Ploche ONE: Honokiol indukuje kalpain sprostredkovaná glukózou regulovaný proteín-94 Štiepenie a apoptózu u ľudských žalúdočné rakovinové bunky a Obmedzuje rast nádorových

Abstract

Pozadie

Honokiol, malú molekulovú hmotnosť prírodný produkt, bolo preukázané, že majú silné anti-neoplastických a anti-angiogénny vlastnosti. Jeho molekulárne mechanizmy a schopnosť rakoviny žalúdka anti-zostávajú neznáme. Bolo preukázané, že anti-apoptotické funkcie z glukózy regulované proteíny (GRP), predpokladá, že ich indukcia v nádorových buniek môže viesť k progresii rakoviny a rezistencie. Skúmali sme účinky honokiol na reguláciu GRP a apoptózy u ľudských buniek karcinómu žalúdka a rastu nádorov.

Metodika a hlavných zistení

liečbe rôznych ľudských buniek karcinómu žalúdka s honokiol viedol k indukcia GRP94 štiepenie, ale neovplyvňuje GRP78. Umlčanie GRP94 o malé interferujúce RNA (siRNA), by mohlo vyvolať apoptózu buniek. Ošetrenie buniek s honokiol alebo chemoterapeutiká činidlo etopozid zvýšila zvýšenie apoptózy a GRP94 degradácii. Calpain aktivita a calpainem-II (m-calpain) proteín (ale nie calpainu-I (μ-calpain)) úroveň môže byť tiež zvýšená o honokiol. Honokiol indukovaná down-regulácia GRP94 a apoptózu v rakovinových bunkách žalúdku môžu byť zvrátené siRNA zacielenie calpainu-II a inhibítory calpainu. Okrem toho, výsledky imunofluorescenčný farbenie a Imunoprecipitácia odhalila špecifickú interakciu s GRP94 calpainu-II v bunkách po ošetrení honokiol. Ďalej poznamenal, že nádor GRP94 nadmerná expresia a rast nádoru u Balb /c nahých myší, ktoré boli naočkované ľudskej rakoviny žalúdka buniek MKN45, sa výrazne znížil o honokiol liečby.

Závery a význam

Tieto výsledky poskytujú prvý dôkaz toho, že honokiol indukovaná calpain II sprostredkované GRP94 štiepenie spôsobuje rakovina žalúdka u ľudí apoptózu buniek. Ďalej navrhujeme, aby honokiol môže byť možný terapeutický prostriedok na zlepšenie klinického výsledku rakoviny žalúdka

Citácia :. Sheu ML, Liu SH, Lan KH (2007) Honokiol Navodzuje kalpain sprostredkovaná glukózou regulovaný proteín-94 Štiepenie a rakovina žalúdka apoptózy v ľudských bunkách a znižuje rast nádoru. PLoS ONE 2 (10): e1096. doi: 10,1371 /journal.pone.0001096

Akademický Editor: Hany El-Shem, Cairo University, Egypt

prijatá: 26. júna 2007; Prijaté: 10.10.2007; Uverejnené: 31. októbra 2007

Copyright: © 2007 Sheu et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bola podporená výskumnými granty z National Science rady Taiwane (NSC95-2320-B040-005). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

žalúdka rakovina je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu vo svete [1]. Takmer nastať dve tretiny prípadov v rozvojových krajinách a 42% v Číne sám [1], [2]. Molekulárne ciele a mechanizmy zlú prognózu, nie sú dobre známe. Liečba lokálne pokročilou rakovinou žalúdka zostáva veľkým problémom. Napriek nedávnej pokroky v liečbe, klinický výsledok u pacientov s karcinómom žalúdka je stále zlá. Okrem chirurgického zákroku, role adjuvantnej terapie podložená [2], [3]. Preto je potrebné identifikovať potenciálne nové terapeutické a chemopreventivní činidlá, je zrejmé.

