PLoS ONE: RhoE Bevordert metastase bij maagkanker door middel van een mechanisme Afhankelijk van verhoogde expressie van CXCR4

Abstract

RhoE, een nieuw lid van de Rho-eiwit familie, is een belangrijke regulator van het cytoskelet en de cel migratie. Onze fractie heeft eerder aangetoond dat RhoE als direct doelwit voor HIF-1α en bemiddelt-hypoxie geïnduceerde epitheliale naar mesenchymale transitie in maagkanker cellen. Daarom is gedaan alsof RhoE een belangrijke rol bij maagkanker metastase zou kunnen spelen. In de onderhavige studie hebben we de rol van RhoE expressie in maagkanker, invasie en metastase, en de invloed van RhoE over de regulering van de mogelijke expressie van stroomafwaartse genen onderzocht. RhoE expressie was verhoogd bij maagkanker weefsels ten opzichte van normale gastrische weefsels. We vonden ook een nauwe correlatie tussen de histologische graad en de diagnose van de patiënt. Up-regulatie van RhoE aanzienlijk verbeterd de trekkende en invasieve mogelijkheden van maagkanker cellen zowel In vitro Kopen en In vivo
. Bovendien neerwaartse regulatie van RhoE verminderde het metastatisch potentieel van kankercellen. PCR-array en de daaropvolgende transwell test toonde aan dat de regulering van maagkanker metastase door RhoE gedeeltelijk werd bemiddeld door CXCR4. Deze waarneming suggereerde dat CXCR4 een stroomafwaartse effector voor RhoE zou kunnen zijn. Kortom, onze studie wees RhoE als nieuw prognostische biomarker en metastase bevorderen gen maagkanker

Citation:. Feng B, K Li, Zhong H, G Ren, Wang H, Shang Y, et al. (2013) RhoE Bevordert metastase bij maagkanker door middel van een mechanisme Afhankelijk van verhoogde expressie van CXCR4. PLoS ONE 8 (11): e81709. doi: 10.1371 /journal.pone.0081709

Editor: Sharmila Shankar, Universiteit van Kansas Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 11 januari 2013; Aanvaard: 24 oktober 2013; Gepubliceerd: 29 november 2013

Copyright: © 2013 Feng et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de Nationale Basic Research Program van China (nr: 2009CB521700), het National High Technology Research en Development Program van China (nr: 2006AA02A253) en de National Science and Technology ondersteunend programma tijdens de Elfde Five-Year Plan periode (No: 2006BAI02A14). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker is de tweede belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen in de wereld en tumor metastase is het grootste obstakel voor de succesvolle behandeling en de belangrijkste oorzaak van de patiënt sterfte [1,2]. Al tientallen jaren zijn tal van studies geprobeerd om de processen en mechanismen op uitzaaiingen bij maagkanker te begrijpen. De laatste jaren is gebleken dat epitheliale mesenchymale transitie (EMT) is van cruciaal belang in dit proces en mate bijdraagt ​​tot kankercel invasie en metastase. Een mogelijke reden is dat tijdens EMT, het cytoskelet fundamenteel gemoduleerd, waardoor de verstrooiing van tumorcellen [3].

RhoE behoort tot een subgroep van de Rho-eiwitten die een sleutelrol in cytoskelet vorming spelen , celmotiliteit, celcyclus en apoptose [4,5]. In tegenstelling tot de typische Rho eiwitten, die cyclus tussen een actieve GTP-gebonden toestand en een rust-GDP-gebonden toestand, RhoE ontbreekt intrinsieke GTPase activiteit en altijd presenteert als de actieve GTP-gebonden vorm [6]. Deze unieke eigenschap geeft aan dat de functie van RhoE hoofdzaak wordt geregeld door de expressie in plaats van de activiteit.

Onlangs zijn enkele studies gevonden dat abnormale expressie van RhoE werd geassocieerd met carcinogenese en dat RhoE kan optreden hetzij als een tumorsuppressorgen of een oncogen, afhankelijk van de oorsprong van de kanker [7-9]. Evenzo RhoE heeft wisselende invloeden op uitzaaiing in verschillende kankers. In melanoom, RhoE ondersteunt de migratie en invasiviteit van tumorcellen door het reguleren van het actine cytoskelet [10]. Echter, in leverkanker, RhoE vertegenwoordigt zichzelf als een suppressor eiwit van tumormetastase [11,12].

