Plos ONE: RhoE Spodbuja metastaze želodčnega raka prek mehanizma Odvisno na povečano ekspresijo CXCR4

Povzetek

RhoE, nov član beljakovin družine Rho, je ključni regulator migracije citoskeletona in celic. Naša skupina je že pokazala, da RhoE kot neposredni cilj za HIF-1 a in posreduje-hipoksije povzroča epitelijskih do mezenhimskega prehodu v želodcu rakavih celic. Zato smo predpostavili, da bi RhoE igrajo pomembno vlogo v želodcu metastaz raka. V tej študiji smo raziskovali vlogo RhoE izražanja na raka želodca, celični invaziji in metastaz ter vpliv RhoE o ureditvi potencialno izražanje navzdol tok genov. RhoE izraz je bil povzdignjen v želodčnih tkiva raka v primerjavi z običajnimi želodčnih tkiva. Našli smo tudi tesno povezanost med histološke zgradbe in diagnoze pacienta. Up-regulacijo RhoE znatno povečala, migracijskih in invazivnih sposobnosti želodčnih rakavih celic, tako in vitro
in in vivo
. Poleg tega navzdol ureditev RhoE zmanjšala metastatskega potenciala rakavih celic. PCR nizi in posledično transwell testa so pokazali, da je bila ureditev želodca metastaz raka, ki ga RhoE delno posreduje CXCR4. Ta ugotovitev je predlagal, da bi lahko CXCR4 efektor nadaljnji za RhoE. Skratka, naša študija opredelila RhoE kot nove prognostičnih biomarkerja in-metastatskega spodbujanje gena raka želodca

Navedba. Feng B, Li K, Zhong H, Ren G, Wang H, Shang Y, et al. (2013) RhoE Spodbuja metastaze želodčnega raka prek mehanizma Odvisno na povečano ekspresijo CXCR4. PLoS ONE 8 (11): e81709. doi: 10,1371 /journal.pone.0081709

Urednik: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, Združenih držav Amerike

Prejeto: 11. januar 2013; Sprejeto: 24. oktober 2013; Objavljeno: 29. november 2013

Copyright: © 2013 Feng et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl Nacionalni Temeljni raziskovalni program Kitajske (št: 2009CB521700), National High Technology raziskovalni in razvojni program Kitajske (št: 2006AA02A253) in National Science and Technology Podporni program v enajsti petletni načrt Obdobje (št: 2006BAI02A14). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v svetu in tumorske metastaze je največja ovira za uspešno zdravljenje in glavni vzrok umrljivosti pacientov [1,2]. Že desetletja, so številne študije poskušali razumeti procese in mehanizme metastaz pri raku želodca. V zadnjih letih je bilo ugotovljeno, da je epitelijska mezenhimskih prehod (EMT) ključnega pomena v tem procesu in znatno prispeva k rakavih celic invazije in metastaz. Eden od možnih razlogov je ta, da v EMT je citoskelet v osnovi modulirane, ki vodi do sipanja tumorskih celic [3].

RhoE spada v podskupino proteinov Rho, ki igrajo ključno vlogo v citoskeletona oblikovanju , celične motilitete, celičnega cikla in apoptozo [4,5]. Za razliko od tipičnih Rho proteinov, ki cikel med aktivnim-GTP vezani stanju in stanju mirovanja, BDP vezan, RhoE primanjkuje notranjo GTPase dejavnosti in vedno predstavlja kot aktivno GTP vezani obliki [6]. Ta edinstvena funkcija pomeni, da je funkcija RhoE bistvu urejeno skozi njegovo ekspresijo namesto s svojo aktivnost.

Nedavno številne študije pokazale, da je bila nenormalno ekspresijo RhoE povezana z karcinogenezi in da RhoE lahko delujejo bodisi kot tumorski supresor gena ali onkogen, odvisno od izvora raka [7-9]. Podobno je RhoE različne vplive na metastaze v različnih rakavih obolenj. V melanoma, RhoE podpira migracijo in invazivnosti tumorskih celic, ki jih ureja aktina skeleta [10]. Vendar pa je v karcinomom jetrnih celic, RhoE se predstavlja kot supresor proteina tumorja metastaz [11,12].

Prej, naša skupina je ugotovila, da je bil RhoE okrepljeno v želodčnih rakavih celic z indukcijo HIF-1α izražanja v skladu z hipoksično pogoje in spodbujati EMT želodčnih rakavih celic [13]. Tako smo predpostavili, da imajo lahko RhoE pozitiven prispevek v metastaz raka želodca. V tej študiji smo ugotavljali vpliva na RhoE na metastaz želodca rakavih celic in osnovnih mehanizmov.