Honokiol, aktívna zložka izoluje a čistí od Magnolia officinalis
bolo preukázané, že majú účinky anti-oxidácie [4], proti lipoperoxidácie [5] a protizápalové in vitro stroje a in vivo
[6], [7]. Honokiol Bolo tiež preukázané, že je systémovo dostupné a netoxické inhibítor angiogenézy [8]. Nedávne štúdie uvádzajú, že indukuje honokiol kaspasy závislá na apoptózu B-bunkovej chronickej lymfocytárnej leukémie a prekonáva konvenčné liekovú rezistenciu do ľudského mnohopočetného myelómu vyvolaním kaspázy-závislé a -independent apoptózy [9], [10]. Úplné posúdenie klinického potenciálu zlúčenín ešte nie je možné, farmakokinetika honokiol bola dôkladne prešetrená, ukázať, že honokiol je k dispozícii na klinickú liečbu rakoviny. Ďalšie prírodné produkty, ktoré obsahujú celý rad terapeutických látok užitočných pri prevencii rozvoja malignít aj naďalej byť objavený; Avšak, veľmi málo je známe o ich základné mechanizmy účinku alebo ich molekulárneho cieľa.

glukóza-regulovaný proteín (GRP) 94 je najhojnejšia glykoproteín v endoplasmatickém retikule (ER), a môže byť zistené len u stavovcov. Nadmerná expresia antisencie a ribozym prístupy v systémoch kultúr tkaniva priamo preukázané, že GRP78 a GRP94 mohla chrániť bunky pred smrťou [11] - [13]. Ochranná funkcia z GRP bola tiež pozorovaná v odolnosti proti žiareniu, u karcinómu krčka maternice [14]. Anti-apoptotické funkcie GRP tiež predpokladá, že ich indukcia v nádorových buniek môže viesť k progresii rakoviny a rezistencie [15] - [18]. Patologické stavy, ako je rast nádoru a malignity boli navrhnuté korelujú s cytoprotektivním proteínom GRP94 nadmernej expresie [19]. V modeli metastatického malignitami, významná účinnosť génu /imunoterapia stratégie GRP94 báze sa ukázalo, keď to bolo v kombinácii s radiačnou terapiou [20]. ER hrá priamu úlohu v aktivácii kaspázy podmnožinu počas aktivácie apoptózy, ku ktorému dochádza v priebehu ER stresu [21]. Na druhej strane, kalpain sú rodinou Ca ^{2 + -dependentních vnútrobunkové cysteinové proteázy. Všadeprítomné exprimovaný kalpain-I (μ-calpain) a calpainem-II (m-calpain) proteázy sa podieľajú na vývoji apoptózy. Nedávna štúdia ukázala, že všadeprítomné kalpain podporovať kaspázy-12 a aktiváciu JNK v ER stresom indukovanej apoptózy [22]. Bolo tiež uvedené, že GRP94 s Ca 2 + viažuci a anti-apoptotické vlastnosti je proteolytický terčom calpainu počas etopozid-indukovanej apoptóze [23]. Okrem toho, v niekoľkých experimentálnych modeloch apoptózy, bolo preukázané, že amino-terminálny calpain inhibičná jednotka Calpastatin môže štiepiť kaspázy, čo naznačuje, štiepenie je dôležitá pre reguláciu calpainu aktivity počas bunkovej smrti [24] - [28] , Kaspázy-7, ktorý je prijatý do ER v stresovaných buniek, môžu tiež štiepi a aktiváciu kaspázy-12 [29] - [31]. Účinky honokiol na GRP súvisiace signalizácie a apoptózy stále zostávajú neznáme. V tejto štúdii sme skúmali molekulárne mechanizmy honokiol na ľudské žalúdočné nádorových buniek apoptózy a rastu nádoru in vitro stroje a in vivo
. Neočakávane sme zistili, že GRP94 absolvoval konkrétny proteolytické štiepenie calpainu počas honokiol indukovanej apoptózy. Tieto pozorovania môže poskytnúť dôkazy, že honokiol je možný terapeutický prostriedok na zlepšenie klinického výsledku rakoviny žalúdka.}

Výsledky

kinetika GRP94 proteolytickým štiepením v ľudských nádorových bunkových línií žalúdočných liečených honokiol

sme najprv skúmal účinky honokiol na prejavy GRP94 a GRP78 v rôznych ľudských nádorových bunkových línií žalúdka. Honokiol výrazne znižuje hladinu GRP94 v na dávke a na čase závislým spôsobom, ale hladina GRP78 nie sú ovplyvnené (obr. 1 a 2). Kinetika honokiol vyvolané GRP94 štiepenie v rôznych ľudských buniek karcinómu žalúdka bolo znázornené na obr. 2. MKN45 alebo SCM-1 bunky boli odolnejšie voči odpovedí honokiol vyvolané ako AGS alebo N87 buniek; hladiny GRP94 bola znížená na asi 50%, pre dvakrát toľko času. Hladiny GRP78 proteíny, ostávajú nezmenené vo všetkých štyroch žalúdočných nádorových bunkových línií. Okrem toho existujú malé GRP94 proteínové výrazy v normálnej myši žalúdočnej epitel tkanív a ľudských endotelových buniek v porovnaní s buniek karcinómu žalúdka (obr. 1C).

