PLOS ONE: Rhoe promove metástase em câncer gástrico através de um mecanismo dependente de maior expressão da CXCR4

Abstract

Rhoe, um novo membro da família de proteínas Rho, é um regulador chave da migração citoesqueleto e celular. O nosso grupo já havia mostrado que Rhoe como um alvo direto de HIF-1α e medeia epitelial induzida por hipóxia a transição mesenquimais em células de câncer gástrico. Por isso, assumiu-se que Rhoe pode desempenhar um papel importante na metástase do cancro gástrico. No presente estudo, nós têm explorado o papel da expressão Rhoe no câncer gástrico, invasão celular e metástase, e a influência de Rhoe na regulação da expressão do potencial de genes a jusante. Rhoe expressão foi elevado em tecidos de cancro gástrico em comparação com tecidos normais gástricas. Encontramos também uma estreita correlação entre o grau histológico eo diagnóstico do paciente. -Regulação de Rhoe aumentou significativamente as capacidades migratórias e invasivos de células cancerosas gástricas tanto in vitro
e in vivo
. Além disso, a infra-regulação da Rhoe diminuiu o potencial metastático das células cancerosas. matriz de PCR e ensaio transpoço posteriores mostraram que o regulamento de metástase de câncer gástrico por Rhoe foi parcialmente mediada pelo CXCR4. Esta observação sugeriu que CXCR4 pode ser um efector a jusante para Rhoe. Em resumo, nosso estudo identificou Rhoe como um novo biomarcador prognóstico e gene promotor de metastática do câncer gástrico

Citation:. Feng B, Li K, Zhong H, Ren G, Wang H, Shang Y, et al. (2013) Rhoe promove metástase em câncer gástrico através de um mecanismo dependente de maior expressão da CXCR4. PLoS ONE 8 (11): e81709. doi: 10.1371 /journal.pone.0081709

editor: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 11 Janeiro, 2013; Aceito: 24 de outubro de 2013; Publicação: 29 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Feng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa básica Nacional da China (Não: 2009CB521700), o Programa de alta Tecnologia Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (Não: 2006AA02A253) eo Nacional de Ciência e Tecnologia Programa de Apoio durante a Décima Primeira Five-year Período do Plano (no: 2006BAI02A14). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo e metástase tumoral é o maior obstáculo para o seu tratamento bem sucedido e a principal causa de mortalidade dos pacientes [1,2]. Por décadas, inúmeros estudos têm tentado compreender os processos e mecanismos de metástase em câncer gástrico. Em anos recentes, verificou-se que epitelial mesenquimal (EMT) é de importância crucial no presente processo e contribui grandemente para a invasão de células cancerosas e metástases. Uma razão possível é que durante EMT, o citoesqueleto é fundamentalmente modulada, levando à dispersão de células de tumor [3].

Rhoe pertence a um sub-grupo das proteínas Rho, que desempenham papéis chave na formação do citoesqueleto , motilidade celular, do ciclo celular e apoptose [4,5]. Ao contrário das proteínas típicas Rho, que alternar entre um estado ligada a GTP activa e um estado de repouso ligada a GDP, Rhoe não tem actividade intrínseca de GTPase e apresenta sempre como a forma ligada a GTP activa [6]. Esta característica única indica que a função de Rhoe é essencialmente regulada através da sua expressão e não pela sua actividade.

Recentemente, vários estudos concluíram que a expressão anormal de Rhoe foi associada com a carcinogénese e de que Rhoe pode actuar quer como um gene supressor de tumor ou um oncogene, dependendo da origem do cancro [7-9]. Da mesma forma, Rhoe tem diferentes influências na metástase em diferentes tipos de câncer. No melanoma, Rhoe suporta a migração e a invasão de células tumorais através da regulação do citoesqueleto de actina [10]. No entanto, no carcinoma hepatocelular, Rhoe representa-se como uma proteína supressora de metástases de tumores [11,12].