Eerder onze fractie heeft geconstateerd dat RhoE bij maagkanker cellen werd versterkt door inductie van HIF-1α expressie onder hypoxische omstandigheden en bevorderd EMT van maagkanker cellen [13]. Zo hebben we de hypothese dat RhoE een positieve bijdrage in de uitzaaiing van maagkanker kunnen hebben. In de huidige studie, onderzochten we de invloed van RhoE op de uitzaaiing van maagkanker cellen en de onderliggende mechanismen.

Materialen en methoden

Cell Culture

De menselijke adenocarcinoom van de maag cellijnen SGC7901, MKN-45, MKN-28, KATO-III en de normale maagslijmvlies cellijn GES werden bewaard in ons instituut [14-16]. Bovendien, de maagkanker cel- lijn SGC7901-M, met een hoog metastatisch potentieel heeft en SGC7901-NM, die een slechte metastatisch vermogen heeft, werden vastgesteld en gehandhaafd ons instituut [17]. Alle cellen werden in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) en gekweekt bij 37 ° C in een volledig vochtig gemaakte atmosfeer van 5% CO2 gehandhaafd.

Tissue Array

Voor immunokleuring toepassingen werden twee weefsel arrays van menselijke maagkanker in de handel verkrijgbaar bij overtreffen Biotech Co Ltd (Shanghai, China). Een weefsel-array bevatte 90 tumorweefsel spots en afgestemd naburige niet-tumorweefsel plekken die werden verkregen van 90 patiënten (met 5,3-6,1 jaar follow-up). De fabrikant verschaft de sekse, leeftijd en klinisch-parameters van de patiënt. De andere reeks bevatte 120 vlekken met 40 primaire tumor weefsel vlekken, 40 geëvenaard naburige niet-tumorweefsel vlekken, en 40 afgestemd lymfkliermetastasen plekken.

Immunohistochemie

Immunohistochemie werd uitgevoerd met behulp Histostain ™ Plus kits (Zhongshan Goldenbridge Biotech, China) volgens de instructies van de fabrikant. De muis anti-RhoE antilichaam (verdund 1: 100, Upstate, MA, USA) of anti-CXCR4-antilichaam (verdund 1: 200; Sigma-Aldrich, MO, USA) werden gebruikt in de IHC test als eerste antilichaam. Muis IgG werd gebruikt in plaats van het eerste antilichaam als negatieve controle in deze studies. Het verkregen resultaat werd semi-kwantitatief door het toewijzen van scores voor de intensiteit van immunoreactiviteit en het percentage cellen positief gekleurd zoals beschreven door anderen. De intensiteit van immunoreactiviteit werd verdeeld in vier categorieën en gescoord als afwezig (-; score: 0), zwak (+; score: 1), matig (++; score: 2), of sterke (+++; score: 3 ) volgens de kleurintensiteit die werd waargenomen in de meeste maagepitheelcellen. Het percentage positieve cellen werd ingedeeld in vier groepen: (1), 0-25% van de tumorcellen vertonen immunoreactiviteit; (2), 25-50% van de cellen; (3), 50-75 procentpunten van cellen; en (4) 75-100% van de cellen. De totale score was het product van de twee [18].

Western blotanalyse

Eiwitmonsters werden uit cellen of weefsels geëxtraheerd door sonicatie in een lysisbuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris -HCl (pH 8,8), 0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% NP40, 5 ug /ml aprotinine, 1 gg /ml leupeptine) op ijs en vervolgens gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 10 min. Eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE electroforese en nitrocellulose membranen (Bio-Rad, CA, USA). Niet-specifieke binding werd geblokkeerd met 5% vetvrije melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het membraan werd daarna afzonderlijk geïncubeerd met anti-RhoE antilichaam (verdund 1: 400, Upstate, MA, USA), anti-CXCR4-antilichaam (verdund 1: 1000, Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-VEGFA antilichaam (verdund 1 : 500; Abcam, MA, USA), anti-CD82-antilichaam (verdund 1: 1000, Abcam, MA, USA), anti-CTSK antilichaam (verdund 1: 1000, Santa Cruz, Texas, USA) of β-actine antilichaam ( verdund 1: 10.000, Sigma-Aldrich, MO, USA) gedurende de nacht bij 4 ° C. Na vier wasbehandelingen met TBS-T buffer werden de membranen geïncubeerd met mierikswortel peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam (verdund 1: 2000, Santa Cruz, Texas, USA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Na 4 wasbehandelingen met TBS-T buffer werden de banden ontwikkeld met SuperSignal Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, MA, USA) om de eiwitten te visualiseren. Vlekken werden vervolgens geanalyseerd door Quantity One®-software (versie 4.2. Bio-Rad, CA, USA) volgens de handleiding. Western blot voor β-actine expressie werd gebruikt als een interne controle.