Materiali in metode

Cell Culture

želodca adenokarcinom človek celične linije SGC7901, MKN-45, MKN-28, KATO-III in normalne želodca sluznice celične linije GES so ohranjeni v našem inštitutu [14-16]. Poleg tega, želodca rak celično linijo SGC7901-M, ki ima visoko metastatskega potenciala in SGC7901-NM, ki ima slabo metastaz sposobnosti, so bili ustanovljeni in vzdrževani v našem inštitutu [17]. Vse celice smo vzdrževali v RPMI 1640 mediju, dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (GIBCO, Carlsbad, CA, ZDA) in kultivirali pri 37 ° C v popolnoma navlaženem atmosferi 5% CO2.

Tissue Array

Za vloge imunskim barvanjem, sta bili dve tkiva nizi človeškega raka želodca komercialno kupili od Preseči Biotech Co Ltd (Shanghai, Kitajska). Ena tkiva matrika vsebuje 90 tumor tkiva lise poveže in sosednjih non-tumorskih tkiv spotov, ki so bili pridobljeni od 90 bolnikov (z 5.3-6.1 let spremljanja). Proizvajalec pod pogojem, spol, starost, in clinicopathological parametre bolnikov. Drugi niz je vsebovala 120 pike z 40 primarnih tumor tkiva vložki, 40 ujema sosednjih tkiv vložki niso tumorjev, in 40 izravnanih bezgavkah mestih.

Imunohistokemija

Imunohistokemija je bila izvedena z Histostain ™ Plus kompleti (Zhongshan Goldenbridge Biotech, Kitajska), v skladu z navodili proizvajalca. Miš proti RhoE protitelo (razredčili 1: 100; Upstate, MA, ZDA) ali CXCR4 anti protitelo (razredčili 1: 200, Sigma-Aldrich, MO, ZDA), so bili uporabljeni v testu IHC kot prvo protitelesa. Mišji IgG smo uporabili namesto prvega protitelesa kot negativno kontrolo v teh študijah. Dobljeni rezultat je semi-kvantitativno ovrednotili z določitvijo rezultate za intenzivnost radioinkorporacijo in deleža celic pozitivno obarvanih kot drugi opisano. Intenzivnost radioinkorporacijo je bil razdeljen v štiri kategorije, in dosegel, kot je odsotna (-; ocena: 0), šibko (+; ocena: 1), zmerna (++; ocena: 2), ali močna (+++; ocena: 3 ) glede na intenzivnost obarvanja, ki je bila ugotovljena v večini epitelnih celic želodca. Delež pozitivnih celic so razvrščene v štiri skupine: (1), 0-25% tumorskih celic razstavnih radioinkorporacijo; (2), 25-50% celic; (3), 50-75 odstotnih točk celic; in (4), 75-100% celic. Skupni rezultat je bil produkt dveh [18].

Western Blot Analiza

Vzorce proteina smo pridobljen iz celic ali tkiv, ki jih sonifikacijo v liznega pufra (150 mM NaCI, 50 mM Tris -HCl (pH8.8), 0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% NP40, 5 ug /ml aprotinina, 1 ug /ml leupeptina) na ledu, nato centrifugiramo pri 12000 obratih na minuto za 10 minut. Proteine ​​smo rešena s SDS-PAGE in elektrotransferiramo na nitrocelulozne membrane (Bio-Rad, CA, ZDA). Nespecifična vezava smo blokirali s 5% nemastnega mleka, 1 uro pri sobni temperaturi. Membrana je nato ločeno inkubirali z anti-RhoE protitelesa (razredčenega 1: 400; podeželju, MA, ZDA), anti-CXCR4 protitelesa (razredčenega 1: 1000, Sigma-Aldrich, MO, ZDA), anti-VEGFA protitelesa (redčenje 1 : 500; Abcam, MA, ZDA), anti-CD82 protitelesa (razredčimo 1: 1000; Abcam, MA, ZDA), anti-CTSK protitelo (razredčimo 1: 1000, santa Cruz, Texas, ZDA) ali β-aktina protitelesa ( razredčenega 1: 10000; Sigma-Aldrich, MO, ZDA) preko noči pri 4 ° C. Po štirih opere z TBS-T pufra smo membrane inkubirali s hrenovo peroksidazo konjugiranih sekundarnega protitelesa (razredčimo 1: 2000, Santa Cruz, Texas, ZDA) 1 uro pri sobni temperaturi. Po 4 opere z TBS-T pufra, so pasovi razviti z SuperSignal kemiluminescenčni Substrat (Thermo Scientific, MA, ZDA) vizualizirati beljakovin. Blots smo nato analizirali s Količina One® programske opreme (različica 4.2. Bio-Rad, CA, ZDA) na podlagi Navodila za uporabo. Western blot za P-aktina izraz je bil uporabljen kot notranje kontrole.

