PLoS ONE: RhoE promovira metastaza u rak želuca kroz mehanizam ovisan o pojačani izražaj CXCR4

Sažetak pregled

RhoE, roman član Rho obitelji proteina, to je ključni regulator stanični skelet i stanične migracije. Naša grupa je ranije pokazao da je RhoE kao izravna meta za HIF-1 a i posreduje hipoksiju izazvanog epitela na mczcnhimnog tranzicije u želučanih stanica raka. Stoga, pretpostavlja se da bi RhoE igraju važnu ulogu u želučanom metastaziranja raka. U ovom istraživanju smo istražili ulogu RhoE izražavanja kod raka želuca, invaziju i metastaziranje stanica, te utjecaj RhoE o reguliranju potencijalni izraz niz tok gena. RhoE ekspresija je povišena u želučanom tkivu raka u usporedbi s normalnim želučanog tkiva. Također smo otkrili usku korelaciju između histološkog stupnja i dijagnozi pacijenta. Up-regulaciju RhoE znatno poboljšane predmetne migratorne i invazivne sposobnosti želučanih stanica raka i In vitro pregled i in vivo pregled. Osim toga, dolje reguliranje RhoE umanjilo metastaziranja stanica raka. PCR polja i naknadno Transwell® analiza je pokazala da je reguliranje želučane metastaza raka by RhoE djelomično posredovan CXCR4. Ovo opažanje sugerira da CXCR4 mogao biti daljnji efektor za RhoE. Ukratko, naša studija identificiran RhoE kao novi prognostički biomarkera i gen metastatski poticanje raka želuca pregled

Izvor. Feng B, Li K, Zhong H, Ren G, Wang H, Shang Y, et al. (2013) RhoE Promiče metastaza u rak želuca kroz mehanizam ovisan o pojačani izražaj CXCR4. PLoS ONE 8 (11): e81709. doi: 10,1371 /journal.pone.0081709 pregled

Urednik: Sharmila Shankar, Sveučilište Kansas Medical Center, Sjedinjenih Američkih Država Netlogu

Primljeno: 11 siječnja 2013; Prihvaćeno: 24. listopada 2013; Objavljeno: 29. studeni 2013 pregled

Copyright: © 2013 Feng et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane Nacionalnog Basic Research programa Kine (br 2009CB521700), Nacionalni Visoka tehnološka istraživanja i razvoj programa Kine (br 2006AA02A253) i National Science and Technology popratni program u jedanaesti petogodišnji plan Period (broj: 2006BAI02A14). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je drugi vodeći uzrok raka povezanih smrti u svijetu i metastaze tumora je najveća prepreka za uspješan tretman i glavni je uzrok smrtnosti pacijenata [1,2]. Već desetljećima, brojne studije su pokušali razumjeti procese i mehanizme metastaza kod raka želuca. U posljednjih nekoliko godina, utvrđeno je da je epitelnih mezenhimalne prijelaza (EMT) je od presudne važnosti u ovom procesu i uvelike pridonosi invazije stanica raka i metastaza. Jedan od mogućih razloga je da se tijekom EMT, citoskeleta u osnovi modulirane, što dovodi do rasipanja tumorskih stanica [3]. Pregled

RhoE pripada podskupini od Rho proteina, koji igraju ključnu ulogu u stanični skelet formacije , staničnu pokretljivost, stanični ciklus i apoptoza [4,5]. Za razliku od tipičnih Rho proteina, koji ciklus između aktivnog GTP-bound države i odmaranja BDP-vezan, RhoE nema intrinzične aktivnosti GTP-aze i uvijek predstavlja kao aktivni GTP vezanog oblika [6]. Ova jedinstvena značajka označava da je funkcija RhoE reguliran u biti preko svoje ekspresije, a ne njegovu aktivnost.

Nedavno je nekoliko istraživanja pokazala da nenormalan izraz RhoE bio povezan s karcinogeneze i da RhoE mogu djelovati bilo kao supresor gena tumora ili onkogena, ovisno o podrijetlu raka [7-9]. Slično tome, RhoE ima različite utjecaje na metastaze u različite oblike raka. U melanom RhoE podržava migraciju i invazivnost stanica tumora reguliranjem aktinskog citoskeleta [10]. Međutim, u hepatocelularnog karcinoma, RhoE se predstavlja kao supresorski protein od metastaza tumora [11,12]. Pregled