ectopische expressie en siRNA-gemedieerde silencing

Voor ectopische expressie van doelgenen, maagkanker cellen getransduceerd met lentivirus vector die RhoE of CXCR4 (verstrekt door GeneChem, Shanghai, China). In het kort werden cellen uitgeplaat en gekweekt tot 75-80% confluentie zonder antibiotica, waarna de lentivirale vectoren aan de cellen in kweekmedium werden toegevoegd met polybreen (2 ug /ml) bij een MOI van 50. Vervolgens werden de cellen gekweekt gedurende een 72 h en de infectie-efficiëntie werd gecontroleerd door fluorescentie microscopie en Western blotanalyse. Tussenkomst van menselijke RhoE of CXCR4 expressie werd bereikt met behulp van een RNA-interferentie techniek. siRNA duplexen werden gesynthetiseerd door Takara Biotechnologie (Liaoning, China) en de beoogde sequenties van RhoE of CXCR4 werden dus gedefinieerd:

RhoE, 5'-GAACGUGAAAUGCAAGAUAUU-3 ';

CXCR4, 5'-UAAAAUCUUCCUGCCCACC-3 '.

Controle siRNA duplexen werden ontworpen na het ondervragen van de BLAST-database met niet-specifieke targeting sequenties. Cellen werden getransfecteerd met behulp van oligonucleotide duplexen LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, NY, USA) volgens de instructies van de fabrikant, waarna zij werden onderworpen aan verdere analyse 48 uur na transfectie.

wondgenezing Assay

Om celmotiliteit detecteren, werden exponentiële fase cellen gezaaid in 6-well platen. Nadat de cellen confluentie bereikten een monolaag van cellen op de substraten, werd een plastic pipet getrokken over het midden van de plaat om een ​​schone 1 mm breed wond en het medium te produceren werd vervangen door vers RPMI 1640 met 1% foetaal runderserum . Na 48 uur werd celbeweging in het wondgebied beoordeeld met behulp van een fasecontrastmicroscoop zoals eerder beschreven [19,20].

Invasion Assay

invasie assays werden uitgevoerd met een Transwell plaat (Corning, NY, USA) gecoat met Matrigel (Becton Dickinson, NJ, USA). In het kort Matrigel werd verdund tot een concentratie van 2 mg /ml en 50 pi van deze oplossing werd in een polycarbonaat filter gebracht en lucht gedroogd. Na spoelen met PBS werden de filters in putjes gebracht en 700 ul RPMI-1640 kweekmedium aangevuld met 10% FBS werd toegevoegd aan de onderste kamer. Cellen werden opnieuw gesuspendeerd in RPMI-1640 bevattende 1% FBS en 1 x 105 cellen in 0,2 ml medium uitgeplaat gedefinieerd in de bovenste kamer. Cellen in de invasie kamers werden geïncubeerd in een bevochtigde incubator gedurende 12-48 uur. Na een extra incubatie werden cellen die de poriën van het membraan doorgedrongen en gedispergeerd met de onderzijde van de filters gekleurd met 5% kristalviolet oplossing voor visualisatie. Vervolgens de binnengedrongen cellen in elk putje werden geteld onder een lichtmicroscoop (Olympus, Tokyo, Japan) en gekwantificeerd visualiseren van vijf willekeurige velden bij een vergroting van 200 x en gemiddeld zoals beschreven door Albini [21]. De invasie assay werd 3 maal herhaald. De waarde van de staafdiagram geeft het gemiddelde aantal binnengedrongen cellen uit 3 afzonderlijke experimenten.

