functie van de GRP is ook waargenomen in stralingsbestendigheidsproef bij cervicale kanker [14]. De anti-apoptotische functie van de GRP voorspelt ook dat hun inductie in neoplastische cellen kunnen leiden tot kanker progressie en resistentie [15] - [18]. Pathologische aandoeningen zoals tumorgroei en maligniteit gesuggereerd dat zij met cytoprotective eiwit GRP94 overexpressie [19]. In gemetastaseerde maligniteiten model, een significante werkzaamheid van de GRP94-genexpressie /immunotherapie strategie krijgt wanneer het werd gecombineerd met bestraling [20]. De ER speelt een directe rol in het activeren van een subset van caspase tijdens de activering van apoptose die optreedt tijdens ER stress [21]. Anderzijds, calpains zijn een familie van Ca ^{2 + -afhankelijk intracellulaire cysteïneproteasen. Alomtegenwoordig uitgedrukt calpaïne-I (μ-calpaïne) en calpaïne II (m-calpaïne) proteasen zijn betrokken bij de ontwikkeling van apoptose. Een recente studie heeft aangetoond dat alomtegenwoordig calpains promoten caspase-12 en JNK activatie tijdens ER stress geïnduceerde apoptose [22]. Ook is aangegeven dat GRP94 met Ca 2 + bindingsplaats en anti-apoptotische eigenschappen is een proteolytisch doelwit van calpaïne in etoposide-geïnduceerde apoptose [23]. Bovendien is in diverse experimentele modellen van apoptose, is aangetoond dat de aminoterminale calpaïne remmende eenheid calpastatin kan worden gekliefd door caspases, suggereren de splitsing is essentieel voor de regulering van calpaïne activiteit tijdens celdood [24] - [28] . Caspase-7, die wordt aangetrokken naar de ER bij gestresste cellen kunnen eveneens splitsen en activeren van caspase-12 [29] - [31]. De effecten van honokiol op de GRP-gerelateerde signalering en apoptose nog steeds onbekend. In de huidige studie, onderzochten we de moleculaire mechanismen van honokiol op de menselijke maagkanker cel apoptose en tumorgroei In vitro Kopen en In vivo
. Onverwacht, vonden we dat GRP94 ondergaat specifieke proteolytische splitsing door calpaïne tijdens honokiol-geïnduceerde apoptose. Deze waarnemingen kunnen bewijzen geven dat honokiol is een mogelijk therapeutisch middel om de klinische uitkomst van maagkanker te verbeteren.}

Resultaten

Kinetics van GRP94 proteolytische splitsing in menselijke maagkanker cellijnen behandeld met honokiol

We beginnen onderzocht de effecten van honokiol op de uitingen van GRP94 en GRP78 in verschillende menselijke maagkanker cellijnen. Honokiol aanmerkelijk verlaagt de niveaus van GRP94 op een dosis- en tijdsafhankelijke wijze, maar GRP78 niveaus niet beïnvloed (fig. 1 en 2). Kinetiek van honokiol GRP94 geïnduceerde klieving in verschillende menselijke maagkanker cellen worden getoond in Fig. 2. MKN45 of SCM-1-cellen waren resistent tegen honokiol geïnduceerde responsen dan AGS of N87 cellen; de niveaus van GRP94 werden teruggebracht tot ongeveer 50% voor twee keer zo lang. De niveaus van GRP78 eiwitten onveranderd in alle vier maagkanker cellijnen. Bovendien zijn er weinig GRP94 eiwitexpressies in normale muis maag epitheelweefsel en humane endotheelcellen in vergelijking met maagkanker cellen (fig. 1C).

