PLoS ONE: RhoE Skatina metastazių skrandžio vėžiu per mechanizmo Priklauso nuo Glaudesnis Išsireiškimas CXCR4

Anotacija

RhoE, romanas narys Rho baltymų šeimai, yra pagrindinis reguliatorius citoskeleto ir ląstelių migraciją. Mūsų grupė jau anksčiau parodė, kad RhoE kaip tiesioginis tikslo HIF-1α ir tarpininkauja hipoksijos sukeltos epitelio į mezenchimos perėjimo skrandžio vėžio ląsteles. Todėl mes prielaidą, kad RhoE gali vaidinti svarbų vaidmenį skrandžio vėžio metastazių. Šiame tyrime mes tyrinėjo RhoE išraiškos vaidmuo skrandžio vėžys, ląstelės invazija ir metastazėmis ir RhoE įtaka reguliuojant potencialų išraiška žemyn upelio genuose. RhoE išraiška buvo padidėjusi skrandžio vėžio audiniuose, palyginti su normaliomis skrandžio audinius. Mes taip pat nustatė, kad egzistuoja glaudus ryšys tarp histologinės lygiui ir paciento diagnozę. Iki-reguliavimo RhoE daug didesnis migracijos ir invazinių gebėjimus skrandžio vėžio ląstelių ir in vitro parsisiųsti ir vivo
. Be to, žemyn reguliavimas RhoE sumažino metastazavusiu potencialą vėžinių ląstelių. PGR masyvo ir po transwell tyrimas parodė, kad skrandžio vėžio metastazių reguliavimas RhoE buvo iš dalies keisdamas CXCR4. Šis pastebėjimas rodo, kad CXCR4 gali būti tolesnis efektorinių už RhoE. Apibendrinant, mūsų tyrimas nustatė RhoE kaip naują prognostinį biologinis žymuo ir metastazavusiu skatinimo geno skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Feng B Li K Zhong H Ren G Wang H Sia Y et al., (2013) RhoE Skatina metastazių skrandžio vėžiu per mechanizmo Priklauso nuo Glaudesnis Išsireiškimas CXCR4. PLoS ONE 8 (11): e81709. Doi: 10,1371 /journal.pone.0081709

redaktorius: Sharmila Shankar, Kanzaso universiteto medicinos centras, Jungtinių Amerikos Valstijų

Įstojo: Sausis 11, 2013 m Priėmė: Balandis 24, 2013 m Paskelbta: Lapkričio 29, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Feng et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Nacionalinės pagrindinių mokslinių tyrimų programą Kinijos (Nėra: 2009CB521700), Nacionalinė Aukštųjų technologijų tyrimų ir technologinės plėtros programoje Kinijos (Nėra: 2006AA02A253) ir Nacionalinis mokslo ir technologijų Pagalbinės programos metu vienuolikos penkerių metų plano laikotarpis (Nėra: 2006BAI02A14). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių pasaulyje ir naviko metastazių yra didžiausia kliūtis savo sėkmingo gydymo ir pagrindinė priežastis pacientų mirtingumą [1,2]. Jau kelis dešimtmečius, daug tyrimų bandė suprasti procesus ir mechanizmus metastazių skrandžio vėžio. Pastaraisiais metais, buvo nustatyta, kad epitelio mezenchiminių perėjimas (EMT) yra labai svarbus šiame procese ir labai prisideda prie vėžio ląstelių invazija ir metastazių. Viena iš galimų priežasčių yra tai, kad per EMT, citoskeleto yra iš esmės moduliuojama, vedantis į naviko ląstelių [3] sklaidos.

RhoE priklauso pogrupio Rho baltymų, kurie atlieka pagrindinius vaidmenis citoskeleto formavimas , ląstelių judrumas, ląstelės ciklo ir apoptozė [4,5]. Skirtingai nuo tipiškų Rho baltymų, kurie ciklas tarp aktyviojo GTP-privalo valstybės ir poilsio BVP jungiasi valstybės, RhoE trūksta vidinę GTPase veiklą ir visada pristato kaip aktyvų GTP-jungiasi forma [6]. Šis unikalus funkcija rodo, kad RhoE funkcija yra iš esmės reguliuojama per savo išraiška, o ne jos veiklos.

Pastaruoju metu kelios tyrimai parodė, kad nenormalus išraiška RhoE buvo susijęs su kancerogenezėje ir kad RhoE gali veikti arba kaip naviko slopinamojo geno arba onkogeno, priklausomai nuo vėžio [7-9] kilmės. Panašiai RhoE yra įvairaus įtakas nuo metastazių įvairių vėžio. Melanomos, RhoE palaiko migraciją ir invaziškumo vėžinių ląstelių reguliuojant aktino citoskeleto [10]. Tačiau, kepenų ląstelių karcinoma, RhoE atstovauja save kaip slopinamojo baltymų naviko metastazių [11,12].