Tail Vein gemetastaseerde Assay

De staart ader metastatische test werd bepaald zoals eerder gerapporteerd [22]. Dertig mannelijk naakt muizen werden behandeld met behulp van best practices humane en in overeenstemming met NIH Animal Care en gebruik Comite richtlijnen werden verzorgd. De cellen werden geoogst via trypsine en driemaal gewassen met PBS. De muizen werden vervolgens geïnjecteerd met 1 x 106 cellen in 0,1 ml PBS met staartader injectie. De muizen werden vervolgens gecontroleerd op de algemene gezondheid en het totale lichaamsgewicht. Op de 28e dag na injectie werden de muizen opgeofferd. Long- en leverweefsels waargenomen met het blote oog en het aantal zichtbare tumoren op de longen en de lever oppervlak werden gekwantificeerd. Long- en leverweefsels werden in seriële secties gesneden, gekleurd met hematoxyline en eosine, vervolgens bekeken onder een lichtmicroscoop. Experimentele en controlegroepen bevatten elk 6 muizen. Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Experimental Animal Welfare en de ethische commissie, de vierde Militaire Medische Universiteit. Animal experimenten werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Institutional Comité for Animal Research, in overeenstemming met de nationale richtlijnen voor de zorg en het gebruik van proefdieren.

tumormetastase PCR Array

De expressie van metastasis- geassocieerde genen werden bepaald door het Human tumormetastase PCR Array (PAK-028A, SuperArray Biosciences, Maryland, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Eerst werd totaal RNA geëxtraheerd uit RhoE-lentviral SGC7901 geïnfecteerde cellen en controlecellen middels standaardprotocollen, dat vervolgens werd omgezet in eerste streng cDNA. De cDNA sjabloon werd gecombineerd met 2 x SuperArray PCR master mix, toegevoegd aan de putjes van een PCR Array plaat (384-well) dat het gen-specifieke primer sets en onderworpen aan real-time PCR. De PCR cycling condities waren als volgt: 40 cycli bij 95 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 1 min en 72 ° C gedurende 30 s. Vijf housekeeping genen werden gebruikt als interne controles. De veelvoudverandering in de expressie van metastase-genen werd bepaald door de werkwijze ΔΔCt.

Statistische analyse

Gegevensanalyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS 17.0 software voor statistische analyse (Chicago, IL, VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). De Mann-Whitney U test werd gebruikt om de significantie van verschillen in de frequentie van de expressie van RhoE tussen maagkanker weefsels en metastasen te evalueren. De Kruskal-Wallis test voor H meervoudige groepen en de Mann-Whitney U test voor twee groepen vergeleken werden toegepast om de relatie tussen beide RhoE expressieniveaus en diverse klinische en pathologische factoren maagkanker monsters te analyseren. Cumulatieve overleving werd berekend met behulp van de Kaplan-Meier-methode en geanalyseerd door de log-rank test. Univariate en multivariate analyses waren gebaseerd op de Cox proportionele hazards regressie model. Vergelijkingen van kwantitatieve gegevens werden geanalyseerd met Student's T-test tussen twee groepen. analyse correlatie tussen de expressie van RhoE en CXCR4 werd geschat door Spearman rang correlatie methode. Verschillen werden statistisch significant bij P < 0,05.

Resultaten

Over-expressie van RhoE is gecorreleerd met de differentiatie graad en tumor staging bij maagkanker weefsels en wijst op een slechte prognose voor patiënten

De expressie van RhoE in de maag kankerweefsel, naburige niet-tumorweefsels en verwante metastatische lymfeknoop weefsel werd onderzocht door immunohistochemie (Figuur 1A). RhoE expressie bleek zwak tot expressie of zelfs afwezig in naburige niet-tumorweefsels (a), terwijl de expressie was significant hoger bij maagkanker weefsels en lymfeknoop metastasen (b-e). Vervolgens analyseerden we de relatie tussen RhoE kleuring en de klinische en parameters van maagkanker patiënten (tabel 1). De resultaten toonden aan dat noch geslacht of leeftijd werd gecorreleerd met de expressie van RhoE. Verhoogde RhoE expressie was statistisch gecorreleerd met de graad van differentiatie (P = 0,005) en stagering, bestaande uit tumorgrootte (T, P < 0,001), lymfeklier invasie (N, P = 0,001), en metastasen op afstand (M, P = 0,003). Bovendien Kaplan-Meier analyse toonde aan dat patiënten met hoge expressieniveaus van RhoE, gepresenteerd met een kortere overleving vergeleken patiënten met een negatieve expressie van RhoE (figuur 1B). Multivariate Cox proportionele hazards model evaluaties aangegeven dat de niveaus van RhoE expressie was een onafhankelijke en belangrijke factor voor overleving bij maagkanker patiënten (tabel S1).
Expressie niveau van RhoE
Categorie
n
- +
++
+++
P value
Total9014283216Age0.421≤6041610187>6049818149Gender0.742Male679232213Female2355103Differentiation0.005^{aWell52120Moderately471215146Poorly380121610TNM StageT allemaal <0.001aT194320T2175840T347414209T4171367N0.001bN031111073N1-N3593182513M0.003bM08014272811M1100145Table 1. Statistische analyse van Immunohistochemische Assay
a, Kruskal-Wallis H Test.; b, Mann-Whitney U Test CSV Download CSV}

