PLoS ONE: Rhoe promuove metastasi in cancro gastrico attraverso un meccanismo dipendente su di espressione migliore di CXCR4

Astratto

Rhoe, un romanzo membro della famiglia di proteine ​​Rho, è un regolatore chiave della migrazione citoscheletro e delle cellule. Il nostro gruppo ha già dimostrato che Rhoe come un bersaglio diretto per HIF-1α e la media epiteliale ipossia indotta transizione mesenchimali in cellule di cancro gastrico. Pertanto, abbiamo ipotizzato che Rhoe potrebbe svolgere un ruolo importante nella metastasi del cancro gastrico. Nel presente studio, abbiamo esplorato il ruolo di espressione Rhoe nel carcinoma gastrico, l'invasione delle cellule e metastasi, e l'influenza della Rhoe sulla regolazione del potenziale espressione dei geni a valle. espressione Rhoe è stata elevata nei tessuti di cancro gastrico rispetto ai normali tessuti gastrici. Abbiamo anche trovato una stretta correlazione tra il grado istologico e la diagnosi del paziente. Up-regolazione di Rhoe migliorato in modo significativo le capacità migratorie ed invasive di cellule di cancro gastrico sia in vitro
e in vivo
. Inoltre, down-regulation dei Rhoe diminuita del potenziale metastatico delle cellule tumorali. PCR array e la successiva analisi transwell hanno mostrato che la regolamentazione delle metastasi del cancro gastrico da Rhoe è stato parzialmente mediata da CXCR4. Questa osservazione suggerisce che CXCR4 potrebbe essere un effettore a valle Rhoe. In sintesi, il nostro studio ha identificato Rhoe come biomarker prognostico romanzo e Gene metastatico promozione di cancro gastrico

Visto:. Feng B, Li K, H Zhong, Ren G, H Wang, Shang Y, et al. (2013) Rhoe promuove metastasi in cancro gastrico attraverso un meccanismo dipendente su di espressione migliore di CXCR4. PLoS ONE 8 (11): e81709. doi: 10.1371 /journal.pone.0081709

Editor: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 11 gennaio 2013; Accettato: 24 ottobre 2013; Pubblicato: 29 Novembre 2013

Copyright: © 2013 Feng et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma nazionale della ricerca di base della Cina (No: 2009CB521700), il programma di alta tecnologia nazionale di ricerca e sviluppo della Cina (No: 2006AA02A253) e la National Science and Technology sostenere il programma durante l'undicesima piano quinquennale periodo (No: 2006BAI02A14). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico è la seconda causa di morte per cancro nel mondo e del tumore metastasi è il più grande ostacolo al suo successo del trattamento e la principale causa di mortalità dei pazienti [1,2]. Per decenni, numerosi studi hanno cercato di comprendere i processi ei meccanismi di metastasi nel cancro gastrico. Negli ultimi anni, si è trovato che epiteliale transizione mesenchimale (EMT) è di fondamentale importanza in questo processo e contribuisce all'invasione cellula tumorale e metastasi notevolmente. Una possibile ragione è che durante EMT, il citoscheletro è fondamentalmente modulata, che porta alla dispersione delle cellule tumorali [3]
.

Rhoe appartiene ad un sottogruppo delle proteine ​​Rho, che svolgono un ruolo chiave nella formazione del citoscheletro , la motilità cellulare, ciclo cellulare e l'apoptosi [4,5]. A differenza delle tipiche proteine ​​Rho, che ciclo tra uno stato GTP-bound attivo e uno stato di PIL legato riposo, Rhoe manca GTPasi attività intrinseca e sempre presenta come la forma GTP-bound attiva [6]. Questa caratteristica unica indica che la funzione di Rhoe è essenzialmente regolata attraverso la sua espressione piuttosto che dalla sua attività.

Recentemente, diversi studi trovarono che espressione anormale di Rhoe era associata alla carcinogenesi e che Rhoe potrebbe agire sia come un gene soppressore del tumore o un oncogene, a seconda della provenienza del cancro [7-9]. Allo stesso modo, Rhoe ha variando influenze sulle metastasi in diversi tipi di cancro. In melanoma, Rhoe supporta la migrazione e l'invasività delle cellule tumorali regolando il citoscheletro actina [10]. Tuttavia, nel carcinoma epatocellulare, Rhoe si presenta come una proteina soppressore di metastasi tumorali [11,12].

