PLoS ONE: Honokiol inducira kalpain posredovani reguliran glukozom Protein-94 odcjepljenja i apoptozu u ljudskim stanicama raka želuca i smanjuje tumorske Growth

Sažetak

Pozadina

Honokiol, malu molekularnu težinu prirodni proizvod, pokazalo se da posjeduju snažnu anti-neoplastične i antiangiogene svojstva. Svoj molekularni mehanizmi i sposobnost anti-raka želuca ostaju nepoznati. Pokazano je da anti-apoptotički funkcija reguliran glukozom proteina (GRPS) predviđa da njihova indukcija u neoplastičnim stanicama može dovesti do progresije raka i otpornost na lijek. Mi smo istražili učinke honokiol na regulaciju GRPS i apoptozu u ljudskim stanicama raka želuca i rast tumora. pregled

metodologiju i glavne nalaze

Liječenje različitih ljudskih stanica sa honokiol želučanog raka dovelo do indukcija GPR94 dekolte, ali nije utjecala na Grp78. Odsutnost GPR94 malim ometa RNA (siRNA) može inducirati staničnu apoptozu. Tretiranje stanica sa honokiol ili kemoterapeutici sredstvo je etopozid poboljšane povećanje apoptoze i Grp94 degradacije. Kalpainski aktivnost i kalpaina II (m-kalpaina) protein (ali ne kalpainom I () μ-kalpaina) stupanj može se također povećati honokiol. Honokiol inducirane GPR94 Smanjivanje se i apoptoze u želučanim stanicama raka može biti poništena od strane siRNA ciljanja kalpainom II i inhibitora kalpaina. Nadalje, rezultati imunofluorescencije bojanjem i imuno otkriva određene interakcije GPR94 s kalpainom II u stanicama nakon honokiol liječenja. Sljedeće smo opazili da tumor GPR94 Prekomjerna ekspresija i rasta tumora u BALB /c golih miševa, koji su inokulirane s ljudskim stanicama raka želuca MKN45, znatno se smanjuju od honokiol tretman. Pregled

Zaključci i značaj pregled

Ovi rezultati prvi dokaz da honokiol inducirane kalpainom II posredovano cijepanje GPR94 uzrokuje humanog karcinoma želuca staničnoj apoptozi. Mi dalje ukazuju na to da honokiol može biti moguće terapijsko sredstvo za poboljšanje kliničkog ishoda raka želuca pregled

Izvor:. Sheu ML, Liu SH, Lan KH (2007.) Honokiol inducira kalpain posredovani reguliran glukozom Protein-94 odcjepljenja i apoptozu u ljudskim karcinoma želuca stanica i smanjuje rast tumora. PLoS ONE 2 (10): e1096. doi: 10,1371 /journal.pone.0001096 pregled

Akademska Urednik: Hany El-Shemy, Sveučilište u Kairu, Egipat pregled

Primljeno: 26. lipnja, 2007; Prihvaćeno: 10. listopada 2007. godine; Objavljeno: 31. listopad 2007 pregled

Copyright: © 2007 Sheu et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane istraživačke potpore iz Nacionalnog vijeća za znanost Tajvana (NSC95-2320-B040-005). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je drugi najčešći uzrok smrti od raka u svijetu [1]. Gotovo dvije trećine slučajeva javlja se u zemljama u razvoju, a 42% u Kini sama [1], [2]. Molekularni ciljevi i mehanizmi u podlozi lošu prognozu nisu dobro razumjeli. Liječenje lokalno uznapredovalim rakom želuca ostaje glavni izazov. Unatoč nedavnim iskoracima u liječenju, klinički ishod pacijenata s rakom želuca i dalje loša. Osim operacije, uloga adjuvantna terapija ostaje nedokazana [2], [3]. Stoga je potrebno identificirati potencijalne nove terapeutske i kemoprevencijskih sredstava je očigledan. Pregled