Anksčiau, mūsų grupė buvo nustatyta, kad RhoE buvo sustiprintas skrandžio vėžio ląstelių indukcijos HIF-1α išraiška pagal hipoksinių sąlygos ir skatinamas EMT skrandžio vėžio ląstelių [13]. Taigi, mes iškėlė hipotezę, kad RhoE gali turėti teigiamą indėlį į skrandžio vėžio metastazių. Šiame tyrime mes ištiriama RhoE įtakos skrandžio vėžio ląstelių metastazės ir pagrindinių mechanizmų.

Medžiagos ir metodai

Mobilusis Kultūra

žmogaus skrandžio adenokarcinoma Mobilaus ryšio linijų SGC7901, MKN-45, MKN-28, Kato-III ir normalus skrandžio gleivinės ląstelių linija GES buvo išsaugota mūsų instituto [14-16]. Be to, skrandžio vėžys somatinių ląstelių linija SGC7901 M, kuris turi aukštą metastazavusiu potencialą ir SGC7901 nm, kurie turi prastą metastazavusiu galimybę, buvo įsteigta ir išlaikoma mūsų instituto [17]. Visi ląstelės ir buvo išlaikytos RPMI 1640 terpėje, papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) ir kultivuojamos 37 ° C temperatūroje, visiškai temperatūroje drėgnoje atmosferoje 5% CO2.

Audinių masyvas

imunodažymu programų, du audinio matricos žmogaus skrandžio vėžio buvo komerciškai perkamos iš pranašesniam Biotech Co. Ltd (Šanchajus, Kinija). Vienas audinio matrica pateikta 90 naviko audinių dėmių ir suderinti gretimų ne vėžinių audinių dėmės, kurios buvo gautos iš 90 pacientų (su 5.3-6.1 metų stebėjimo). Gamintojas pateikė lytis, amžius ir klinikos parametrus pacientams. Kitas masyvo pateikta 120 taškus su 40 pirminio naviko audinių dėmių, 40 suderintų gretimų ne vėžinių audinių dėmių, o 40 suderintų limfmazgių metastazėmis dėmės.

imunohistocheminis

imunohistocheminis buvo atliekama naudojant Histostain ™ Plus komplektai (Zhongshan Goldenbridge Biotech, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. Pelės anti-RhoE antikūnas (praskiestas 1: 100; tolyn nuo, MA, JAV) ar anti-CXCR4 antikūnas (praskiestas 1: 200; Sigma-Aldrich, MO, JAV) buvo naudojami IHC tyrimu kaip pirmojo antikūno. Pelės IgG kiekis buvo naudojamas, o ne pirmuoju antikūno kaip neigiamos kontrolės šiuose tyrimuose. Gautas rezultatas buvo pusiau kiekybiškai įvertina priskyrimo balų už reaktyvumas intensyvumo ir ląstelių teigiamai dažytų, kaip aprašyta kiti proporcingai. Iš reaktyvumas intensyvumas buvo suskirstyti į keturias kategorijas ir sėkmingai, kaip nebūna (-; balas: 0), silpnas (+; rezultatas: 1), vidutinio sunkumo (++; balas: 2) arba stipri (+++; rezultatas: 3 ) pagal dažymo intensyvumo, kuris buvo stebėtas taikant skrandžio epitelinių ląstelių dauguma. Teigiamų ląstelių dalis buvo suskirstyti į keturias grupes: (1), 0-25% naviko ląstelių eksponuoti reaktyvumas; (2), 25-50% ląstelių; (3), 50-75 procentinių punktų ląstelių; ir (4), 75-100% ląstelių. Bendras rezultatas buvo iš dviejų [18].

Vakarų dėmė analizė

Baltymų mėginiai buvo išgaunamas iš ląstelių arba audinių ultragarsu į lizės buferiniame tirpale (150 mm NaCl, 50 mM Tris produktas -HCl (pH8.8), 0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF 1% NP40, 5 mikrogramai /ml aprotinino, 1 mikrogramai /ml leupeptiną) ant ledo, tada centrifuguojamas 12000 apsisukimų per minutę 10 min. Baltymai buvo išspręstas SDS-PAGE ir electrotransferred ant nitroceliuliozės membranos (Bio-Rad, CA, USA). Nespecifinį buvo užblokuotas su 5% be riebalų pieno 1 valandą kambario temperatūroje. Membrana buvo tada atskirai inkubuojamos su anti-RhoE antikūno (praskiestas santykiu 1: 400; pietūs, MA, JAV), anti-CXCR4 antikūno (praskiestų 1: 1000; Sigma-Aldrich, MO, JAV), anti-VEGFA antikūnas (praskiestas 1 : 500; Abcam, MA, JAV), anti-CD82 antikūnas (skiesti 1: 1000; Abcam, MA, JAV), anti-CTSK antikūnas (skiesti 1: 1000; Santa Krusas, Teksasas, JAV) arba β-aktino antikūnas ( skiesti santykiu 1: 10000; Sigma-Aldrich, MO, JAV) per naktį 4 ° C temperatūroje. Po keturių plauna su TBS-T buferio, membranos buvo inkubuojamos su krienų peroksidazės-konjuguoto antrinio antikūno (skiesti santykiu 1: 2000; Santa Cruz, Texas, JAV) 1 val kambario temperatūroje. Po 4 plovyklose su TBS-T buferiu, juostos buvo sukurtos su SuperSignal cheminės liuminescencijos Substratas (Thermo Scientific, MA, JAV) vizualizuoti baltymus. tada dėmės buvo analizuojami Kiekis One® programinė įranga (Versija 4.2. Bio-Rad, CA, JAV) Po Vartotojo vadove. Vakarų dėmė už beta-aktino išraiška buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės.