Anteriormente, o nosso grupo verificou que Rhoe foi melhorada em células de cancro gástrico pela indução da expressão de HIF-1α sob condições de hipóxia e EMT promovido das células cancerosas gástricas [13]. Assim, a hipótese de que Rhoe pode ter uma contribuição positiva na metástase do câncer gástrico. No presente estudo, investigamos o efeito de Rhoe sobre a metástase das células cancerosas gástricas e os mecanismos subjacentes.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

O adenocarcinoma gástrico humano linhagens de células SGC7901, MKN-45, MKN-28, KATO-III e os GES da linha de células normais da mucosa gástrica foram preservados em nosso instituto [14-16]. Além disso, o cancro gástrico linha cell- SGC7901-H, que tem um elevado potencial metastático, e SGC7901-nm, que tem uma capacidade metastática pobre, foram criados e mantidos no nosso instituto [17]. Todas as células foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) e cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada totalmente de 5% de CO2.

arranjo de tecido

Para aplicações de positividade, duas matrizes de tecido de câncer gástrico humano foram comercialmente comprado de Outdo Biotech Co. Ltd (Xangai, China). Uma matriz de tecido continham 90 pontos de tecido de tumor e combinados manchas de tecidos não tumorais adjacentes que foram obtidas a partir de 90 pacientes (com 5.3-6.1 anos de seguimento). O fabricante proveu o sexo, a idade e os parâmetros clínico dos pacientes. A outra matriz continha 120 pontos com 40 pontos primários de tecido tumoral, 40 combinados manchas de tecidos não tumorais adjacentes, e 40 combinados presença de metástases linfáticas pontos.

Imunohistoquímica

A imuno-histoquímica foi realizada utilizando Histostain ™ Além disso, kits (Zhongshan Goldenbridge Biotech, China) de acordo com as instruções do fabricante. O anticorpo de ratinho anti-Rhoe (diluído 1: 100; Upstate, MA, EUA) ou anticorpo anti-CXCR4 (diluído 1: 200; Sigma-Aldrich, MO, EUA) foram usadas no ensaio IHC como primeiro anticorpo. IgG de ratinho foi usado em vez do primeiro anticorpo tal como o controlo negativo nestes estudos. O resultado obtido foi avaliada semi-quantitativamente, atribuindo pontuações para a intensidade da imunorreactividade e por a proporção de células coradas positivamente como descrito por outros. A intensidade da imunorreatividade foi dividido em quatro categorias e teve como ausente (-; pontuação: 0), fraco (+; pontuação: 1), moderada (++; pontuação: 2) ou forte (+++; pontuação: 3 ) de acordo com a intensidade de coloração que foi observado na maioria das células epiteliais gástricas. A proporção de células positivas foi classificada em quatro grupos: (1), 0-25% de células tumorais que apresentam imunorreactividade; (2), 25-50% das células; (3), 50-75 pontos percentuais de células; e (4), 75-100% de células. A pontuação global foi o produto dos dois [18].

Análise Western Blot

As amostras de proteínas foram extraídas a partir de células ou tecidos por sonicação em um tampão de lise (NaCl 150 mM, Tris 50 mM -HCl (pH 8,8), SDS a 0,1%, EDTA a 2 mM, PMSF 1 mM, 1% de NP40, 5 ug /mL de aprotinina, 1 ug /mL de leupeptina) em gelo, depois centrifugadas a 12.000 rpm durante 10 min. As proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e electrotransferidas para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad, CA, EUA). A ligação não específica foi bloqueada com leite isento de gordura a 5% durante 1 hora à temperatura ambiente. A membrana foi então incubadas separadamente com o anticorpo anti-Rhoe (diluído 1: 400; Upstate, MA, EUA), anticorpo anti-CXCR4 (diluído 1: 1000; Sigma-Aldrich, MO, EUA), anticorpo anti-VEGFA (diluído 1 : 500; Abcam, MA, EUA), anticorpo anti-CD82 (diluído 1: 1000; Abcam, MA, EUA), anticorpo anti-CTSK (diluído 1: 1.000; Santa Cruz, Texas, EUA) ou anticorpo β-actina ( diluído a 1: 10.000; Sigma-Aldrich, MO, EUA) durante a noite a 4 ° C. Depois de quatro lavagens com tampão de TBS-T, as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (diluído 1: 2.000; Santa Cruz, Texas, EUA) durante 1 h à temperatura ambiente. Após 4 lavagens com tampão de TBS-T, as bandas foram reveladas com substrato quimioluminescente SuperSignal (Thermo Scientific, MA, EUA) para visualizar as proteínas. As manchas foram então analisados ​​por Quantidade One® software (Versão 4.2. Bio-Rad, CA, EUA), seguindo o Guia do Usuário. Western blot para expressão β-actina foi utilizada como um controlo interno.