Honokiol, aktivni sastojak izoliran i očišćen iz Magnolia officinalis
, pokazano je da posjeduje učinke anti-oksidacije [4] na peroksidaciju lipida [5] i anti-upalno in vitro pregled i in vivo pregled [6], [7]. Honokiol također je pokazala da je sistemski dostupni i netoksični inhibitor angiogeneze [8]. Novija istraživanja su izvijestili da honokiol inducira kaspaze ovisne apoptozu kronične limfocitne leukemije B-stanica i da se prevladaju konvencionalnog rezistenciju u ljudskom multipli mijelom indukcijom kaspaze ovisnim ili neovisnim apoptoze [9], [10]. Iako je puna procjena kliničkog potencijala spojeva još nije moguće, Farmakokinetika honokiol je temeljito istražio, otkrivajući da honokiol je dostupna na kliničkom liječenju raka. Više prirodni proizvodi koji sadrže razne terapijske spojeve korisne u sprečavanju razvoja zloćudnih bolesti i dalje biti otkrivena; Međutim, vrlo se malo zna o njihovim temeljnim mehanizmima djelovanja i njihove molekularne mete. pregled

glukoza-regulirana protein (GRP) 94 je najobilniji glikoprotein u endoplazmin retikulum (ER) i samo mogu prepoznati u kralježnjaka. Prekomjerna ekspresija negativna i ribosom pristupa u sustavu tkiva kulture direktno je pokazao da Grp78 i GPR94 mogu zaštititi stanice od smrti [11] - [13]. Zaštitna funkcija za GRPS Također je primijećeno otpornost na zračenja karcinoma cerviksa [14]. Anti-apoptotički funkcija GRPS također predviđa da njihova indukcija u neoplastičnim stanicama može dovesti do progresije raka i otpornosti na lijekove [15] - [18]. Patološka stanja kao što je rast tumora i malignih oboljenja, se smatralo da koreliraju s citozaštitnu proteina GPR94 prekomjerna ekspresija [19]. U metastatskom malignih bolesti modelu značajno efikasnost gena /imunoterapiju strategije GPR94 bazi Pokazalo kada je u kombinaciji s terapijom zračenjem [20]. ER ima izravnu ulogu u aktiviranju podskup kaspaze tijekom aktivacije apoptoze koja se javlja tijekom ER stresom [21]. S druge strane, kalpaini su familija Ca ^{2 + ovisnog intracelularna cistein proteaza. Posvuda je izrazio kalpaina-I (μ-kalpaina) i kalpaina-II (m-kalpaina) proteaze uključene u razvoj apoptoze. Nedavna studija pokazala je da sveprisutni kalpaini promovirati kaspaze-12 i aktivaciju JNK u ER izazvanog stresom apoptoze [22]. Također je naznačeno da GPR94 Ca 2 + -vezujući i antiapoptotski svojstva je proteolitički meta kalpaina za etopozid apoptozi [23]. Osim toga, u nekoliko eksperimentalnih modela apoptoze, pokazano je da se amino-terminalni kalpain inhibicijska jedinica calpastatin može cijepiti pomoću kaspaze, što upućuje na cijepanje je neophodan za regulaciju kalpaina aktivnosti tijekom stanične smrti [24] - [28] , Kaspaze-7, koji je regrutirao u Hitnu u stresnim stanice, može se isto tako probiti i aktiviraju kaspaze-12 [29] - [31]. Učinci honokiol na vezane GRPS-signalizacije i apoptoze i dalje ostaju nepoznati. U ovom istraživanju, možemo istražiti molekularne mehanizme honokiol na ljudsko stanica raka apoptoze želuca i rast tumora In vitro
i in vivo pregled. Neočekivano, otkrili smo da GPR94 prolazi specifičnu proteolitičke razgradnje kalpain tijekom honokiol inducirana apoptoza. Ova zapažanja daju se dokaza da honokiol je moguće terapijsko sredstvo za poboljšanje kliničkog ishoda želuca. Pregled}

Rezultati

Kinetika GPR94 proteolitičke razgradnje u ljudskim staničnim linijama karcinoma želuca liječenih honokiol

prvo ispitati učinke honokiol na izrazima GPR94 i Grp78 u raznim ljudskim staničnim linijama karcinoma želuca. Honokiol znatno smanjuje razinu GPR94 u u dozi i vremenski ovisan način, ali Grp78 razine ne utječe na (sl. 1 i 2). Kinetika honokiol inducirane GPR94 cijepanja u raznim ljudskim stanicama raka želuca su prikazani na slici. 2. MKN45 ili SCM-1 stanice su otpornije na odgovora honokiol inducirani od AGS ili N87 stanica; razine GPR94 smanjena na 50% za dvostruko više vremena. Razine Grp78 proteina ostaje nepromijenjena sve četiri stanične linije raka želuca. Osim toga, tu su malo GPR94 proteina izrazi u normalnom miša želučani epitel tkiva i ljudskim stanicama endotela u usporedbi s želučanih stanica raka (sl. 1 C). Pregled