Honokiol indukuje GRP94 štiepenie spojené s proapoptotický reakciu

ako je znázornené na obr. 3, honokiol zvýšila poly (ADP-ribóza) polymerázy (PARP), štiepenie a indukovatelný gén poškodenie DNA CHOP /GADD153 (a proteín bol identifikovaný sprostredkovať ER vyvolané stresom apoptózu) hladiny v bunkách MKN45 v dávke a v závislosti na čase spôsobom. Honokiol 20 a 40 M vyvolať aj výrazy štiepené kaspázy-12 a kaspázy-7 (p20), ktoré je veľkosť nárastu bola úmerná časovanie (obr. 3B). Okrem toho pochopiť, či GRP94 štiepenie bol zapojený v ľudskom žalúdku nádorových buniek apoptózu, apoptóza bola detekovaná u GRP94-siRNA transfekciou buniek. Umlčanie GRP94 o siRNA indukovanú apoptózu buniek (obr. 4A) a znížená expresia GRP94 proteín (Obr. 4B-a). Tiež sme porovnávali účinky honokiol na apoptózy a degradácie GRP94 v ľudských nádorových bunkách žalúdka sa chemoterapeutík agenta etoposidu. Výsledky ukázali, že ošetrenie buniek s honokiol alebo etoposidu zvýšila zvýšenie apoptózy (Obr. 4A) a degradáciu GRP94 (obr. 4B-b). Keď boli bunky súčasne liečení 40 M etopozidu a 20 M honokiol, väčší nárast degradácia GRP94 než oni sa premietal (obr 4B-b.); Tieto výsledky naznačujú, že kombinovanie honokiol s inými protirakovinovými liekmi, môže byť potenciálne terapeutickú stratégiou.

calpainu je vyžadované pre honokiol sprostredkované bunkové apoptózy

Ďalej sme zistiť, či je aktivita calpainu (vápnik -dependentních tiolové proteázy), bude vyvolaná honokiol v štyroch žalúdočných nádorových bunkových línií. Ako je znázornené na Obr. 5A, honokiol 20 M zvýšila calpainu aktivity v závislosti na čase, ktorý začal zvyšovať na 15 min, a dosiahol vrchol v 60 min, a potom klesla na nižšiu úroveň, pri 4 hodín. Bunky zostali priľnavý v časovom priebehu, bez straty životaschopnosti (dáta nie sú uvedené). Na obr. 5B, výsledky ukázali, že zvýšenie aktivity calpainu v reakcii na honokiol (20 až 40 M) po dobu 60 minút v štyroch žalúdočné nádorových bunkových línií. Okrem toho, kalpain inhibítorov, N-acetyl-Leu-Leu-norleucinal (ALLN), N-acetyl-Leu-Leu-methioninal (Allmi), a Z-Leu-Leu-CHO, účinne inhibuje zvýšenie calpainu aktivita indukovaná honokiol v N87 a bunky SCM-1 (obr. 5c).

ďalej sme testovali, či sa znížila kalpain činnosť by mohlo ohroziť schopnosť honokiol na indukciu apoptózy. Ako je znázornené na Obr. 6A, honokiol (40 M) indukovanú apoptózu v SCM-1 bunky, ktoré by mohli byť obrátené kalpain inhibítorov (ALLN alebo Allmi). Okrem toho, honokiol rozšírené kalpain-II proteín, ale nie calpain I-proteín výrazy v bunkách SCM-1 (Obr. 7A). S použitím prístupu siRNA na porazený aktivitu calpain-II viedla k významnému odznení honokiol (20 M) indukovanej apoptózy v ľudských buniek karcinómu žalúdka po 4 h spracovanie (obr. 6B). Sírne-calpain-I neovplyvnilo honokiol indukovanú apoptózu (obr. 6B).