Honokiol induceert GRP94-splitsing geassocieerde apoptotische respons

zoals getoond in Fig. 3, honokiol verhoogde de poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) splitsing en DNA schade induceerbare gen CHOP /GADD153 (een eiwit is geïdentificeerd ER stress geïnduceerde apoptose mediëren) niveaus MKN45 cellen op een dosis- en tijdsafhankelijke manier. Honokiol 20 en 40 M leverde ook de uitingen van gesplitst caspase-12 en caspase-7 (p20), waarbij de mate van toename was evenredig met de timing (fig. 3B). Bovendien, om te begrijpen of GRP94 splitsing is betrokken bij de menselijke maagkanker cel apoptose apoptose werd gedetecteerd in GRP94-siRNA getransfecteerde cellen. Silencing van GRP94 door siRNA geïnduceerde apoptose (Fig. 4A) en verminderde GRP94 eiwitexpressie (Fig. 4B-a). We vergeleken ook de effecten van honokiol op apoptose en GRP94 afbraak in menselijke maagkanker cellen met chemotherapeutische agens etoposide. De resultaten toonden aan dat behandeling van cellen met honokiol of etoposide verbeterde de verhoging van apoptose (Fig. 4A) en GRP94 afbraak (Fig. 4B-b). Wanneer cellen gelijktijdig werden behandeld met 40 M etoposide en 20 M honokiol, een grotere toename van de GRP94 degradatie dan wat ze deden was (Fig 4B-b.); Deze resultaten impliceren dat de combinatie van honokiol met andere antikankergeneesmiddelen een mogelijke therapeutische strategie zijn.

calpaïne is vereist voor honokiol gemedieerde apoptose

We vervolgens bepaald of de activiteit van calpaïne (calcium afhankelijke thiol proteasen) worden geïnduceerd door honokiol vier maagkanker cellijnen. Zoals getoond in Fig. 5A, honokiol 20 M verhoogde calpaïne activiteit in een tijdsafhankelijke wijze die begon toe te nemen in 15 min, en piekte op 60 min en daalde tot een lager niveau 4 uur. Cellen bleven adherent via tijdsverloop, zonder verlies van levensvatbaarheid (data niet getoond). In Fig. 5B, de resultaten bleek dat de toename van de calpaïne-activiteit als reactie op honokiol (20 en 40 M) gedurende 60 min in vier maagkanker cellijnen. Bovendien calpaïne inhibitoren, N-acetyl-leu-leu-norleucinal (ALLN), N-acetyl-leu-leu-methioninal (ALLM) en Z-Leu-Leu-CHO, remt effectief de groei van calpaïne activiteit geïnduceerd door honokiol N87 en in SCM-1-cellen (Fig. 5C).

verder hebben we getest of verminderde calpaïne activiteit kan het vermogen van honokiol op apoptose inductie compromitteren. Zoals getoond in Fig. 6A, honokiol (40 M) geïnduceerde apoptose in SCM-1 cel, die zouden kunnen worden teruggedraaid door calpaineremmers (ALLN of ALLM). Bovendien honokiol verbeterde calpaïne II-eiwit, maar niet calpaïne-I eiwitexpressies in SCM-1-cellen (Fig. 7A). Met behulp van een siRNA benadering van calpaïne II-activiteit knockdown tot een aanzienlijke vermindering van honokiol (20 M) geïnduceerde apoptose in menselijke maagkanker cellen na 4 uur behandeling (Fig. 6B). SiRNA-calpaïne-I geen invloed honokiol-geïnduceerde apoptose (Fig. 6B).