In precedenza, il nostro gruppo ha scoperto che Rhoe è stato migliorato in cellule di cancro gastrico per induzione dell'espressione di HIF-1α sotto condizioni di ipossia e EMT promosso delle cellule di cancro gastrico [13]. Così, abbiamo ipotizzato che Rhoe può avere un contributo positivo nella metastasi del tumore gastrico. In questo studio, abbiamo studiato l'effetto del Rhoe sulla metastasi delle cellule di cancro gastrico ed i meccanismi sottostanti.

Materiali e Metodi

Cell Culture

L'adenocarcinoma gastrico umano linee cellulari SGC7901, MKN-45, MKN-28, KATO-III e le normali GES linea cellulare della mucosa gastrica sono stati conservati nel nostro istituto [14-16]. Inoltre, il cancro gastrico linea di cellulo SGC7901-M, che ha un alto potenziale metastatico, e SGC7901-NM, che ha una scarsa capacità metastatica, sono stati stabiliti e aggiornati in nostro istituto [17]. Tutte le cellule sono state mantenute in terreno RPMI 1640 supplementato con 10% di siero fetale bovino (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) e coltivate a 37 ° C in atmosfera umidificata completamente 5% CO2.

Tissue Array

Per le applicazioni di immunoistochimica, due array di tessuto di cancro gastrico umano sono stati regolarmente acquistati da superarsi Biotech Co. Ltd (Shanghai, Cina). Una vasta gamma dei tessuti conteneva 90 punti di tessuto tumorale e abbinati macchie tessuti non tumorali adiacenti che sono stati ottenuti da 90 pazienti (con 5.3-6.1 anni di follow-up). Il produttore ha fornito il sesso, l'età, e parametri clinico-patologici dei pazienti. L'altra serie conteneva 120 punti con 40 punti primari di tessuto tumorale, 40 punti di tessuti non tumorali adiacenti abbinati, e 40 abbinati linfonodali metastasi macchie.

L'immunoistochimica

L'immunoistochimica è stata effettuata utilizzando Histostain ™ Plus kit (Zhongshan Goldenbridge Biotech, Cina) secondo le istruzioni del produttore. Il mouse anti-Rhoe anticorpi (diluito 1: 100; Upstate, MA, USA) o di anticorpi-CXCR4 anti- (diluito 1: 200; Sigma-Aldrich, MO, USA) sono stati utilizzati nel test IHC come primo anticorpo. IgG di topo è stato utilizzato al posto del primo anticorpo come controllo negativo in questi studi. Il risultato ottenuto è stato semi-quantitativamente valutata assegnando punteggi per l'intensità di immunoreattività e la percentuale di cellule colorate positivamente come descritto da altri. L'intensità della immunoreattività è stata divisa in quattro categorie e ha segnato come assente (-; punteggio: 0), debole (+; punteggio: 1), moderata (++; Punteggio: 2), o forte (+++; punteggio: 3 ) secondo l'intensità di colorazione che è stato osservato nella maggior parte delle cellule epiteliali gastriche. La percentuale di cellule positive è stata classificata in quattro gruppi: (1), 0-25% di cellule tumorali che presentano immunoreattività; (2), 25-50% di cellule; (3), 50-75 punti percentuali di cellule; e (4), 75-100% di cellule. Il punteggio complessivo è stato il prodotto dei due [18].

Western Blot analisi

campioni proteici sono stati estratti dalle cellule o tessuti per sonicazione in un tampone di lisi (150 mM NaCl, 50 mM Tris -HCl (pH8.8), 0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% NP40, 5 ug /ml aprotinina, 1 mg /ml leupeptina) su ghiaccio, poi centrifugato a 12.000 rpm per 10 min. Le proteine ​​sono state risolte mediante SDS-PAGE e elettrotrasferite su membrane di nitrocellulosa (Bio-Rad, CA, USA). Legame non specifico è stato bloccato con il latte senza grassi 5% per 1 ora a temperatura ambiente. La membrana è stata poi separatamente incubato con l'anticorpo anti-Rhoe (diluito 1: 400; Upstate, MA, USA), anticorpo anti-CXCR4 (diluito 1: 1000; Sigma-Aldrich, MO, USA), anticorpo anti-VEGFA (diluito 1 : 500; Abcam, MA, USA), anticorpo anti-CD82 (diluito 1: 1000; Abcam, MA, USA), anticorpo anti-CTSK (diluito 1: 1000; Santa Cruz, Texas, USA) o di anticorpi β-actina ( diluito 1: 10000; Sigma-Aldrich, MO, USA) notte a 4 ° C. Dopo quattro lavaggi con tampone TBS-T, le membrane sono state incubate con l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (diluito 1: 2000; Santa Cruz, Texas, USA) per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo 4 lavaggi con tampone TBS-T, le bande sono stati sviluppati con SuperSignal Substrato Chemiluminescente (Thermo Scientific, MA, USA) per visualizzare le proteine. Macchie sono stati poi analizzati per quantità One® software (versione 4.2. Bio-Rad, CA, USA) seguendo Guida per l'utente. Western Blot per l'espressione β-actina è stato utilizzato come controllo interno.