Vervolgens bestudeerden we de expressieniveaus van RhoE in primaire maagkanker weefsels en bij elkaar passende metastatische lymfeknoop weefsel. De expressieniveaus van RhoE afwezig in 7 maagkanker weefsels, zwak tot expressie in 16 maagkankerpatiënten, matig uitgedrukt in 11, en hoog tot expressie in kankerweefsels 6, respectievelijk. Daarentegen in lymfeknoop metastasen het overeenkomstige nummer was 3, 12, 14 en 11. Voorts is de expressie van RhoE significant hoger bij metastatische lymfeknoop weefsel dan in primaire kanker weefsels. Deze waarnemingen gaven aan dat RhoE expressie werd gecorreleerd met uitzaaiingen bij maagkanker (tabel 2, P < 0,05).
Expressie niveau van RhoE
histologische soort
n
-
+
++
+++
P Waarde
Primaire kanker tissues407161160.048 <sup>* Lymfeklier metastases403121411Table 2. Expressie van RhoE in primaire kanker weefsels en Matched lymfekliermetastasen .
* Mann-Whitney U Test CSV Download CSV</sup>

Expressie van RhoE in cellijnen werd geanalyseerd door Western blot (figuur 1C). We vonden dat vergeleken met die in de GES cellijn, de expressie van RhoE significant hoger bij verschillende maagkanker cellijnen. Bovendien is het niveau van eiwitexpressie RhoE was het zeer invasieve SGC7901-M cel sublijn significant hoger dan in de minder invasieve cel sublijn SGC7901-NM. Daarom werden verdere studies van tumormetastase gedaan gebaseerd op cellulaire modellen met SGC7901-M en SGC7901 NM-cellijnen.

RhoE bevordert de migratie en invasieve vermogen van maagkanker cellen in vitro en in vivo

Om de rol van RhoE bij maagkanker metastase te verkennen, we up-gereguleerd zijn eiwitexpressie in SGC7901-NM cellen na transductie met de RhoE lentivirus vector of de controle vector (genaamd SGC7901-NM-RhoE of SGC7901-NM-control ). Daarentegen dempend van RhoE expressie in SGC7901-M cellen werd bereikt na transfectie met siRNA gericht tegen RhoE mRNA of met controle-siRNA (vernoemd SGC7901-M-siRhoE of SGC7901-M-control respectievelijk). Eiwit expressie niveaus werden bevestigd door Western blot analyse na transfectie (Figuur 2A).

Hierna In vitro
migratie en invasie assay werden uitgevoerd (Figuur 2B en 2C). We vonden verhoogde expressie van RhoE aanzienlijk kunnen up-reguleren van de trekkende en invasieve mogelijkheden van de maagkanker cellijn SGC7901-NM, in wondgenezing en transwell invasie assays. Daarentegen SGC7901-M cellen, vertonen bevochtigd uitdrukking van RhoE toonde een opmerkelijke remming van trekkende en invasieve capaciteiten in vergelijking met controle cellen. Om te begrijpen of de functies van RhoE waren gemeenschappelijke gebeurtenissen in verschillende maagkanker cellen of SGC7091 specifieke gebeurtenissen, de maagkanker cellijnen MKN45 en MKN28 werden gebruikt om dezelfde experimenten voltooien. De resultaten van zowel de wondgenezing en transwell invasie assays bleek dat RhoE bevorderde de migratie en invasieve vermogen van zowel MKN45 en MKN28 cellen (figuur S1), waaruit bleek dat de functies van RhoE die gedetecteerd in vitro
waren uitgebreid voor alle maagkanker cellijnen. Ondertussen hebben we ook uitgevoerd MTT test om wether wijziging van RhoE expressie kunnen beïnvloeden celgroei van maagkanker in onze studie te testen. Zoals Figuur S3A getoond, kon noch up- regulatie van RhoE in SGC7901-NM cellen noch down-regulatie van RhoE in SGC7901-M cellen tot een duidelijke verandering van de cel proliferatie (p > 0,05), waardoor het effect van RhoE uitgesloten op celproliferatie wat zou verwarring brengen aan onze resultaten en verder bevestigd dat RhoE cel beweeglijkheid van maagkanker cellen kan bevorderen.