Lokalisatie en interactie van calpaïne II en GRP94 na behandeling honokiol

De volgende stap was om de rol helderen van calpaïne-II-geïnduceerde honokiol GRP94 afbraak. Laser confocale microscopische studie, de lokalisatie van calpaïne II-eiwit werd bepaald door groene fluorescentie, terwijl de lokalisatie van GRP94 werd bepaald door rode fluorescentie. Zoals getoond in Fig. 7B, zowel calpaïne-II en GRP94 werden gedetecteerd in cytoplasma met co-lokalisatie in menselijke maagkanker cellen. De fluorescentie van calpaïne-II werd geleidelijk verhoogd, maar fluorescentie van GRP94 werd geleidelijk af in menselijke maagkanker cellen onder honokiol behandeling. Om de resultaten van immunocytochemische kleuring dat calpaïne II-interactie met GRP94 verder te bevestigen, werden de proeven van co-immunoprecipitatie en Western blotting bij maagkanker cellen uitgevoerd. Zoals getoond in Fig. 7C-calpaïne II specifiek aan GRP94 verschillende maagkanker cellen in aanwezigheid van honokiol (20 en 40 M) in vergelijking met IgG controle. Daarnaast testten we of de proteolytische activiteiten van caspase, proteasoom of cathepsine betrokken waren bij de splitsing van GRP94. Onze resultaten toonden aan dat behandeling van cellen met caspase remmers (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-fmk en z-DEVD-fmk, 50 M) en hoge dosis gedeeltelijk splitsing van GRP94 geblokkeerd tijdens-honokiol geïnduceerde apoptose (Fig. 8A ) vergeleken met calpaïneremmer ALLM 25 M, die GRP94 splitsing volledig kunnen blokkeren. Voorbehandeling van cellen met de cathepsine B inhibitor CA-074-Me 25 en 50 M en cathepsine L remmer cathepsine L remmer II 25 en 50 M en proteasoom inhibitor MG132 0,1-10 M kon GRP94 splitsing te blokkeren (Fig. 8B en 8C) . Voorts kon de specifieke splitsing van GRP94 van calpaïne zal worden geobserveerd met cellysaten bereid uit menselijke maagkanker cellen (gegevens niet getoond).

Vervolgens onderzochten we of de calpaïne-activatie vereist voor honokiol geïnduceerde apoptose. In Fig. 9, de verhogingen van calpaïne-II eiwitexpressie en GRP94 afbraak en caspase-7 en caspase-12 activatie geïnduceerd door honokiol (40 M) werden vermeden door farmacologische calpaïne inhibitoren en transiënte transfectie van siRNA-calpaïne-II in SCM-1 cellen.

honokiol verzwakt tumor GRP94 over-expressie en tumorgroei in naakt muizen

Naakt muizen werden ingeënt met 4 x 10 ^{6 ongedifferentieerde adenocarcinoom cellen MKN45 en behandeld met honokiol 0,5 en 1,5 mg /kg of voertuig bij tumor bleek. Immunohistologische en Western blot analyse toonde dat GRP94 overexpressie en geaccumuleerd in tumorgebied, maar niet in normaal maagweefsel (Fig. 10A-10A-a en b). Honokiol sterk verminderde de accumulatie van GRP94 in tumoren in vergelijking met dragercontrole (Fig. 10A-10A-a en b). De expressie van GRP78 werd niet beïnvloed (gegevens niet getoond). Vaststellen of honokiol tumorgroei In vivo
, vaste tumoren werden vastgesteld bij muizen en het antitumoreffect van het herhaaldelijk geïnjecteerd honokiol bestudeerd kon onderdrukken. Zoals getoond in Fig. 10B, de toediening van honokiol 0,5 en 1,5 mg /kg vertoonden een significante anti-tumor activiteit.}

Discussie

We meldden hier voor de eerste keer dat calpaïne, een nonlysosomal Ca ^{2 + -geactiveerde cysteïneprotease, vooral calpaïne-II, speelt een belangrijke rol bij de splitsing van GRP94, GRP78 maar wordt niet beïnvloed, en de regulatie van apoptose geïnduceerd door honokiol in menselijke maagkanker cellen. In het bijzonder ontvangen wij functionele bewijzen dat de splitsing van GRP94 op honokiol behandeling werkt als een therapeutisch voordeel, het remmen van tumorgroei in een muismodel van menselijke maagcarcinoom. Voor zover wij weten, is dit het eerste verslag dat honokiol tonen kan calpaïne-induceerbaar chaperonne-eiwit GRP94 degradatie zijn het doelwit tijdens apoptose te manipuleren.}