Prije toga, naša grupa je utvrdio da RhoE je poboljšana u želučanim stanicama raka indukcijom HIF-1α izražavanja pod hipoksična uvjeti i promovira EMT želučanih stanica raka [13]. Dakle, pretpostavili smo da RhoE može imati pozitivan doprinos u metastazi raka želuca. U ovom istraživanju, istražili smo utjecati RhoE na metastaza želučanih stanica raka i mehanizme. Pregled

materijali i postupci

Kultura stanica pregled

Ljudski želučanog adenokarcinoma staničnih linija SGC7901, MKN-45, MKN-28, KATO-III i normalne želučane sluznice stanica linije GES su sačuvani u našem institutu [14-16]. Osim toga, rak želuca staničnoj linija SGC7901-M, koja ima visok metastatski potencijal, a SGC7901-NM, koji ima slabu metastatski sposobnost, osnovana su i održavani u našem institutu [17]. Sve stanice su održavane u RPMI 1640 mediju obogaćenom s 10% fetalnog goveđeg seruma (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) i uzgajane pri 37 ° C u potpunosti vlažnoj atmosferi 5% CO2. pregled

Tissue Array pregled

Za imunološko aplikacija, dva tkiva polja ljudskog karcinoma želuca komercijalno su kupljeni od nadmašiti Biotech Co Ltd (Shanghai, Kina). Jedan niz tkiva sadržavala 90 tumorskog tkiva spotova i uskladiti susjedna non-tumorsko tkivo pjege koje su dobivene od 90 pacijenata (s 5.3-6.1 godina praćenja). Proizvođač pod uvjetom da je spol, dob, i kliničkopatološka parametara pacijenata. Drugi niz sadržavao 120 mjesta sa 40 osnovnih točaka tumorskog tkiva, 40 podudarnih susjedna non-tumorsko tkivo spotova i 40 podudarnih metastaze limfnih čvorova mjesta. Pregled

Imunohistokem pregled

Imunohistokem je izvedena pomoću Histostain ™ Plus kompleti (Zhongshan Goldenbridge Biotech, Kina) u skladu s uputama proizvođača. Miš anti-RhoE antitijelo (razrijeđen 1: 100, Upstate, MA, USA) ili anti-CXCR4 antitijelo (razrijeđen 1: 200, Sigma-Aldrich, MO, USA) su korišteni u ispitivanju IHC kao prvog antitijela. IgG je korišten umjesto prvog antitijela kao negativna kontrola u ovim ispitivanjima. Dobiveni rezultat je semikvantitativno procijenjena dodjeljivanjem rezultate za intenzitet imunoreaktivnosti i omjera stanica pozitivno obojenih kao što je opisano od strane drugih. Intenzitet imunoreaktivnost je bila podijeljena u četiri kategorije i zabio kao odsutna (-; ocjena: 0), slab (+; rezultat: 1), umjerena (++; rezultat: 2), ili jaki (+++; rezultat: 3 ) prema intenzitetu bojanja koja je uočena u većini epitelnih stanica želuca. Udio pozitivnih stanica je podijeljena u četiri grupe: (1), 0-25% tumorskih stanica pokazuju imunoreaktivnost; (2), 25-50% stanica; (3), 50-75 postotna boda stanica; i (4), 75-100% stanica. Ukupni rezultat je proizvod od dva [18].

Western blot analiza pregled

uzorci proteina je izvađen iz stanice ili tkiva s ultrazvukom u puferu za lizu (150 mM NaCl, 50 mM Tris -HCl (pH8.8), 0.1% SDS, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% NP40, 5 ug /ml aprotinina, 1 ug /ml leupeptina) na ledu, pa centrifugirane na 12.000 okretaja u minuti tijekom 10 minuta. Proteini se mogu razdvojiti pomoću SDS-PAGE i electrotransferred na nitrocelulozne membrane (Bio-Rad, CA, USA). Nespecifično vezanje bila blokirana s 5% nemasnog mlijeka za 1 sat na sobnoj temperaturi. Membrana je potom zasebno inkubirane s anti-RhoE antitijelom (razrijeđeno 1: 400, Upstate, MA, USA), anti-CXCR4 protutijelom (razrijeđenog 1: 1000, Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-VEGFA antitijela (razrijeđen 1 : 500; Abcam, MA, USA), anti-CD82 antitijelo (razrijeđena 1: 1000; Abcam, MA, USA), anti-CTSK antitijela (razrijeđena 1: 1000, Santa Cruz, Texas, USA) ili β-aktin antitijelo ( razrijeđen 1: 10000, Sigma-Aldrich, MO, USA) preko noći na 4 ° C. Nakon četiri ispiranja s TBS-T puferu, membrane se inkubiraju sa peroksidazom hrena konjugiranih sekundarnih antitijela (razrijeđen 1: 2000, Santa Cruz, Texas, USA) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon 4 ispiranja s TBS-T puferu, trake su razvijene s SuperSignal kemiluminiscentnom podlogom (Thermo Scientific, MA, USA) za vizualizaciju proteina. Mrlje su zatim analizirani Količina One® softvera (verzija 4.2. Bio-Rad, CA, USA) nakon korisnički priručnik. Western blot za P-aktin izražavanja je korištena kao interna kontrola. Pregled