Lokalizácia a interakcie calpainem-II a GRP94 po honokiol liečbe

Ďalším krokom bolo objasnenie role kalpain-II v honokiol indukovanej degradácii GRP94. Laserové konfokálna mikroskopické štúdie lokalizácie proteínu calpain-II bola stanovená zelenej fluorescencie, zatiaľ čo lokalizácia GRP94 bola stanovená červenú fluorescenciu. Ako je znázornené na Obr. 7B, a to ako kalpain-II a GRP94 boli detekované v cytoplazme sa spoločnou lokalizáciu v ľudských buniek karcinómu žalúdka. Fluorescencia calpainu-II sa postupne zvyšuje, ale fluorescencie GRP94 bola v ľudských buniek karcinómu žalúdka postupne znižuje počas liečby honokiol. Pre ďalšie potvrdenie výsledkov z imunocytochemické farbenie že calpain-II interaguje s GRP94, boli vykonané skúšky ko-Imunoprecipitácia a Western blotting v rakovinových bunkách žalúdka. Ako je znázornené na Obr. 7C, kalpain-II bol špecificky spojené s GRP94 v rôznych buniek karcinómu žalúdka v prítomnosti honokiol (20 až 40 M) v porovnaní s kontrolným IgG. Navyše sme testovali, či proteolytické aktivity kaspázy, proteazómu alebo katepsinu boli zapojení do štiepenie GRP94. Naše výsledky ukázali, že liečba buniek s inhibítormi kaspázy (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK a Z-DEVD-FMK, 50 M) pri vysokých dávkach čiastočne zablokovala štiepenie GRP94 počas honokiol indukovanej apoptózy (Obr. 8A ) v porovnaní s inhibítorom calpainu Allmi 25 M, čo by mohlo úplne zablokovať GRP94 štiepenie. Predbežné spracovanie buniek s inhibítorom inhibítor katepsinu B CA-074-Me 25 a 50 M a katepsin L inhibítor katepsinu L II 25 a 50 M a proteazómu inhibítor MG132 0,1 - 10 M nebol schopný blokovať GRP94 štiepenie (obr. 8B a 8C) , Okrem toho, špecifické štiepenie GRP94 podľa calpainu bolo možné pozorovať za použitia bunkových lyzátov pripravených z ľudských buniek karcinómu žalúdka (dáta nie sú uvedené).

Ďalej sme skúmali, či je vyžadovaná aktivácia calpain pre honokiol indukovanú apoptózu buniek. Na obr. 9, zvyšuje expresie calpain-II proteínu a degradáciou GRP94 a kaspázy-7 a kaspázy-12 aktivácia vyvolané honokiol (40 M) bolo možné predísť farmakologických inhibítorov kalpain a prechodné transfekcia siRNA-kalpain-II v bunkách SCM-1.

honokiol tlmí nádorové GRP94 nadmernej expresie a rast nádoru u holých myší

nahých myší bolo zaočkované 4 x 10 ^{6 nediferencovanej bunky adenokarcinómu MKN45 a pridá sa k honokiol 0,5 a 1,5 mg /kg alebo vozidlo, keď nádor sa stal evidentná. Imunohistochemické a Western blot analýza ukázala, že GRP94 nadmerná expresia a akumuluje v nádore regióne, ale nie v normálnej žalúdočnej tkaniva (obr. 10A-A a 10 A-B). Honokiol výrazne znížila hromadenie GRP94 v nádoroch v porovnaní s kontrolným vozidla (obr. 10A-A a 10 A-B). Expresia GRP78 nebola ovplyvnená (dáta nie sú uvedené). Na určenie, či honokiol mohol potlačiť rast nádoru in vivo
, odolný nádory boli stanovené u myší a anti-tumor účinok podávať opakovane honokiol bola študovaná. Ako je znázornené na Obr. 10B, podávanie honokiol 0,5 a 1,5 mg /kg vykazoval významnú protinádorovú aktivitu.}

Diskusia

označená sme tu prvýkrát, že calpainem, je nonlysosomal Ca ^{2 + aktivovaný cysteinové proteázy, najmä kalpain-II, hrá kľúčovú úlohu pri štiepení GRP94, ale GRP78 nie je ovplyvnená, a v regulácii apoptózy indukovanej honokiol v ľudských buniek karcinómu žalúdka. Najmä za predpokladu, že funkčné dôkazy štiepenie GRP94 pri honokiol liečebných úkonov terapeutický prínos, inhibíciu nádorového rastu v myšiam modeli ľudského karcinómu žalúdka. Pokiaľ je nám známe, je toto prvá správa ukázať, že honokiol môže manipulovať kalpain indukovatelné gardedáma bielkovín GRP94 degradácii terčom počas apoptózy.}

