Background VerfÜgung
Honokiol, eng kleng molekulare Gewiicht natierlech Produit, gouf mächtegst anti-neoplastic an Anti-angiogenic Eegeschaften ze besëtzen gewisen. Seng molekulare Mechanismussen an d'Fäegkeet vun Anti-gastric Kriibs bleiwen onbekannt. Et gouf gewisen, datt d'Anti-apoptotic Funktioun vun den Zockerspigel-reegelen Proteinen (GRPs) renomméierter däitscher Zeitung, datt hir Aféierungs- zu neoplastic Zellen zu Kriibs Werdegang an Drogenofhängeger Resistenz Féierung kann. Mir lant de Folge vun honokiol op d'Regelung vun GRPs an apoptosis zu Mënsch gastric Kriibs Zellen an entholl Wuesstem. VerfÜgung
Methodik an Principal effektiv VerfÜgung
Prefabrizéierten vun verschiddenen Mënsch gastric Kriibs Zellen mat honokiol un der Leedung Aféierungs- vun GRP94 Rëss, mä huet Afloss GRP78 net. Silencing vun GRP94 duerch kleng interfering RNS (siRNA) konnt Zell apoptosis induce. Traitement vun Zellen mat honokiol oder chemotherapeutics Agent etoposide verstäerkte d'Erhéijung vun apoptosis an GRP94 ofgeschnidden. D'calpain Aktivitéit an calpain-II (m-calpain) FAQ (awer net calpain-ech (μ-calpain)) Niveau kéint och vun honokiol fräi ginn. gezielt calpain-II an calpain inhibitors Honokiol-entschlof GRP94 verwandelt-Regulatioun an apoptosis zu gastric Kriibs Zellen vun siRNA kéint réckgängeg. Doriwwer eraus, datt d'Resultater vun immunofluorescence staining an immunoprecipitation engem spezifeschen Interaktioun vun GRP94 mat calpain-II zu Zellen folgenden honokiol Behandlung. Mir observéiert nächst datt entholl GRP94 iwwer-Ausdrock an entholl Wuesstem zu BALB /c Sauna Mais, déi mat mënschlechen gastric Kriibs Zellen MKN45 inoculated goufen, sinn Ofstand vun honokiol Behandlung ofgeholl. VerfÜgung
Konklusiounen an Grousses VerfÜgung
déi Dës Resultater vum éischten Beweiser datt calpain-II-mediated GRP94 Rëss bewierkt Mënsch apoptosis gastric Kriibs Zell honokiol-entschlof. Mir proposéiere weider dass honokiol eng méiglech therapeutesch Agent kann Medeziner Resultat vun gastric Kriibs ze verbesseren VerfÜgung
Fro:. Sheu ML, Liu néirens, Lan KH (2007) Honokiol Induces Calpain-Mediated Glukose-reegelen Protein-94 Rëss an Apoptosis zu Mënscherechter Gastric Cancer BTS an verklengert entholl Wuesstem. PLoS NËMMEN 2 (10): e1096. Doi: 10.1371 /journal.pone.0001096 VerfÜgung
Akademesch Redakter: Hany El-Shemy, Kairo University, Egypten VerfÜgung
Arnaque: 26 Juni, 2007; Akzeptéiert: 10 Oktober 2007; Publizéiert: 31. Oktober 2007 VerfÜgung
Copyright: © 2007 Sheu et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung
Funding:. Dës Aarbecht war déi vun der Recherche Stipendien aus National Science Conseil vun Taiwan (NSC95-2320-B040-005) ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung
Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung
Gastric Kriibs ass déi zweet Équipe gemeinsam Ursaach vum Kriibs Doud an d'Welt [1]. Bal zwee-Drëttel vun de Fäll virkommen an Entwécklungslänner an 42% an China gehalen [1], [2]. D'molekulare Ziler a Mechanismen aarmséileg hätt Basisdaten sinn net gutt verstanen hunn. D'Behandlung vun lokalen fortgeschratt gastric Kriibs bleift eng grouss Erausfuerderung. Trotz leschte Schrett an Behandlung, bleift d'Medeziner Resultat fir gastric Kriibs Patienten aarm. Ausser Agrëff, d'Roll vun adjuvant Therapie bleift unproven [2], [3]. Dofir musst Potential Roman therapeutesch an chemopreventive Agenten ze identifizéieren ass kloer. VerfÜgung