Honokiol uzrokuje GPR94 cijepanja povezane apoptotičnog odgovora pregled

kao što je prikazano na slici. 3 honokiol povećao poli (ADP-riboza) polimeraze (PARP) cijepanje i oštećenje DNA inducibilne genske CHOP /GADD153 (protein je identificiran posredovati ER stresom inducirana apoptoza) razina u MKN45 stanicama u dozi i vremenski ovisnog način. Honokiol 20 i 40 M je također potaknuo iskaza cijepa kaspaze-12 i kaspaza-7 (P20), što je veličina povećanja je proporcionalna vremenu (sl. 3b). Osim toga, da shvate da li GPR94 cijepanje je uključen u ljudskom stanica raka apoptoze želuca, apoptoza je otkriven u GPR94-siRNA-inficiranim stanicama. Odsutnost GPR94 po siRNA inducirane apoptoze stanica (sl. 4A) i smanjena ekspresija GPR94 protein (Sl. 4B-a). Također smo usporedili učinke honokiol na apoptozu i degradacije GPR94 u ljudskim stanicama s kemoterapeutici agenta ctopozid želučanog karcinoma. Rezultati su pokazali da tretman stanica s honokiol ili etopozidom pojačava porast u apoptozi (sl. 4A) i degradaciju GPR94 (Sl. 4B-b). Kada se stanice istovremeno tretirati sa 40 M etopozida i 20 M honokiol, većeg povećanja GPR94 razgradnju nego što je bio prikazan (Slika 4B-b.); ovi rezultati upućuju na to da je kombiniranje honokiol s drugim lijekovima protiv raka može biti potencijalna terapijska strategija. pregled

kalpaina je potreban za honokiol posredovana stanična apoptoza Netlogu

Sljedeći utvrditi da li je djelovanje kalpain (kalcij ovisnog tiolni proteaze) će se inducirati honokiol četiri želučanim staničnim linijama raka. Kao što je prikazano na slici. 5A, honokiol 20 M povećao kalpaina aktivnosti u vremenski ovisan način, koja je počela da se poveća na 15 minuta, a nalazio se na 60 minuta, a zatim se spustio na nižu razinu na 4 sata. Stanice ostaju prijanja preko vremenskog tijeka, bez gubitka vijabilnosti (podaci nisu prikazani). Na sl. 5B, rezultati su pokazali da je povećanje aktivnosti kalpaina u odgovoru na honokiol (20 i 40 M) tijekom 60 minuta u četiri želučanih staničnim linijama raka. Nadalje, inhibitiri kalpaina, N-acetil-Leu-Leu-norleucinal (ALLN), N-acetil-Leu-Leu-methioninal (ALLM) i Z-Leu-Leu-CHO, učinkovito inhibira rast kalpaina aktivnosti inducirano honokiol u N87 i SCM-1 stanica (sl. 5c). pregled

nadalje ispitati je li smanjena kalpaina aktivnost može ugroziti sposobnost honokiol na indukciju apoptoze. Kao što je prikazano na slici. 6A honokiol (40 M) inducira apoptozu stanica u SCM-1 stanice, a koji može okrenuti pomoću inhibitora kalpaina (ALLN ili ALLM). Štoviše, honokiol poboljšane kalpaina-II proteina, ali ne i kalpainom I protein izrazi u SCM-1 stanica (sl. 7a). Pomoću siRNA pristup obaranje aktivnosti kalpaina-II je dovelo do značajnog smanjivanja honokiol (20 M) koji inducira apoptozu u ljudskim stanicama raka želuca nakon 4 h tretmana (Sl. 6B). SiRNA-kalpainom nisam utjecati honokiol inducirana apoptoza (Sl. 6b). Pregled