espressione ectopica e siRNA-mediata silenziamento

Per l'espressione ectopica di geni bersaglio, cellule di cancro gastrico sono state trasdotte con lentivirus che esprimono vettore Rhoe o CXCR4 (fornito da GeneChem, Shanghai, Cina). Brevemente, le cellule sono state piastrate e coltivate al 75 al 80% di confluenza senza antibiotici, dopo di che sono stati aggiunti alle cellule in terreno di crescita dei vettori lentivirali contenenti polibrene (2 mg /ml) ad una MOI di 50. Successivamente, le cellule sono state coltivate per un'altra 72 h e l'efficienza infezione è stata controllata da microscopia a fluorescenza e analisi Western blot. Interferenza di espressione Rhoe o CXCR4 umano è stato realizzato utilizzando una tecnica di RNA interferenza. duplex siRNA sono stati sintetizzati da Takara Biotechnology (Liaoning, Cina) e le sequenze mirate di Rhoe o CXCR4 sono stati definiti così:

Rhoe, 5'-GAACGUGAAAUGCAAGAUAUU-3 ';

CXCR4, 5'-UAAAAUCUUCCUGCCCACC-3 '.

duplex di controllo siRNA sono stati progettati dopo aver interrogato il database BLAST con i non-specifiche sequenze di targeting. Le cellule sono state trasfettate con duplex oligonucleotide utilizzando LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, NY, USA) secondo le istruzioni del produttore, a seguito della quale sono stati sottoposti ad analisi ulteriori 48 ore dopo la trasfezione.

cicatrizzanti Assay

Per rilevare la motilità delle cellule, le cellule fase esponenziale sono state seminate in 6 pozzetti. Dopo che le cellule raggiunte confluenza come un monostrato di cellule sul substrato piatto, un puntale plastica era tracciata attraverso il centro della piastra di produrre un pulito 1 mm vasta area della ferita e il mezzo è stato sostituito con RPMI1640 fresco contenente 1% di siero fetale bovino . Dopo 48 ore, il movimento delle cellule nella zona della ferita è stata valutata utilizzando un microscopio a contrasto di fase, come precedentemente descritto [19,20].

Invasion Assay

saggi cellulari di invasione sono stati eseguiti utilizzando un piatto transwell (Corning, NY, USA) rivestiti con Matrigel (Becton Dickinson, NJ, USA). Brevemente, Matrigel è stato diluito ad una concentrazione di 2 mg /ml e 50 ml di questa soluzione è stata posta in un filtro di policarbonato e asciugare all'aria. Dopo lavaggio con PBS, i filtri sono stati collocati in pozzi e 700 ml di mezzo di coltura RPMI-1640 supplementato con 10% FBS è stato aggiunto nella camera inferiore. Le cellule sono state risospese in RPMI-1640 contenente 1% FBS e 1 × 105 cellule in 0,2 ml di mezzo definiti sono state piastrate nella camera superiore. Le cellule nelle camere di invasione sono state incubate in un incubatore umidificato per 12-48 h. Dopo un'incubazione supplementare, cellule che penetravano i pori della membrana e disperse alla superficie inferiore dei filtri sono state colorate con cristalvioletto soluzione 5% per la visualizzazione. Successivamente, le cellule invase in ciascun pozzetto sono state contate al microscopio ottico (Olympus, Tokyo, Giappone) e quantificate da visualizzare cinque campi casuali presso un ingrandimento di × 200 e mediati come descritto da Albini [21]. Il saggio di invasione è stato ripetuto 3 volte. Il valore del grafico a barre rappresenta il numero medio di cellule invase da 3 esperimenti separati.