Honokiol, eng aktiv Komponent isoléiert an Dir sidd aus der Magnolia officinalis VerfÜgung, huet bewisen, gouf d'Auswierkunge vun Anti-Chemiker ze besëtzen [4], géint Lipid peroxidation [5] an Anti-demagogesch kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung [6], [7]. Honokiol huet och eng systemesch sinn an Net-gëfteg inhibitor vun angiogenesis gin gewise [8]. Déi rezent Etude confirméiert datt honokiol caspase-ofhängeg apoptosis zu B-Zell chronescher Rezepter Leukämie Zellen an overcomes konventionell Drogen Resistenz zu Mënsch Multiple myeloma vun Aféierungs- vun caspase-ofhängeg an -independent apoptosis [9], [10] induces. Obwuel e voll Beurteelung vun de Medeziner Potential vun der awer nach net méiglech ass, ass déi pharmacokinetics vun honokiol grëndlech propagéieren, datt honokiol demaskéierte op Medeziner Kriibs Therapie sinn ass. Méi natierlech Produiten enger Varietéit vun therapeutesch awer sënnvoll an d'Préventioun vun der Entwécklung vun malignancies gin entdeckt weider mat; Ee, ass ganz wéineg iwwert hir Basisdaten Mechanisme vun Aktioun oder hir molekulare Zil- bekannt. VerfÜgung Glukose-reegelen FAQ (VIDEO) 94 enger meescht räich glycoprotein zu endoplasmic reticulum ass (ËH) an nëmmen zu Wierbeldéieren identifizéiert ginn. Iwwer-Ausdrock antisense an ribozyme Approche zu Stoffer Kultur Systemer hien direkt, datt GRP78 an GRP94 Zellen géint Doud schützen kéint [11] - [13]. D'Schutz- Funktioun vun der GRPs huet och zu Resistenz zu Stralung vun cervical Kriibs [14] observéiert ginn. D'Anti-apoptotic Funktioun vun der GRPs renomméierter däitscher Zeitung och, dass hir Aféierungs- zu neoplastic Zellen zu Kriibs Werdegang an Drogenofhängeger Resistenz Féierung kann [15] - [18]. Agebousst Konditiounen wéi entholl Wuesstem an malignancy gewiescht mat cytoprotective FAQ GRP94 iwwer-Ausdrock [19] ze vergläichen ugeholl. An metastatic malignancies Modell, e wesentleche Efficacitéit vun der GRP94-baséiert Gentherapie /immunotherapy Strategie gewise gouf, wou et mat Bestrahlungen [20] kombinéiert huet. D'ËH spillt en direkten Roll engem Ziel vun caspase während Aktivatioun vun apoptosis zu activating dass während ËH Stress existeiert [21]. Op der aner Hand, sinn calpains enger Famill vu Ca Kinetik vun GRP94 proteolytic Rëss am mënschleche Linnen gastric Kriibs Zell mat honokiol VerfÜgung behandelt Mir iwwerpréift éischtens d'Auswierkunge vun honokiol op der Ausstralung vun GRP94 an GRP78 zu verschiddenen Mënsch gastric Kriibs Zell Linnen. Honokiol Ofstand Verloschter de Niveau vun GRP94 zu engem dose- an Zäit-ofhängeg Manéier, mä GRP78 Niveau sinn net betraff (ausstinn. 1 an 2). Kinetik vun honokiol-entschlof GRP94 Rëss an verschiddenen Mënsch gastric Kriibs Zellen sech am Lalumi gewisen. 2. MKN45 oder SCM-1 Zellen sech méi resistent honokiol-entschlof Äntwerte wéi AGS oder N87 Zellen; den Niveau vun GRP94 sech fir duebel esou vill Zäit mat iwwer 50% reduzéiert. Den Niveau vun GRP78 Proteinen bleiwen an all véier gastric Kriibs Zell Linnen. Ausserdem ginn et wéineg GRP94 FAQ Ausstralung an normal Maus gastric epithelium Otemschwieregkeeten a mënschlech endothelial Zellen als Verglach mat gastric Kriibs Zellen (Figebam. 