expressão ectópica e siRNA-Mediated silenciamento

Para a expressão ectópica de genes alvo, as células cancerosas gástricas foram transduzidas com lentivírus vector expressando Rhoe ou CXCR4 (fornecido pelo GeneChem, Xangai, China). Resumidamente, as células foram plaqueadas e cultivadas a 75 a 80% de confluência, sem antibióticos, após o que os vectores lentivirais foram adicionados às células em meio de crescimento contendo polibreno (2 ug /ml) a uma MOI de 50. Em seguida, as células foram cultivadas durante mais 72 h e a eficiência da infecção foi verificada por microscopia de fluorescência e análise por Western blot. Interferência de expressão Rhoe ou CXCR4 humano foi conseguida utilizando uma técnica de interferência de RNA. ARNic em cadeia dupla foram sintetizados pela Takara Biotecnologia (Liaoning, China) e as sequências alvo de Rhoe ou CXCR4 foram definidos da seguinte forma:

Rhoe, 5'-GAACGUGAAAUGCAAGAUAUU-3 ';

CXCR4, 5'-UAAAAUCUUCCUGCCCACC-3 '.

duplexes Controle siRNA foram concebidos depois de interrogar o banco de dados BLAST com sequências de direccionamento não-específicas. As células foram transfectadas com duplexes de oligonucleótidos utilizando a LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, Nova Iorque, EUA) de acordo com as instruções do fabricante, na sequência do qual eles foram submetidos a análises mais 48 h pós-transfecção.

cicatrização de feridas Ensaio

Para detectar a motilidade celular, células em fase exponencial foram semeadas em placas de 6 poços. Após as células atingiram a confluência como uma monocamada de células no substrato de placa, uma ponta de pipeta de plástico foi traçada através do centro da placa para produzir um 1 mm de largura da área da ferida limpa e o meio foi substituído com meio RPMI 1640 fresco contendo 1% de soro fetal de bovino . Após 48 h, a movimentação das células para a área da ferida foi avaliada utilizando um microscópio de contraste de fase como descrito anteriormente [19,20].

Invasion Ensaio

ensaios celular invasão foram realizadas utilizando uma placa transwell (Corning, NY, EUA) revestidas com Matrigel (Becton Dickinson, NJ, EUA). Resumidamente, Matrigel foi diluído para uma concentração de 2 mg /ml, e 50 ul desta solução foi colocado um filtro de policarbonato e secas ao ar. Após lavagem com PBS, os filtros foram colocados em poços e 700 ul de meio de cultura RPMI-1640 suplementado com FBS 10% foi adicionado para dentro da câmara inferior. As células foram ressuspensas em meio RPMI-1640 contendo 1% de FBS e 1 × 105 células em 0,2 ml de meio definido foram plaqueadas na câmara superior. As células nas câmaras de invasão foram incubadas num incubador humidificado durante 12-48 h. Depois de uma incubação adicional, as células que penetrou os poros da membrana e dispersos para a superfície inferior dos filtros foram coradas com solução de violeta cristal a 5% para visualização. Em seguida, as células invadidas em cada poço foram contadas sob um microscópio de luz (Olympus, Tóquio, Japão) e quantificados a partir de visualização cinco campos aleatórios com uma ampliação de × 200 e em média, tal como descrito por Albini [21]. O ensaio de invasão foi repetido 3 vezes. O valor do gráfico de barras que representa o número médio de células invadidas a partir de 3 experiências separadas.