Lokalizacija i interakcija kalpaina-II i GPR94 sljedeće honokiol tretman pregled

Slijedeći korak bio je da se razjasni uloga kalpain-II u degradaciju GPR94 honokiol inducirana. Za lasersko konfokalnom mikroskopske studije, lokalizacija kalpainom II proteina određena je zelene fluorescencije, a lokalizacija GPR94 određena je crvene fluorescencije. Kao što je prikazano na slici. 7B, i kalpaina II i GPR94 su nađeni u citoplazmi s ko-lokalizaciju u ljudskim stanicama raka želuca. Fluorescentna kalpain-II postepeno povećava, ali fluorescencija GPR94 postupno smanjio u ljudskim stanicama raka želuca pod honokiol liječenja. Kako bi se dodatno potvrđuju rezultate iz imunocitokemijsku bojenja koji kalpaina II stupa u interakciju s GPR94, provedeni su testovi ko-imuno i Western blot želučanih stanica raka. Kao što je prikazano na slici. 7C kalpain II je posebno povezano sa GPR94 u različitim želuca stanice raka u prisutnosti honokiol (20 i 40 M) u odnosu IgG kontrolom. Osim toga, mi smo testirali da li proteolitičke aktivnosti kaspaze, proteazomu ili katepsin bili uključeni u cijepanja GPR94. Naši rezultati pokazuju da tretman stanica s inhibitorima kaspaze (Ac-DEVD-CHO, Z VAD-FMK i Z-DEVD-FMK, 50 M) na visokoj dozi djelomično blokiran cijepanje GPR94 tijekom honokiol apoptozi (Sl. 8A ) u usporedbi s inhibitorom kalpaina ALLM 25 m, koji bi mogao u potpunosti blokirati GPR94 rascjep. Prethodna obrada stanica s inhibitorom inhibitor katepsina B CA-074-me 25 i 50 M i katepsin L inhibitor katepsina L II 25 i 50 M i proteasomalni inhibitor MG132 0,1-10 M nije bio u mogućnosti blokirati GPR94 dekolte (Sl. 8b i 8c) , Nadalje, specifičan cijepanje GPR94 kalpain nije promatrana uz korištenje staničnih lizata pripravljenim iz ljudskih stanica raka želuca (podaci nisu prikazani). Pregled

sljedeći istraživali da li je potrebna aktivacija kalpaina za honokiol induciranu staničnu apoptozu. Na sl. 9, povećanja ekspresije kalpainom II proteina i degradacija GPR94 i caspase-7 i caspase-12 aktiviranje inducirane honokiol (40 M) je spriječena farmakološkim inhibitori kalpaina i prijelazne transfekcije siRNA-kalpaina-II u SCM-1 stanicama. pregled

honokiol prigušuje tumora GPR94 prekomjerna ekspresija i rast tumora u golih miševa

golih miševa bivaju inokulirane sa 4 × 10 ^{6 nediferencirane stanice adenokarcinoma MKN45 i obradi honokiol 0,5 i 1,5 mg /kg ili vozilo kada je tumor je postalo očito. Imunohistokemijska i Western blot analiza je pokazala da GPR94 prekomjerna ekspresija i akumulirane u tumorskom regiji, ali ne u normalnom želučanog tkiva (Sl. 10A-a i 10A-b). Honokiol značajno smanjio nakupljanje Grp94 kod tumora u usporedbi s kontrolnom (Sl. 10A i 10A-a-b). Ekspresija Grp78 nije utjecao (podaci nisu prikazani). Da bi se utvrdilo da li honokiol može potisnuti rast tumora in vivo pregled, solidni tumori uspostavljeni su u miševa i antitumorski učinak puta ubrizgava honokiol je proučavao. Kao što je prikazano na slici. 10B, davanje honokiol 0,5 i 1,5 mg /kg pokazali značajno antitumorsko djelovanje. Pregled}