1c). VerfÜgung Honokiol induces GRP94 Rëss-verbonne apoptotic Äntwert VerfÜgung als zu Lalumi gewisen. 3, honokiol der puer dovun (Kréien-ribose) polymerase (PARP) Rëss an DNA Schued inducible Gentherapie schneiden /GADD153 (e FAQ identifizéiert gouf ËH Stress-entschlof apoptosis zu Mediate) fräi Niveauen am MKN45 Zellen zu engem dose- an Zäit-ofhängeg Manéier. Honokiol 20 an 40 M ausgeléist och den Ausdrock vun eenalecn caspase-12 an caspase-7 (p20), déi d'visuell Magnitude vum Erhéijung fir de timing proportional war (Figebam. 3B). Desweideren, ze verstoen ob GRP94 Rëss an de Mënsch apoptosis gastric Kriibs Zell Équipe war, war am GRP94-siRNA-transfected Zellen apoptosis fonnt. Silencing vun GRP94 vun siRNA entschlof Zell apoptosis (Figebam. 4A) a rofgaang GRP94 FAQ Ausdrock (Figebam. 4B-e). Mir Verglach och d'Auswierkunge vun honokiol op apoptosis an GRP94 ofgeschnidden an mënschlechen gastric Kriibs Zellen mat chemotherapeutics Agent etoposide. D'Resultater weisen, datt Behandlung vun Zellen mat honokiol oder etoposide d'Erhéijung vun apoptosis (Figebam. 4A) gestäerkt a GRP94 ofgeschnidden (Figebam. 4B-b). Wann Zellen sech gläichzäiteg mat 40 M etoposide an 20 M honokiol, e groussen Zouhuele GRP94 ofgeschnidden behandelt wéi se gewisen huet war (Lalumi 4B-b.); dës Resultater zou, datt mat anere anticancer Drogen vun honokiol der kombinéiert vläicht e Potential therapeutesch Strategie ginn. VerfÜgung Calpain fir honokiol-mediated Zell apoptosis VerfÜgung néideg ass Mir sech nächst ob d'Aktivitéit vun calpain (Kalzium -dependent thiol proteases) géif vun honokiol zu véier gastric Kriibs Zell Linnen entschlof ginn. Als zu Lalumi gewisen. 5A, honokiol 20 M fräi calpain Aktivitéit zu enger Zäit-ofhängeg Manéier, déi um 15 min Deux huet, an erreecht 60 min, an nëmmen dann op 4 h zu engem méi nidderegen Niveau erof. Zellen blouf Operstéiungszeen iwwer d'Zäit natierlech, mat kee Verloscht vun Nuetsvolen (Donnéeën net gewisen). An Figebam. 5B, huet d'Resultater, déi d'Erhéijung vun calpain Aktivitéit an Äntwert ze honokiol (20 an 40 M) fir 60 min zu véier gastric Kriibs Zell Linnen. Ausserdeem, inhibited calpain inhibitors, N-acetyl-Leu-Leu-norleucinal (ALLN), N-acetyl-Leu-Leu-methioninal (ALLM), an Z-Leu-Leu-CHO, effektiv d'Erhéijung vun calpain Aktivitéit vun honokiol entschlof an N87 an SCM-1 Zellen (Figebam. 5C). VerfÜgung Mir weider getest, ob calpain Aktivitéit ofgeholl der Fähegkeet vun honokiol op apoptosis Aféierungs- Kompromëss kéint. Als zu Lalumi gewisen. 6A, honokiol (40 M) entschlof Zell apoptosis zu SCM-1 Zell, déi vun calpain inhibitors (ALLN oder ALLM) opgehuewe ginn hätt. honokiol verstäerkte calpain-II FAQ Tastatur, mee net calpain-ech FAQ Ausstralung an SCM-1 Zellen (Figebam. 7A). zu engem groussen Reduktioun vun honokiol (20 M) -induced apoptosis zu Mënsch gastric Kriibs Zellen no 4 h Behandlung (Figebam. 6B) gefouert engem siRNA Approche benotzt fir calpain-II Aktivitéit knockdown. SiRNA-calpain-ech hat Afloss net honokiol-entschlof apoptosis (Figebam. 