Ectopic Ekspresija i siRNA-posrednika Ušutkavanje pregled

Za izvanmaternične ekspresiju ciljnih gena, želučani stanice raka su transduced s lentivirus vektor izražavanja RhoE ili CXCR4 (dobiven od GeneChem, Šangaj, Kina). Ukratko, stanice su nasađene i uzgaja na 75 do 80% -tne konfluencije bez antibiotika, nakon čega je lentivirusne vektore su dodani stanicama u mediju za rast koji sadrži polibren (2 ug /ml), na MOI od 50. Dalje, stanice su uzgajane još 72 h, a učinkovitost infekcija je provjerena fluorescentnim mikroskopom i Western blot analize. Smetnje ljudskog RhoE ili CXCR4 izražavanja je postignuta upotrebom tehnike RNA interferenciju. siRNA dvoetažni sintetizirani su Takara biotehnologiju (Liaoning, Kina) i ciljane sekvence RhoE ili CXCR4 definirani su na sljedeći način: pregled

RhoE, 5'-GAACGUGAAAUGCAAGAUAUU-3 '; pregled

CXCR4, 5'-UAAAAUCUUCCUGCCCACC-3 '.

Upravljačka siRNA dvoetažni dizajnirani su nakon ispitivao BLAST bazu podataka s nespecifičnim sekvenci ciljanja. Stanice su transficirane s oligonukleotidnim parova primjenom LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, NY, USA) prema uputama proizvođača, a nakon što su bili podvrgnuti daljnje analize 48 h nakon transfekcije. pregled

zacjeljivanja rana Ispitivanje pregled

otkrivanje staničnu pokretljivost, eksperimentalnoj fazi stanice su posađene u ploče sa 6 jažica. Pošto stanice dostignu ušće kao jednoslojne stanice na podlozi ploče plastični pipete ucrtan je preko središta ploče da se dobije čisti 1 mm široku rana površine i medij je zamijenjen sa svježim RPMI1640 koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma , Nakon 48 sati, stanice kretanje u područje rane procijenjen je faznokontrastne mikroskopom kako je ranije opisano [19,20]. Pregled

Test invazije pregled

invazije stanica ispitivanja izvedena su pomoću ploča Transwell® (Corning, NY, USA) obložene Matrigel (Becton Dickinson, New Jersey, USA). Ukratko, Matrigel se razrijedi do koncentracije od 2 mg /ml i 50 ul ove otopine se stavi u polikarbonatni filter i osušena na zraku. Nakon ispiranja s PBS, filteri se stave u jažice, a 700 ul RPMI-1640 mediju za kulturu uz dodatak 10% FBS je dodano u donje komore. Stanice su resuspendirane u RPMI-1640 koji sadrži 1% FBS-a i 1 × 105 stanica u 0,2 ml medija definirani su nasađene na gornju komoru. Stanice u invazije komorama se inkubiraju u vlažnom inkubatoru 12-48 h. Nakon dodatne inkubacije, stanice koje su prodrle pore membranu i dispergirana na donju površinu filtera su obojene s 5% -tnom otopinom kristalno ljubičastog za vizualizaciju. Zatim su izvršile invaziju stanica u svaku jamicu se broji pod svjetlosnim mikroskopom (Olympus, Tokyo, Japan) i kvantificirati iz vizualizaciju pet slučajnih polja i povećanje od × 200 i prosječno kao što je opisano od strane Albini [21]. Invazija je test je ponovljen 3 puta. Vrijednost bar graf predstavlja prosječni broj napali stanica od 3 odvojena pokusa. Pregled