Rasprava pregled

Mi smo izvijestili ovdje po prvi put da kalpaina, A nonlysosomal Ca ^{2 + aktiviranu cistein proteaza, a posebno kalpaina II, igra ključnu ulogu u cijepanju GPR94, ali Grp78 ne utječe i na regulaciju apoptoze inducirane honokiol ljudskih stanica raka želuca. Posebno, pod uvjetom da funkcionalne dokaza da se cijepanje GPR94 po honokiol tretman djeluje kao u terapijske svrhe, inhibicije rasta tumora u mišjem modelu ljudske želučane karcinoma. Prema našim saznanjima, ovo je prvo izvješće pokazati da honokiol mogu manipulirati kalpaina-induktivni Chaperone proteina GPR94 degradaciju biće meta tijekom apoptoze. Pregled}

Studije iz više laboratorija ukazao na Hitnu kao ciljane kupe po terapijskim sredstvima uključen u izvršenju apoptoze. Citosolne Ca ^{2+ je impliciran je kao drugi glasnik za proapoptosis uključeni u oba pokreće apoptozu i reguliraju kaspaze i kalpaina [32] - [34]. Nedavna studija je pokazala da kalpain je važan posrednik resveratrola (prirodni biljni polifenola) koji inducira apoptozu u raka dojke [35]. Otkrili su da resveratrol može uzrokovati povećanje intracelularne Ca 2+, te aktivira posredovano kalpainom apoptoze, što dovodi do razgradnje plazmatske membrane Ca 2 + -ATPaze izooblika 1 i fodrin u kaspaze-3 deficijentne MCF- 7 stanica. Honokiol također je izvijestila da izazove Ca 2 + mobilizacija u štakora kortikalnih neurona i ljudskih neuroblastoma SH-SY5Y stanica, vjerojatno kroz aktivaciju fosfolipaze C i IP _{3 receptori [36]. U ovom istraživanju, otkrili smo da honokiol je sposoban za povećanje kalpaina aktivnosti i ekspresiju proteina kalpaina-II, ali ne i kalpaina-ja tijekom honokiol inducirani želučani stanica raka apoptoze. Osim toga, inhibitori kalpaina i utišavanje kalpain-II siRNA značajno preinačio honokiol-inducirana apoptoza. Ovi rezultati upućuju na to da Ca 2 + -triggered aktivacija kalpaina-II može imati potencijalnu ulogu u honokiol inducirana apoptoza. Pregled}}

GPR94 /gp96 je član ER stanovnik obitelji HSP90. GPR94 igra važnu ulogu u održavanju stanične homeostaze. Ovaj konvencionalni pojam GPR94 kao protein folding pratioc se ažurira otkrića da GRPS promicanje proliferaciju tumora, metastaze rezistenciju i imunoterapija, koje su glavne kliničke implikacije u prognozi i liječenju raka. [3] GPR94 Pokazano je da je povezan s tumorogenosti u staničnim linijama raka, glodavac tumorskih modela i ljudskih biopsije raka [37] - [39]. To je u skladu s nalazima da je indukcija GRPS uzrokuje zaštitnu funkciju kao odgovora preživljavanja na hranjivoj gladi, acidoze, te uvjetima hipoksije, koji su uobičajeni u slabo prokrvljenim solidnim tumorima [11], [40]. Također je ukazao da je većina GRPS u stanicama tumora se bavi više pratioc kompleksa, a to nije u normalnim stanicama [41]. Cijepljenje miševa s tumorom izvedeni stresnih proteina, GPR94, može izazvati antitumorskih imunih odgovora, čime značajno supresije rasta tumora i metastaza. Aktivnost inhibitora Hsp90 je dobro potvrđen u predkliničkim modelima raka dojke, i u jednom agensa studija i u kombinaciji s uobičajenom kemoterapijom [41]. Nadalje, predloženo je da se GPR94 je fiziološki supstrat kalpaina [23]. Kalpain je pokazao da se aktivira na ER membranu, gdje međudjeluje sa GPR94, što je rezultiralo u specifičnom proteolitičkom cijepanju kao i stanice apoptozu izazvanih etopozid [23]. U trenutnoj studiji, otkrili smo da honokiol izazvanog GPR94 dekolte i apoptoze u stanicama raka želuca može biti potpuno obrnut kalpaina inhibiraju i utišavanje kalpain-II od siRNA. inhibitori kaspaze u visokoj dozi djelomično preinačio honokiol izazvanu GPR94 rascjep. Prethodna obrada stanica s katepsina B i inhibitora L i inhibitora proteasomalni nije bio u mogućnosti blokirati honokiol izazvanu GPR94 rascjep. Također smo pokazali da utišavanje od GPR94 po siRNA može izazvati rak želuca staničnoj apoptozi. Nadalje, rezultati Imunocitokemijska bojanjem i imuno otkriva određene interakcije GPR94 s kalpainom II u stanicama raka želuca nakon honokiol liječenja. Specifično cijepanje GPR94 kalpain također nije promatrana uz korištenje staničnih lizata pripravljenim iz ljudskih stanica raka želuca. Ti rezultati, prema tome, ukazuju na to da kalpainom II posredovano cijepanje GPR94 igra važnu ulogu u honokiol-aktiviranih stanica karcinoma želuca apoptoze. Pregled

