Фон
<р> Honokiol, небольшой молекулярный вес натуральный продукт, было показано, обладает мощным противовоспалительным и опухолевые антиангиогенные свойства. Его молекулярные механизмы и способность анти-рака желудка остается неизвестным. Было показано, что Антиапоптозный функция Глюкоза-регулируемых белков (GRPS) предсказывает, что их индукция в опухолевые клетки могут привести к прогрессированию рака и лекарственной устойчивости. Мы исследовали влияние хонокиол на регуляции апоптоза и ВРП в раковых клетках желудка человека и роста опухоли.
Выводы и значение
<р> Эти результаты дают первое доказательство того, что гонокиол индуцированных калпаин-II-опосредованную GRP94 расщепление вызывает клетку рака желудка человека апоптозу. Кроме того, мы предлагаем, что хонокиол может быть возможным терапевтическое средство для улучшения клинического исхода рака желудка
<р> Цитирование:. Sheu ML, Лю SH, Lan KH (2007) Honokiol Индуцирует кальпаином-опосредованной глюкозо-отрегулированный Белково-94 Расщепление и апоптоз в человеческих раковых клетках желудка и снижает рост опухоли. PLoS ONE 2 (10): e1096. DOI: 10.1371 /journal.pone.0001096
<р> Академический редактор: Хани Эль-Shemy, Университет Каира, Египет
<р> Поступило: 26 июня 2007 года; Принято: 10 октября 2007 года; Опубликовано: 31 октября 2007
<р> Copyright: © 2007 Sheu и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
Финансирование:. Эта работа была поддержана исследовательских грантов от Национального научного совета Тайваня (NSC95-2320-B040-005). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение Кинетика GRP94 протеолитического расщепления в желудочном линиях раковых клеток человека, обработанных хонокиол кальпаином требуется для хонокиол-опосредованного апоптоза клеток Кроме того, мы проверили, действительно ли уменьшились кальпаином активность может поставить под угрозу способность хонокиол по индукции апоптоза. Как показано на рис. 6A, хонокиол (40 М) индуцирует апоптоз клеток в SCM-1 клетки, которые могут быть отменены ингибиторы калпаина (или всех п всех т). Кроме того, хонокиол усовершенствованные белок калпаина-II, но не кальпаином-I белка выражения в клетках SCM-1 (рис. 7а). Использование миРНК подход к нокдаун активности калпаина-II привело к значительному области борьбы с хонокиол (20 М) индуцированный апоптоз в клетках рака желудка человека после 4 ч обработки (рис. 6б). МиРНК-калпаина-я не влияет на хонокиол апоптоз, вызванный (рис. 6б). Honokiol затухает GRP94 опухоли избыточная экспрессия и рост опухоли у голых мышей голым мышам инокулировали с 4 × 10 6 недифференцированных клеток аденокарциномы MKN45 и обрабатывали хонокиол 0,5 и 1,5 мг /кг или транспортного средства, когда опухоль стала очевидной. Иммуногистохимического и Вестерн-блоттинга анализ показал, что GRP94 избыточная экспрессия и накапливается в области опухоли, но не в нормальной желудочной ткани (фиг. 10A-А и 10 А-В). Honokiol заметно уменьшилось накопление GRP94 в опухолях по сравнению с управления транспортным средством (фиг. 10A-А и 10 А-В). Выражение GRP78 не была затронута (данные не показаны). Для того, чтобы определить, может ли гонокиол подавлять рост опухоли в естественных условиях Клетки, условия культивирования и реагенты Всего лизаты клеток получали, как описано ранее [44]. Белки разделяли с помощью сборного 8-20% электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, а затем электрофоретически переносили из геля на поливинилидендифторидную мембран. После блокирования блоты инкубировали с анти-GRP94, анти-GRP78, анти-каспазы 12, анти-каспазы 