repne vene Metastatski Test pregled

repne vene metastatski analiza utvrđeno je kako je ranije opisano [22]. Trideset muških golim miševima su obrađeni pomoću najboljih humane prakse i bili zbrinuti u skladu s NIH Animal Care and Use odbora smjernicama. Stanice su skupljene primjenom tripsina i isprane tri puta s PBS. Miševi su tada injektirano 1 x 106 stanica u 0,1 ml PBS kroz repnu venu injekcije. Miševi su zatim praćene za opće zdravlje i ukupne tjelesne težine. 28. dan nakon injekcije, miševi su žrtvovani. Pluća i jetre tkiva su promatrani golim okom, a broj vidljivih tumora na pluća i jetre površine su kvantificirani. Pluća i jetre tkiva izrezana su u serijskim dijelove, obojeni s hematoksilinom i eozinom, zatim promatra pod svjetlosnim mikroskopom. Eksperimentalne i kontrolne grupe svaki sadržavao 6 miševa. Svi eksperimentalni postupci su odobreni od strane Odbora Eksperimentalna dobrobiti životinja i etiku, Vojnomedicinsku Sveučilišta Četvrte. Eksperimenti na životinjama su provedena uz suglasnost institucionalnog odbora za istraživanje životinja, u skladu s nacionalnim smjernicama za njegu i korištenje laboratorijskih životinja. pregled

metastaza tumora PCR Array pregled

izražavanja metastasis- povezane geni su određena ljudska metastaza tumora PCR Array (PAH-028A; SuperArray bioznanosti, Maryland, USA) u skladu s uputama proizvođača. Prvo, ukupna RNA je ekstrahirana iz RhoE-lentviral inficirane SGC7901 stanica i kontrolne stanice koristeći standardne protokole koji se zatim prevode u prvi-strand cDNA. CDNA predložak se pomiješa s 2 x SuperArray PCR glavne smjese, doda se u jažice za PCR Array ploča (s 384 jažica) koja sadrži genski specifičnih primera postavlja i podvrgnuta PCR u realnom vremenu. PCR biciklističke uvjeti su sljedeći: 40 ciklusa na 95 ° C za 15 s, 60 ° C 1 min, a na 72 ° C u trajanju od 30 s. Pet domaćih gena korišteni su kao internih kontrola. Fold-promjena u ekspresiji gena metastaza povezanih određen je ΔΔCt metodom. Pregled

Statistička analiza pregled

Analiza podataka izvršena je korištenjem SPSS 17,0 statistički softver za analizu (Chicago, IL, SAD). Mann-Whitney U test korišten je za procjenu značajnosti razlika u učestalosti ekspresije RhoE između želučane tkiva karcinoma i metastaza u limfnim čvorovima. Kruskal-Wallis H test za multi-skupina, a Mann-Whitney U test za dvije usporedbe grupe su korišteni da se analizira odnos između obje razine RhoE ekspresije i raznim kliničko-patološki faktori želučane uzoraka raka. Kumulativno vrijeme preživljavanja je izračunata primjenom metode Kaplan-Meier opstanak i analizira log-rank testa. Jednosmjerna i multivarijatne analize na temelju Cox proporcionalnih rizika regresije. Usporedbe kvantitativnih podataka su analizirani studentovim T-test između dvije skupine. Usporedna analiza između ekspresije RhoE i CXCR4 procijenjena je Spearmanov metodom rang korelacije. Razlike su smatrane za statistički značajne kada P < 0.05. pregled

Rezultati

Prekomjerna ekspresija RhoE je u korelaciji s diferencijacijom razredu i stupnjevanje tumora u želučanog tkiva raka i ukazuje na lošu prognozu za bolesnike pregled

izraz RhoE u želučanom raka tkiva, susjednih ne-tumorskih tkiva i srodne metastatski limfni čvor tkiva ispitana je imunohistokemijski (Slika 1A). RhoE izraz pronađen je slabo izražena ili je uopće nema u susjednim non-tumorskim tkivima (a), dok je njegov izraz lica bio je značajno viši u želučanom tkivu raka i metastaza u limfnim čvorovima (b-e). Zatim smo analizirali odnos između RhoE bojenja i kliničkopatološkim parametara pacijenata oboljelih od raka želuca (Tablica 1). Rezultati su pokazali da ni spol, niti starost bila povezana s izrazom RhoE. Međutim, povećana RhoE izraz statistički povezana s stupanj diferencijacije (P = 0,005) i stupnjevanje tumora, koji se sastojao od veličine tumora (T, P < 0,001), limfnog čvora invazije (N, P = 0,001), a udaljenim metastazama (M, P = 0,003). Nadalje, Kaplan-Meier analiza preživljavanja pokazala je da pacijenti s visokim razinama ekspresije RhoE, predstavljeni s kraćim ukupno preživljenje u usporedbi pacijente s negativnim izrazom RhoE (Slika 1B). Multivarijatna Cox procjene razmjerna opasnosti modela pokazuju da su razine RhoE izražavanja bili su neovisni i značajan faktor za preživljavanje u bolesnika s karcinomom želuca (Tablica S1).
razina ekspresije RhoE
kategoriji pregled n
- + pregled ++ pregled +++
P value
Total9014283216Age0.421≤6041610187>6049818149Gender0.742Male679232213Female2355103Differentiation0.005^{aWell52120Moderately471215146Poorly380121610TNM stageT <0.001aT194320T2175840T347414209T4171367N0.001bN031111073N1-N3593182513M0.003bM08014272811M1100145Table 1. Statistička analiza Analize su imunohistokemijski pregled a, Kruskal-Wallis H test. b, Mann-Whitney U test CSV Preuzimanje CSV}