kalpain i kaspaza dvije porodice cistein proteazama koje su uključene u regulaciju patološku stanicu smrt [22], [31]. Ove proteaze podijeliti nekoliko supstrate smrti povezanih uključujući kaspaze sebe, proteine ​​staničnog skeleta, Bax, ponudu [42]. Kalpaina posredovane proteolize zarade u ograničenom način, ali ne zahtijeva posebnu aminokiselinski ostatak kao da kaspaze. Iako su obje te kalpain kaspaze predloženo da igraju važnu ulogu u regulaciji patološki stanične smrti, interakcije ovih dviju porodica proteaza pod patološkim uvjetima nisu jasni. U ovom istraživanju, obaranje i farmakoloških inhibitori pristupi su značajno doprinijeli našem znanju kalpaina biologije, osobito s obzirom na njegovu specifičnu funkciju stanične apoptoze, što je moguće da kaspaza 7 i 12 su nizvodno od kalpain u posredovanju honokiol induciranog raka želuca apoptoze stanica. pregled

lijekovi prirodni proizvod su predložili da igra dominantnu ulogu u farmaceutskoj skrbi [43]. Prirodni proizvodi su jedan od važnih izvora potencijalne kemoterapijskih raka i sredstvima za kemoprevenciju [43]. Honokiol je naširoko koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini i japanske nekoliko tisuća godina, uglavnom, za tretman anti-trombotična, anti-bakterijski, anti-upalna i anksiolitičkim učincima. Prethodna izvješća su pokazala da honokiol također posjeduju potentne antineoplastična i antiangiogene karakteristike [6], [19], [38]. Međutim, precizna molekularni mehanizam pokazali su djelovanje anti-tumorskog honokiol nije sasvim razjašnjena. Dakle, rezultati ovog istraživanja pružaju dokaze za djelovanje protiv tumora honokiol kod raka želuca, a što je još važnije, molekularna osnova za njegovo djelovanje. otkrili smo da honokiol inducira aktivaciju kalpaina, GPR94 cijepanja i apoptozu u ljudskim stanicama raka želuca. Nadalje, nakon davanja honokiol kod golih lijepo implantirane MKN45 želuca tumorske stanice pokazuju značajnu anti-tumorsku aktivnost. To pretkliničkih studija može poslužiti kao okvir i predstavlja obećavajući novi ciljani pristup. Dodatno, prirodni spojevi su se pokazali u kombinaciji s konvencionalnim citotoksičnih sredstava može biti klinički korisno u antitumorskih lijekova. Ova prednost plus dokazi nastajanju svojih anti-tumorskih mehanizmima bi honokiol stalnu kliničku primjenu zato što je učinkovit i siguran sredstvo protiv tumora. Pregled

Materijali i metode pregled

Stanice, Kultura uvjeti i reagensi

Humane stanične linije, uključujući kavkaski želučanih staničnim linijama karcinoma (AGS, umjereno-slabo diferenciranog adenokarcinoma stanične linije i N87, dobro diferencirani stanične linije karcinoma) i azijskih staničnim linijama karcinoma želuca (MKN45 i SCM-1, nediferencirane stanice adenokarcinoma) dobivene su od banke stanica u raka središtu Taipei veterana opće bolnice (Tajvan). Stanice su održavane u RPMI 1640 mediju koji sadrži 10% toplinom inaktiviranog FCS (Life Technologies) i streptomicin /penicilin (Life Technologies) u vlažnoj atmosferi 5% CO _{2 atmosfere. Honokiol je dobiven od Wako Chemical Company (Japan), a čistoća se odredi da bude minimalno 99% tekućinskom kromatografijom visoke djelotvornosti.}