veia caudal metastático Ensaio

na veia da cauda de ensaio metastática foi determinada como relatado anteriormente [22]. Trinta ratos nus masculinos foram tratados utilizando as melhores práticas humanas e foram tratados de acordo com as diretrizes Animal Care NIH e do Comitê Use. As células foram colhidas utilizando tripsina e lavadas três vezes com PBS. Os ratos foram então injectados com 1 × 106 células em 0,1 ml de PBS através de injecção na veia da cauda. Os ratos foram em seguida monitorizados quanto a saúde geral e o peso total do corpo. No dia 28 após a injecção, os ratinhos foram sacrificados. tecidos de pulmão e fígado foram observados a olho nu, e o número de tumores visíveis na superfície do pulmão e fígado foram quantificados. tecidos de pulmão e fígado foram cortados em secções em série, coradas com hematoxilina e eosina, em seguida, observado sob um microscópio de luz. grupos experimental e controle cada continha 6 ratos. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Bem-estar e Ética Comitê Experimental Animal, a Quarta Universidade Médica Militar. Experimentos em animais foram realizados com a aprovação do Comitê Institucional de Pesquisa Animal, em conformidade com as diretrizes nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório.

Tumor matriz Metástase PCR

A expressão de metastasis- genes associados foram determinados pelo tumor humano matriz Metástase de PCR (HAP-028A; SuperArray Biosciences, Maryland, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Primeiro, o ARN total foi extraído a partir Rhoe-lentviral infectados SGC7901 células e as células de controlo, utilizando protocolos padrão, a qual foi, em seguida, convertido em ADNc de primeira cadeia. O molde de ADNc foi combinado com 2 × SuperArray PCR Master Mix, adicionou-se aos poços de uma placa de matriz de PCR (384 cavidades), contendo os conjuntos de iniciadores específicos do gene, e submetido a PCR em tempo real. As condições dos ciclos de PCR foram as seguintes: 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 min, e 72 ° C durante 30 s. Cinco genes de limpeza foram usados ​​como controles internos. A dobra-alterações na expressão de genes relacionados com a metástase foi determinada pelo método ΔΔCt.

Análise estatística

A análise dos dados foi realizada usando o software de análise estatístico SPSS 17.0 (Chicago, IL, EUA). O teste de Mann-Whitney foi utilizado para avaliar a significância das diferenças na frequência de expressão de Rhoe entre os tecidos de câncer gástrico e de metástases linfáticas. O teste de Kruskal-Wallis H para multi-grupos, e o teste de Mann-Whitney para duas comparações entre os grupos foram utilizados para analisar a relação entre ambos os níveis de expressão Rhoe e vários fatores clínico-patológico de amostras de cancro gástrico. tempo de sobrevivência cumulativa foi calculada usando o método de sobrevida de Kaplan-Meier e analisadas pelo teste de log-rank. Análises univariada e multivariada foram baseados no modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox. Comparações de dados quantitativos foram analisados ​​por -test T de Student entre dois grupos. análise de correlação entre a expressão de Rhoe e CXCR4 foi estimada pelo método de correlação de Spearman. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando P < 0,05.

Resultados

Sobre-expressão de Rhoe está correlacionada com o grau de diferenciação e estadiamento do tumor em tecidos com câncer gástrico e indica um mau prognóstico para pacientes