Tail Vein metastatico Assay

La vena della coda test metastatico è stato determinato come riportato in precedenza [22]. Trenta topi nudi maschi sono stati trattati utilizzando le migliori pratiche umane e sono stati curati in conformità con le linee guida NIH cura degli animali e del Comitato Usa. Le cellule sono state raccolte con tripsina e lavate tre volte con PBS. I topi sono stati poi iniettati con 1 × 106 cellule in 0,1 ml di PBS mediante iniezione coda vena. I topi sono stati poi monitorati per la salute generale e il peso corporeo totale. Il giorno 28 dopo l'iniezione, i topi sono stati sacrificati. tessuti polmonari ed epatici sono stati osservati ad occhio nudo e il numero di tumori visibili sulla superficie polmone e fegato sono stati quantificati. tessuti del polmone e del fegato sono stati tagliati in sezioni seriali, colorate con ematossilina e eosina, quindi osservate al microscopio ottico. gruppi sperimentali e di controllo ogni contenevano 6 topi. Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Welfare e Comitato Etico sperimentali animali, la Quarta Università Medica Militare. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti con l'approvazione della Commissione istituzionale per la ricerca degli animali, in conformità alle linee guida nazionali per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

Tumore Metastasi PCR array

L'espressione di metastasis- geni associati sono stati determinati dal tumore umano metastasi PCR Array (IPA-028A; SuperArray Biosciences, Maryland, USA) secondo le istruzioni del produttore. In primo luogo, l'RNA totale è stato estratto da Rhoe-lentviral infettate SGC7901 cellule e cellule di controllo utilizzando protocolli standard, che è stato poi convertito in cDNA primo filone. Il modello cDNA è stato combinato con un 2 × SuperArray PCR Master Mix, aggiunta ai pozzetti di una piastra Array PCR (384 pozzetti) che contiene i set di primer gene-specifici, e sottoposto a PCR in tempo reale. Le condizioni di ciclo di PCR erano come segue: 40 cicli a 95 ° C per 15 s, 60 ° C per 1 minuto, e 72 ° C per 30 s. Cinque geni housekeeping sono stati utilizzati come controlli interni. La piega-cambiamento nell'espressione di geni metastasi correlate è stata determinata con il metodo ΔΔCt.

Analisi statistica

L'analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il software di analisi statistica SPSS 17.0 (Chicago, IL, STATI UNITI D'AMERICA). Il test di Mann-Whitney U è stato utilizzato per valutare la significatività delle differenze nella frequenza di espressione di Rhoe tra tessuti di cancro gastrico e metastasi linfonodali. Il test di Kruskal-Wallis H per il multi-gruppi, e il test di Mann-Whitney U per due confronti del gruppo sono stati impiegati per analizzare il rapporto tra i due livelli di espressione Rhoe e vari fattori clinico-patologici di campioni di cancro gastrico. tempo di sopravvivenza cumulativa è stata calcolata con il metodo di sopravvivenza di Kaplan-Meier e analizzati dal log-rank test. analisi univariata e multivariata erano basate sul modello di rischio proporzionale di regressione di Cox. Il confronto dei dati quantitativi sono stati analizzati-test t di Student tra i due gruppi. L'analisi di correlazione tra l'espressione di Rhoe e CXCR4 è stato stimato dal metodo di correlazione di Spearman. Le differenze sono state considerate statisticamente significative quando P < 0.05.

Risultati

Over-espressione di Rhoe è correlata con il grado di differenziazione del tumore e la stadiazione nei tessuti di cancro gastrico e indica una prognosi per i pazienti

L'espressione di Rhoe in gastrica tessuti tumorali, tessuti non tumorali adiacenti e relativi tessuti nodi linfatici metastatico è stata esaminata mediante immunoistochimica (Figura 1A). espressione Rhoe stato trovato debolmente espressa o addirittura assente nei tessuti non tumorali adiacenti (a), mentre la sua espressione era significativamente maggiore nei tessuti di cancro gastrico e metastasi linfonodali (b-e). Successivamente, abbiamo analizzato il rapporto tra Rhoe colorazione ed i parametri clinico-patologici di pazienti affetti da cancro gastrico (Tabella 1). I risultati hanno mostrato che né genere né l'età era correlato con l'espressione di Rhoe. Tuttavia, ha aumentato l'espressione Rhoe era statisticamente correlata con il grado di differenziazione (P = 0.005) e la stadiazione del tumore, che consisteva di dimensioni del tumore (T, P < 0,001), linfonodi invasione (N, P = 0.001), e metastasi a distanza (M, P = 0.003). Inoltre, l'analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier ha mostrato che i pazienti con livelli di espressione elevati di Rhoe, presentati con una sopravvivenza globale più breve rispetto ai pazienti con espressione negativa di Rhoe (Figura 1B). Multivariata di Cox valutazioni modello di rischio proporzionale hanno indicato che i livelli di espressione Rhoe erano un fattore indipendente e significativo per la sopravvivenza in pazienti affetti da cancro gastrico (Tabella S1).
livello di espressione di Rhoe
Categoria
n -
+
++
+++
P value
Total9014283216Age0.421≤6041610187>6049818149Gender0.742Male679232213Female2355103Differentiation0.005^{aWell52120Moderately471215146Poorly380121610TNM stageT <0.001aT194320T2175840T347414209T4171367N0.001bN031111073N1-N3593182513M0.003bM08014272811M1100145Table 1. Analisi statistica di immunoistochimica Assay
a, Kruskal-Wallis H Test.; b, Mann-Whitney U test CSV Scarica CSV}