negimdinis išraiška ir siRNR tarpininkaujant Triukšmo slopinimo

negimdinio išraiškos tikslinių genų, skrandžio vėžio ląstelės buvo transdukuotus lentivirus vektorius išreikšti RhoE arba CXCR4 (pateikta GeneChem, Šanchajus, Kinija). Trumpai tariant, ląstelės bent iš 50. Toliau MOI buvo padengtas ir išaugo iki 75 iki 80% santakoje be antibiotikų po kurio lentiviruso vektoriai buvo pridėtos prie terpėje ląstelės, kurių sudėtyje yra polibrenui (2 mikrogramai /ml), ląstelės buvo auginamos kitam 72 val ir infekcija efektyvumas buvo patikrintas fluorescencijos mikroskopijos ir Vakarų blot analizė. Trukdžiai žmogaus RhoE arba CXCR4 išraiška buvo pasiektas naudojant RNR interferencijos metodą. siRNA dupleksus buvo sintetinamas Takara biotechnologijos (Liaoning, China) ir tikslinės sekos RhoE ar CXCR4 buvo taip apibrėžta:

RhoE, 5'-GAACGUGAAAUGCAAGAUAUU-3 ";

CXCR4, 5'-UAAAAUCUUCCUGCCCACC-3 ".

Valdymo siRNA dupleksus buvo sukurta po to, kai tardo Sprogimas duomenų bazę nespecifinių skirtomis sekas. Ląstelės buvo pernešta su Oligonųkleotidų per du aukštus, naudojant LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, NY, JAV) pagal gamintojo instrukcijas, po kurio jiems buvo atliktas toliau analizuoja 48 valandas po transfekcijq.

žaizdų gijimo Analizės

Jei aptikti ląstelių judrumą, eksponentinis fazės ląstelės buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse. Po to, kai ląstelių pasiekė santaką kaip ląstelių dėl plokštės substrato monosluoksnio, plastikinė pipetės galiuką buvo parengtas skersai lėkštelės, kad susidarytų švarų 1 mm pločio žaizdų plotas bei atsižvelgiant į vidutinio centre buvo pakeistas su šviežia RPMI1640, turintis 1% vaisiaus jaučio serumo , Po 48 h, ląstelių judėjimas į žaizdos srityje buvo įvertintas naudojant fazinio kontrasto mikroskopu, kaip aprašyta anksčiau [19,20].

invazija Analizės

Mobilusis invazija tyrimai buvo atliekami naudojant transwell plokštės (Corning, NY, JAV), padengtas Matrigel ( "Becton Dickinson, NJ, JAV). Trumpai, Matrigel buvo skiedžiamas iki koncentracijos 2 mg /ml, o 50 mikrol, šio tirpalo buvo dedama į specialią polikarbonato filtro ir oro-džiovinti. Praplovus PBS, filtrai buvo dedamas į šulinius ir 700 pL RPMI-1640 mitybinės terpės, papildytos su 10% FBS buvo pridėta į apatinę kamerą. Ląstelės buvo resuspenduotos RPMI-1640, kuriame yra 1% FBS ir 1 × 105 ląstelių apibrėžtą terpę 0,2 ml buvo padengtą į viršutinį kameroje. Ląstelės invazija kamerose buvo inkubuojamos temperatūroje drėgnoje inkubatoriuje 12-48 h. Po to, kai papildomą inkubacijos, ląstelių, kurios įsiskverbė į membranos poras ir disperguoti į apatinio paviršiaus ir augalų filtrų buvo tamsintas su 5% metilvioletinio tirpalui vizualizaciją. Be to, šie įsiveržė ląstelės kiekvieną duobutę buvo skaičiuojami pagal šviesos mikroskopu ( "Olympus", Tokijas, Japonija) ir kiekybiškai nuo vizualizuoti penkis atsitiktinius laukus esant × 200 priartinimas ir vidutiniškai, kaip aprašyta Albini [21]. Invazija tyrimas buvo pakartotas 3 kartus. Iš histogramos vertė sudaro vidutinį skaičių įsiveržė ląstelių iš 3 atskirų eksperimentų.