zunajmaternična Izražanje in siRNA-posredovano dušenje zvoka

Za zunajmaternične izražanja tarčnih genov, želodčne rakave celice so transduciramo z lentivirusni vektor izraža RhoE ali CXCR4 (ki jih GeneChem, Šanghaj, Kitajska). Na kratko smo celice prevlečeni in zrasel na 75 do 80% konfluence brez antibiotikov, nakar so lentivirusni vektorji dodani celice v rastnem mediju, ki vsebuje polybrene (2 ug /ml) pri MOI 50. Naslednji so bile celice gojimo v drugo 72 h in učinkovitost okužba je bila preverjena s fluorescenčno mikroskopijo in Western blot analizo. Vpliv človeškega RhoE ali CXCR4 smo dosegli z uporabo tehnike za interference RNA. siRNA duplexes smo sintetizirali Takara biotehnologije (Liaoning, Kitajska) in ciljna zaporedja RhoE ali CXCR4 so bili opredeljeni tako:

RhoE, 5'-GAACGUGAAAUGCAAGAUAUU-3 ';

CXCR4, 5'-UAAAAUCUUCCUGCCCACC-3 ".

Nadzorna siRNA dvoetažna so bili zasnovani po poizvedovanjem bazo podatkov BLAST z nespecifičnih ciljanje sekvenc. Celice so transfekciji s oligonukleotidnih dupleksov uporabo LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, NY, ZDA) po navodilih proizvajalca, po katerem so bile namenjene za nadaljnje analize 48 h post-transfekciji.

ran-zdravilni Vsebnost

Za odkrivanje celic gibljivost, so eksponentne faze celice zasejali v 6 vdolbinami. Po celic doseženih strnjene kot enojno plast celic na substratu plošče je plastični pipeti vrh potegnemo po sredini plošče, da dobimo čisto 1 mm široko območje rane in medij je bil nadomeščen s svežo RPMI1640 ki vsebuje 1% fetalni goveji serum . Po 48 urah se je gibanje celica v območju rane ocenjena s pomočjo fazno kontrastnim mikroskopom, kot je prej opisano [19,20].

invazijo Vsebnost

Cell invasion teste smo izvedli ob uporabi transwell ploščo (Corning, NY, ZDA), prevlečene z Matrigel (Becton Dickinson, NJ, USA). Na kratko smo Študiie razredčimo do koncentracije 2 mg /ml in 50 xl te raztopine damo v filter polikarbonata in zračno sušimo. Po spiranju s PBS, so filtri objavljen v vrtine in 700 ul v RPMI-1640 gojišča dopolnjene z 10% FBS, smo dodali v spodnjo komoro. Celice smo resuspendirali v RPMI-1640, ki vsebuje 1% FBS in 1 x 105 celic v 0,2 ml definiranih gojišče smo nanesli v zgornjo komoro. Celice v invazijo komorah inkubiramo v navlaženem inkubatorju za 12-48 ur. Po dodatnem inkubaciji smo celice, ki prebada pore v membrani in razpršene na spodnjo površino filtrov obarvali s 5% raztopino kristal vijoličnega za vizualizacijo. Naslednji so bili napadel celice v vsako jamico prešteti pod svetlobnim mikroskopom (Olympus, Tokyo, Japonska) in količinsko od vizualizacijo pet naključnih polja pri povečavi × 200 in povprečno kot ga Albini [21] opisano. Invazija test smo ponovili 3-krat. Vrednost grafa bar predstavlja povprečno število napadel celic iz 3 ločenih poskusih.