7, анти-ППА, анти-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), анти-калпаин-я (μ-калпаин), анти-калпаин-II (м-калпаин) (Santa Cruz Biotechnology) и анти-β актина (Sigma), антитела в PBS в пределах 0,1% Tween 20 в течение 1 ч, после чего три 10-минутных промывок в PBS в пределах 0,1% Tween 20. затем мембраны инкубировали с конъюгированного с пероксидазой хрена вторичного антитела, в течение 60 мин. В иммунопреципитации, белки (500 г), инкубировали со специфическими антителами и иммобилизованных на протеин А-сефарозы. Гранулы тщательно промывали буфером immunoprecipitative Bacco, в вареном, и микроцентрифуге. Ввод 10% от клеточного лизата для IP и 50 г белков анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Обнаружение проводили с Вестерн-блоттинга реагента ECL (Amersham) и ХЛ разоблачил пленок Kodak X-Omat. Клетки дважды промывали PBS, фиксировали в 4% параформальдегид в течение 30 мин, а затем блокировали путем инкубации в 1% бычьего сывороточного альбумина в PBS. Первичные антитела, как указано, были применены к слайдам при разведении 1:500 и инкубировали при 4 ° С в течение ночи. Образцы обрабатывали FITC-конъюгированных или TRITC-конъюгированных вторичных антител (Sigma). ФИТЦ-меченых или TRITC-меченые клетки затем анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Для лазерной микроскопии сканирования, иммунофлюоресценции меченных клетки анализировали с использованием инвертированного лазерного сканирующего микроскопа (Zeiss LSM 410 инвертировать, Германия), оснащенную как иона аргона (488 нм) и He-Ne (543 нм) лазеров. Совместной локализации двух меченых антигенов была обнаружена как единое изображение, когда были наложены изображения с обоих каналов. Конфокальные изображения были фона вычитали и объединены с помощью конфокальной Assistant программное обеспечение, и обработаны с помощью программного обеспечения Adobe Photoshop. Животные
<р> рак желудка является второй наиболее распространенной причиной смерти от рака в мире [1]. Почти две трети случаев происходят в развивающихся странах и в Китае, 42% в одиночку [1], [2]. Молекулярные мишени и механизмы, лежащие в основе плохого прогноза недостаточно хорошо изучены. Лечение местно-распространенного рака желудка остается серьезной проблемой. Несмотря на недавние успехи в лечении, клинический исход для больных раком желудка остается на низком уровне. Помимо хирургии, роль адъювантной терапии остается недоказанной [2], [3]. Таким образом, необходимость выявления потенциальных новых терапевтических и химиопрофилактики очевидна.
<Р> Honokiol, активный компонент, выделенный и очищенный от магнолии лекарственный
, было продемонстрировано, обладают эффекты анти-окисления [4], против перекисного окисления липидов [5] и противовоспалительный в пробирке
и в естественных условиях
[6], [7]. Honokiol также было показано, чтобы быть системно доступны и нетоксичного ингибитора ангиогенеза [8]. Недавние исследования сообщили, что хонокиол индуцирует каспазы-зависимый апоптоз в хронический лимфолейкоз клетках и преодолевает традиционную лекарственную устойчивость множественной миеломы человека путем индукции каспазы-зависимой и -независимый апоптоза [9], [10]. Хотя полная оценка клинического потенциала соединений пока не представляется возможным, фармакокинетики хонокиол был тщательно исследован, показывая, что хонокиол доступен по клинической терапии рака. Другие натуральные продукты, содержащие различные терапевтические соединений, полезных для профилактики развития злокачественных опухолей продолжают обнаруживаться; Тем не менее, очень мало известно о лежащих в их основе механизмов действия или их молекулярной мишени.