Štúdia z rôznych laboratóriách poukázal na pohotovosť ako cieľového priestoru terapeutickými činidlami, ktorej v prevedení apoptózy. Cytozólový Ca ^{2+ bol zapletený ako druhý posol proapoptosis podieľa na oboch spúšťanie apoptózy a upravujú kaspázy alebo kalpain [32] - [34]. Nedávna štúdia ukázala, že calpain je dôležitým mediátorom resveratrolu (prírodné rastlinné polyfenolov) indukovanú apoptózu pri karcinóme prsníka [35]. Zistili, že resveratrol môže spôsobiť zvýšenie intracelulárneho Ca 2+, a aktivuje kalpain-sprostredkovanú apoptosu, čo vedie k degradácii plazmatické membrány Ca 2 + -ATPázu izoformy 1 a fodrin v kaspázy-3 deficitom MCF- 7 buniek. Honokiol bola tiež hlásená indukcia Ca 2+ mobilizácia u potkaních kortikálnych neurónov a ľudského neuroblastómu SH-SY5Y buniek, pravdepodobne cez aktiváciu fosfolipázy C a IP _{3 receptory [36]. V tejto štúdii sme zistili, že honokiol je schopné zvyšovať calpainu aktivity a expresie proteínov calpainem-II, ale nie calpainu-Aj pri honokiol indukovanej žalúdočnej nádorových buniek apoptózu. Okrem toho, inhibítory calpainu a umlčanie kalpain-II podľa siRNA významne obrátil apoptózu honokiol indukovanej. Tieto nálezy naznačujú, že 2 + -triggered aktivácia Ca calpain-II môžu hrať potenciálne rolu v honokiol indukovanej apoptózy.}}

GRP94 /gp96 je ER člen bydliska rodiny HSP90. GRP94 hrá dôležitú úlohu v udržiavaní bunkovej homeostázy. Táto konvenčná poňatie GRP94 ako proteín skladacie sprievod je aktualizovaný objavy, ktoré GRPS a podporuje tak proliferáciu nádoru, metastázy, rezistenciu voči liekom, a imunoterapia, ktoré majú významné klinické dôsledky v prognóze a liečbe nádorových ochorení [3]. GRP94 bolo preukázané, že sú spojené s tumorigenicity u nádorových bunkových línií, hlodavec nádorových modelov a biopsia ľudskej rakoviny [37] - [39]. To je v súlade so zistením, že indukcia GRP spôsobuje ochrannú funkciu ako reakcia na prežitie živín hladovanie, acidóza a hypoxia podmienky, ktoré sú bežné v zle vaskularizovaného solídnych nádorov [11], [40]. Bolo tiež ukázalo, že väčšina z GRP v nádorových bunkách sa zaoberá multi-chaperonových komplexy, pričom nie je v normálnych bunkách [41]. Vakcinácia myší s nádorom odvodené stresových proteínov, GRP94, môžu vyvolať protinádorové imunitnej odpovede, čím sa získa výrazné potlačenie nádorového rastu a metastáz. Aktivita inhibítorov HSP90 bol tiež overený v predklinických modeloch rakoviny prsníka, a to ako v štúdiách monoterapiu alebo v kombinácii s bežnou chemoterapiou [41]. Navyše bolo navrhnuté, že GRP94 je fyziologickým substrátom pre calpainu [23]. Calpain bolo preukázané, že sa aktivuje na membránu ER, kde interaguje s GRP94, čo má za následok jeho špecifického proteolytickým štiepením, ako sú bunky podliehajú apoptóze vyvolanú etopozid [23]. V súčasnej štúdii sme zistili, že honokiol indukované GRP94 štiepenie a apoptózu u ľudských buniek karcinómu žalúdka môže byť úplne zvrátiť kalpain inhibítorov a umlčanie calpainu-II pomocou siRNA. Inhibítory kaspázy vo vysokých dávkach čiastočne zvrátiť GRP94 štiepenie honokiol indukovanej. Predbežné spracovanie buniek s kathepsin B a L a inhibítorov inhibítora proteazómu nebol schopný blokovať honokiol vyvolané GRP94 štiepenie. Tiež sme preukázali, že umlčanie GRP94 podľa siRNA môže spôsobiť žalúdočné rakovinových buniek apoptózu. Okrem toho, výsledky imunocytochemické farbenie a Imunoprecipitácia odhalila špecifickú interakciu s GRP94 calpainu-II z buniek karcinómu žalúdka po honokiol liečby. Špecifická Štiepenie GRP94 podľa calpainu bolo tiež možné sledovať pomocou fragmenty buniek pripravenej z ľudských buniek karcinómu žalúdka. Tieto zistenia teda naznačujú, že kalpain II sprostredkované štiepenie GRP94 hrá dôležitú úlohu v honokiol spusteného žalúdočné rakovina bunkovej apoptózy.