6B). VerfÜgung Lokalisatioun an Interaktioun vun calpain-II an GRP94 folgenden honokiol Behandlung VerfÜgung Déi nächst Schrëtt der Roll entschlësselen war fir vun calpain-II zu GRP94 ofgeschnidden honokiol-entschlof. An Laser confocal microscopic studéieren, war d'Lokalisatioun vun calpain-II FAQ déi gréng fluorescence sech hierkommen d'Lokalisatioun vun GRP94 duerch rout fluorescence sech war. Als zu Lalumi gewisen. 7B, souwuel calpain-II an GRP94 sech zu Zytoplasma mat Co-Lokalisatioun vun mënschlech gastric Kriibs Zellen fonnt. D'fluorescence vun calpain-II gouf lues fräi, mä fluorescence vun GRP94 war zu Mënsch gastric Kriibs Zellen ënner honokiol Behandlung graduell erofgaangen. Fir weider d'Resultater vun immunocytochemical staining confirméieren datt calpain-II mat GRP94 openee, den Tester vun de Ko-immunoprecipitation a Western blotting zu gastric Kriibs Zellen sech gesuergt. Als zu Lalumi gewisen. 7C, calpain-II gouf speziell mat GRP94 zu verschiddenen gastric Kriibs Zellen an der Präsenz vun honokiol (20 an 40 M) assoziéiert wéi mat IgG Kontroll Verglach. Desweideren, getest mir ob der proteolytic Aktivitéite vun caspase, proteasome oder cathepsin waren an der Rëss vun GRP94 Équipe. Eis Resultater weisen, datt Behandlung vun Zellen mat caspase inhibitors (AC-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK an Z-DEVD-FMK, 50 M) op héich Dosis deelweis d'Rëss vun GRP94 während honokiol-entschlof apoptosis (Lalumi blockéiert. 8A ) sou mat calpain inhibitor Verglach ALLM 25 M, wat komplett GRP94 Rëss Spär konnt. Pretreatment vun Zellen mat der cathepsin B inhibitor CA-074-me 25 an 50 M an L cathepsin inhibitor cathepsin L inhibitor II 25 an 50 M an proteasome inhibitor MG132 0.1-10 M hat GRP94 Rëss ze blockéieren (ausstinn. 8B an 8C) . Ausserdeem, konnt de spezifeschen Rëss vun GRP94 vun calpain vum Mënsch gastric Kriibs Zellen bereet Zell lysates observéiert ginn benotzen (Daten dës net). VerfÜgung Mir propagéieren nächst ob der calpain Aktivéierung fir honokiol-entschlof Zell apoptosis néideg ass. An Figebam. 9, déi Erhéijunge vun calpain-II FAQ Ausdrock an GRP94 ofgeschnidden an caspase-7 an caspase-12 Aktivatioun vun honokiol entschlof (40 M) waren déi pharmacological calpain inhibitors a flüchteg transfection vun siRNA-calpain-II zu SCM-1 Zellen verhënnert. VerfÜgung honokiol attenuates entholl GRP94 iwwer-Ausdrock an entholl Wuesstem an Sauna Mais VerfÜgung gewaltege Sträit Mais mat 4 × 10 Mir ginn hei fir d'éischte Kéier, datt calpain, engem nonlysosomal Ca Ënnersich vu multiple Laboratoiren an der ËH als Zil unzekräizen dodrun vun therapeutesch Agenten agebonne zu apoptosis Ausféierung. Cytosolic Ca GRP94 /gp96 ass d'ËH résident Member vun der HSP90 Famill. GRP94 spillt eng wichteg Roll bewosst homeostasis an ënnerhalen. Dëst konventionell Konzept vun GRP94 als FAQ folding chaperone ass duerch d'Entdeckungen aktualiséiert datt entholl Prolifératioun, Metastasen, Drogen- Resistenz GRPs förderen, a immunotherapy, déi an der Iwwregens hätt a Behandlung vu Kriibs grouss Krankheete Konsequenzen hunn [3]. GRP94 huet bewisen gouf mat tumorigenicity zu Kriibs Zell Linnen, Knabberdéieren entholl Modeller a mënschlech Kriibs biopsies verbonne ginn [37] - [39]. Dat ass konsequent mat de Conclusiounen, déi de Aféierungs- vun GRPs engem Schutzpatrounin