In seguito, abbiamo studiato i livelli di espressione di Rhoe in primarie tessuti di cancro gastrico ed i loro tessuti nodo metastatico linfatici abbinate. I livelli di espressione Rhoe erano assenti in 7 tessuti di cancro gastrico, debolmente espresso in 16 pazienti affetti da cancro gastrico, moderatamente espresso in 11, e altamente espresso in 6 tessuti tumorali rispettivamente. Per contro, nel linfonodo metastasi il numero corrispondente era 3, 12, 14 e 11. Inoltre, l'espressione di Rhoe era significativamente maggiore nei tessuti linfonodali metastatiche da quella presente nei tessuti tumorali primari. Queste osservazioni hanno indicato che l'espressione Rhoe era correlata con metastasi nel carcinoma gastrico (Tabella 2, P < 0,05).
Livello di espressione di Rhoe
istologica tipo
n
-
+
++
+++
P Valore
cancro primario tissues407161160.048 <sup>* linfonodo metastases403121411Table 2. Espressione dei Rhoe nella primaria del cancro tessuti e abbinati metastasi linfonodale .
* Mann-Whitney U test CSV Scarica CSV</sup>

L'espressione di Rhoe in linee cellulari è stato analizzato mediante Western blot (Figura 1C). Abbiamo trovato che, rispetto a quella nella linea cellulare GES, l'espressione di Rhoe era significativamente più alta in varie linee cellulari di cancro gastrico. Inoltre, il livello di espressione della proteina Rhoe era significativamente più alta nel sub-linea cellulare SGC7901-M altamente invasiva rispetto al meno invasiva sub-linea cellulare SGC7901-NM. Pertanto, ulteriori studi di metastasi tumorali sono stati fatti basano su modelli cellulari con le SGC7901-M e SGC7901-NM linee cellulari.

Rhoe promuove le capacità migratorie ed invasive di cellule di cancro gastrico in vitro e in vivo

Per esplorare il ruolo di Rhoe in gastrica metastasi del cancro, abbiamo up-regolati sua espressione delle proteine ​​nelle cellule SGC7901-NM dopo trasduzione con il vettore lentivirus Rhoe o controllo vettoriale (chiamato SGC7901-NM-Rhoe o SGC7901-NM-control ). Al contrario, smorzando di espressione Rhoe nelle cellule SGC7901-M è stato raggiunto dopo trasfezione con siRNA mirati contro Rhoe mRNA o con il controllo siRNA (dal nome SGC7901-M-siRhoE o SGC7901-M-controllo, rispettivamente). i livelli di espressione della proteina sono stati confermati da analisi di Western Blot dopo la trasfezione (Figura 2A).

Avanti, in vitro
migrazione e test di invasione sono stati eseguiti (Figura 2B e 2C). Abbiamo trovato una maggiore espressione di Rhoe potrebbe significativamente up-regolare le capacità migratorie ed invasive del cancro gastrico linea cellulare SGC7901-NM, nella guarigione delle ferite e transwell saggi di invasione. Per contro, le cellule SGC7901-M, esibendo espressione inumidito di Rhoe mostrato una notevole inibizione della capacità migratorie ed invasive rispetto alle cellule di controllo. Per capire se le funzioni di Rhoe erano eventi comuni in vari gastrica cellule tumorali o eventi specifici SGC7091, il cancro gastrico linee cellulari MKN45 e MKN28 sono stati usati per completare gli stessi esperimenti. I risultati di entrambi ferita-guarigione e transwell saggi di invasione hanno rivelato che Rhoe promosso le capacità migratorie ed invasive di entrambe le cellule MKN45 e MKN28 (Figura S1), che ha suggerito che le funzioni di Rhoe che sono stati rilevati in vitro
erano completo per tutti cancro linee cellulari gastrici. Nel frattempo, abbiamo anche effettuato test MTT per verificare l'alterazione wether di espressione Rhoe potrebbero influenzare la crescita delle cellule del cancro gastrico nel nostro studio. Come mostrato Figura S3A, né il regolamento a monte di Rhoe nelle cellule SGC7901-NM né down-regulation di Rhoe nelle cellule SGC7901-M potrebbe causare rilevante cambiamento di proliferazione cellulare (p > 0,05), in tal modo escluso l'effetto della Rhoe sulla proliferazione delle cellule che porterebbe confusione ai nostri risultati e ulteriormente confermato che Rhoe può promuovere la motilità cellulare di cellule di cancro gastrico.