<р> Глюкоза-регулируемого белка (GRP) 94 является наиболее распространенным гликопротеин в эндоплазматической сети (ER) и быть идентифицированы только в позвоночным. Избыточная экспрессия антисмысловой и рибозим подходов в системах ткани культуры непосредственно показали, что GRP78 и GRP94 может защитить клетки от гибели [11] - [13]. Защитная функция ВРП также наблюдалась в устойчивости к радиации в рак шейки матки [14]. Антиапоптозный функция ВРП также предсказывает, что их индукция в опухолевые клетки может привести к опухолевой прогрессии и лекарственной устойчивости [15] - [18]. Патологические состояния, такие как рост опухоли и злокачественной опухоли было предложено соотнести с цитопротекторный белка GRP94 сверхэкспрессии [19]. В метастатической модели злокачественных новообразований, значительная Эффективность GRP94 на основе генной стратегии /иммунотерапии было показано, когда она была в сочетании с лучевой терапией [20]. ER играет непосредственную роль в активации подмножество каспазы в процессе активации апоптоза, который происходит во время ER стресса [21]. С другой стороны, калпаины представляют собой семейство Са 2 + -зависимые внутриклеточные цистеина протеаз. Повсеместно выразил кальпаином-I (μ-калпаина) и калпаина-II (м-калпаина) протеаз участвуют в развитии апоптоза. Недавнее исследование показало, что вездесущие калпаины способствуют каспазы-12 и активацию JNK во время ER стресс-индуцированного апоптоза [22]. Кроме того, было показано, что GRP94 с Ca 2 + -связывающего и антиапоптические свойства является протеолитический мишенью кальпаином во время этопозид-индуцированного апоптоза [23]. Кроме того, в нескольких экспериментальных моделях апоптоза, было показано, что аминоконцевой калпаин ингибирующее единица кальпастатина может быть расщеплен каспаз, что указывает на расщепление имеет важное значение для регуляции кальпаина активности во время гибели клеток [24] - [28] , Каспазы-7, который набирается на ER в подчеркнутых клетках, также может расщепляют и активировать каспазы-12 [29] - [31]. Эффекты хонокиол на GRPs связанной сигнализации и апоптоза до сих пор остаются неизвестными. В настоящем исследовании, мы исследовали молекулярные механизмы хонокиол на желудочную апоптоза клеток человека рака и роста опухоли в пробирке
и В естественных условиях
. Неожиданно мы обнаружили, что GRP94 испытывает специфический протеолитическое расщепление с помощью кальпаином во время хонокиол-индуцированного апоптоза. Эти наблюдения могут дать показания, что хонокиол является возможным терапевтическое средство для улучшения клинического исхода рака желудка.
Результаты
<р> Мы, во-первых исследовали эффекты хонокиол на выражениях GRP94 и GRP78 в различных желудочных линиях раковых клеток человека. Honokiol заметно уменьшает уровни GRP94 в дозы и зависимым от времени образом, но уровни GRP78 не влияет (рис. 1 и 2). Кинетика гонокиол индуцированных GRP94 расщепления в различных человеческих клеток рака желудка было показано на рис. 2. MKN45 или SCM-1 клетки были более стойкими к гонокиол индуцированных реакций, чем AGS или N87 клеток; уровни GRP94 сократились примерно на 50% в течение в два раза больше времени. Уровни GRP78 белков остаются неизменными во всех четырех желудочных линий раковых клеток. Кроме того, есть небольшие GRP94 белка выражения в нормальной мыши желудочный эпителий ткани и эндотелиальных клетках человека по сравнению с желудочным раковыми клетками (рис. 1в).
Honokiol индуцирует GRP94 расщепление ассоциированный отклик апоптический
<р> Как показано на рис. 3, гонокиол увеличил поли (АДФ-рибоза) полимеразы (PARP) расщепление и повреждение ДНК, индуцируемый ген ЧОП /GADD153 (белок был идентифицирован в качестве посредника ER стресс-индуцированной апоптоз) уровней в MKN45 клетках в дозы и зависит от времени способ. Honokiol 20 и 40 M также вызвало выражения расщепленной каспазы-12 и каспазы-7 (P20), что величина роста была пропорциональна времени (рис. 3б). К тому же, чтобы понять, было ли GRP94 расщепление участвует в организме человека клеток желудка апоптоз, апоптоз был обнаружен в GRP94-миРНК-трансфецированных клеток. Сайленсинг GRP94 с помощью миРНК индуцированного апоптоза клеток (рис. 4А) и снижение экспрессии GRP94 белка (рис. 4В-а). Мы также сравнили эффекты хонокиол на апоптоз и деградации GRP94 в раковых клетках желудка человека с химиотерапевтические агентом этопозид. Результаты показали, что обработка клеток гонокиол или этопозидом усиливает увеличение апоптоза (рис. 4, а) и деградацию GRP94 (рис. 4В-б). Когда клетки одновременно обрабатывали 40 М этопозид и 20 M хонокиол, большего увеличения деградации GRP94, чем они было показано (рис 4B-б.); эти результаты означают, что объединение хонокиол с другими противоопухолевыми препаратами может быть потенциальной терапевтической стратегией.