kalpain a kaspázy sú dve rodiny cysteínových proteáz, ktoré sa podieľajú na regulácii patologické bunky smrť [22], [31]. Tieto proteázy zdieľať niekoľko úmrtí súvisiacich s substrátov vrátane kaspázy seba, cytoskeletu bielkoviny, Bax a Bid [42]. Calpain sprostredkované proteolýzy prebieha v obmedzenej miere, ale nevyžaduje zvyšok konkrétne aminokyseliny takého kaspázy. Aj keď bola navrhnutá ako calpain a kaspázy hrať dôležitú úlohu v regulácii patologických bunkovú smrť, interakcie týchto dvoch rodín proteázy za patologických podmienok, nie sú jasné. V tejto štúdii, knockdown a farmakologické inhibítory prístupy významne prispeli k poznaniu calpainu biológie, najmä s ohľadom na jeho špecifické funkcie na apoptózu buniek, čo je možné, že sa kaspázy 7 a 12 po prúde od calpainu v sprostredkovaní honokiol indukovanej rakoviny žalúdka bunková apoptóza.

lieky prírodný produkt boli navrhnuté hrať dominantnú úlohu v lekárenskej starostlivosti [43]. Prírodné produkty sú jedným z dôležitých zdrojov potenciálnych chemoterapeutík rakoviny a chemopreventive agentmi [43]. Honokiol bol široko používaný v tradičnej čínskej a japonskej medicíne po niekoľko tisíc rokov, a to najmä pre liečbu anti-thrombocytic, anti-bakteriálne, protizápalové a anxiolytické účinky. Predchádzajúce správy ukázali, že je tiež honokiol majúci silné anti-neoplastických a antiangiogenetické vlastnosti, [6], [19], [38]. Avšak, presný mechanizmus vystavených protinádorovej aktivity honokiol nie je dobre známa. To znamená, že výsledky tejto štúdie poskytujú dôkazy pre protinádorovú aktivitu honokiol v karcinómu žalúdka, a čo je dôležitejšie, molekulárnej základ pre jeho účinok. Zistili sme, že honokiol indukuje aktiváciu calpainu, GRP94 štiepenie, a apoptózy v ľudských buniek karcinómu žalúdka. Okrem toho, po podaní honokiol u nahých Nice, implantované MKN45 žalúdočné nádorové bunky vykazovali významnú protinádorovú aktivitu. Táto predklinické štúdie môžu slúžiť ako rámec a predstavuje sľubný nový cielený prístup. Okrem toho boli tieto prírodné látky bolo preukázané, že v kombinácii s bežnými cytotoxickými látkami môžu byť klinické prospešná s protinádorových liečiv. Táto výhoda plus objavujúce sa dôkazy o svojich protinádorových mechanizmov, aby honokiol prebiehajúcich klinických žiadosť o bytie efektívne a bezpečné protinádorová látka.