per indagare ulteriormente se una maggiore Rhoe potrebbe alterare il in vivo
metastatico capacità delle cellule di cancro gastrico , abbiamo effettuato in vivo
coda vena saggi metastatici in topi nudi con SGC7901-NM-Rhoe e SGC7901-NM-controllo linee cellulari. Nei topi sacrificati, si è constatato che le cellule che mostrano alti livelli di espressione Rhoe portato a significativamente più visibili liver- e polmone-superficie tumori rispetto a cellule di controllo (P < 0.05, figura 3). H ed E colorazione hanno mostrato che le cellule SGC7901-NM-Rhoe apparentemente hanno prodotto metastasi in entrambi fegato e polmoni, mentre le cellule di controllo visualizzati solo metastasi parziali. Presi insieme, questi dati suggeriscono che Rhoe svolto un ruolo importante nel promuovere la metastasi delle cellule di cancro gastrico sia in vitro
e in vivo
.

CXCR4 potrebbe essere una valle flusso genico di Rhoe nel cancro gastrico

per determinare i possibili geni a valle attraverso il quale Rhoe può mediare la sua funzione nella metastasi delle cellule di cancro gastrico, abbiamo effettuato la PCR array di esplorare l'espressione differenziale dei geni metastasi correlate condivisa tra SGC7901-NM-Rhoe e SGC7901-NM-controllo linee cellulari. I geni che aumenta o diminuisce ≥ 2 volte sono stati considerati come potenziali geni a valle Rhoe-dipendenti. In sintesi, abbiamo rilevato 84 geni e, infine, trovato 6, che sono stati notevolmente cambiato dopo l'espressione del Rhoe è stato migliorato (Tabella 3). Tra i 6 geni, 3 (CXCR4, VEGFA, CTSK) erano up-regolato, e altri tre (MMP7, CD82, CTSL1) sono stati down-regolato nelle cellule SGC7901-NM-Rhoe.
livello di espressione di mRNA nome
Gene
Descrizione
SGC7901-NM-controllo
SGC7901-NM-Rhoe
CXCR4Chemokine (motivo CXC) del recettore 41.003.30VEGFAVascular fattore di crescita endoteliale A1.002.78CTSKCathepsin K1.002.68CTSL1Cathepsin L11.00-2.12CD82CD82 molecule1.00-2.29MMP7Matrix metallopeptidasi 71.00-2.47Table 3. I geni espressi in modo differenziale Metastasi-correlate dopo Augmented Rhoe Espressione.
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in questo studio, l'espressione di CXCR4, VEGFA, CTSK e CD82 sono stati verificati mediante analisi Western blot e interessante, abbiamo scoperto che solo l'espressione CXCR4 era coerente con i risultati ottenuti con la PCR analisi serie. Il livello di proteine ​​di CXCR4 è stata soppressa da interferenze di Rhoe e al contrario, è stata aumentata quando Rhoe è stata espressa ectopicamente (Figura 4A). Così, la correlazione tra Rhoe ed espressione CXCR4 è stata analizzata mediante immunoistochimica in 60 cancro gastrico tessuti I risultati hanno mostrato che CXCR4 era altamente espresso in tessuti dove Rhoe era positivamente macchiato, mentre era scarsamente espresso in quei tessuti dove Rhoe stato espresso ad un livello basso (Figura 4B). Inoltre, sia Rhoe e l'espressione CXCR4 sono stati concordi nel 83,3% (50/60) dei campioni carcinomi gastrici, il coefficiente di correlazione di Spearman R era 0,80 (p < 0,001) e ha indicato una stretta correlazione tra i due espressione Rhoe e CXCR4 nei tumori gastrici (Tabella 4). Come riportato, sovraespresso CXCR4 gioca un ruolo importante nella metastasi del cancro ed è coinvolto nel processo EMT, che suggerisce che CXCR4 potrebbe essere un gene valle di Rhoe con importanza nella metastasi delle cellule di cancro gastrico [23].
CXCR4
Spearman di correlation
RhoE
+
++
+++
Negative
n
p
p
R
+1820060<0.001<0.0010.80++11730+++0270Negative2008Table 4. Correlazione tra l'espressione di Rhoe e CXCR4 in 60 coppie di cancro gastrico tessuti.
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CXCR4 è essenziale per indurre invasione da parte Rhoe in cellule di cancro gastrico