A expressão de Rhoe em gástrica tecidos cancerosos, tecidos não tumorais adjacentes e os tecidos relacionados de linfonodos metastáticos foi examinada por imuno-histoquímica (Figura 1A). Rhoe expressão foi encontrado expresso fracamente ou mesmo ausente em tecidos adjacentes não tumorais (a), enquanto a sua expressão foi significativamente mais elevada em tecidos de cancro gástrico e metástases dos nódulos linfáticos (b-e). Em seguida, analisamos a relação entre coloração Rhoe e os parâmetros clínico de pacientes com câncer gástrico (Tabela 1). Os resultados mostraram que Sexo e idade não estava correlacionada com a expressão de Rhoe. No entanto, o aumento da expressão Rhoe foi estatisticamente correlacionado com o grau de diferenciação (P = 0,005) e estadiamento do tumor, que consistiu do tamanho do tumor (T, P < 0,001), invasão linfonodo (N, P = 0,001), e metástase distante (H, P = 0,003). Além disso, a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier mostrou que os pacientes com níveis de expressão elevados de Rhoe, apresentados com uma sobrevida global mais curto em comparação aos pacientes com expressão negativa de Rhoe (Figura 1B). Multivariada Cox avaliações proporcional modelo de risco indicou que os níveis de expressão Rhoe foram um fator independente e significativo para a sobrevivência em pacientes com câncer gástrico (Tabela S1).
nível de expressão de Rhoe
Categoria
n
- +
++
+++
P value
Total9014283216Age0.421≤6041610187>6049818149Gender0.742Male679232213Female2355103Differentiation0.005^{aWell52120Moderately471215146Poorly380121610TNM stageT <0.001aT194320T2175840T347414209T4171367N0.001bN031111073N1-N3593182513M0.003bM08014272811M1100145Table 1. Análise Estatística de imuno-histoquímica Ensaio
a, Kruskal-Wallis H Teste.; b, Mann-Whitney U CSV Baixar CSV}

Em seguida, foram estudados os níveis de Rhoe expressão em tecidos com câncer gástrico primários e seus tecidos linfonodo metastático combinados. Os níveis de expressão Rhoe estavam ausentes em 7 tecidos de cancro gástrico, fracamente expresso em 16 doentes com cancro gástrico, moderadamente expresso em 11, e altamente expresso em tecidos de cancro 6, respectivamente. Em contraste, no nó de linfa metástases o número correspondente era de 3, 12, 14 e 11. Além disso, a expressão de Rhoe foi significativamente mais elevada em tecidos de nódulos linfáticos metastáticos do que a encontrada em tecidos cancerosos primários. Estas observações indicam que a expressão Rhoe foi correlacionada com metástase em câncer gástrico (Tabela 2, P < 0,05).
Nível de expressão de Rhoe
tipo histológico
n
-
+
++
+++
P Valor
câncer primário tissues407161160.048 <sup>* Linfonodo metastases403121411Table 2. expressão de Rhoe em Câncer tecidos primários e combinados metástases linfonodais .
* Mann-Whitney U CSV Baixar CSV</sup>

a expressão de Rhoe em linhas celulares foi analisada por Western blot (Figura 1C). Nós descobrimos que em comparação com o que, em células da linha de GES, a expressão de Rhoe foi significativamente mais elevada em várias linhas celulares de cancro gástrico. Além disso, o nível de expressão da proteína Rhoe foi significativamente maior na sub-linha celular SGC7901-M é altamente invasivo do que na sub-linha celular SGC7901-NM menos invasiva. Portanto, mais estudos de metástase de tumor foram feitas com base em modelos de celular com as linhas celulares SGC7901-M e SGC7901-NM.

Rhoe promove as habilidades migratórias e invasivos de células cancerosas gástricas in vitro e in vivo

Para explorar o papel da Rhoe na metástase do câncer gástrico, que regulado para cima sua expressão de proteínas em células SGC7901-NM seguinte transdução com o vector lentivírus Rhoe ou vector de controlo (chamado SGC7901-NM-Rhoe ou SGC7901-NM-control ). Por outro lado, amortecimento de expressão Rhoe em células SGC7901-M foi alcançada após a transfecção com siRNA dirigido contra mRNA Rhoe ou com controle de siRNA (chamado SGC7901-M-siRhoE ou SGC7901-M-controle, respectivamente). os níveis de expressão da proteína foram confirmados por análise de Western blot após a transfecção (Figura 2A).