Studies van meerdere laboratoria wees op de ER als doelwit compartiment van therapeutische middelen betrokken in uitvoering apoptose. Cytosolische Ca ^{2+ is geïmpliceerd als een tweede boodschapper van proapoptosis betrokken bij zowel triggering apoptose reguleren caspasen of calpains [32] - [34]. Een recente studie heeft aangetoond dat calpaïne is een belangrijke mediator van resveratrol (een natuurlijke plantaardige polyfenol) geïnduceerde apoptose bij borstkanker [35]. Zij vonden dat resveratrol een toename van intracellulair Ca 2+ kunnen veroorzaken, en activeert calpaïne-gemedieerde apoptose, wat leidt tot de afbraak van plasmamembraan Ca 2 + -ATPase isoform 1 en fodrin in caspase-3 deficiënte MCF- 7 cellen. Honokiol is ook gemeld Ca induceren 2 + mobilisatie in ratten corticale neuronen en menselijke neuroblastoma SH-SY5Y cellen, waarschijnlijk door activering van fosfolipase C en IP _{3 receptoren [36]. In deze studie bleek dat honokiol tot versterking calpaïne activiteit en calpaïne II-eiwitexpressie maar calpaïne-I is in honokiol-geïnduceerde maagkanker apoptose. Bovendien calpaïne inhibitoren en silencing van calpaïne-II siRNA significant omgekeerd de honokiol geïnduceerde apoptose. Deze bevindingen impliceren dat Ca 2 + -triggered calpaïne-II activering een mogelijke rol in-honokiol geïnduceerde apoptose kunnen spelen.}}

GRP94 /gp96 is de ER inwoner lid van de familie HSP90. GRP94 speelt een belangrijke rol bij het handhaven van de cellulaire homeostase. Deze conventionele begrip GRP94 als eiwitvouwing chaperonne wordt bijgewerkt door de ontdekkingen die GRPS bevorderen tumor proliferatie, metastase, drug resistentie en immunotherapie, die belangrijke klinische implicaties voor de prognose en behandeling van kanker [3]. GRP94 is aangetoond geassocieerd te worden met tumorgeniciteit bij kankercellijnen, knaagdier tumormodellen en menselijke kanker biopsies [37] - [39]. Dit is consistent met de bevindingen dat de inductie van GRP veroorzaakt een beschermende functie als overlevingsreacties nutriënten honger, acidose en hypoxie omstandigheden die gebruikelijk in slecht gevasculariseerde vaste tumoren [11] zijn [40]. Ook is gebleken dat de meeste GRP in tumorcellen is betrokken bij meerdere chaperone complexen, hoewel het niet in normale cellen [41]. Vaccinatie van muizen met tumor afgeleide stresseiwitten, GRP94, uitlokken anti-tumor immuunrespons, waardoor een duidelijke onderdrukking van tumorgroei en metastase. De activiteit van Hsp90 remmers is goed gevalideerd in preklinische borstkankermodellen, zowel in monotherapie studies en in combinatie met conventionele chemotherapie [41]. Bovendien is gesuggereerd dat GRP94 een fysiologisch substraat voor calpaïne [23]. Calpaïne is aangetoond worden geactiveerd ER membraan, waarbij interactie met GRP94, waardoor de proteolytische splitsing de cellen apoptose veroorzaakt door etoposide [23] ondergaan. In de huidige studie vonden we dat honokiol-geïnduceerde klieving GRP94 en apoptose in menselijke maagkanker cellen volledig kan worden omgekeerd door calpaïne inhibitoren en silencing van calpaïne II-siRNA. Caspase-remmers bij hoge doseringen gedeeltelijk teruggedraaid de honokiol geïnduceerde GRP94 splitsing. Voorbehandeling van cellen met de cathepsine B en L remmers en proteasoom remmer kon honokiol-geïnduceerde klieving GRP94 blokkeren. We hebben ook aangetoond dat silencing van GRP94 door siRNA maagkanker cellen apoptose kan induceren. Bovendien geven de resultaten van immunocytochemische kleuring en immunoprecipitatie onthulde een specifieke interactie van GRP94 met calpaïne II bij maagkanker cellen na behandeling honokiol. De specifieke splitsing van GRP94 van calpaïne kan ook worden waargenomen door gebruik cellysaten bereid uit menselijke maagkanker cellen. Deze bevindingen daarom suggereren dat calpaïne II-gemedieerde klieving GRP94 een belangrijke rol spelen in honokiol veroorzaakt maagkanker cel apoptose speelt.