uodegos venos metastazavęs Analizės

uodegos venos metastazavusiu tyrimas buvo nustatyta kaip pranešta anksčiau [22]. Trisdešimt vyrai nuogi pelėms buvo tvarkoma naudojant geriausius humaniškus metodus ir buvo prižiūrimi pagal NIH gyvūnų globos ir vaistų komiteto rekomendacijas. Ląstelės buvo surinktos naudojant tripsino ir tris kartus plaunamos PBS. tada pelėms buvo sušvirkšta 1 × 106 ląstelių 0,1 ml PBS per uodega venų injekcijos. tada pelės buvo stebimi dėl bendros sveikatos ir visos kūno masės. Dėl 28-osios dieną po injekcijos, pelėms buvo paaukota. Plaučių bei kepenų audiniai buvo stebimas plika akimi ir matomų navikų dėl plaučių ir kepenų paviršiaus skaičius buvo kiekybiškai. Plaučių bei kepenų audiniai buvo supjaustyti serijos skyriuose, tamsintas hematoksilinu ir eozinu, tada stebima šviesos mikroskopu. Eksperimentinės ir kontrolinės grupės kiekvienas pateikta 6 peles. Visi eksperimentiniai procedūras patvirtino Eksperimentinių gyvūnų gerovės ir etikos komitetą, ketvirtosios Karo medicinos universitete. Gyvūnų eksperimentai buvo atliekami su institucinių reikalų komiteto gyvūnų tyrimų patvirtinimo, pagal nacionalines gaires dėl priežiūros ir naudojimo laboratoriniams gyvūnams.

metastazavimui PGR masyvas

iš metastasis- išraiškos susiję genai lėmė žmogaus navikų Metastazė PGR array (PAH-028A; SuperArray biomokslų, Maryland, JAV) pagal gamybos instrukcijas. Pirma, RNR buvo išskirta iš RhoE-lentviral užsikrėtę SGC7901 ląstelių ir kontrolinėse duobutėse naudojant standartinius protokolus, kurie tuomet buvo konvertuota į pirmą kryptis kDNR. KDNR šablonas buvo derinamas su 2 × SuperArray PGR master mix, pridėtas prie PGR Array plokštės (384 šulinėlių), kuriame genų būdingų gruntas rinkinius šulinių ir taikomos realaus laiko PGR. PGR dviračių sąlygos buvo taip: 40 ciklų, esant 95 ° C temperatūroje 15 S, 60 ° C temperatūroje 1 min, ir 72 ° C temperatūroje 30 s. Penki buities genai buvo naudojami kaip vidaus kontrolės. Sulenktas-pasikeitimas metastazės susijusių genų raiškos nulėmė ΔΔCt metodu.

Statistinė analizė

Duomenų analizė buvo atlikta naudojant SPSS 17.0 statistinės analizės programinę įrangą (Čikaga, IL, JAV). Mann-Whitney U testas buvo naudojamas siekiant įvertinti skirtumų išraiška RhoE tarp skrandžio vėžio audiniuose ir metastazių limfmazgiuose dažnio reikšmę. Kruskal-Wallis H testas daugiabučių grupių ir Mann-Whitney U testas dvi grupės palyginimų dirbo analizuoti abiejų RhoE ekspresijos lygį ir įvairių Klinikos-patologinis veiksnių skrandžio vėžio egzempliorių santykius. Kaupiamasis išlikimo laikas buvo apskaičiuotas naudojant Kaplan-Meier išgyvenimo būdą ir analizuojami log-rank testą. Vienmatės ir daugiamatės analizės buvo pagrįsti Cox proporciniai pavojų regresijos modelį. Palyginimai kiekybiniais duomenimis buvo analizuojami Stjudento t -test tarp dviejų grupių. Koreliacinė analizė tarp RhoE ir CXCR4 išraiška buvo vertinama pagal Spearman koreliacijos rangas metodu. Skirtumai buvo laikomi statistiškai reikšmingas, kai p < 0,05.

Rezultatai

Per išraiška RhoE koreliuoja su diferenciacijos laipsnio ir naviko stadija skrandžio vėžio audiniuose ir rodo prastą prognozę dėl pacientų

iš RhoE išraiška skrandžio vėžio audiniuose, šalia ne naviko audiniai ir susiję metastazavusiu limfmazgių audinių išnagrinėjo imunohistocheminis (1A pav.) RhoE išraiška buvo nustatyta silpnai išreikštos ar net išvykęs į gretimų ne navikų audiniuose (A), o jo išraiška buvo reikšmingai didesnis skrandžio vėžio audiniuose ir limfmazgiuose metastazių (B-E). Be to, mes analizavo tarp RhoE dažymo ir klinikos parametrų skrandžio vėžiu sergančių pacientų (1 lentelė) santykis. Rezultatai parodė, kad nei lytis, nei amžius koreliuoja su RhoE išraiška. Tačiau, padidėjo RhoE išraiška buvo statistiškai koreliuoja su diferenciacijos laipsnio (P = 0,005) ir naviko stadija, kurį sudarė naviko dydis (t, P < 0,001), limfmazgių invazijos (n, p = 0,001), ir tolimą metastazių (M, P = 0,003). Be to, Kaplan-Meier išgyvenamumo analizė parodė, kad pacientams, sergantiems aukštos raiškos lygių RhoE įteikė trumpesnį bendrą išgyvenamumą lyginant tuos pacientus su neigiamu išraiška RhoE (1b pav.) Daugiamatė Cox proporcinės rizikos modelis vertinimai parodė, kad RhoE išraiškos lygis buvo nepriklausoma ir reikšmingas veiksnys išgyvenimo skrandžio vėžiu sergančių pacientų (lentelė S1).
išraiška lygis RhoE
Kategorija
N -
+
++
+++ pervežimas P value
Total9014283216Age0.421≤6041610187>6049818149Gender0.742Male679232213Female2355103Differentiation0.005^{aWell52120Moderately471215146Poorly380121610TNM stageT <0.001aT194320T2175840T347414209T4171367N0.001bN031111073N1-N3593182513M0.003bM08014272811M1100145Table 1. statistinė analizė imunohistocheminiu
A, Kruskal-Wallis H testas.; B Mann-Whitney U testą CSV Atsisiųsti CSV}