Western analiza i imunoprecipitacijama blot pregled

Cijeli stanični lizati dobije se kao što je prethodno opisano [44]. Proteini su odvojeni predfabricirani 8-20% SDS-poliakrilamid gel elektroforeze, i tada elektroforetski prenosi iz gela na polivinilidenfluorid membrane. Nakon blokiranja, mrlje su inkubirane s anti-GPR94, anti-Grp78, anti-kaspaza 12, anti-kaspaza 7, anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), anti-kalpainom I (μ-kalpaina) anti-kalpainom II (m-kalpaina) (Santa Cruz Biotechnology), i anti-β aktin (Sigma) antitijela u PBS unutar 0,1% Tween 20 u trajanju od 1 h i zatim se tri puta po 10 min ispiranja u PBS u 0,1% Tween 20 membrane su zatim inkubirane s peroksidaza-konjugiranog sekundarnog antitijela za 60 min. U imunoprecipitaciju, proteini (500 g) su inkubirani s antitijelima specifičnim i učvršćeno je na protein A-Sepharose kuglica. Kuglice su isprane ekstenzivno sa Bacco je immunoprecipitative puferom kuhana i microcentrifuged. Ulaz 10% staničnog lizata za IP i 50 g proteina analizirani su pomoću Western blot-a. Detekcija je provedena pomoću Western blot reagensa ECL (Amersham) i chemiluminescence je bio izložen od strane Kodak X-Omat filmova. Pregled

kalpaina aktivnosti Analize

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC je kalpain proteaze podloge. Kvantifikacija 7-amino-4-metilkumarin (UPS) fluorescencijom omogućuje praćenje enzimske hidrolize peptid-AMC konjugata i može se koristiti za mjerenje aktivnosti enzima. Stanice su pripremljene i tretira se na 24 jažica Coming /Costar pločama. Prije dodatka inhibitora stanica su bile napunjene sa 40 M Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) i tretira s honokiol na naznačenom vremenu na 37 ° C u vlažnoj 5% CO _{2 inkubator. Proteoliza fluorescentne probe je praćena upotrebom fluorescentnog ploče čitanja sustav (HTS-7000 plus Series biološkom testu, Perkin Elmer) s postavkama filtriranja od 360 ± 20 nm za pobudu i 460 ± 20 nm za emisiju. Pregled}

siRNA i Testovi transfekcije pregled

siRNA parova koji su specifični za inhibiciju kalpaina-i (μ-kalpaina) i kalpaina-II (m-kalpaina) izrazi u ljudskim stanicama su dobivene od Santa Cruz Biotechnology: kalpaina-i, kataloški br , SC-29885, bazen za tri meta-specifične 20-25 nt iRNK; kalpainom II, kat. SC-41459, meta-specifična 20-25 nt siRNA. (kat. sc-37.007) kontrolnih siRNA je non-ciljanje 20-25 nt siRNA dizajniran kao negativna kontrola. Štoviše, siRNA parova koji su specifični za inhibiciju ekspresije GPR94 sintetiziran komercijalno MWG Biotech (Njemačka). Osjećaj (gore) i negativna (dolje) sekvence GPR94 siRNA duplex su kako slijedi: 5'-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 '; 3'-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 '. Kao nespecifični kontrola, NC siRNA dvoetažni sa slučajnim sekvenci je dizajniran kako slijedi: 5'-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 '; 3'-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 '. Je siRNA su korišteni u koncentraciji od 100-200 nM za prolazne transfekcije stanica s lipofektaminom (tvrtka Invitrogen) po jažici u ploču s 6 jažica sa svježim medijem. Nakon 24 sata od početne transfekciju i 24-36 sata tretmana, stanice ili stanični lizati su sakupljene i analizirane za apoptozu ili ekspresiju proteina, pojedinačno. Pregled