calpaïnen en caspasen zijn twee families van cysteine ​​proteasen die zijn betrokken bij het reguleren van pathologische cel dood [22], [31]. Deze proteasen delen verscheidene death gerelateerde substraten waaronder caspasen zelf, cytoskeleteiwitten, Bax, Bid en [42]. Calpaïne-gemedieerde proteolyse verloopt in beperkte mate maar geen specifiek aminozuurresidu zoals die van caspases vereisen. Hoewel zowel calpaïne en caspase voorgesteld belangrijke rol spelen bij het reguleren van pathologische celdood, de interactie van deze twee families van proteasen onder pathologische omstandigheden zijn niet duidelijk. In de onderhavige studie hebben knockdown en farmacologische remmers benaderingen belangrijke bijdrage tot de kennis van calpaïne biologie, in het bijzonder met betrekking tot zijn specifieke functie apoptose, hetgeen mogelijk dat caspases 7 en 12 zijn stroomafwaarts van calpaïne bij het mediëren-honokiol geïnduceerde maagkanker cel apoptose.

Natuurlijk product drugs zijn voorgesteld om een ​​dominante rol in de farmaceutische zorg [43] spelen. Natuurlijke producten zijn een van de belangrijkste bronnen van mogelijke chemotherapeutische kanker en chemopreventieve middelen [43]. Honokiol is op grote schaal gebruikt in de traditionele Chinese en Japanse geneeskunde voor enkele duizenden jaren, vooral voor de behandeling van anti-thrombocytic, anti-bacterieel, anti-inflammatoire en anxiolytische effecten. Eerdere rapporten hebben aangetoond dat honokiol ook bezit krachtige anti-neoplastische en anti-angiogene eigenschappen [6], [19], [38]. Echter, de precieze moleculaire mechanisme van vertoonde antitumoractiviteit door honokiol niet goed begrepen. Dus de resultaten van dit onderzoek geven bewijzen voor de antitumoractiviteit van honokiol bij maagkanker, en nog belangrijker, de moleculaire basis voor zijn werking. We vonden dat honokiol induceert de activatie van calpaïne, GRP94 splitsing en apoptose in menselijke maagkanker cellen. Bovendien, na toediening van naakt honokiol in mooie geïmplanteerd MKN45 gastrische tumorcellen significante antitumoractiviteit. Deze preklinische studie kan dienen als kader en vertegenwoordigt een veelbelovende nieuwe doelgerichte aanpak. Bovendien hebben de natuurlijke verbindingen gebleken te combineren met gebruikelijke cytotoxische middelen kan klinisch gunstig met antikanker drugs. Dit voordeel plus de opkomende bewijs van de anti-tumor mechanismen honokiol lopende klinische toepassing voor het zijn een effectieve en veilige anti-tumor middel.

Materialen en methoden

Cells, Cultuur Voorwaarden en reagentia

humane cellijnen waaronder blanke maagkanker cellijnen (AGS, een matig-slecht gedifferentieerd adenocarcinoom cellijn, en de N87, een goed gedifferentieerd carcinoom cellijn) en Aziatische maagkanker cellijnen (MKN45 en SCM-1, de ongedifferentieerde adenocarcinoom cellen) werden verkregen van celbank in kanker centrum van Taipei veteranen algemeen ziekenhuis (Taiwan). De cellen werden in RPMI 1640 medium dat 10% hitte-geïnactiveerd FCS (Life Technologies) en streptomycine /penicilline (Life Technologies) in een bevochtigde 5% CO _{2 atmosfeer gehandhaafd. Honokiol werd verkregen van Wako Chemical Company (Japan), en de zuiverheid werd bepaald minimaal 99% door hoge-prestatie vloeistofchromatografie zijn.}