Nakon toga smo proučavali razine ekspresije RhoE u osnovnim želučanog tkiva raka i njihovih podudarnih metastatski limfni čvor tkiva. Razina ekspresije RhoE odsutna u 7 želučanim tkiva raka, slabo izražen u 16 bolesnika s karcinomom želuca, umjereno izražena u 11 i jako izražene u 6 tkivima raka, respektivno. S druge strane, u metastaze limfnih čvorova odgovarajući broj je 3, 12, 14 i 11. Osim toga, izraz RhoE bila je značajno viša u metastatskih limfnih čvorova tkiva nego da se u osnovnim tkiva raka. Ova opažanja ukazuju da RhoE ekspresija povezana sa metastazama na karcinoma želuca (Tablica 2, P < 0,05).
Expression razina RhoE
Histološki tip pregled n
-
+
++
+++
P vrijednost pregled primarnog raka tissues407161160.048 ^{* limfnih čvorova metastases403121411Table 2. Ekspresija RhoE u primarni rak tkiva i podudarni metastaze limfnih čvorova . pregled * Mann-Whitney u test CSV Preuzimanje CSV}

Izražavanje RhoE u staničnim linijama analiziran je Western blot (slika 1C). Otkrili smo da je u usporedbi s onom u GES staničnu liniju, izraz RhoE bila je značajno viša u raznim raka želuca staničnih linija. Osim toga, razina RhoE ekspresije proteina bila je značajno viša u vrlo invazivne SGC7901-M stanica pod-linije u odnosu na manje invazivne stanice pod-linije SGC7901-NM. Stoga, daljnje studije tumorske metastaze su gotovi temelji na staničnoj modeliranje s SGC7901-M i SGC7901-NM staničnih linija. Pregled

RhoE promiče selica i invazivne sposobnosti želučanih stanica raka in vitro i in vivo

Kako bi istražili ulogu RhoE u želučanom metastaza raka, mi regulira prema gore do izražaja proteina u SGC7901-NM stanica nakon prijenosa s RhoE lentivirusa vektor ili kontrolnim vektorom (nazvan SGC7901-NM-RhoE ili SGC7901-NM-kontrole ). S druge strane, vlaženje od RhoE izražavanja u SGC7901-M stanice postignut je poslije transfekcije s siRNA usmjerena protiv RhoE mRNA ili kontrolu siRNA (nazvane SGC7901-M-siRhoE ili SGC7901-M-kontrole, respektivno). Razina ekspresije proteina potvrđena je pomoću Western blot analize poslije transfekcije (Slika 2A). pregled

Zatim in vitro pregled migraciju i invaziju ispitivanje provedeni su (slika 2b i 2c). Pronašli smo pojačanu ekspresiju RhoE može značajno se reguliraju predmetne migratorne i invazivne sposobnosti za rak želuca stanične linije SGC7901-nm, u zacjeljivanju rana i transjažičnih pokusima invazije. S druge strane, SGC7901-M stanice, koje pokazuju navlaženom izraz RhoE pokazala izuzetnu inhibiciju selica i invazivne sposobnosti u usporedbi s kontrolnim stanicama. Da bi razumjeli da li su funkcije RhoE su zajedničke manifestacije u razne želučane stanice raka ili SGC7091 specifične događaje, rak želuca staničnih linija MKN45 i MKN28 su korišteni za završetak iste eksperimente. Rezultati oba ozdravljenju rane i transjažična pokusima invazije otkrila da RhoE promovirao selica i invazivne sposobnosti obiju MKN45 i MKN28 stanica (Slika S1), što sugerira da su funkcije RhoE detektirana In vitro pregled su sveobuhvatno sve želučanih kanceroznih staničnih linija. U međuvremenu, mi također izvodi MTT testa za testiranje vremenskim promjenu RhoE izražavanja moglo utjecati na rast stanica raka želuca u našem istraživanju. Kao Slika S3A prikazano, ni nad- regulacija RhoE u SGC7901-NM stanica, niti dolje reguliranje RhoE u SGC7901-M stanica može uzrokovati značajne promjene u staničnom proliferacijom (p > 0,05), čime se isključuje utjecaj RhoE na proliferaciju koji će donijeti pomutnju u naše rezultate i dodatno potvrdio da RhoE mogu promovirati stanica motilitet želuca stanica raka. pregled