Funktioun als d'Iwwerliewe Äntwerte Nährwert Honger bewierkt, acidosis, an hypoxia Konditiounen, déi an schlecht vascularized staark erhéijen gemeinsam ginn [11], [40]. Et ass och versicht ginn, datt déi meescht vun de GRPs zu entholl Zellen am Multi-chaperone investéiert engagéiert ass, wann et net zu normalen Zellen [41] ass. Impfpass vun Mais mat entholl-ofgeleet Stress Proteinen, kann GRP94, dran anti-entholl immun Äntwerte, eng schéi Ennerdréckung vun entholl Wuesstem an Metastasen noginn. Der Aktivitéit vun Hsp90 inhibitors gouf zu preclinical Broscht Kriibs Modeller, souwuel eenzel-Agent Studien an a Kombinatioun mat konventionelle Chimiotherapie [41] gutt validéiert. Desweideren, et gëtt ugeholl, datt GRP94 eng Fro gestallt Realitéiten fir calpain ass [23]. Calpain gouf um ËH Membran ageschalt bewisen gin, wou et mat GRP94 openee, an hir spezifesch proteolytic Rëss doraus wéi d'Zellen apoptosis vun etoposide ausgeléist hi [23]. Am Moment studéieren, hunn mir dass honokiol-entschlof GRP94 Rëss an apoptosis mënschlechen Zellen gastric Kriibs kann komplett vun calpain inhibitors an silencing vun calpain-II vun siRNA réckgängeg gemaach ginn. Caspase inhibitors op héich Dosis réckgängeg deelweis de honokiol-entschlof GRP94 Rëss. Pretreatment vun Zellen mat der cathepsin B an L inhibitors an proteasome inhibitor ass knapp honokiol-entschlof GRP94 Rëss ze blockéieren. Mir bewisen, och dass gastric Kriibs Zell vun GRP94 vun siRNA silencing apoptosis induce kann. Doriwwer eraus, datt d'Resultater vun immunocytochemical staining an immunoprecipitation engem spezifeschen Interaktioun vun GRP94 mat calpain-II zu gastric Kriibs Zellen folgenden honokiol Behandlung. Déi spezifesch Rëss vun GRP94 vun calpain och observéiert ginn hätt aus Mënsch gastric Kriibs Zellen bereet Zell lysates benotzt. Dës bruet, also, proposéiere datt calpain-II-mediated GRP94 Rëss spillt eng wichteg Roll an honokiol-ausgeléist gastric Kriibs Zell apoptosis. VerfÜgung Calpains an caspases sinn zwou Famillen vun cysteine proteases datt se zu Regulatioun agebousst Zell Équipe sinn Doud [22], [31]. Dës proteases deelen puer Doud-Zesummenhang heescht de Législateur, dorënner caspases selwer, cytoskeletal Proteinen, Bax, a richteg [42]. Calpain-mediated proteolysis Erléis vun enger limitéierter Manéier awer net e spezifeschen Aminosaier lafenden wéi déi vun caspases verlaangen. Obwuel souwuel calpain an caspase proposéiert goufen zu Regulatioun agebousst Zell Doud wichteg Roll ze spillen, sinn d'Interaktiounen tëscht deenen zwou Famillen vun proteases ënner agebousst Konditiounen net kloer. Am Moment studéieren, knockdown an pharmacological inhibitors Approche hu vill un eist Wëssen vun calpain Biologie, besonnesch mat Respekt un hir spezifesch Funktioun op Zell apoptosis bäigedroen, wat méiglech ass, datt caspases 7 an 12 aus calpain matgeholl ginn gastric Kriibs zu mediating honokiol-entschlof Zell apoptosis. VerfÜgung Natural Produit Drogen goufen eng dominant Roll an pharmazeuteschen Pfleeg ze spillen ugeholl [43]. Natural Produite sinn eent vun de wichtegste Quelle vun Potential Kriibs chemotherapeutic an chemopreventive Agenten [43]. Honokiol ass fir e puer dausend Joer an der traditioneller chinesescher a