Em seguida, In vitro
migração e invasão do ensaio foram realizadas (Figura 2B e 2C). Encontramos maior expressão da Rhoe poderia significativamente up-regular as habilidades migratórias e invasivos da linha de células de câncer gástrico SGC7901-NM, na cicatrização de feridas e transpo� ensaios de invasão. Em contraste, as células SGC7901-M, exibindo expressão umedecido de Rhoe mostrou uma notável inibição de habilidades migratórias e invasivos, em comparação com células de controlo. Para entender se as funções de Rhoe eram eventos comuns em várias células cancerosas ou eventos específicos do SGC7091 gástrico, as linhagens de células de câncer gástrico MKN45 e MKN28 foram usadas para completar as mesmas experiências. Os resultados de ambos os cicatrização de feridas e transpo� ensaios de invasão revelou que Rhoe promoveu as habilidades migratórias e invasivos de ambos os MKN45 e MKN28 células (Figura S1), que sugeriu que as funções de Rhoe que foram detectados in vitro
foram abrangentes para todas as linhas de células de câncer gástrico. Enquanto isso, nós também realizado ensaio de MTT para testar alteração wether de expressão Rhoe poderia afetar o crescimento de células de câncer gástrico em nosso estudo. Como a Figura S3A mostrado, nem a regulação para cima da Rhoe em células SGC7901 nm nem a sub-regulação de Rhoe em células SGC7901-M poderia causar alteração da proliferação celular (p > 0,05) marcado, portanto, excluído o efeito de Rhoe sobre a proliferação celular o que traria confusão com nossos resultados e ainda confirmou que Rhoe pode promover a motilidade celular das células cancerosas gástricas.

para investigar mais se o aumento Rhoe poderia alterar o in vivo
capacidade metastático das células cancerosas gástricas , foi realizada in vivo
cauda veia ensaios metastático em camundongos nus usando SGC7901-NM-Rhoe e SGC7901-NM de controle de linhas celulares. Em ratinhos sacrificados, verificou-se que as células que exibem níveis mais elevados de expressão Rhoe aumentaram significativamente mais visíveis Fígado e pulmão de superfície tumores, em comparação com células de controlo (P < 0,05, Figura 3). H e E coloração revelou que as células SGC7901-NM-Rhoe aparentemente produzido metástases em ambos os fígados e pulmões, enquanto que as células de controlo exibida apenas parciais metástases. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que Rhoe desempenhou um papel importante na promoção da metástase das células cancerosas gástricas tanto in vitro
e in vivo
.