om verder te onderzoeken of verhoogde RhoE kunnen veranderen de in vivo
metastatische vermogen van maagkanker cellen , uitgevoerd we in vivo
staartader uitgezaaide assays in naakt muizen met behulp van SGC7901-NM-RhoE en SGC7901-NM-control cellijnen. In muizen geofferd, werd gevonden dat cellen die hogere RhoE expressie leidde tot aanzienlijk meer toegankelijk lever- en longen oppervlak tumoren vergeleken met controlecellen (P < 0,05, figuur 3). H en E kleuring toonde aan dat SGC7901-NM-RhoE cellen blijkbaar geproduceerd uitzaaiingen in zowel de lever en longen, terwijl controle cellen weergegeven slechts gedeeltelijk uitzaaiingen. Tezamen bieden deze gegevens suggereerde dat RhoE een belangrijke rol gespeeld bij het bevorderen van metastase van maagkanker cellen zowel In vitro Kopen en In vivo
.

CXCR4 kan een down- stroom-gen van RhoE bij maagkanker

om de mogelijke downstream-genen waardoor RhoE zijn functie kan bemiddelen bij de metastase van maagkanker cellen te bepalen, voerden we PCR Array aan de differentiële expressie van metastase-gerelateerde genen te verkennen gedeeld tussen SGC7901-NM-RhoE en SGC7901-NM-control cellijnen. Genen die verhoogde of verlaagde ≥ 2 maal werden beschouwd als mogelijke RhoE-afhankelijke downstream genen. Kortom, wij ontdekt 84 genen en uiteindelijk totaal 6, die sterk zijn gewijzigd na expressie van RhoE werd verhoogd (tabel 3). Onder de 6 genen, 3 (CXCR4, VEGFA, CTSK) waren up-gereguleerd, en drie anderen (MMP7, CD82, CTSL1) werden down-gereguleerd in SGC7901-NM-RhoE cellen.
Expressie niveau van mRNA
Gene naam
Beschrijving
SGC7901-NM-control
SGC7901-NM-RhoE
CXCR4Chemokine (CXC motief) receptor 41.003.30VEGFAVascular endotheliale groeifactor A1.002.78CTSKCathepsin K1.002.68CTSL1Cathepsin L11.00-2.12CD82CD82 molecule1.00-2.29MMP7Matrix metallopeptidase 71.00-2.47Table 3. differentieel tot expressie metastase-gerelateerde genen na Augmented RhoE Expression.
CSV Download CSV

in deze studie, de expressie van CXCR4, VEGFA, CTSK en CD82 werden geverifieerd door Western blotanalyse en interessant, we vonden dat alleen CXCR4 expressie was consistent met de resultaten die door PCR array analyse resultaten. Het eiwitniveau van CXCR4 werd onderdrukt door tussenkomst van RhoE en daarentegen, was verhoogd RhoE ectopisch tot expressie werd gebracht (Figuur 4A). Zo is de correlatie tussen RhoE en CXCR4 expressie werd geanalyseerd door immunohistochemie in 60 maagkanker weefsels De resultaten toonden aan dat CXCR4 was sterk tot expressie gebracht in weefsels waarin RhoE was positief gekleurd, terwijl het slecht tot expressie werd gebracht in die weefsels waarin RhoE expressie werd gebracht op een laag niveau (Figuur 4B). Bovendien, zowel RhoE en CXCR4 expressie waren concordant in 83,3% (50/60) van maagcarcinomen specimens, de R Spearman correlatiecoëfficiënt was 0,80 (P < 0,001) en gaf een nauwe correlatie tussen beide RhoE en CXCR4 expressie in maagkanker (Tabel 4). Zoals gemeld, tot overexpressie gebracht CXCR4 speelt een belangrijke rol in kanker metastase en is betrokken bij het EMT proces, dat suggereerde dat CXCR4 een stroomafwaarts gen RhoE van belang kunnen zijn in de metastase van maagkanker cellen [23].
CXCR4
Spearman correlation
RhoE
+
++
+++
Negative
n
p
p
R
+1820060<0.001<0.0010.80++11730+++0270Negative2008Table 4. Correlatie tussen Expressie van RhoE en CXCR4 in 60 paren maagkanker weefsels.
CSV Download CSV