Tail Vein metastatskega Vsebnost

repne vene metastatskega test je bil določen kot je že poročali [22]. Trideset moški golih miši smo obravnavali z uporabo najboljših humanih načinov in je bilo poskrbljeno v skladu s smernicami NIH nego živali in uporaba odbora. Celice smo zbrali z uporabo tripsina in sprali trikrat s PBS. Miši smo nato injicirali 1 x 106 celic v 0,1 ml PBS z repno vensko injekcijo. Miši so nato spremljali na splošno zdravje in celotne telesne teže. Na 28. dan po injekciji, smo žrtvovali miši. Pljuč in jeter tkiva so opazili s prostim očesom in število vidnih tumorjev na pljučih in jetrih površini bili količinsko. Pljuč in jeter tkiva smo razrezali v serijskih oddelkov, obarvali s hematoksilinom in eozinom, nato opazuje pod svetlobnim mikroskopom. Eksperimentalne in kontrolne skupine vsak vsebuje 6 miši. Vse eksperimentalne postopke je odobril odbor za eksperimentalni dobro počutje živali in etiko, četrtega vojaške Medical University. Poskusi na živalih so bile izvedene z odobritvijo institucionalnega odbora za raziskave živali, v skladu z nacionalnimi smernicami za nego in uporabo laboratorijskih živali.

tumorske metastaze PCR Array

The izražanje metastasis- s tem povezani geni so določena s Human tumorske metastaze PCR Array (PAH-028A; Superarray Biosciences, Maryland, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Najprej skupaj RNA je bila vzeta iz RhoE-lentviral okuženih SGC7901 celic in kontrolnih celic z uporabo standardnih protokolov, ki je bil nato pretvorijo v prvi sklop cDNA. Predlogo cDNA smo združili z 2 x Superarray PCR centralnega mešanici doda vdolbinice PCR Array ploščo (384 vdolbinami), ki vsebuje gen-specifični grundirne nize in podvržemo PCR v realnem času. Kolesarske pogoji PCR so bili naslednji: 40 ciklov pri 95 ° C za 15 sekund, 60 ° C 1 min in 72 ° C za 30 sekund. Pet gospodinjstva geni so bili uporabljeni kot notranjih kontrol. Pregib-sprememba ekspresijo povezanih z metastazami genov smo določili z metodo ΔΔCt.

Statistična analiza

Analiza podatkov smo izvedli s pomočjo statistične programske analize SPSS 17,0 (Chicago, IL, ZDA). Test Mann-Whitney U je bila uporabljena za oceno pomembnosti razlik v pogostosti izražanja RhoE med želodca tkiv rakom in bezgavkah. Test Kruskal-Wallis H za multi-skupine, in test Mann-Whitney U za dva primerjave skupin so bili zaposleni za analizo odnosa med obema RhoE stopnjah izražanja in različnih klinično-patološki dejavniki želodca osebkov raka. Skupni čas preživetja je bila izračunana po metodi preživetja po metodi Kaplan-Meier in analizirali s testom log-ranga. Univariatne in multivariatne analize so temeljile na Cox sorazmernih tveganj regresijski model. Primerjave kvantitativnih podatkov smo analizirali s T -test Študentske med obema skupinama. Analiza korelacije med izražanjem RhoE in CXCR4 je bila ocenjena z metodo rang korelacije Spearman je. Razlike so bile upoštevane statistično pomembne pri P < 0,05.

Rezultati

Prekomerno izražanje RhoE je v korelaciji s stopnjo diferenciacije in tumorja uprizoritve v želodcu tkivih raka in kaže na slabo prognozo za bolnike

Izraz RhoE v želodcu rak tkiva, ki mejijo non-tumor tkiva in sorodne metastatskega bezgavkah tkiva je pregledal imunohistokemični (slika 1A). RhoE izraz je dalo šibko izražen niti ni v sosednjih tkiv brez tumorjev (a), medtem ko je njegov izraz bistveno višja v želodčnih tkivih rakom in bezgavkah (b-e). Dalje, smo analizirali odnos med RhoE barvanjem in clinicopathological parametrov bolnikov želodca z rakom (tabela 1). Rezultati so pokazali, da niti spol niti starost povezana z izražanjem RhoE. Vendar, povečana RhoE izraz je statistično povezana s stopnjo diferenciacije (P = 0,005) in tumorja uprizarjanja, ki je obsegal velikost tumorja (T, P < 0,001), bezgavk invazije (N, P = 0,001) in daljni metastaziranje (M, P = 0,003). Poleg tega, Kaplan-Meier analiza preživetja je pokazala, da pri bolnikih z visoko stopnjo izraženosti RhoE, predstavljenih s krajšim celokupno preživetje v primerjavi bolnike z negativnim izražanjem RhoE (slika 1B). Multivariatno Cox ocene sorazmerna nevarnosti modela je pokazala, da so bile ravni RhoE izražanja neodvisen in pomemben dejavnik za preživetje pri bolnikih želodca z rakom (tabela S1).
raven Izražanje RhoE
kategoriji
n -
+
++
+++
P value
Total9014283216Age0.421≤6041610187>6049818149Gender0.742Male679232213Female2355103Differentiation0.005^{aWell52120Moderately471215146Poorly380121610TNM stageT <0.001aT194320T2175840T347414209T4171367N0.001bN031111073N1-N3593182513M0.003bM08014272811M1100145Table 1. Statistična analiza imunohistokemicne Vsebnost
A, Kruskal-Wallis H test.; b, Mann-Whitney U test CSV prenos CSV}