kako bi se dodatno istražiti da li povećana RhoE mogao promijeniti In vivo
metastatskog sposobnosti želučanih stanica raka proveli smo in vivo pregled repnu venu metastatske pokusi u miševima pomoću SGC7901-NM-RhoE i SGC7901-NM-kontrolu staničnih linija. U žrtvovane miševa, utvrđeno je da stanice koje prikazuju višu razinu RhoE izražavanja dovela do sve vidljiviji liver- i pluća površinskih tumora u usporedbi s kontrolnim stanicama (P < 0.05, slika 3). H i E bojenje je pokazalo da SGC7901-NM-RhoE stanice očito proizvedeno metastaze u oba jetru i pluća, dok kontrolne stanice prikazuju samo djelomične metastaze. Uzeti zajedno, ovi podaci predložio da RhoE odigrao važnu ulogu u promicanju metastaza želučanih stanica raka i In vitro pregled i in vivo pregled. Pregled

CXCR4 mogao biti preuzet tok gena RhoE u rak želuca Netlogu

da bi se utvrdilo moguće nizvodnog gena kroz koji RhoE može posredovati svoju funkciju u metastaza želučanih stanica karcinoma, proveli smo PCR Array istražiti diferencijalno ekspresiju gena metastaza povezanih dijeli se između SGC7901-NM-RhoE i SGC7901-NM-kontrole staničnih linija. Geni koji povećana ili smanjena ≥ 2 puta su se smatrali potencijalnim RhoE-ovisnih nizvodno gena. Sve u svemu, otkrili smo 84 gena i na kraju pronašao 6, koje su znatno promijenilo nakon izraz RhoE je poboljšana (tablica 3). Među 6 gena, 3 (CXCR4, VEGFA, CTSK) porasli su regulirane, a tri su (MMP7, CD82, CTSL1) podregulirani u SGC7901-NM-RhoE stanica.
Expression razina imena mRNA pregled Genea pregled Opis
SGC7901-NM-kontrole
SGC7901-nm RhoE pregled CXCR4Chemokine (CXC motiv) receptora 41.003.30VEGFAVascular endotelnog faktora rasta A1.002.78CTSKCathepsin K1.002.68CTSL1Cathepsin L11.00-2.12CD82CD82 molecule1.00-2.29MMP7Matrix metalopeptidaze 71.00-2.47Table 3. diferencijalno Izraženo Metastaza-srodnih gena nakon prošireni RhoE izražavanja.
CSV Preuzmite CSV

u ovom istraživanju, izraz CXCR4, VEGFA, CTSK i CD82 su verificirana Western blot analize i zanimljivo, otkrili smo da je samo CXCR4 izraz lica bio je u skladu s rezultatima dobivenim PCR analizom polja. Razina proteina CXCR4 je potisnuto uplitanja RhoE i za razliku od, je porastao kada RhoE ektopički izražena (slika 4a). Tako je korelacija između RhoE i CXCR4 izražavanja analizirana je imunohistokemijski u 60 karcinoma želuca tkiva Rezultati su pokazali da CXCR4 je vrlo izražena u tkivima gdje RhoE je pozitivno obojenih, dok je slabo izražena u onim tkivima gdje RhoE je izražena na niskoj razini (Slika 4B). Osim toga, oba RhoE i CXCR4 izraz su podudaraju se u 83,3% (50/60) želučanog karcinoma uzoraka je Spearman R koeficijent korelacije bio je 0,80 (P 0,001), te ukazuje na usku povezanost između oba RhoE i CXCR4 izražavanja u želučanog karcinoma (Tablica 4). Kao što je prikazano, prekomjerno eksprimiran CXCR4 također igra važnu ulogu u metastazi raka te je uključena u proces EMT, koja ukazuju na CXCR4 možda nizvodni gen RhoE s važnosti u metastazi želuca stanica raka. [23]
CXCR4
Spearman-a correlation
RhoE
+
++
+++
Negative
n
p
p
R
+1820060<0.001<0.0010.80++11730+++0270Negative2008Table 4. Korelacija između iskazivanje RhoE i CXCR4 u 60 parova rak želuca tkiva.
CSV Preuzimanje CSV