Per studiare l'effetto di CXCR4 sulla capacità di Rhoe di funzionare nella metastasi del cancro gastrico, abbiamo migliorato l'espressione di CRCR4 nelle cellule SGC7901-M-siRhoE da lentivirale tranduction e down-regolato la sua espressione nelle cellule SGC7901-NM-Rhoe da interferenze siRNA. Il livello di proteina è stata determinata mediante analisi Western blot (Figura S2). Nel seguente saggio transwell, abbiamo scoperto che una maggiore espressione di CXCR4 potrebbe ripristinare la capacità invasiva delle cellule SGC7901-M-siRhoE, mentre al contrario a tacere endogena CXCR4 represso l'invasione delle cellule SGC7901-NM-Rhoe (Figura 5). Queste osservazioni hanno indicato che Rhoe indotto gastrica l'invasione delle cellule tumorali, che è stata parzialmente mediata da CXCR4. Queste osservazioni ulteriormente dimostrato che CXCR4 era un bersaglio a valle di Rhoe.

Discussione

aberrante-espresso Rhoe è spesso associato con la progressione del tumore. Tuttavia, il ruolo o Rhoe può spostarsi tra soppressore tumorale e oncogene seconda della provenienza del tumore [7-9]. Come riportato, il cancro gastrico rimane uno dei tumori più comuni in tutto il mondo, soprattutto in Asia orientale. In precedenza, è stato dimostrato che l'espressione anormale Rhoe è ben correlata con la progressione del cancro gastrico. Come descritto Zhou e Li, l'espressione di Rhoe è aumentata nel carcinoma gastrico per l'induzione di HIF-1α, e la cui espressione potrebbe andare aumentata ancora di più quando le cellule tumorali generano resistenza ai farmaci anti-tumorali. Inoltre, una maggiore espressione di Rhoe promuove la resistenza ai farmaci, sopprimendo l'espressione Bax [13,24].

Nel presente studio, abbiamo scoperto che l'espressione Rhoe è stato elevato nei tessuti di cancro gastrico, mentre era assente o debolmente espresso in tessuti non tumorali adiacenti. Inoltre, evidenze cliniche hanno dimostrato che Rhoe sovra-espressione è risultata significativamente correlata con i gradi di differenziazione delle cellule tumorali e stadiazione TNM, che consiste di dimensioni del tumore (T), l'invasione dei linfonodi (N) e metastasi (M). Ancora più importante, i livelli di espressione Rhoe sono stati un fattore di rischio indipendente e significativo per la sopravvivenza nel carcinoma gastrico. Inoltre, l'espressione up-regolata Rhoe poteva prevedere una prognosi sfavorevole nei pazienti affetti da cancro gastrico. Nel loro insieme, i nostri dati suggeriscono fortemente che Rhoe potrebbe aver servito come un oncogene nel cancro gastrico e ha svolto un ruolo positivo nella progressione del cancro gastrico, soprattutto nelle metastasi del cancro. E 'possibile che formalmente Rhoe potrebbe essere un fattore prognostico romanzo in pazienti con cancro gastrico. Così, se si considera che la metastasi è uno dei motivi principali per la mortalità cancro gastrico, i nostri risultati potrebbero fornire un nuovo indizio o nuovo obiettivo di inibire le metastasi del tumore nel cancro gastrico e potrebbe finalmente contribuire allo sviluppo di strategie terapeutiche per prolungare la sopravvivenza dei pazienti.

Tuttavia, il ruolo di Rhoe in metastasi del cancro rimane parzialmente indeterminato. In cellule di carcinoma epatocellulare e tumorali mesenchimali, aumentata espressione Rhoe correla con ridotta capacità metastatica, mentre nelle cellule di melanoma, Rhoe promuove la migrazione cellulare e dell'invasione [10,12,25]. Per esplorare il ruolo di Rhoe in metastasi del cancro gastrico, abbiamo abbattuto Rhoe nella cella linea SGC7901-M, che ha un alto potenziale metastatico e abbiamo indotto la sua espressione nella linea cellulare SGC7901-NM, che è poveri a metastasi . Successivamente, in vitro
test hanno dimostrato che l'aumento Rhoe promosso la motilità cellulare e invasività, mentre è diminuito Rhoe ha portato ad un carattere non invasivo delle cellule di cancro gastrico. Questi risultati sono stati ulteriormente confermati dalla in vivo
test. E 'ben noto che la migrazione delle cellule di cancro migliorata e l'invasione sono i passi necessari per la formazione finale di metastasi. Pertanto, in cellule di cancro gastrico, Rhoe potrebbe essere un gene funzionale metastasis-promozione. Tuttavia, abbiamo anche notato che la morfologia delle cellule è cambiato molto dopo l'alterazione dell'espressione Rhoe. Ulteriori ricerche hanno scoperto che questo cambiamento morfologica potrebbe essere causato dalla scomparsa di fibra di stress (Figura S3B), piuttosto che un cambiamento di proliferazione cellulare.