<р> Далее мы определить, являются ли активность кальпаином (кальций -зависимые тиоловых протеаз) будет индуцируется гонокиол в четырех желудочных линиях раковых клеток. Как показано на рис. 5A, гонокиол 20 М увеличивал кальпаином активность в зависимости от времени, который начал расти на 15 мин, и достиг максимума через 60 мин, а затем упала до более низкого уровня в 4 ч. Клетки оставались прилипший в течение времени, конечно, без потери жизнеспособности (данные не показаны). На рис. 5B, результаты показали, что увеличение активности кальпаина в ответ на гонокиол (20 и 40 м) в течение 60 мин в четырех желудочных линиях раковых клеток. Кроме того, кальпаином ингибиторы, N-ацетил-Leu-Leu-norleucinal (всех п), N-ацетил-Leu-Leu-methioninal (всех т), и Z-Leu-Leu-CHO, эффективно ингибирует увеличение кальпаина активности, вызванное гонокиол в N87 и клетках SCM-1 (рис. 5в).
Локализация и взаимодействие кальпаина-II и GRP94 следующие хонокиол лечения
<р> Следующим шагом было выяснение роли из кальпаина-II в хонокиол-индуцированной деградации GRP94. В лазерной конфокальной микроскопическом исследовании, локализация белка калпаин-II определяли с помощью зеленой флуоресценции, в то время как локализация GRP94 определялась красной флуоресценции. Как показано на рис. 7В, как калпаин-II и GRP94 были обнаружены в цитоплазме с совместной локализации в клеток рака желудка человека. Флуоресценции кальпаина-II постепенно увеличивалась, но флуоресценция GRP94 постепенно уменьшается в клеток рака желудка человека при лечении хонокиол. Для дальнейшего подтверждения результатов иммуногистохимического окрашивания, что калпаина-II взаимодействует с GRP94, были проведены испытания совместно иммунопреципитации и Вестерн-блоттинга в клетках рака желудка. Как показано на рис. 7C, калпаин-II была специфически связана с GRP94 в различных клеток рака желудка в присутствии гонокиол (20 и 40 м) по сравнению с контролем IgG. Кроме того, мы проверили, были ли вовлечены протеолитические деятельность каспазы, протеасоме или катепсина в расщеплении GRP94. Наши результаты показали, что обработка клеток ингибиторами каспаз (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK и Z-DEVD-ФМК, 50 М) при высокой дозе частично блокировали расщепление GRP94 во время гонокиол-индуцированного апоптоза (рис. 8А ) по сравнению с ингибитором кальпаина всех т 25 м, что может полностью блокировать GRP94 расщепление. Предварительная обработка клеток с ингибитором ингибитора катепсина B CA-074-Me 25 и 50 м и катепсина L ингибитор катепсина L II 25 и 50 М и Протеасома ингибитором MG132 0,1-10 М не смог блокировать GRP94 расщепление (рис. 8B и 8C) , Кроме того, специфическое расщепление GRP94 путем кальпаином можно было наблюдать с помощью клеточных лизатов, полученных из клеток рака желудка человека (данные не показаны).
<Р> Затем мы исследовали, требуется ли активация калпаин для гонокиол индуцированных апоптоза клеток. На рис. 9, прирост экспрессии калпаина-II белка и деградации GRP94 и каспазы-7 и активации каспазы-12, индуцированные хонокиол (40 М) были предотвращены фармакологических ингибиторов калпаина и транзиторной трансфекции миРНК-кальпаина-II в клетках SCM-1.
, твердые опухоли были установлены у мышей и эффект противоопухолевой неоднократно впрыскивают Изучена гонокиол. Как показано на рис. 10B, введение хонокиол 0,5 и 1,5 мг /кг показали значительную противоопухолевую активность.
Обсуждение
<р> Мы сообщили здесь в первый раз, что калпаина, A nonlysosomal Ca 2 + -активированную цистеин-протеазы, особенно кальпаином-II, играет ключевую роль в расщеплении GRP94, но GRP78 не влияет, и в регуляции апоптоза, индуцированного гонокиол в клеток рака желудка человека. В частности, мы обеспечили функциональные доказательства того, что при расщеплении GRP94 при гонокиол лечения действует в качестве терапевтического эффекта, ингибирования роста опухоли в мышиной модели карциномы желудка человека. Насколько нам известно, это первый отчет, чтобы показать, что хонокиол может манипулировать кальпаином-индуцируемый шаперонная белка деградации GRP94 быть объектом во время апоптоза.