Japanesch Medezin oft benotzt, virun allem, fir d'Behandlung vun Anti-thrombocytic, anti-bakteriell, anti-demagogesch, an anxiolytic Effekter. Virdrun Rapporten hunn jo bewisen, dass honokiol ass och mächtegst anti-neoplastic an Anti-angiogenic Eegeschafte [6], [19], [38] ass: et. Allerdéngs ass de preziser molekulare Mechanismus vun Schatzkummer anti-entholl Aktivitéit vun honokiol net gutt verstanen hunn. Sou, d'Resultater vun dëser Etude déi dofir fir d'Anti-entholl Aktivitéit vun honokiol zu gastric Kriibs, a méi wichteg, de molekulare Basis fir hir Wierkung. Mir hu fonnt, datt honokiol induces der Aktivatioun vun calpain, GRP94 Rëss, an apoptosis zu Mënsch gastric Kriibs Zellen. Desweideren, an der Administratioun vun honokiol an Sauna léif implanted mat MKN45 gastric entholl Zellen zougedréckt a wesentleche anti-entholl Aktivitéit. Dëst preclinical Etude kann als e Kader ze servéieren a stellt eng villverspriechend Roman geziilte Approche. Ausserdeem hunn déi natierlech awer schonn mat konventionelle cytotoxic Agenten ze kombinéieren dës mat anticancer Drogen positiv Krankheete kënnen. Dëse Virdeel plus d'Schwellelänner Beweiser vu sengen anti-entholl Mechanismen maachen honokiol Dräierkoalitioun Medeziner Demande fir eng effikass a sécher anti-entholl Agent ginn. VerfÜgung BTS, Kultur Konditioune an Reagents Mënscherechter Zell Linnen dorënner Caucasian gastric Kriibs Zell Linnen (AGS, eng mëttelméisseg-Pro ënnerscheet adenocarcinoma Zell Linn, an N87, eng gutt ënnerscheet carcinoma Zell Linn) an asiatesch gastric Kriibs Zell Linnen (MKN45 an SCM-1, der Strenz adenocarcinoma Zellen) sech aus Zell Bank zu Kriibs Zentrum vun Taipei Veteranen allgemenge Spidol (Taiwan) kritt. Zellen sech am RPMI 1640 mëttelfristeg wouvun 10% Hëtzt-inactivated FCS (Life Technologies) an streptomycin /penicillin (Life Technologies) an engem humidified 5% CO 2 Atmosphär haten. Honokiol war vun Wako chemesche Company (Japan) kritt, an hir war Puritéit sech e Minimum vu 99% vun héich-Performance flësseg chromatography gin. VerfÜgung Western Blot Analys an Immunoprecipitations VerfÜgung Lait Zell lysates ëmschriwwen virdru waren bereet [44]. Proteinen sech vun Pre-Goss 8-20% SDS-polyacrylamide gelies electrophoresis getrennt, an dann electrophoretically aus der gelies op polyvinylidene difluoride Schläimhait transferéiert. No erauszesichen, goufen blots incubated mat, anti-GRP94, anti-GRP78, anti-caspase 12, anti-caspase 7, anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Déi), anti-calpain-ech (μ-calpain), Anti-calpain-II (m-calpain) (Santa Cruz Déi), an anti-β actin (Fläch) antibodies vun PBS bannent 0,1% Tween 20 fir 1 h duerch dräi 10 min Mëtten an PBS bannent 0,1% Tween 20. D'duerno Schläimhait sech dann mat horseradish peroxidase-conjugated Secondaire antibodies fir 60 min incubated. An immunoprecipitation, Proteinen (500 g) sech mat spezifesche antibodies incubated an op FAQ A-Sepharose Glaspärelen Sommet. Glaspärelen goufen extensiv mat Pizzi d'immunoprecipitative Prellbock, gekacht, an microcentrifuged gewäsch. Input 10% vun Zell lysate fir IP an 50 g Proteinen sech duerch Western blotting analyséiert. Ze erkennen ass mat Western blotting reagent ECL (Amersham) gesuergt, an chemiluminescence