Materiály a metódy

Cells, Kultúra podmienky a činidlá

ľudských bunkových línií vrátane kaukazskej žalúdočných nádorových bunkových línií (AGS, stredne-zle diferencované bunkové línie adenokarcinómu a N87, dobre diferencovaný bunková línia karcinómu) a ázijské bunkových línií karcinómu žalúdka (MKN45 a SCM-1, nediferencovanej bunky adenokarcinómu) boli získané z bunkovej banky v rakoviny centre Taipei veteránov všeobecnej nemocnice (Taiwan). Bunky boli udržiavané v médiu RPMI 1640 obsahujúcom 10% tepelne inaktivovaného FCS (Life Technologies) a streptomycín /penicilínu (Life Technologies) vo zvlhčenej 5% CO _{2 atmosfére. Honokiol bol získaný od Wako Chemical Company (Japonsko), a jeho čistota bola stanovená na minimálne 99% vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie.}

Western blot analýza a Imunoprecipitácia

lyzáty celých buniek boli pripravené, ako bolo opísané skôr [44]. Proteíny boli oddelené prefabrikovaný 8-20% elektroforézou na SDS-polyakrylamidovom gélu a elektroforeticky prenesené z gélu na polyvinylidendifluoridovou membránu. Po blokovaní boli bloty inkubovali s anti-GRP94, anti-GRP78, anti-kaspázy 12, anti-kaspázy 7, anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), anti-kalpain-I (μ-calpainem), anti-calpain-II (m-calpain) (Santa Cruz Biotechnology), a anti-β aktínu (Sigma) protilátky v PBS v rámci 0,1% Tween 20 po dobu 1 hodiny a následne tri 10 min premytí v PBS v 0,1% Tween 20. membrány potom boli inkubované s konjugátom peroxidázou chrenu sekundárnej protilátky po dobu 60 minút. V imunoprecipitáciou, proteíny (500 g) boli inkubované so špecifickými protilátkami a imobilná na guličky proteín A-Sepharose. Perličky boli dôkladne premytá immunoprecipitative vyrovnávacej pamäte Bacco je, varené, a mikroodst. Vstup 10% z bunkového lyzátu pre IP a 50 g proteínov bola analyzovaná metódou Western blot. Detekcia bola vykonávaná pomocou Western blotting činidla ECL (Amersham) a chemiluminiscencie bola vystavená filmy Kodak X-OMAT.

calpainu Aktivita Testy

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC je calpain proteáza substrát. Kvantifikácia 7-amino-4-metylkumarín (AMC) fluorescencie umožňuje sledovanie enzýmovej hydrolýzy konjugátu peptid-AMC a môže byť použitý pre meranie aktivity enzýmu. Bunky boli pripravené a spracuje sa na 24-jamkové Corning /Costar doštičkách. Pred pridaním inhibítorov buniek boli nanesené na 40 M Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol) a pôsobí sa na uvedenú honokiol časovanie pri 37 ° C vo zvlhčenej 5% CO _{2 inkubátora. Proteolýza z fluorescenčné sondy bola sledovaná pomocou fluorescenčnej snímacím systémom doska (HTS-7000 Plus Series Biotest, Perkin Elmer) s nastavením filtrov 360 ± 20 nm pre excitáciu a 460 ± 20 nm pre emisiu.}

siRNA a transfekční testy

duplex siRNA špecifické pre inhibíciu calpainu-i (μ-calpain) a kalpain-II (m-calpain) výrazy v ľudských bunkách boli získané od Santa Cruz Biotechnology: calpainem-i, katalóg č , sc-29885, kaluž 3 cieľovo špecifickú 20-25 nt siRNA; calpainem-II, katalóg č. SC-41459, cieľovo špecifické 20-25 nt siRNA. Kontrolný siRNA (katalógové č. Sc-37007) je non-zacielenie 20-25 nt siRNA navrhnutá ako negatívna kontrola. Okrem toho sa duplexy siRNA špecifické pre inhibíciu expresie GRP94 bol syntetizovaný komerčne MWG Biotech (Nemecko). Zmysel (hore) a antisencie (dole) sekvencia GRP94 duplexu siRNA boli nasledovné: 5'-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 '; 3'-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 '. Ako nešpecifická kontrola, NC siRNA duplex s náhodnými sekvenciami bol navrhnutý nasledovne: 5'-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 '; 3'-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 '. Tieto siRNA boli použité v koncentrácii 100-200 nM pre prechodnú transfekciu buniek s LIPOFECTIN (Invitrogen) na jamku v 6-jamkové doštičky s čerstvým médiom. Po 24 hodinách od počiatočnej transfekcia a 24-36 h ošetrenie, bunky alebo fragmenty buniek boli zhromaždené a analyzované na apoptózu alebo expresiu proteínu, v danom poradí.