Vėliau, mes studijavo raiškos lygius RhoE pirminės skrandžio vėžio audiniuose ir jų suderintų metastazavusiu limfmazgių audinių. Ekspresijos lygis RhoE nebuvo nė vienoje 7 skrandžio vėžio audiniuose, silpnai išreikštas 16 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, vidutiniškai išreikštas 11, ir labai išreikštas 6 vėžio audiniuose, atitinkamai. Priešingai, limfmazgių metastazės atitinkamas skaičius buvo 3, 12, 14 ir 11. Be to, iš RhoE išraiška buvo reikšmingai didesnis metastazių limfmazgiuose audinių, nei buvo nustatyta pirminio vėžio audiniuose. Šios pastabos rodo, kad RhoE išraiška koreliavo su metastazėmis skrandžio vėžiu (2 lentelė, p < 0,05).
Išraiška lygis RhoE
histologinis tipas
N pervežimas - CR.LT +
++
+++
p reikšmė
Pirminė vėžio tissues407161160.048 <sup>* limfmazgių metastases403121411Table 2. išreiškimas RhoE pradinėje vėžio audinių ir suderinti limfmazgių Metastazių .
* Mann-Whitney U testas CSV Atsisiųsti CSV</sup>

išraiška RhoE ląstelių linijų buvo analizuojami Vakarų dėmė (1c pav). Mes nustatėme, kad, palyginti su į GES ląstelių linijos, iš RhoE išraiška buvo reikšmingai didesnis įvairių skrandžio vėžio ląstelių linijų. Be to, RhoE baltymų ekspresijos lygis buvo gerokai didesnis labai invazinės SGC7901 M ląstelių sub-line nei mažiau invazinės ląstelių Sub-line SGC7901 nm. Todėl tolesni tyrimai naviko metastazių buvo atlikti remiantis ląstelių modeliavimo su SGC7901-M ir SGC7901 nm ląstelių linijų.

RhoE skatina migracijos ir invazinių gebėjimus skrandžio vėžio ląstelių in vitro ir in vivo

"tirti RhoE vaidmenį skrandžio vėžio metastazių, mes iki reguliuojama jos baltymų raišką SGC7901 nm ląstelių šią perdavime su RhoE lentivirus vektoriumi ar valdymo vektorių (pavadintas SGC7901-NM-RhoE ar SGC7901-NM-kontrolės ). Priešingai, slopinimo ir RhoE raiškos SGC7901 M ląstelių buvo pasiektas po transfekciją su siRNA nukreiptas prieš RhoE iRNR arba kontrolės siRNA (pavadintas SGC7901-M-siRhoE ar SGC7901-M-kontrolės atitinkamai). Baltymo ekspresija koncentracija buvo patvirtinta Vakarų blot analize po transfekciją (2a pav.)

Be to, in vitro
migracija ir invazija tyrimas buvo atliktas (2b ir 2c pav). Mes nustatėme, sustiprintą išraišką RhoE galėtų gerokai iki reguliuoti migracijos ir invazinių gebėjimus skrandžio vėžio ląstelių linijos SGC7901-NM, žaizdų gijimą ir transwell invazija tyrimų. Priešingai, SGC7901-M ląstelės, kuriose eksponuojamos sudrėkintą išraišką RhoE parodė nepaprastą slopina migracijos ir invazinių gebėjimų, palyginti su kontrolinių ląstelių. Norėdami suprasti, ar RhoE funkcijos buvo bendri renginiai įvairiose skrandžio vėžio ląstelės ar SGC7091 konkrečių įvykių, skrandžio vėžio ląstelių linijos MKN45 ir MKN28 buvo naudojamas siekiant užbaigti tuos pačius eksperimentus. Abiejų žaizdos gijimą ir transwell invazija tyrimų rezultatai parodė, kad RhoE skatinama migracijos ir invazinių gebėjimus tiek MKN45 ir MKN28 ląstelių (S1 paveiksle), kuris pasiūlė, kad RhoE funkcijos, kurios buvo aptiktos in vitro
buvo išsamus visų skrandžio vėžio ląstelių linijų. Tuo tarpu, mes taip pat atliko MTT išbandyti Orai keitimu RhoE išraiška gali turėti įtakos ląstelių augimą skrandžio vėžio mūsų tyrime. Kaip parodyta S3A pav, nei aukštyn reguliavimas RhoE į SGC7901 nm ląstelių, nei žemyn reguliavimo RhoE į SGC7901 M ląstelių gali sukelti pažymėti ląstelių proliferacija (p > 0,05) pokyčius ir taip paneigė, RhoE poveikį ląstelių proliferaciją kuris atneš sumaištį į mūsų rezultatus ir dar kartą patvirtino, kad RhoE gali skatinti ląstelių judrumą skrandžio vėžio ląsteles.