V nadaljevanju smo preučevali raven izražanja RhoE v primarnih želodčne tkivih z rakom in njihovih izravnanih metastatskega bezgavk tkiva. Je ekspresijski nivoji RhoE sta odsotna v 7 želodčnih tkivih rakom, šibko izražen pri 16 bolnikih z rakom želodca, zmerno izražene v 11 in močno izražena v 6 rakavih tkivih oz. Nasprotno, v bezgavkah ustrezno število je 3, 12, 14 in 11. Poleg tega je izraz RhoE bistveno višja v metastatskih bezgavk tkiv, kot je ugotovljeno v primarnih tkiv raka. Te ugotovitve so pokazali, da je bila RhoE izraz povezana z metastazami na raka želodca (tabela 2, P < 0,05).
Izražanje raven RhoE
histološki tip
n
-
+
++
+++
p vrednost
rakom Osnovna tissues407161160.048 <sup>* limfnega vozla metastases403121411Table 2. Izražanje RhoE v primarnim rakom tkiv in ujemanjem bezgavkah .
* Mann-Whitney U test CSV prenos CSV</sup>

Izražanje RhoE v celičnih linij smo analizirali z Western blot (slika 1C). Ugotovili smo, da v primerjavi z na GES celično linijo, je bila, da je izraz RhoE bistveno višja v različnih raka želodca celičnih linij. Poleg tega je bila stopnja RhoE beljakovin izražanja v zelo invazivno SGC7901-M celic pod črto bistveno višja kot v manj invazivni celic sub-line SGC7901-NM. Zato nadaljnje študije tumorske metastaze so končali na osnovi celičnih modelov z SGC7901-M in SGC7901-NM celičnih linij.

RhoE spodbuja migracijskih in invazivnih sposobnosti želodčnih rakavih celic in vitro in in vivo

Če želite raziskati vlogo RhoE v želodcu metastaz raka, smo se regulirano svojo beljakovin izraz v SGC7901-NM celic naslednje transdukcija z lentivirusom vektorja RhoE ali nadzorni vektor (imenovan SGC7901-NM-RhoE ali SGC7901-NM-nadzor ). Nasprotno, dušenje od RhoE izražanja v SGC7901 M celic je bil dosežen po transfekciji s siRNA usmerjeno proti RhoE mRNA ali nadzor siRNA (imenovan SGC7901-M-siRhoE ali SGC7901-M-kontrolo oz). stopnje izraženosti proteinske so potrdili blot analizo Western po transfekciji (slika 2A).

Naprej in vitro
migracije in invazije test smo izvedli (slika 2B in 2C). Našli smo povečano ekspresijo RhoE lahko precej up-urejanje migracijskih in invazivnih sposobnosti v želodčni rak celične linije SGC7901-NM, pri celjenju ran in transwell invazijo testov. Nasprotno, SGC7901-M celice, ki kažejo navlaženo izražanje RhoE pokazala izjemno zaviranje migracijskih in invazivnih sposobnosti v primerjavi s kontrolnimi celicami. Da bi razumeli, ali so bile naloge RhoE skupni dogodki v različnih želodca rakave celice ali SGC7091 specifične dogodke, so rak želodca celične linije MKN45 in MKN28 uporabljajo za dokončanje istih poskusov. Rezultati obeh celjenje ran in transwell invazijo testi so pokazali, da RhoE spodbujati migracijskih in invazivnih sposobnosti obeh MKN45 in MKN28 celic (slika S1), ki je predlagal, da funkcije RhoE, ki so bile odkrite in vitro
so bili izčrpno vseh želodčnih rakavih celičnih linij. Medtem pa smo izvedli tudi MTT metodo za ugotavljanje vreme spremembo RhoE izražanja lahko vpliva na rast celic raka želodca v naši raziskavi. Kot je prikazano Slika S3A bi niti gor ureditev RhoE v SGC7901-NM celic niti navzdol ureditev RhoE v SGC7901 M celic povzroča bistvenega spremembo celično proliferacijo (p > 0,05), s čimer se izključi vpliv RhoE na celično proliferacijo ki bi prinesla zmedo na naše rezultate in dodatno potrdili, da lahko RhoE spodbujajo celično gibljivost želodca rakavih celic.