war vun der Kodak X-Omat Filmer ausgesat. VerfÜgung Calpain Aktivitéit Assays VerfÜgung Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC ass e calpain protease Realitéiten. Quantitation vun 7-Aminosaier-4-methylcoumarin (AMC) fluorescence Genehmegungen d'Iwwerwachung vun Aktivitéit hydrolysis vun der peptide-AMC conjugate a ka benotzt ginn Aktivitéit Aktivitéit ze moossen. Zellen sech bereet a behandelt op 24-Meter Corning /ëmsou Placken. Virum Zousätzlech vun inhibitors Zellen sech mat 40 M Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) a behandelt mat honokiol fir uginn timing bei 37 ° C an enger humidified 5% CO 2 incubator iwwerlaascht. Proteolysis vun der unisse Studiebäihëllefe iwwerwaacht gouf e unisse zappen liesen System (HTS-7000 Plus Serie BioAssay, Perkin Elmer) mat filter Astellunge vun 360 ± 20 nm fir excitation an 460 ± 20 nm fir Emissioun benotzt. VerfÜgung SiRNA an Transfection Assays VerfÜgung d'siRNA duplexes spezifesch fir d'inhibition vun calpain-ech (μ-calpain) an calpain-II (m-calpain) Ausstralung an mënschlech Zellen aus Santa Cruz déi kritt huet: calpain-ech, Katalog kee . sc-29885, engem Pool vun 3 Zil--spezifesch 20-25 NG siRNAs; calpain-II, Katalog keen. sc-41459, eng Zilscheif-spezifesch 20-25 NG siRNA. D'Kontroll siRNA (Katalog keen. Sc-37007) ass eng non-gezielt 20-25 NG siRNA als negativ Kontroll entworf. Desweideren, duplexes der siRNA spezifesch fir d'inhibition vun GRP94 Ausdrock Wierderbuch war kommerziell vun MWG Biotech (Däitschland). De Sënn (uewen) a antisense (ënnen) Message vun der GRP94 siRNA duplex sech wéi follegt zesummen: 5'-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 "; 3'-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 ". Als nonspecific Kontroll, war en NC siRNA duplex mat ënnerschiddleche Message entworf wéi follegt zesummen: 5'-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 "; 3'-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 ". D'siRNAs sech op eng Konzentratioun vu 100-200 nm fir flüchteg transfection vun Zellen mat Lipofectin (Invitrogen) pro gutt zu enger 6-gutt Plack mat frëschen mëttelfristeg benotzt. No 24 h aus der initialen transfection an 24-36 h Behandlung, sech gesammelt Zellen oder Zell lysates a fir apoptosis oder FAQ Ausdrock analyséiert, bzw.. VerfÜgung Immunofluorescence an Laser Scannen Confocal Microscopy VerfÜgung BTS sech zweemol mat PBS, fix zu 4% paraformaldehyde fir 30 min an dann virbildlech incubation vun 1% Bovine serum albumin vun PBS gewäsch. Primärschoul antibodies wéi uginn op engem dilution vun 1:500 an incubated bei 4 ° C un der drënner Iwwernuechtung applizéiert goufen. D'Echantillon waren mat FITC-conjugated oder TRITC-conjugated Secondaire antibodies (Fläch) traitéiert. D'FITC-Label oder TRITC-Label Zellen sech dann duerch fluorescence microscopy analyséiert. Fir Laser Scanner microscopy, goufen immunofluorescence-Label Zellen mat enger Faarf Laser Scannen microscope (König LSM 410 ëmdréinen, Däitschland) analyséieren, mat zwou Argon ioun equipéiert (488 nm) an HeNe (543 nm) lasers. Co-Lokalisatioun vun zwee Fortgeschratten antigens war als eenzeg Bild fonnt wann d'Biller aus zwou Chaînen overlaid goufen. Confocal Biller waren Hannergrond-subtracted