Western blotanalyse en Immunoprecipitaties

Hele cellysaten werden bereid zoals eerder [44] beschreven. Eiwitten werden gescheiden door prefab 8-20% SDS-polyacrylamide gelelektroforese en vervolgens elektroforetisch overgebracht uit de gel naar polyvinylideendifluoride membranen. Na het blokkeren werden de blots geïncubeerd met anti-GRP94, anti-GRP78, anti-caspase 12, anti-caspase 7, anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), anti-calpaïne-I (μ-calpaïne), anti-calpaïne II (m-calpaïne) (Santa Cruz Biotechnology) en anti-β actine (Sigma) antilichamen in PBS in 0,1% Tween 20 gedurende 1 uur gevolgd door drie 10 min wassingen in PBS in 0,1% Tween 20. De membranen werden vervolgens geïncubeerd met mierikswortel peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 60 min. In immunoprecipitatie, eiwitten (500 g) werden geïncubeerd met specifieke antilichamen en geïmmobiliseerd op eiwit A-Sepharose kralen. Korrels werden uitgebreid gewassen met immunoprecipitative buffer Bacco's, gekookt, en microcentrifuge. Invoer 10% cellysaat voor IP en 50 g eiwitten werden geanalyseerd door Western blotting. Detectie werd uitgevoerd met Western blotting reagens ECL (Amersham), en chemiluminescentie werd blootgelegd door de Kodak X-Omat films.

calpaïne Activiteit Testen

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC een protease calpaïne substraat. Kwantificering van 7-amino-4-methyl- coumarine (AMC) fluorescentie maakt het monitoren enzym hydrolyse van het peptide-conjugaat AMC en kan worden gebruikt om de enzymactiviteit te meten. Cellen werden bereid en behandeld op 24-well Corning /Costar-platen. Voorafgaand aan de toevoeging van inhibitoren cellen werden beladen met 40 M Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) en behandeld met honokiol voor timing aangegeven bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO _{2 incubator. Proteolyse van de fluorescerende probe werd gecontroleerd met behulp van een fluorescerende plaat leessysteem (HTS-7000 Plus Series bioassay, Perkin Elmer) met filter instellingen van 360 ± 20 nm voor excitatie en 460 ± 20 nm voor de emissie.}

SiRNA en transfectie Assays

de siRNA duplexen specifiek voor de remming van calpaïne-I (μ-calpaïne) en calpaïne II (m-calpaïne) expressies in humane cellen werden verkregen van Santa Cruz Biotechnology: calpaïne-I, catalogusnr . sc-29885, een pool van 3 doelgroep-specifieke 20-25 nt siRNA's; calpaïne-II, catalogusnr. sc-41459, een target-specifieke 20-25 nt siRNA. Controle siRNA (catalogus nr. SC-37007) is een niet-targeting 20-25 nt siRNA uitgevoerd als een negatieve controle. Bovendien is de siRNA duplexen specifiek voor de remming van GRP94 expressie commercieel gesynthetiseerd door MWG Biotech (Duitsland). De sense (bovenste) en antisense (onderste) sequenties van de siRNA-duplex GRP94 waren als volgt: 5'-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 '; 3'-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 '. Als niet-specifieke controle werd een NC siRNA duplex met willekeurige sequenties werd gemaakt als volgt: 5'-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 '; 3'-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 '. De siRNA's werden gebruikt in een concentratie van 100-200 nM voor transiënte transfectie van cellen met Lipofectin (Invitrogen) per putje in een 6-wells plaat met vers medium. Na 24 uur vanaf de eerste transfectie en 24-36 uur behandeling werden cellen of cellysaten verzameld en geanalyseerd op apoptose of eiwitexpressie, respectievelijk.