da bi še dodatno raziskati, ali bi lahko povečali RhoE spremeniti in vivo
metastatskega sposobnost želodca rakavih celic smo izvedli in vivo
rep vene metastatskim testi v golih miših z uporabo SGC7901-NM-RhoE in SGC7901-NM-nadzor celične linije. V žrtvovati miših, je bilo ugotovljeno, da celice, ki prikazujejo višjo raven RhoE izražanja privedlo do znatno bolj vidne liver- in pljuč površinsko tumorji v primerjavi s kontrolnimi celicami (P < 0,05, slika 3). H in E obarvanje pokazala, da SGC7901-NM-RhoE celice očitno proizvaja metastaze v obeh jeter in pljuč, medtem ko nadzorni celice prikaže samo delne metastaze. Če povzamemo, ti podatki kažejo, da RhoE igral pomembno vlogo pri spodbujanju metastaze želodčnih rakavih celic, tako in vitro
in in vivo
.

CXCR4 je lahko navzdol tok gen RhoE želodčnega raka

pri določanju možnih down-stream gene, preko katerih lahko RhoE mediacijo svojo funkcijo v metastaz želodca rakavih celic, smo izvedli PCR Array raziskati različno izražanje, povezanih z metastazami genov delita SGC7901-NM-RhoE in SGC7901-NM-kontrolnih celičnih linij. Geni, ki poveča ali zniža ≥ 2-krat so se štejejo kot potencialne nadaljnjim genov RhoE odvisnih. Skratka, smo odkrili 84 genov in na koncu ugotovila, 6, ki so izrazito spremenile, ko je bil izraz RhoE okrepljeno (tabela 3). Med 6 genov, 3 (CXCR4, VEGFA, CTSK) so se povečale za regulirano, in tri druge (MMP7, CD82, CTSL1) so dol-urejeno v SGC7901-NM-RhoE celic.
raven Izražanje mRNA
Gene imena
Opis
SGC7901-NM-nadzor
SGC7901 nm RhoE
CXCR4Chemokine (CXC motiv) receptorjev 41.003.30VEGFAVascular endotelijski rastni faktor A1.002.78CTSKCathepsin K1.002.68CTSL1Cathepsin L11.00-2.12CD82CD82 molecule1.00-2.29MMP7Matrix metalopeptidazno 71.00-2.47Table 3. različno izražena Metastasis-Podobni Geni po Augmented RhoE izraza.
CSV prenos CSV

v tej študiji so izraz CXCR4, VEGFA, CTSK in CD82 preveri z Western blot analizo in zanimivo, smo ugotovili, da je bil le CXCR4 izraz v skladu z rezultati, pridobljenimi s PCR analizo matrike. Raven beljakovin CXCR4 je zatreti z motnjami v RhoE in v nasprotju s tem se je povečala, ko je bil RhoE ectopically izražena (slika 4A). Tako je bila korelacija med RhoE in CXCR4 analizirali z imunohistokemijo v 60 rakom želodca tkiva Rezultati so pokazali, da je bila CXCR4 močno izražen v tkivih, kjer je RhoE pozitivno obarvajo, medtem ko je bilo slabo izražen v tkivih, kjer je RhoE izraženih na nizki ravni (slika 4B). Poleg tega so bile tako RhoE in CXCR4 izraz skladnih v 83,3% (50/60) v želodcu karcinome osebkov, je koeficient korelacije Spearman R 0.80 (P < 0,001) in kaže na tesno povezavo med obema RhoE in CXCR4 v želodcu raka (tabela 4). Kot poročajo, prekomerno izražen CXCR4 prav tako igra pomembno vlogo pri rakastih metastaz in je vključen v proces EMT, ki nakazujejo, da bi lahko CXCR4 gen nadaljnjega za RhoE s pomena v metastaz želodca rakavih celic [23].
CXCR4
Spearman je correlation
RhoE
+
++
+++
Negative
n
p
p
R
+1820060<0.001<0.0010.80++11730+++0270Negative2008Table 4. Korelacija med izražanju RhoE in CXCR4 v 60 parov Rak želodca tkiv.
CSV prenos CSV