CXCR4 is essentieel induceren invasie door RhoE bij maagkanker cellen

Om het effect van CXCR4 onderzoeken op het vermogen van RhoE te functioneren in de metastase van maagkanker, verbeterde we de expressie van CRCR4 in SGC7901-M-siRhoE cellen door lentivirale tranduction en down-gereguleerd tot uitdrukking in SGC7901-NM-RhoE cellen door siRNA interferentie. Het eiwitgehalte werd bepaald door Western blot analyse (figuur S2). In de volgende transwell test bleek dat verhoogde expressie van CXCR4 het invasieve vermogen van SGC7901-M-siRhoE cellen zou kunnen herstellen, terwijl daarentegen silencing onderdrukt endogene CXCR4 de invasie van SGC7901-NM-RhoE cellen (Figuur 5). Deze waarnemingen gaven aan dat RhoE geïnduceerde maagkanker invasie werd gedeeltelijk gemedieerd door CXCR4. Deze waarnemingen ook verder aangetoond dat CXCR4 was een down-stream doelwit van RhoE.

Discussie

afwijkend-uitgedrukt RhoE wordt vaak geassocieerd met progressie van de tumor. Echter kan de rol o RhoE schakelen tussen tumor suppressor en oncogen afhankelijk van de oorsprong van de tumor [7-9]. Zoals gemeld, maagkanker blijft één van de meest voorkomende kanker wereldwijd, vooral in Azië. Eerder is aangetoond dat abnormale expressie RhoE goed gecorreleerd met de progressie van maagkanker. Als Zhou en Li beschreven, wordt de expressie van RhoE toegenomen bij maagkanker bij de inductie van HIF-1α, en waarvan de expressie kon nog versterkt wanneer kankercellen genereren resistentie tegen anti-tumor middelen. Daarnaast verhoogde expressie van RhoE bevordert de resistentie tegen geneesmiddelen door het onderdrukken van Bax expressie [13,24].

In de huidige studie, vonden we dat RhoE expressie werd verhoogd in maagkanker weefsels dat zij afwezig of zwak uitgedrukt in aangrenzende niet-tumor weefsel was. Bovendien klinisch bewijs toonde aan dat RhoE overexpressie was significant gecorreleerd met de mate van kanker celdifferentiatie en TNM, bestaande uit tumorgrootte (T), lymfeklier invasie (N) en metastase (M). Belangrijker RhoE expressieniveaus een zelfstandige en belangrijke risicofactor voor overleving bij maagkanker. Bovendien kan opgereguleerd expressie van RhoE een slechte uitkomst bij maagkankerpatiënten voorspellen. Samengevat, onze gegevens suggereren sterk dat RhoE kunnen dienen als referentie oncogen bij maagkanker en een positieve rol gespeeld bij maagkanker progressie, vooral bij kanker metastase. Het is mogelijk dat formeel RhoE een nieuwe prognostische factor bij patiënten met maagkanker kan zijn. Aldus aangezien metastase is een van de belangrijkste oorzaken van maag kankersterfte kan onze bevindingen een nieuw idee of nieuwe doelstelling tumormetastase remmen bij maagkanker bieden en kan uiteindelijk bijdragen aan de ontwikkeling van therapeutische strategieën voor de overleving van patiënten verlengen.

Toch is de rol van RhoE bij kanker metastase blijft gedeeltelijk onbepaald. In hepatocellulaire carcinoom en mesenchymale tumorcellen, verhoogde RhoE expressie correleert met een verminderde metastatische vermogen, terwijl in melanoomcellen, RhoE bevordert celmigratie en invasie [10,12,25]. Om de rol van RhoE in metastase van maagkanker te verkennen, we neergehaald RhoE in de SGC7901-M cel-lijn, met een hoog metastatisch potentieel heeft en we geïnduceerde tot uitdrukking in de SGC7901-NM cellijn, die slecht in metastase . Vervolgens
in vitro assays aangetoond dat verhoogde cellulaire motiliteit RhoE bevorderd en invasiviteit, terwijl RhoE daalde tot een niet-invasieve karakter van maagkanker cellen. Deze resultaten werden verder bevestigd door de In vivo
assay. Het is bekend dat verhoogde kankercel migratie en invasie zijn noodzakelijke stappen voor de laatste vorming van uitzaaiingen. Derhalve bij maagkanker cellen RhoE kan een functionele metastase bevorderen gen. Toch hebben we ook gemerkt dat de cel morfologie een hoop veranderd na de wijziging van RhoE expressie. Verder onderzoek bleek dat deze morfologische verandering kan worden veroorzaakt door het verdwijnen van stress vezels (figuur S3B), dan verandering van celproliferatie.