<Р> Исследования, проведенные в нескольких лабораториях указали на ER в качестве целевого отсека с помощью терапевтических агентов вовлеченного в исполнении апоптозу. Цитозольного Са 2+ участвует в качестве второго посланника proapoptosis, участвующих в обоих запускающего апоптоз и регулирующих каспаз или кальпаинов [32] - [34]. Недавнее исследование показало, что калпаина является важным медиатором ресвератрола (естественный завод полифенолов) -индуцированное апоптоз при раке молочной железы [35]. Они обнаружили, что ресвератрол может привести к увеличению внутриклеточного Са 2 +, и активирует кальпаином-опосредованный апоптоз, что приводит к деградации плазматической мембраны Ca 2 + -АТФазы изоформы 1 и фодрина в каспазы-3 дефицитной MCF- 7 клеток. Honokiol также сообщалось, чтобы побудить Ca 2 + мобилизация в крысиных корковых нейронов и нейробластомы человека SH-SY5Y клеток, предположительно через активацию фосфолипазы С и IP <суб> 3 рецепторов [36]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что хонокиол способен повышать активность кальпаина и экспрессии белка калпаина-II, но не кальпаином-I во время хонокиол индуцированных клеток желудка апоптоза. Кроме того, ингибиторы кальпаином и глушение кальпаина-II по миРНК значительно отменила хонокиол апоптоз, вызванный. Эти находки указывают на то, что Са 2 + -triggered активация калпаина-II может играть потенциальную роль в хонокиол-индуцированного апоптоза.
<Р> GRP94 /gp96 является членом резидентов ЭР семейства HSP90. GRP94 играет важную роль в поддержании клеточного гомеостаза. Это условное понятие GRP94, как белка складывания компаньонки обновляется открытиями, которые способствуют GRPS пролиферации опухоли, метастазирование, устойчивость к лекарствам, и иммунотерапию, которые имеют серьезные клинические последствия для прогноза и лечения онкологических заболеваний [3]. GRP94 было показано, связано с туморогенности в линиях раковых клеток, моделях опухолей с грызунами и биопсий рака человека [37] - [39]. Это согласуется с выводами, что индукция вызывает ВРП защитную функцию в качестве ответов на выживание питательного голодания, ацидоза и условиях гипоксии, которые являются общими в плохо васкуляризированных солидных опухолей [11], [40]. Кроме того, было оказалось, что большая часть ВРП в опухолевых клетках участвует в нескольких шаперонов комплексов, в то время как оно не в нормальных клетках [41]. Вакцинация мышей полученные из опухоли стрессовых белков, GRP94, могут вызывать противоопухолевые иммунные реакции, что дает заметное подавление роста опухоли и метастазов. Активность ингибиторов Hsp90 была хорошо подтверждена в доклинических моделях рака молочной железы, как в исследованиях монотерапии и в сочетании с традиционной химиотерапией [41]. Кроме того, было высказано предположение, что GRP94 является физиологическим субстратом для кальпаином [23]. Кальпаином Было показано, что активируется на мембране ER, где он взаимодействует с GRP94, что приводит к его специфической протеолитическим расщеплением, как клетки подвергаются апоптозу, спровоцированные этопозид [23]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что хонокиол индуцированных GRP94 расщепление и апоптоз клеток рака желудка человека может быть полностью отменено кальпаином ингибиторы и молчание кальпаина-II с помощью миРНК. Ингибиторы каспаз в высоких дозах частично отменила хонокиол-индуцированной GRP94 расщепление. Предварительная обработка клеток с катепсина В и ингибиторов L и ингибитора протеасом не смог блокировать гонокиол индуцированных GRP94 расщепление. Мы также показали, что глушение GRP94 с помощью миРНК может вызвать рак желудка апоптоз клеток. Кроме того, результаты иммуногистохимического окрашивания и иммунопреципитации выявили специфическое взаимодействие GRP94 с кальпаина-II в клетках рака желудка следующий гонокиол лечения. Специфическое расщепление GRP94 путем кальпаином также можно было наблюдать с помощью клеточных лизатов, полученных из клеток рака желудка человека. Эти данные, следовательно, позволяют предположить, что калпаина-II-опосредованную GRP94 расщепление играет важную роль в хонокиол запускаемых клеток желудка апоптоза.
<Р> калпаины и каспазы два семейства цистеиновых протеаз, что они участвуют в регуляции патологической клетки смерть [22], [31]. Эти протеазы разделяют несколько субстратов смерти, связанных в том числе каспаз себя, белки цитоскелета, Bax и Bid [42]. Кальпаином-опосредованного протеолиза протекает в ограниченной степени, но не требует конкретного аминокислотного остатка, как у каспаз. Хотя оба калпаин и каспазы было предложено играть важную роль в регуляции патологическую гибель клеток, взаимодействия этих двух семейств протеаз при патологических состояниях не ясны. В настоящем исследовании, нокдаун и фармакологические ингибиторы подходы внесли значительный вклад в наши знания о кальпаина биологии, особенно в отношении его специфической функции на апоптоза клеток, что возможно, что каспазы 7 и 12 ниже по течению от кальпаином в опосредовании хонокиол-индуцированного рака желудка апоптоз клеток.