CXCR4 je bistvenega pomena pri spodbujanju invazijo s RhoE v želodčnih rakavih celic

Da bi raziskali vpliv CXCR4 od sposobnosti RhoE za delovanje v metastaz raka želodca, smo dvignili izražanje CRCR4 v SGC7901-M-siRhoE celic z lentivirusni tranduction in dol regulirano svoj izraz v SGC7901-NM-RhoE celic, motnje siRNA. Raven proteina smo določili z blot analizo Western (Slika S2). V naslednjem transwell testu smo ugotovili, da lahko povečana ekspresija CXCR4 obnoviti invazivno sposobnost SGC7901-M-siRhoE celic, medtem ko je nasprotno dušenje zvoka endogenih CXCR4 zatrta vdor SGC7901-NM-RhoE celic (slika 5). Te ugotovitve so pokazali, da RhoE povzroča želodčni rak celic invazijo, ki je deloma posredovana z CXCR4. Te ugotovitve še dodatno pokazala, da je CXCR4 cilj predstavlja navzdol tok RhoE.

Pogovor

odklonsko-izražena RhoE je pogosto povezana z napredovanja tumorja. Vendar pa se je vloga o RhoE preklop med zaviralnih in onkogena glede na izvor tumorja [7-9]. Kot poročajo, želodčni rak ostaja eden najpogostejših rakov po vsem svetu, še posebej v vzhodni Aziji. Prej, se je izkazalo, da je nenormalen RhoE izraz dobro korelira z napredovanje raka želodca. Kot Zhou Li opisano, je izraz RhoE raka želodca poveča za indukcijo HIF-1 a, in katerega izraz bi šel razširjena še bolj, ko se rakave celice ustvarjajo odpor do anti-tumorskih zdravil. Poleg tega okrepljeno izraz RhoE spodbuja odpornost na zdravila, ki jih zatirati Bax izraz [13,24].

V tej raziskavi smo ugotovili, da je bil RhoE izraz povišano želodčnih tkivih rakom ker je bil odsoten ali slabo izražena v sosednjih non-tumorskih tkivih. Poleg tega klinični dokazi pokazali, da RhoE prekomerno izražanje je značilno povezana s stopnjami diferenciacije rakave celice in TNM uprizoritev, ki je sestavljen iz velikost tumorja (T), bezgavk invazije (N) in metastaz (M). Še pomembneje je, so RhoE stopnje izraženosti neodvisen in pomemben dejavnik tveganja za preživetje pri raku želodca. Poleg tega bi lahko up-urejena izraz RhoE napovedujejo slabe rezultate pri bolnikih z rakom želodca. Skupaj, naši podatki jasno kažejo, da bi lahko RhoE služila kot onkogen raka želodca in odigrala pozitivno vlogo pri želodčnem napredovanje raka, še posebej raka metastaz. To je formalno mogoče, da bi RhoE roman napovedni dejavnik pri bolnikih z rakom želodca. Tako je, če upoštevamo, da metastaze, je eden od glavnih vzrokov za smrtnost raka želodca, naše ugotovitve lahko zagotovi nov namig ali novo tarčo za zaviranje tumorske metastaze pri raku želodca in bi na koncu pomagal pri razvoju terapevtskih strategij, da se podaljša preživetje bolnikov.

Kljub temu, vloga RhoE v raka metastaz ostaja delno določen. V hepatocelularnim karcinomom in mezenhimske tumorskih celic, poveča RhoE izraz povezana z zmanjšano metastatskim sposobnosti, medtem ko je v celice melanoma, RhoE spodbuja migracijo celic in invazijo [10,12,25]. Raziskati vlogo RhoE v metastaz raka želodca, smo podrli RhoE v SGC7901-M celično linijo, ki ima visoko metastatskega potenciala in mi povzroča izražati v SGC7901-NM celično linijo, ki je slaba na metastaze . Kasneje, in vitro
testi pokazali, da povečana RhoE spodbuja celično gibljivost in invazivnost, medtem ko se je zmanjšala RhoE privedla do neinvazivno značaja želodca rakavih celic. Ti rezultati so dodatno potrdili s in vivo
testu. Znano je, da so povečano migracijo rakava celica in invazija potrebne ukrepe za končno tvorbe metastaz. Zato v želodčnih rakavih celicah, lahko RhoE funkcionalna gen-metastaze pospeševanje. Kljub temu pa smo opazili tudi, da je morfologija celic zelo spremenila po spremembi RhoE izražanja. Nadaljnje preiskave ugotovila, da bi se ta morfološka sprememba, ki jo izginotje stresa vlakna (slika S3B) povzročila, namesto spreminjanja celične proliferacije.