immunofluorescentie en laser scanning confocale microscopie

De cellen werden tweemaal gewassen met PBS in 4% paraformaldehyde gedurende 30 min en vervolgens geblokkeerd door incubatie in 1% runderserumalbumine in PBS. Primaire antilichamen zoals aangegeven bij een verdunning van 1:500 werden toegepast op objectglaasjes en geïncubeerd bij 4 ° C overnacht. De monsters werden behandeld met FITC-geconjugeerd of TRITC-geconjugeerde secundaire antilichamen (Sigma). De FITC-gemerkte of TRITC-gelabelde cellen werden vervolgens geanalyseerd door fluorescentie microscopie. Voor laser scan microscoop, werden immunofluorescentie-gemerkte cellen geanalyseerd met een omgekeerde laser scanning microscoop (Zeiss LSM 410 invertsuiker, Duitsland), uitgerust met zowel argon ion (488 nm) en HeNe (543 nm) lasers. Co-lokalisatie van twee gelabelde antigenen werd gedetecteerd als een enkel beeld wanneer de beelden van beide kanalen werden bedekt. Confocale beelden werden-achtergrond afgetrokken en samengevoegd met behulp van de confocale Assistant-software-programma, en verwerkt met Adobe Photoshop software.

annexine-V-FITC en PI Double kleuring

De annexine V /propidiumjodide (BD Clontech) werd gebruikt om het aantal apoptotische cellen gekwantificeerd zoals eerder [44] beschreven. Cellen werden tweemaal met PBS gewassen en gekleurd met annexine V en PI gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Het niveau van apoptose werd bepaald door het meten van de fluorescentie van de cellen door flowcytometer (Becton Dickinson). Data-acquisitie en analyse werden uitgevoerd door het CellQuest programma (Becton Dickinson).

Dieren

Animal experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Comité van dierproeven, de Nationale Chung Hsing University richtlijnen uitgevoerd, Taichung, Taiwan. Mannelijke BALB /c naakt muizen ( nu /nu
) werden gekocht van NLAC Taiwan, Inc., Taipei, Taiwan. De muizen werden gekweekt en gehandhaafd onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden voorzien gesteriliseerd voedsel en water ad libitum, en ondergebracht in een barrière faciliteit met 12 uur licht /donker cycli. Experimentele procedures werden uitgevoerd op 6 weken oude muizen. De dieren werden gedood wanneer ze stervende verschenen.

tumorgroei Assay

Cell tumorvorming werd in 6 weken oude mannelijke BALB /c naakt muizen onderzocht. Kort samengevat, 4 x 10 ^{6 cellen (MKN45) in een exponentiële groeifase werden gesuspendeerd in 1 ml kweekmedium met 10% foetaal runderserum. Een enkele celsuspensie van MKN45 werd subcutaan geïnoculeerd in de dorsale zijde van de muizen. Tumoren werden vastgesteld voor 14 dagen na inoculatie en MKN45 cellen gevolgd door behandeling met vehikel, 0,5 en 1,5 mg /kg honokiol elke dag gedurende 10 dagen (7 muizen /groep). Het volume van de geïmplanteerde tumor in dorsale kant van muizen werd gemeten met twee keer per week met een schuifmaat, met behulp van de formule V
= ( LW
2) n /6: waarbij V
, volume (mm 3); L
, de grootste diameter (mm); W
, kleinste diameter (mm).}

Immunohistochemie

De expressie van GRP94 in muizen vaste tumor werd onderzocht door immunohistochemie. Dunne tumorsecties (5 pm) werden bereid, gefixeerd met koude aceton, geblokkeerd met 3% waterstof peroxidase en gekleurd met primair antilichaam GRP94.

Statistische Analyses

De waarden in deze studie worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Alle analyses werden uitgevoerd door variantieanalyse gevolgd door een Fisher minst significant verschil onderzoek. P
waarde van minder dan 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

• PLoS ONE: Galectine-3 Maakt celmotiliteit bij maagkanker door Up-reguleren van Protease-Activated Receptor-1 (PAR-1) en Matrix metalloproteïnase-1 (MMP-1)
• PLoS ONE: High-Mannose Binding Antiviral lectine PFL van Pseudomonas fluorescens Pf0-1 Bevordert celdood van Cell maagkanker MKN28 via Interactie met α2 integrine