<р> препараты натуральный продукт было предложено играть доминирующую роль в фармацевтической помощи [43]. Натуральные продукты являются одним из важных источников потенциального химиотерапевтического и химиопрофилактики [43]. Honokiol широко используется в традиционной китайской и японской медицине в течение нескольких тысяч лет, в основном, для лечения анти-тромбоцитарного, антибактериальное, противовоспалительное и успокаивающее действие. Предыдущие отчеты показали, что хонокиол также обладающий мощным противовоспалительным и опухолевые антиангиогенные свойства [6], [19], [38]. Однако точный молекулярный механизм выставленного противоопухолевой активности путем хонокиол не очень хорошо понял. Таким образом, результаты этого исследования, предоставляют доказательства для противоопухолевой активности хонокиол при раке желудка с, и что еще более важно, молекулярную основу ее эффекта. Мы обнаружили, что гонокиол индуцирует активацию кальпаином, GRP94 расщепление, и апоптоза в клетках рака желудка человека. К тому же, после введения гонокиол оголенным Ниццей имплантированы MKN45 желудочных опухолевых клеток показали значительную противоопухолевую активность. Это Доклинические исследования могут служить основой и представляет собой многообещающим новый целевой подход. Кроме того, природные соединения, как было показано, что в сочетании с обычными цитостатическими агентами, могут быть полезными при клинической противоопухолевыми препаратами. Это преимущество плюс новые данные о его противоопухолевых механизмов делают хонокиол продолжающуюся клиническое применение для быть эффективным и безопасным противоопухолевый агент.
Материалы и методы
<р> линий клеток человека в том числе кавказских желудочных линий раковых клеток (AGS, умеренно-слабо дифференцированы линии клеток аденокарциномы и N87, хорошо дифференцированы клеточной линии карциномы) и азиатских желудка клеточных линий рака (MKN45 и SCM-1, недифференцированные клетки аденокарциномы) были получены из банка клеток в раковой центре ветеранов Тайбэй больницы общего профиля (Тайвань). Клетки поддерживали в среде RPMI 1640, содержащей 10% инактивированной нагреванием FCS (Life Technologies) и стрептомицина /пенициллин (Life Technologies) в увлажненной 5% CO <суб> 2 атмосферы. Honokiol получали из Wako Chemical Company (Япония), и его чистота была определена как минимум на 99% с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Вестерн-блоттинга и иммунопреципитации
кальпаином Определение активности
<р> Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC является субстратом калпаин протеазы. Количественное 7-амино-4-метилкумарин (АМС) флуоресценции позволяет контролировать ферментного гидролиза конъюгата пептид-AMC и может быть использован для измерения активности фермента. Клетки были получены и обработаны на 24-луночные планшеты Корнинг /Costar. Перед добавлением ингибиторов клетки нагружали 40 м Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) и обрабатывают гонокиол для указанного времени при температуре 37 ° C в увлажненной 5% CO <суб> 2 инкубаторе. Протеолиза флуоресцентного зонда контролировали с помощью флуоресцентного пластины чтения системы (HTS-7000 Plus Series биооценки, Perkin Elmer) с настройками фильтра 360 ± 20 нм для возбуждения и 460 ± 20 нм для эмиссии.
миРНК и Трансфекция
Assays <р> миРНК дуплексы специфичные для ингибирования кальпаина-I (μ-кальпаина) и кальпаина-II (м-кальпаина) выражения в клетках человека были получены от Santa Cruz Biotechnology: кальпаина-I, № по каталогу , SC-29885, пул 3 целевых показателей конкретного 20-25 нт миРНК; калпаина-II, № по каталогу. SC-41459, мишень конкретных 20-25 нт миРНК. (№ по каталогу. SC-37007) киРНК управления является ненацеливании 20-25 нт миРНК разработаны в качестве отрицательного контроля. Кроме того, миРНК дуплексы специфические для ингибирования экспрессии GRP94 синтезируют коммерчески MWG Biotech (Германия). Смысл (вверху) и антисмысловые (внизу) последовательности дуплекса GRP94 миРНК были следующими: 5'-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 '; 3'-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 '. В качестве неспецифической управлением, NC миРНК дуплекса со случайными последовательностями была разработана следующим образом: 5'-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 '; 3'-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 '. Эти siРНК, использовались в концентрации 100-200 нМ для временной трансфекции клеток с липофектином (Invitrogen) на лунку в 6-луночный планшет со свежей средой. Через 24 ч от начальной трансфекции и 24-36 лечения ч, клетки или клеточные лизаты собирали и анализировали на апоптоз или экспрессии белка, соответственно.