Jei toliau tirti, ar padidėjo RhoE galėtų pakeisti in vivo, pervežimas metastazavusiu gebėjimą skrandžio vėžio ląsteles , mes atliekame vivo
uodegos venos metastaziniai tyrimai nuogas pelėmis SGC7901-NM-RhoE ir SGC7901-NM-kontrolės ląstelių linijas. Be sacrified pelėmis, buvo nustatyta, kad ląstelės rodantys didesnį RhoE išraiška lėmė žymiai matomi liver- ir plaučių paviršiaus navikai, palyginti su kontrolinių ląstelių (p < 0,05, 3 pav.) O ir E dėmių parodė, kad SGC7901-NM-RhoE ląstelės matyt gaminamas metastazes abiejų kepenis ir plaučius, o kontrolinių ląstelių rodoma tik metastazes dalinius. Kartu paėmus, šie duomenys rodo, kad RhoE suvaidino svarbų vaidmenį skatinant metastazių skrandžio vėžio ląsteles ir in vitro parsisiųsti ir vivo
.

CXCR4 gali būti Down srautas genas RhoE skrandžio vėžio

Jei nustatyti galimus žemyn upelio genus, per kurį RhoE gali tarpininkauti savo funkciją skrandžio vėžio ląstelių metastazės, mes atliekame PGR Array ištirti diferencijuotai išraišką metastazės susijusių genų dalijasi SGC7901-NM-RhoE ir SGC7901 nm kontrolės ląstelių linijų. Genai, kurie padidinti ar sumažinti ≥ 2 kartus buvo laikomi potencialiais RhoE-priklausomų tolesniems genuose. Apibendrinant, mes nustatėme 84 genus ir galiausiai rado 6, kuris buvo gerokai pasikeitė, kai išraiška RhoE buvo sustiprintas (3 lentelė). Tarp 6 genų, 3 (CXCR4, VEGFA, CTSK) buvo iki reguliuojama, ir trys kitos (MMP7, CD82, CTSL1) buvo žemyn reguliuojama SGC7901-NM-RhoE ląsteles.
išraiška lygis iRNR
Gene vardo
Aprašymas pervežimas SGC7901-NM-kontrolės pervežimas SGC7901-NM-RhoE
CXCR4Chemokine (CXC motyvas) receptorių 41.003.30VEGFAVascular endotelio augimo faktoriaus A1.002.78CTSKCathepsin K1.002.68CTSL1Cathepsin L11.00-2.12CD82CD82 molecule1.00-2.29MMP7Matrix metallopeptidase 71.00-2.47Table 3. skirtingai išreikštos Metastazė susijusių genai po Padidinta RhoE išraiška.
CSV Parsisiųsti CSV

šiame tyrime iš CXCR4, VEGFA, CTSK ir CD82 ekspresija patikrino Vakarų blot analizė ir įdomiai, mes nustatėme, kad tik CXCR4 išraiška atitiko gautų rezultatų PGR matricos analizė. Baltymų lygis CXCR4 buvo numalšinta įsikišimo RhoE ir priešingai, buvo padidintas, kai RhoE buvo ectopically išreiškė (4a paveikslas). Taigi, tarp RhoE ir CXCR4 išraiška koreliacija buvo analizuojamas imunohistocheminiu 60 skrandžio vėžiu audinių, rezultatai parodė, kad CXCR4 buvo labai išreikštas audinius, kur RhoE buvo teigiamai tamsintas, o ji buvo prastai išreikšta tose audinius, kur buvo išreikštas RhoE žemo lygio (4B pav.) Be to, tiek RhoE ir CXCR4 išraiška buvo Współbrzmieniowy į 83,3% (50/60) skrandžio karcinoma egzempliorių, The Ietininkas R koreliacijos koeficientas buvo 0,80 (p < 0,001) ir nurodė, glaudų ryšį tarp abiejų RhoE ir CXCR4 išraiška skrandžio vėžio (4 lentelė). Kaip pranešama, per išreiškė CXCR4 taip pat vaidina svarbų vaidmenį vėžio metastazių ir dalyvauja EMT procesą, kuris pasiūlė, kad CXCR4 gali būti pasroviui geną RhoE su svarbą skrandžio vėžio ląstelių [23] metastazių.
CXCR4
Spirmeno correlation
RhoE
+
++
+++
Negative
n
p
p
R
+1820060<0.001<0.0010.80++11730+++0270Negative2008Table 4. Koreliacija tarp išraiškos RhoE ir CXCR4 per 60 porų skrandžio vėžio audiniuose.
CSV Parsisiųsti CSV