Zoals gemeld, RhoE regelt kanker metastase, en doet dat meestal door het remmen van de ROCK /MYPT pathway [26]. Deze sectie werd onderzocht in een ander onderzoek door onze groep (gegevens niet getoond). In deze studie, pasten we PCR-array analyse voor de identificatie van andere stroomafwaartse genen van RhoE bij maagkanker metastase, met als doel het bepalen van de onderliggende mechanismen van tumormetastase. Daarom kregen we 6 differentieel tot expressie-metastase gerelateerde genen volgende up-regulatie van RhoE (CXCR4, VEGFA, CTSK, MMP7, CD82 en CTSL1). MMP7 (matrixmetalloproteïnase-7) behoort tot de MMP-familie van eiwitten, die betrokken zijn bij de afbraak van de extracellulaire matrix in fysieke en pathologische aandoening [27].

Er werd gemeld dat verhoogde expressie van MMP7 verbeterde het invasieve vermogen van kankercellen [28]. In PCR-array analyse, werd MMP7 bevonden down-gereguleerd in zeer invasieve SGC7901-NM-RhoE cellen, die in tegenspraak met eerdere verslagen was. Zo hebben wij MMP7 minder belangrijk in onze studie en had de expressie niet controleren door Western blot. Om soortgelijke reden, hadden we niet controleren van de expressie van CTSL1. Tot onze verbazing, een van de 4 genen gedetecteerd door Western blotanalyse, alleen de expressie van CXCR4 werd in overeenstemming met de verkregen met behulp van PCR Array analyseresultaat gevonden. Nader onderzoek wees uit dat up-regulatie van CXCR4 bij maagkanker cellen kunnen de invasieve capaciteit, die werd onderdrukt door RhoE knock-out gedeeltelijk te herstellen. Daarentegen, down-regulatie van CXCR4 verminderde de invasie van maagkanker cellen, die werd veroorzaakt door overexpressie gebracht RhoE. Aldus kan CXCR4 potentiële stroomafwaartse effector van RhoE bij maagkanker metastase.

CXCR4, samen met de ligand CXCL12 (namelijk de CXCL12 /CXCR4-as), is algemeen bekend betrokken te zijn bij veel aspecten van tumorprogressie, vooral bij tumormetastase. Eerder werd gemeld dat de CXCL12 /CXCR4-as van essentieel belang was voor uitgezaaide kankercellen te verspreiden aan organen en daardoor mogelijk te maken tumorcellen toegang tot cellulaire niches die tumor-cel overleving en groei [29] te bevorderen. Daarnaast vereist geactiveerde CXCR4 binding aan G-eiwitten aan extracellulaire signalen omzetten in de cel en leiden uiteenlopende reacties [23]. Bovendien, wanneer men bedenkt dat RhoE is een lid van de G-eiwitfamilie, geacht wij RhoE het repertoire van CXCL12 /CXCR4 as signalen kunnen uitbreiden met het verhogen van de expressie van de CXCR4 receptor. Daarentegen zou RhoE binden aan CXCR4 en bemiddelen stroomafwaartse signaaltransductie, die uiteindelijk kan leiden tot kanker metastase. Verder hebben we eerder aangetoond dat RhoE deelneemt aan hypoxie- geïnduceerde EMT, een sleutelproces dat bijdraagt ​​tot kanker metastase, waarbij CXCR4 ook betrokken. Deze nauwe banden tussen RhoE en CXCR4 sterk gesuggereerd dat RhoE versterkt metastase door up-reguleren van CXCR4 bij maagkanker. De gedetailleerde mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze routes moet verder onderzocht worden.

Conclusie

Onze studie toonde aan dat RhoE werd overexpressie in maagkanker en gecorreleerd met de progressie van kanker.

• PLoS ONE: Het omzetten van een Microarray handtekening in een diagnostische test: een proef van Custom 74 Gene Array om opheldering en voorspelling van de prognose van maagkanker
• PLoS ONE: Resveratrol remt de groei van maagkanker door het induceren G1 Phase Arrestatie en afsterven in een Sirt1-afhankelijke manier