иммунофлуоресценции и лазерный сканирующий конфокальной микроскопией
<р> Йодидный аннексина-V FITC и PI Double Окрашивание аннексина V /пропидия (BD Clontech), использовали для количественного определения количества апоптотических клеток, как описано ранее [44]. Клетки дважды промывали ПБС и окрашивали аннексина V и PI в течение 20 мин при комнатной температуре. Уровень апоптоза определяли путем измерения флуоресценции клеток на проточном цитометре (Becton Dickinson). сбор и анализ данных были выполнены программой CellQuest (Becton Dickinson).
<р> Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами, принятыми Комитетом экспериментов на животных, Национального университета Чжунсин мимо, Тайчжун, Тайвань. Мужчина BALB /C голых мышей ( ню /ню
) были приобретены у NLAC Тайвань, Inc., Тайбэй, Тайвань. Мышей выращивали и поддерживали под конкретного патогена условиях, при условии, стерилизованной пищи и воды вволю, и помещен в барьерном объекте с 12 ч свет /темнота циклов. Экспериментальные процедуры были выполнены на 6-недельных мышей. Животных подвергали эвтаназии, когда они появились умирающий.
Анализ роста опухоли
<р> Cell туморогенность был рассмотрен в 6-недельных самцов BALB /C голых мышей. В кратком изложении, 4 × 10 6 клеток (MKN45) в экспоненциальной фазе роста, суспендировали в 1 мл культуральной среды с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Одноклеточного суспензию MKN45 подкожно инокулировали в спинной стороне мышей. Опухоли были созданы в течение 14 дней после того, как MKN45 клеток прививки и с последующей обработкой автомобиля, 0,5 и 1,5 мг /кг хонокиол каждый день в течение 10 дней (7 мышей /группа). Объем имплантированной опухоли в спинной стороне мышей измеряли два раза в неделю с суппортом, используя формулу V
= ( LW
2) я /6: где V
, объем (мм 3); L
, самый большой диаметр (мм); W
, наименьший диаметр (мм).
Immunohistochemistry
<р> Выражение GRP94 в солидной опухоли мышей исследовали с помощью иммуногистохимии. Тонкие опухолевые срезы (5 мкм) получали, фиксировали холодным ацетоном, блокировали 3% пероксидазой водорода и окрашивали для первичного антитела GRP94.
Статистический анализ
<р> Значения, приведенные в данном исследовании представлены в виде среднего значения ± SEM. Все анализы были выполнены с помощью дисперсионного анализа с последующим не менее существенной разницы тестом Фишера. P
значение менее 0,05 рассматривалось как статистически значимо.
Тяжелые осложнения COVID-19, связанные с нарушением кишечного барьера
Микробиом спермы выявлен с помощью секвенирования РНК
Новый инструмент для расшифровки микробиома кишечника
Пищеварительные проявления распространены, но незначительны среди госпитализированных пациентов с COVID-19
Микропластик впервые обнаружен в отходах жизнедеятельности человека
Исследования связывают распространенность SARS-CoV-2,
Апоптоз - важный медиатор патогенеза коронавирусной инфекции животных.
Апоптоз - это форма запрограммированной гибели клеток, который возникает в клетках, которые непоправимо повреждены, или в клетках, инфицированных некоторыми вирусами. Этот механизм чрезвычайно важен д
Микробиом кишечника также присутствует в жизни плода.
Исследование, опубликованное в Журнал клинических исследований показывает, что и у мышей, и у людей кишечник плода имеет свой микробиом, который, вероятно, происходит прямо из материнского организма
Нил Белл назначен директором по развитию Avacta Life Sciences
Avacta Group plc, разработчик Affimer ® биотерапевтические препараты и реагенты, рада объявить о немедленном назначении Нила Белла директором по развитию Avacta Life Sciences. Нил будет отвечать за