CXCR4 yra būtinas skatinančius invazija RhoE skrandžio vėžio ląstelių

Jei ištirti CXCR4 poveikį apie RhoE gebėjimas veikti, skrandžio vėžio metastazių, mes sustiprino CRCR4 išraišką SGC7901 M-siRhoE ląstelių lentiviruso tranduction ir žemyn reguliuojama išreikštas SGC7901-NM-RhoE ląstelių siRNA trukdžių. Baltymų lygis buvo nustatomas Western Blot analizės būdu (S2 pav). Toliau transwell tyrime, mes nustatėme, kad sustiprintos išraiška CXCR4 gali atkurti invazinių gebėjimas SGC7901 M-siRhoE ląstelių, o priešingai triukšmo slopinimo endogeninė CXCR4 represuoti į SGC7901-NM-RhoE ląstelių invazija (5 paveikslas). Šios pastabos rodo, kad RhoE sukelta skrandžio vėžio ląstelių invaziją, kuri buvo iš dalies procesų, kuriuose CXCR4. Šios pastabos taip pat dar parodė, kad CXCR4 buvo žemyn srautas tikslas RhoE.

Diskusijos

nenormaliai-išreikšta RhoE yra dažnai susijęs su naviko progresavimo. Tačiau, vaidmuo O RhoE gali pereiti tarp auglio slopinamojo ir onkogeno priklausomai nuo naviko [7-9] kilmės. Kaip pranešama, skrandžio vėžys išlieka viena iš labiausiai paplitusių vėžio formų pasaulyje, ypač Azijoje. Anksčiau, ji buvo parodyta, kad nenormalus RhoE išraiška yra gerai koreliuoja su skrandžio vėžio progresavimo. Kaip aprašyta, Zhou Li, iš RhoE išraiška padidėjo skrandžio vėžio iki HIF-1α ir indukcijos, kurio išraiška gali eiti papildyta dar daugiau, kai vėžinės ląstelės sukuria atsparumą priešvėžiniai vaistai. Be to, sustiprintas išraiška RhoE skatina atsparumą vaistams, uždraudžiant BAX išraišką [13,24].

Šiame tyrime mes nustatėme, kad RhoE išraiška buvo padidėjusi skrandžio vėžio audiniuose kadangi buvo išvykęs ar silpnai išreikštas gretimų ne tumoro audiniuose. Be to, klinikinių duomenų, parodė, kad RhoE per-išraiškos reikšmingai koreliavo su vėžinių ląstelių diferenciacijos ir TNM sustojimo laipsnių, kurie susideda iš naviko dydis (T), limfmazgių invazijos (N) ir metastazių (M). Dar svarbiau, RhoE ekspresijos lygis buvo nepriklausoma ir reikšmingas rizikos veiksnys išgyvenimo skrandžio vėžio. Be to, iki reguliuojama išraiška RhoE gali prognozuoja prastą rezultatą skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Kartu paėmus, mūsų duomenys aiškiai rodo, kad RhoE galėjo tarnavo kaip skrandžio vėžio onkogeno ir suvaidino teigiamą vaidmenį skrandžio vėžio progresavimą, ypač vėžio metastazių. Ji yra formaliai įmanoma, kad RhoE galėtų būti naujas prognostinis faktorius pacientams, sergantiems skrandžio vėžio. Taigi, manydama, kad metastazių yra viena iš pagrindinių priežasčių, dėl skrandžio vėžio mirtingumo, mūsų išvados gali pateikti naują clue arba naują tikslą slopinti auglio metastazių skrandžio vėžio ir gali pagaliau padėti terapines strategijas pratęsti pacientų išgyvenimą.

vis dėlto RhoE vaidmuo vėžio metastazių lieka dalinai nenustatyta. Be kepenų ląstelių karcinoma ir mezenchiminių vėžinių ląstelių, padidėjo RhoE išraiška koreliuoja su sumažėjusiu metastazavusiu gebėjimas, o melanomos ląstelių, RhoE skatina ląstelių migraciją ir invazija [10,12,25]. Tirti RhoE vaidmenį metastazių skrandžio vėžio, mes nuvertė RhoE į SGC7901-M ląstelių linijos, kuri turi aukštą metastazavusiu potencialą ir mes sukeltos savo išraišką į SGC7901-NM ląstelių linijos, kuri yra prasta ne metastazių , Vėliau in vitro
tyrimai parodė, kad padidėjo RhoE skatinamas ląstelių judrumą ir invaziškumo, o sumažėjo RhoE lėmė skrandžio vėžio ląstelių neinvazinė pobūdžio. Šie rezultatai dar labiau patvirtino in vivo, pervežimas tyrimu. Jis yra gerai žinoma, kad sustiprintos vėžio ląstelių migracija ir invazija yra veiksmai, būtini galutiniam formavimo metastazių. Todėl, skrandžio vėžio ląstelių, RhoE gali būti funkcinės metastazių-skatinti genas. Nepaisant to, mes taip pat pastebėjo, kad ląstelių morfologija labai pasikeitė po pakeitimo RhoE išraiška. Kiti tyrimai parodė, kad šis morfologinis kaita gali būti sukeltas dingimo streso pluošto (S3B paveikslas), o ne ląstelių proliferacijos kaita.