Imunofluorescencija i laserska skenirajuća konfokalnom mikroskopijom pregled

Stanice su dva puta isprane s PBS, fiksirane u 4% paraformaldehidu tokom 30 minuta, i zatim su blokirane inkubacijom s 1% albumina goveđeg seruma u PBS-u. Primarna antitijela kao što je prikazano apliciraju u preparatima u razrjeđenju 1:500 i inkubiraju na 4 ° C preko noći. Uzorci su tretirani s FITC-konjugiranim i TRITC-konjugiranih sekundarnih antitijela (Sigma). FITC-obilježenog TRITC obilježene stanice su zatim analizirane fluorescentnim mikroskopom. Za laserske mikroskopije skeniranja imunofluorescencije obilježenim Stanice su analizirane uporabom obrnuti laserskog skenirajućeg mikroskopa (Zeiss LSM 410 invertni, Germany), opremljen s obje argona ionom (488 nm) i HeNe (543 nm) lasera. Co-lokalizacija dvije obilježene antigene detektiran kao jednu sliku kada se prekriju slike iz oba kanala. Konfokalnom slike su pozadine-oduzima i spojene pomoću Osnove optike pomoćnika softverski program, i obraditi s Adobe Photoshop softver. Pregled

Aneksin-V FITC i PI Double Bojenje pregled

aneksin V /propidij jodid (BD Clontech) se koristi za određivanje broja apoptotičnih stanica kao što je ranije opisano [44]. Stanice su isprane dva puta s PBS i bojane s Annexin V i PI 20 minuta na sobnoj temperaturi. Razina apoptoze se određuje mjerenjem fluorescencije stanica za protočnom citometru (Becton Dickinson). Prikupljanje podataka i analiza su provedena od strane CellQuest programa (Becton Dickinson).

Životinje pregled

Eksperimenti na životinjama su provedeni u skladu sa smjernicama izdanim od strane Odbora životinjama, Nacionalno sveučilište Chung Hsing, Taichung, Tajvan. Muški BALB /c miševe ( nu /nu pregled) kupljeni su od NLAC Tajvana, Inc., Taipei, Tajvan. Miševi uzgojeni su i održavani u specifičnim uvjetima bez patogena, sterilna hrana i voda ad libitum, a smješteni u ograđenoj ustanovi sa 12-h svjetlo /tmina ciklusa. Eksperimentalni postupci su provedena na 6 tjedana starih miševa. Životinje su eutanazirane kad su se pojavili su krepavale. Pregled

tumora Pokus rasta pregled

tumorogenosti stanica ispitan je u 6 tjedana starih muških Balb /c miševa. Ukratko, 4 × 10 ^{6 stanica (MKN45) u eksponencijalnoj fazi rasta, su suspendirani u 1 ml medija za kulturu s 10% fetalnog goveđeg seruma. Jedan stanica suspenzija MKN45 subkutano nasadi se u leđnoj strani miševa. Tumori uspostavljeni su 14 dana nakon inokulacije stanica MKN45 i zatim obradom s vozilom, 0,5 i 1,5 mg /kg honokiol svaki dan tijekom 10 dana (7 miševa /skupini). Volumen implantirani tumora u leđnoj strani miševa je mjerena dva puta tjedno s čeljust, koristeći formulu V pregled = ( LW pregled 2) π /6: gdje je V
, volumen (mm 3); L pregled, najveći promjer (mm); W
, najmanji promjer (mm). Pregled}

Imunohistokemija pregled

Ekspresija Grp94 kod miša čvrstog tumora ispitana imunohistokemijom. pripremljeni su tanki tumora sekcije (5 um), fiksirane s hladnim acetonom, blokirani sa 3% vodikovim peroksidazu, a obojeni za primarnu GPR94 antitijela. pregled

Statistička analiza pregled

vrijednosti navedene u ovoj studiji su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. Sve analize su izvršene sa analizom varijance zatim Fisherov najmanje značajne razlike test. P pregled vrijednost manja od 0,05 gleda kao statističke značajnosti. Pregled

• PLO ON: galektin-3 Olakšava pokretljivost stanica na rak želuca do doreguliranje proteaze-activated receptor-1 (PAR-1) i matriks metaloproteinaze-1 (MMP-1)
• PLoS ONE: Visoka manoza-binding Antiviral lektin PFL iz Pseudomonas fluorescens Pf0-1 Promiče smrti stanice želuca stanica raka MKN28 putem interakcije s a2-integrin