an fusionéiert der Confocal Co Software Programm benotzt, an Filteren mat Adobe Photoshop Software. VerfÜgung Annexin-V FITC an PI Double Staining VerfÜgung D'annexin V /propidium Kaliumiodid (BD Clontech) war benotzt Zuelen vun apoptotic Zellen ze ofgedonkelt wéi virdrun [44] beschriwwen. Zellen sech zweemol mat PBS an Kierchefënster mat annexin V an PI fir 20 min bei Raumtemperatur gewäsch. Den Niveau vun apoptosis gouf duerch Miessunge fluorescence vun den Zellen duerch onkontrolléiert cytometer (Becton Dickinson) alles. Donnéeën Acquisitioun an Analyse waren duerch d'CellQuest Programm (Becton Dickinson) gesuergt. VerfÜgung Déieren VerfÜgung Déieren Experiment laut duerchgefouert zu der erausginn Richtlinnen vun de Comité vun Déieren Experimenter, National Chung Hsing Universitéit, Taichung, Taiwan. Männlech BALB /c Sauna Mais ( Nu /Nu VerfÜgung) sech aus NLAC Taiwan, Inc., Taipei, Taiwan kaaft. De Mais goufen ënner bestëmmten pathogen-gratis Konditiounen flegelhaft an haten, mat goen Iessen a Waasser ad libitum gëtt, an zu enger Barrière Gebei mat 12 h Liicht /donkel Monaco waren. Experimentell Prozeduren sech op 6-Woch-al Mais gemaach. D'Déiere waren euthanized wann se Kreativitéit wossten. VerfÜgung entholl Wuesstem Assay VerfÜgung Zell tumorigenicity gouf zu 6-Woch-alen Mann BALB /c Sauna Mais iwwerpréift. Kuerz, 4 × 10 Immunohistochemistry VerfÜgung Den Ausdrock vun GRP94 zu Maus staark entholl vun immunohistochemistry iwwerpréift huet. Dënn entholl Rubriken (5 μm) ware bereet, fix mat kal acetone, mat 3% Waasserstoff peroxidase blockéiert, a mat fir Primärschoul GRP94 antibody Kierchefënster. VerfÜgung statistique Analysen VerfÜgung D'Wäerter an dëser Etude entscheet sinn als mengen ± Sem presentéiert. All analyséiert goufen déi Analyse vun Varianz vun engem Fisher d'mannst groussen Ënnerscheed Test duerno gesuergt. P VerfÜgung Wäert vu manner wéi 0,05 war den statistesch Bedeitung gekuckten. VerfÜgung
Resultater VerfÜgung
Diskussioun VerfÜgung
spontan a Methode VerfÜgung
Darmmikrobiom ännert sech beim Kachen vu Planzefudder,
Oral Hygiène a Gravitéit vum COVID-19-d'Verbindung
Genetesche Risiko fir Autoimmunitéit ka mat Differenzen am Darmmikrobiom verbonne sinn
Wëssenschaftlecht Symposium bei LABVOLUTION konzentréiert sech op Schlësselthemen am Liewenswëssenschaften
Immunzellen reparéieren beschiedegt Darm bei Kanner mat IBD
Planzbaséiert Diäten verbesseren d'Häerzgesondheet iwwer dem Darmmikrobiom
Wëssenschaftler léisen mysteriéise Fall vum Auto Brauerei Syndrom
Fuerscher a China hunn eng wichteg Entdeckung gemaach, déi de konfus Fall vun engem 27 Joer ale Mann erkläert, deen eng Geschicht hat fir sech bedréckt ze ginn ouni tatsächlech Alkohol ze drénken. S
Kuerzkette Fettsäure -Ergänzung verbessert den Erhuelung vum Schlag,
Mais Studie weist Ergänzung vum Kierper vu kuerze Ketten Fettsäuren kann dSchlagerhuelung verbesseren, laut Fuerschung bei Mais kierzlech verëffentlecht am JNeurosci. Kuerzkette Fettsäure-Ergänzung ka
Haushënn onwahrscheinlech SARS-CoV-2 ze iwwerdroen,
soen dFuerscher Fuerscher a Spuenien an Däitschland hunn eng Studie gemaach déi weist datt Haushënn onwahrscheinlech zu der Iwwerdroung a Gemeinschaftsverbreedung vu schwéiere akuten Otemschwieregkeet