imunofluorescenčný a laserového skenovania konfokálna mikroskopie

Bunky boli dvakrát premyté PBS, fixované v 4% paraformaldehydu po dobu 30 minút a potom blokované inkubáciou v 1% hovädzom sérovým albumínom v PBS. Primárne protilátky boli, ako je uvedené aplikované na sklíčka v riedení 1: 500 a inkubujú sa pri teplote 4 ° C cez noc. Vzorky sa spracujú s FITC-konjugovanými alebo TRITC-konjugovaných sekundárnych protilátok (Sigma). Značených FITC alebo TRITC-značené bunky potom boli analyzované fluorescenčnej mikroskopie. Pre laserové skenovacie mikroskopia, bunky imunofluorescenčný značené boli analyzované za použitia inverzného laserového skenovacieho mikroskopu (Zeiss LSM 410 invertný, Nemecko), ktorý je vybavený ako iónov argónu (488 nm) a Hene (543 nm) lasery. Ko-lokalizácia dvoch značených antigénov bola detekovaná ako jeden obraz, kedy boli prekryté obrazy z oboch kanáloch. Konfokálna obrazy boli na pozadí po odpočítaní a spojil sa s použitím konfokálna Assistant softvérový program, a spracovávajú sa softvérom Adobe Photoshop.

annexin-V FITC a PI Double Farbenie

annexin V /propidium jodid (BD Clontech) bola použitá pre kvantifikáciu množstva apoptotických buniek, ako bolo opísané skôr [44]. Bunky boli dvakrát premyté PBS a zafarbené annexinu V a PI po dobu 20 minút pri teplote miestnosti. Hladina apoptózy bola stanovená meraním fluorescencie buniek pomocou prietokového cytometra (Becton Dickinson). získavanie a analýza dát boli vykonané pomocou programu CellQuest (Becton Dickinson).

Zvieratá

Pokusy na zvieratách boli vykonané podľa smerníc vydaných výborom o experimentoch na zvieratách National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan. Muž Balb /c nahých myší ( nu /nu
) boli zakúpené od NLAC Taiwanu, Inc., Taipei, Taiwan. Myši boli chované a udržiavané za špecifických patogénov bez podmienok, za predpokladu, sa im sterilizovaná strava a voda ad libitum a sídli v bariérovej zariadení s 12 h svetlo /tma cyklov. Experimentálne postupy boli vykonané na šesť týždňov starých myší. Zvieratá boli zabité, keď sa objavili upadajúci.

rast nádorových Assay

Cell karcinogenity bola skúmaná v 6 týždňov starí samci Balb /c nahých myší. Stručne povedané, 4 x 10 ^{6 z buniek (MKN45) v exponenciálnej fáze rastu boli suspendované v 1 ml kultivačného média s 10% fetálneho hovädzieho séra. Suspenzie single-buniek MKN45 bolo podkožne Inokulované do dorzálnej strany myší. Nádory boli stanovené na 14 dní po naočkovaní buniek MKN45 a nasleduje spracovanie s vozidlom, 0,5 a 1,5 mg /kg honokiol každý deň po dobu 10 dní (7 myší /skupina). Objem tumoru implantovaného do dorzálnej strany myší bol meraný dvakrát týždenne posuvným meradlom, podľa vzorca V
= ( LW
2) π /6: kde V
množstve (mm 3); L
, najväčší priemer (mm); W
, najmenší priemer (mm).}

Imunohistochémia

Expresia GRP94 v myšiam solídneho nádoru bola skúmaná pomocou imunohistochémia. Boli pripravené tenké nádorové rezy (5 um), fixované chladným acetónom, blokované 3% vodíka peroxidázy, a zafarbené pre primárne GRP94 protilátku.

Štatistické analýzy

Hodnoty uvedené v tejto štúdii sú uvedené ako priemer ± SEM. Všetky analýzy boli vykonané pomocou analýzy variance nasledovanou Fisherov najmenej významný rozdiel testu. P
hodnota menšia ako 0,05 bola vnímaná ako štatistickej významnosti.

• Ploche ONE: galektinu-3 Uľahčuje pohyblivosť buniek v rakoviny žalúdka až regulujúca Protease-activated receptor-1 (PAR-1) a matrix metaloproteinázy-1 (MMP-1)
• Ploche ONE: High-manózu Väzba antivirotikum lektín PFL z Pseudomonas fluorescens Pf0-1 podporuje bunkovú smrť v žalúdku Cancer Cell MKN28 prostredníctvom interakcie s a2-Integrin