Kot poročajo, RhoE ureja rakavih metastaz, in to počne predvsem z zaviranjem ROCK /MYPT poti [26]. Ta oddelek je bila raziskana v drugi raziskavi, ki ga naše skupine (podatki niso prikazani). V tej raziskavi smo uporabili PCR analizo Matrika za ugotavljanje drugih nadaljnjim geni RhoE v želodcu metastaz raka, z namenom določitve osnovnih mehanizmov tumorja metastaz. Zato smo pridobili 6 različno izražene, povezanih z metastazami genov spremljanje regulacijo RhoE (CXCR4, VEGFA, CTSK, MMP7, CD82 in CTSL1). MMP7 (matrica metalo-7) spada v družino MMP proteinov, ki sodelujejo pri razgradnji zunajceličnega matriksa tako v fizičnem in patološkega stanja [27].

Je bilo, da povišana izraz MMP7 povečala invazivno sposobnost rakavih celic [28]. V PCR analizo polja, je MMP7 ugotovljeno, da je navzdol urejena v zelo invazivnih SGC7901-NM-RhoE celic, kar je v nasprotju s prejšnjimi poročili. Tako smo upoštevali MMP7 manj pomembna v naši raziskavi in ​​ne preveri njegovo izražanje Western blot. Za podobnih razlogov, nismo preveriti izražanje CTSL1. Na naše presenečenje, med 4 genov z Western blot analizo ugotovljenih je bilo le izraz CXCR4 ugotovljeno v skladu z rezultatom, dobljenim s PCR analizo Array. Nadaljnja preiskava je pokazala, da bi lahko up-regulacijo CXCR4 v želodcu rakaste celice delno obnoviti invazivno sposobnost, ki je bil zatreti s RhoE knock-out. Nasprotno pa navzdol ureditev CXCR4 zmanjšala vdor želodčnih rakavih celic, ki so povzročene s prekomerno izražen RhoE. Tako lahko CXCR4 biti potencial dol toku efektor RhoE v želodcu metastaz raka.

CXCR4, skupaj z ligandom CXCL12 (sicer CXCL12 /CXCR4 osi), je dobro znano, da je vpleten v številne vidike napredovanje tumorja, zlasti v tumorske metastaze. To je bilo prej poročali, da so CXCL12 /CXCR4 osi bistvena za metastatskim rakave celice, da se razpršijo do organov in s tem omogočajo tumorskih celic za dostop do mobilnih niše, ki dajejo prednost preživetje tumorskih celic in rast [29]. Poleg tega, da aktivira CXCR4 zahteva vezavo na G-proteini za prenos zunajcelične signale v celico in sproži različne odzive [23]. Poleg tega, če upoštevamo, da je RhoE član družine G-proteina, smo menili, da bi lahko RhoE razširilo repertoar CXCL12 /CXCR4 osi signale s povečanjem izražanje receptorja CXCR4. Nasprotno, RhoE lahko vežejo na CXCR4 in posredovanje prenos signala na nižji stopnji, ki bi lahko na koncu povzroči raka metastaz. Poleg tega smo že dokazali, da RhoE sodeluje v hypoxia- inducirane EMT, ki je ključni proces, ki prispeva k raka metastaze, v katere je vpletena tudi CXCR4. Te tesne povezave med RhoE in CXCR4 močno predlagal, da RhoE okrepljeno metastaze z up-regulacijo CXCR4 pri raku želodca. Podrobni mehanizmi, ki so odgovorni za te poti potrebuje dodatne študije.

Zaključek

Naša raziskava je pokazala, da je bila RhoE izraženi pri raku želodca in povezana z napredovanjem raka.

• Plos ONE: Pretvorba mikromrež Podpis v Diagnostic Test: preskušanju meri 74 Gene Array za pojasnilo in Napoved Prognoza želodca Cancer
• Plos ONE: Resveratrol zavira rast želodčnega raka, ki ga indukcijo G1 faza za prijetje in staranje v SIRT1 odvisnih Manner