Kaip pranešama, RhoE reguliuoja vėžio metastazes, ir tai daro daugiausia slopindamas Rock /MYPT kelią [26]. Šiame skyriuje buvo tiriama kitoje tyrime mūsų grupėje (duomenys neparodyti). Šiame tyrime mes taikomas PGR Array analizę už kitiems tolesniems genų RhoE skrandžio vėžio metastazių identifikavimo, siekdamos nustatyti pagrindinius mechanizmus naviko metastazių tikslo. Todėl mes gauti 6 skirtingai išreikštas metastazių susijusių genų tolesnių-reguliavimo RhoE (CXCR4, VEGFA, CTSK, MMP7, CD82 ir CTSL1). MMP7 (matrica metaloproteinazės-7) yra siejamas su MMP šeimos baltymų, kurie yra susiję su ekstraląstelinės matricos suskirstymą tiek fiziškai ir patologinės būklės [27].

Buvo pranešta, kad padidėjusi išraiška MMP7 sustiprintas invazinių gebėjimą vėžinių ląstelių [28]. Be PGR matricos analizę, MMP7 buvo nustatyta, kad žemyn reguliuojama labai invazinių SGC7901-NM-RhoE ląstelių, kurios buvo prieštaringa ankstesnėse ataskaitose. Taigi, mūsų nuomone, MMP7 mažiau svarbi mūsų tyrime ir nepatikrino jo išraišką Vakarų dėmė. Dėl panašių priežasčių, mes ne patikrinti CTSL1 išraiška. Mūsų nuostabai, tarp 4 Western Blot analizės genų, tik CXCR4 išraiška buvo nustatyta suderinta su rezultatais, gautais PGR Array analizė. Tyrimas parodė, kad iki-reguliavimo CXCR4 skrandžio vėžio ląsteles galėtų iš dalies atkurti invazinių gebėjimas, kuris buvo gniaužė RhoE trankyti-out. Priešingai, žemyn reguliavimas CXCR4 sumažino skrandžio vėžio ląstelių, kurios buvo sukeltų pernelyg išreikšta RhoE invaziją. Taigi, CXCR4 gali būti potencialus žemyn upelio EFFECTOR iš RhoE skrandžio vėžio metastazių.

CXCR4, kartu su savo ligando CXCL12 (ty CXCL12 /CXCR4 ašis), yra gerai žinoma, kad dalyvauja daugelyje aspektų naviko progresavimas, ypač naviko metastazių. Anksčiau buvo pranešta, kad CXCL12 /CXCR4 ašis buvo svarbu metastazavusio vėžio ląstelės skirstytis organus ir tokiu būdu leidžia naviko ląstelės prieiti prie korinio nišas, naudingas naviko ląstelių išgyvenimą ir augimą [29]. Be to, aktyvuotos CXCR4 reikia privalomas G-baltymų perkelti ekstraląstelines signalus į ląstelę ir inicijuoti skirtingus atsakymus [23]. Be to, svarstant, kad RhoE yra G-baltymo šeimos narys, mes laikoma, kad RhoE gali išplėsti CXCL12 /CXCR4 ašis signalų repertuarą didinant CXCR4 receptorių ekspresiją. Priešingai, RhoE gali įpareigoti CXCR4 ir tarpininkauti pasroviui perduoti signalo, kuris gali pagaliau baigtis vėžio metastazių. Be to, mes anksčiau parodė, kad RhoE dalyvauja hypoxia- sukeltas EMT, pagrindinis procesas, kuris prisideda prie vėžio metastazių, kurioje CXCR4 taip pat dalyvauja. Šie glaudūs ryšiai tarp RhoE ir CXCR4 stipriai teigiama, kad RhoE sustiprintas metastazių iki reguliavimo CXCR4 skrandžio vėžio. Išsamios mechanizmai, atsakingi už šių būdų turi dar vieną tyrimą.

Išvada

Mūsų tyrimas parodė, kad RhoE buvo ekspresija skrandžio vėžio ir koreliuoja su vėžio progresavimą.

• PLoS ONE: Konvertavimas mikrogardeliq Parašas į diagnostinį testą: pagal užsakymą 74 Gene Array Bandomoji paaiškinti ir prognozavimo skrandžio Cancer
• PLoS ONE: Resveratrolis Slopina skrandžio vėžio augimą skatinančius G1 fazės suimti ir senatvė į Sirt1 priklausomas Manner