Come riportato, Rhoe regola metastasi del cancro, e lo fa principalmente inibendo la via ROCK /MYPT [26]. In questa sezione è stato studiato in un altro studio di ricerca dal nostro gruppo (dati non riportati). In questo studio, abbiamo applicato PCR analisi Array per l'identificazione di altri geni a valle di Rhoe a metastasi del cancro gastrico, con l'obiettivo di determinare i meccanismi alla base di metastasi tumorali. Di conseguenza, abbiamo ottenuto 6 geni metastasi legati differenzialmente espressi dopo up-regolazione di Rhoe (CXCR4, VEGFA, CTSK, MMP7, CD82 e CTSL1). MMP7 (metalloproteinasi della matrice-7) appartiene alla famiglia MMP di proteine, che sono coinvolti nella ripartizione della matrice extracellulare sia in condizioni fisiche e patologiche [27].

E 'stato riferito che elevata espressione della MMP7 migliorato la capacità invasiva delle cellule tumorali [28]. In PCR analisi serie, MMP7 è risultato essere down-regolato nelle cellule SGC7901-NM-Rhoe altamente invasive, che era in contraddizione con precedenti relazioni. Così, abbiamo considerato MMP7 di minore importanza nel nostro studio e non ha verificato la sua espressione da Western Blot. Per ragioni simili, non abbiamo fatto il check-espressione di CTSL1. Con nostra sorpresa, tra i 4 geni rilevati da analisi Western Blot, solo l'espressione di CXCR4 è stato trovato in linea con il risultato ottenuto mediante PCR analisi Array. Ulteriori indagini hanno dimostrato che up-regolazione di CXCR4 in cellule di cancro gastrico potrebbe parzialmente ripristinare la capacità invasiva, che è stato soppresso da Rhoe knock-out. Al contrario, down-regolazione del CXCR4 diminuita l'invasione delle cellule di cancro gastrico, che è stata indotta da un eccesso di espresso Rhoe. Così, CXCR4 può essere un effettore potenziale a valle del Rhoe in metastasi del cancro gastrico.

CXCR4, insieme con il suo ligando CXCL12 (cioè l'asse /CXCR4 CXCL12), è noto per essere coinvolto in molti aspetti progressione tumorale, soprattutto nelle metastasi tumorali. In precedenza era stato riferito che l'asse di CXCL12 /CXCR4 è stato essenziale per le cellule tumorali metastatiche per disperdere agli organi e, quindi, consentono alle cellule tumorali di accedere nicchie cellulari che favoriscono la sopravvivenza delle cellule tumorali e la crescita [29]. Oltre a questo, attivato CXCR4 richiede legame con proteine ​​G per trasferire segnali extracellulari nella cella e avviare le risposte divergenti [23]. Inoltre, se si considera che Rhoe è un membro della famiglia G-proteine, si è ritenuto che Rhoe potrebbe allargare il repertorio di segnali dell'asse CXCL12 /CXCR4 aumentando l'espressione del recettore CXCR4. Al contrario, Rhoe potrebbe legarsi a CXCR4 e mediare la trasduzione del segnale a valle, che potrebbe finalmente portare a metastasi del cancro. Inoltre, abbiamo in precedenza dimostrato che Rhoe partecipa a ipossia indotta EMT, un processo chiave che contribuisce a metastasi del cancro, in cui CXCR4 è anche coinvolto. Queste strette connessioni tra Rhoe e CXCR4 suggerito fortemente che Rhoe migliorato le metastasi da up-regolazione CXCR4 nel cancro gastrico. I meccanismi dettagliati responsabili di queste vie bisogno di ulteriori studi.

Conclusione

Il nostro studio ha dimostrato che Rhoe è stato sovraespresso nel cancro gastrico e correlata con la progressione del cancro.

• PLoS ONE: Conversione di una firma per microarray in un test diagnostico: una prova di ordinazione 74 Gene Array per la chiarificazione e la previsione prognosi di gastrico Cancer
• PLoS ONE: il resveratrolo inibisce la crescita di cancro gastrico inducendo G1 fase di arresto e senescenza in un Manner