CXCR4 je bitno u poticanju invaziju RhoE u želučanim stanicama raka pregled

Kako bi istražili učinak CXCR4 o sposobnosti RhoE da funkcionira u metastazi raka želuca, poboljšali smo ekspresiju CRCR4 u SGC7901-M-siRhoE stanica lentivirusnim tranduction i dolje-regulira svoj izraz u SGC7901-NM-RhoE stanica siRNA smetnje. Razina proteina određena je pomoću Western blot analize (Slika S2). U sljedećem testu bunara, otkrili smo da je poboljšana izraz CXCR4 mogao vratiti invazivnu sposobnost SGC7901-M-siRhoE stanicama, dok s druge strane stišavanje buke endogenim CXCR4 potisnuti invaziju SGC7901-NM-RhoE stanicama (Slika 5). Ova opažanja ukazuju da RhoE induciranog želučanog invazije stanica raka, što je djelomično posredovanog CXCR4. Ova opažanja i dodatno pokazao da CXCR4 je meta nizvodno od RhoE. pregled

Rasprava pregled

neprirodno-izrazili RhoE često je povezana s progresijom tumora. Međutim, uloga o RhoE mogu prebacivanje supresor tumora i onkogena, ovisno o podrijetlu tumora [7-9]. Kako je izvijestila, rak želuca i dalje jedan od najčešćih oblika raka u svijetu, pogotovo u istočnoj Aziji. Ranije je pokazano da nenormalan RhoE izraz dobro korelira s progresijom raka želuca. Kao Zhou Li opisano, izraz RhoE je povećana kod raka želuca od indukcije HIF-1 a, a čija ekspresija može ići proširen još kada stanice raka stvaraju otpornost na antitumorskih lijekova. Osim toga, pojačana ekspresija RhoE potiče otpornost na lijek suzbijanju Bax izraza [13,24]. pregled

U ovom istraživanju, otkrili smo da RhoE ekspresija je povišena u želučanim tkiva raka dok je bio odsutan ili slabo izražene u susjednim non-tumorskog tkiva. Osim toga, klinički dokazi su pokazali da RhoE prekomjerna ekspresija značajno korelira sa stupnjem raka staničnom diferencijacijom i TNM, koji se sastoji od veličine tumora (T), limfnog čvora invazije (N) i metastaze (M). Što je još važnije, RhoE razine ekspresije su neovisna i značajan faktor rizika za preživljavanje kod raka želuca. Osim toga, regulira prema gore ekspresiju RhoE mogao predvidjeti slab ishod u bolesnika s rakom želuca. Uzeti zajedno, naši podaci snažno sugerirao da RhoE možda služio kao onkogena kod raka želuca i odigrao pozitivnu ulogu u želučanom progresiju raka, posebno u metastaza raka. To je formalno moguće da RhoE mogao biti novi prognostički faktor u bolesnika s karcinomom želuca. Dakle, s obzirom da su metastaze je jedan od glavnih razloga za smrtnosti od raka želuca, naši rezultati mogu dati novi trag ili novi cilj za inhibiciju tumorskih metastaza kod raka želuca, a možda konačno pomoći u razvoju terapeutskih strategija za produženje života bolesnika. pregled

Pa ipak, uloga RhoE u metastaza raka i dalje samo djelomično neodređena. U hepatocelularnih stanicama karcinoma i mezenhimalne tumora, povećana RhoE ekspresija korelira sa smanjenom metastatskim sposobnosti, dok je u stanicama melanoma, RhoE potiče staničnu migraciju i invaziju [10,12,25]. Kako bi istražili ulogu RhoE u metastazi raka želuca, ispao mi se RhoE u SGC7901-M stanična linija, koja ima visok metastatski potencijal i izazvali smo svoj izraz u SGC7901-NM stanična linija, koja je siromašna na metastaze , Nakon toga, in vitro testovi su pokazali da
povećana RhoE promovira staničnu pokretljivost i invazivnost, dok smanjena RhoE dovelo do neinvazivnu karakter želuca stanica raka. Ovi rezultati su dodatno potvrđuje i in vivo
testu. Dobro je poznato da poboljšanu migracija stanica raka i invaziju nužni koraci za konačno dobivanje metastaza. Stoga, u želučanim stanica karcinoma RhoE može biti funkcionalna metastaza promotora gena. Ipak, mi također primijetio da je stanična morfologija mnogo promijenio nakon izmjene RhoE izražavanja. Daljnja istraživanja pokazala da je ova promjena morfološka mogu uzrokovati nestanak stresa vlakana (slika S3B), a ne promjena stanične proliferacije. pregled

Kako je izvijestila, RhoE regulira metastaza raka, te se tako govore inhibirajući ROCK /MYPT put [26]. Ovaj dio je istraživana u drugom istraživačkom studiji našoj grupi (podaci nisu prikazani). U ovom istraživanju, primjenjuju se PCR analizu Array za identifikaciju drugih nizvodno gena RhoE u želučanom metastaza raka, s ciljem utvrđivanja temeljne mehanizme tumorskih metastaza. Prema tome, dobili smo 6 diferencijalno eksprimirani geni metastaziranja povezanih praćenje regulaciju RhoE (CXCR4, VEGFA, CTSK, MMP7, CD82 i CTSL1). MMP7 (matrična metaloproteinaza-7) pripada obitelji MMP proteina, koji su uključeni u razgradnju ekstracelularnog matriksa u fizičkoj i patoloških stanja [27]. pregled

To je izvijestio da je pojačana ekspresija MMP7 pojačan invazivnu sposobnost stanica raka [28]. U PCR analiza polja, MMP7 je utvrđeno da je dolje uređeno visoko invazivnih SGC7901-NM-RhoE stanice, što je u suprotnosti s ranijim izvješćima. Dakle, smatra se MMP7 od manje važnosti u našem istraživanju i nisu potvrdili svoj izraz Western blot. Za sličnog razloga, nismo provjerili izraz CTSL1. Na naše iznenađenje, između 4 gena je određeno 'Western blot' analizom samo izraz CXCR4 pronađen u skladu sa rezultatom dobivenim PCR analizom Array. Daljnja istraga je pokazala da je up-regulaciji CXCR4 u želučanih stanica raka djelomično mogao vratiti invazivnu sposobnost, koja je potisnuta od strane RhoE nokauta. Nasuprot tome, down-regulacija CXCR4 umanjuje invaziju stanica raka želuca, što je induciranog overekspresija RhoE. Dakle, CXCR4 može biti potencijalni nizvodnog efektora RhoE u želučanom metastaza raka. Pregled

CXCR4, zajedno sa svojim ligand CXCL12 (naime CXCL12 /CXCR4 os), dobro je poznato da se uključe u mnogim aspektima napredovanja tumora, posebno tumorskih metastaza. Ranije je izvijestio da su CXCL12 /CXCR4 os je bitno za metastatske stanice raka da se rasprše na organe i na taj način omogućiti tumorske stanice za pristup stanične nišama koje pogoduju opstanku tumorskih stanica i rast [29]. Osim toga, aktivirani CXCR4 zahtijeva vezanje na G-proteine ​​izvanstaničnog prijenos signala u stanici i inicirati različita odgovora [23]. Osim toga, kada je s obzirom da je RhoE je član G-protein obitelji, smatrat ćemo da RhoE mogli povećati repertoar CXCL12 /CXCR4 os signala povećanjem ekspresije CXCR4 receptora. S druge strane, RhoE može vezati za CXCR4 i posreduje nizvodno prijenos signala, što je u konačnici moglo dovesti do metastaza raka. Nadalje, već smo pokazali da RhoE sudjeluje u hypoxia- izazvana EMT, što je ključni proces koji doprinosi metastaze raka, u kojoj CXCR4 također su uključeni. Te bliske veze između RhoE i CXCR4 snažno sugerirao da RhoE pojačan metastaza reguliranjem up-CXCR4 kod raka želuca. Detaljne mehanizmi odgovorni za tih puteva potrebna daljnja istraživanja. pregled

Zaključak pregled

Naša studija je pokazala da RhoE je izraženo u rak želuca i povezano s napredovanjem raka. pregled

• PLoS ONE: Pretvaranje mikročipa potpis u dijagnostičkom testu: Trial of Custom 74 ekspresijom gena za pojašnjenje i prognozu prognozu rak želuca
• PLoS ONE: Resveratrol inhibira rast raka želuca by Izazivanje G1 faza boravišta i starenje u Manner