CXCR4 poderia ser um down- gene da corrente de Rhoe no cancro gástrico

para determinar as possíveis genes a jusante, através do qual Rhoe podem mediar a sua função na metástase de células de cancro gástrico, foi realizada a matriz de PCR para explorar a expressão diferencial de genes relacionados com a metástase compartilhado entre SGC7901-NM-Rhoe e linhagens de células-NM-controle SGC7901. Genes que aumentaram ou diminuíram ≥ 2 vezes foram considerados como potenciais genes a jusante Rhoe-dependentes. Em suma, foram detectados 84 genes e, finalmente, encontrado 6, que foram significativamente alterados após expressão de Rhoe foi melhorada (Tabela 3). Entre os 6 genes, 3 (CXCR4, VEGFA, CTSK) foram regulados positivamente, e outros três (MMP7, CD82, CTSL1) foram regulados negativamente em células SGC7901-NM-Rhoe.
nível de expressão de mRNA nome
Gene
Descrição
SGC7901-NM-control
SGC7901-NM-Rhoe
CXCR4Chemokine (CXC motif) receptor 41.003.30VEGFAVascular fator de crescimento endotelial A1.002.78CTSKCathepsin K1.002.68CTSL1Cathepsin L11.00-2.12CD82CD82 molecule1.00-2.29MMP7Matrix metalopeptidase 71.00-2.47Table 3. genes diferencialmente expressos Metástase-relacionadas depois Augmented Rhoe Expression.
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neste estudo, a expressão de CXCR4, VEGFA, CTSK e CD82 foram verificados por análise de transferência de Western e Curiosamente, verificou-se que apenas a expressão de CXCR4 foi consistente com os resultados obtidos por análise de PCR de matriz. O nível de proteína de CXCR4 foi suprimida pela interferência de Rhoe e por outro lado, foi aumentado quando Rhoe foi expresso ectopicamente (Figura 4A). Assim, a correlação entre Rhoe e expressão de CXCR4 foi analisada por imuno-histoquímica em 60 cancro gástrico tecidos Os resultados mostraram que o CXCR4 foi altamente expressa em tecidos onde Rhoe foi coradas positivamente, enquanto ele estava fracamente expresso nos tecidos onde Rhoe foi expressa a um nível baixo (Figura 4B). Além disso, tanto Rhoe e expressão CXCR4 foram concordantes em 83,3% (50/60) dos espécimes carcinomas gástricos, o coeficiente de correlação de Spearman R foi de 0,80 (P < 0,001) e indicou uma correlação estreita entre ambos expressão Rhoe e CXCR4 em cancros gástricos (Tabela 4). Como relatado, sobre-expressos CXCR4 também desempenha um papel importante na metástase do cancro e está envolvida no processo de TEM, que sugeriu que o CXCR4 pode ser um gene a jusante da Rhoe com importância na metástase de células de cancro gástrico [23].
CXCR4
Spearman correlation
RhoE
+
++
+++
Negative
n
p
p
R
+1820060<0.001<0.0010.80++11730+++0270Negative2008Table 4. correlação entre a expressão de Rhoe e CXCR4 em 60 pares de câncer gástrico tecidos.
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CXCR4 é essencial para induzir a invasão de Rhoe em células cancerosas gástricas

Para investigar o efeito da CXCR4 na capacidade de Rhoe para funcionar na metástase do cancro gástrico, que aumentou a expressão de CRCR4 em células SGC7901-H-siRhoE por tranduction lentiviral e regulados negativamente a sua expressão em células SGC7901-NM-Rhoe por interferência siRNA. O nível de proteína foi determinada por análise de Western blot (Figura S2). No ensaio Transwell seguinte, verificou-se que a expressão aumentada dos receptores CXCR4 podia restaurar a capacidade invasiva de células SGC7901-H-siRhoE, enquanto que pelo contrário o silenciamento endógena CXCR4 reprimiu a invasão de células SGC7901-NM-Rhoe (Figura 5). Estas observações indicaram que Rhoe induzida invasão de células de cancro gástrico, o qual foi parcialmente mediada pelo CXCR4. Estas observações também a demonstrar que CXCR4 era um alvo a jusante de Rhoe.

Discussão

aberrante-expressa Rhoe é frequentemente associada com a progressão do tumor. No entanto, o papel ó Rhoe pode deslocar entre supressor de tumor e do oncogene, dependendo da origem do tumor [7-9]. Conforme relatado, o câncer gástrico continua sendo um dos cânceres mais comuns em todo o mundo, especialmente na Ásia Oriental. Anteriormente, foi demonstrado que a expressão anormal Rhoe está bem correlacionada com a progressão do cancro gástrico. Como Zhou e Li descrito, a expressão de Rhoe é aumentada no cancro gástrico pela indução de HIF-1α, e cuja expressão pode ir ainda mais aumentada quando as células cancerosas gerar resistência às drogas anti-tumorais. Além disso, a expressão aumentada de Rhoe promove a resistência aos fármacos através da supressão de expressão do Bax [13,24].

No presente estudo, verificou-se que a expressão Rhoe foi elevada em tecidos de câncer gástrico considerando que estava ausente ou fracamente expressa em tecidos não tumorais adjacentes. Além disso, evidências clínicas mostraram que Rhoe sobre-expressão foi significativamente correlacionada com o grau de diferenciação celular câncer e estadiamento TNM, que consiste em tamanho do tumor (T), linfonodo invasão (N) e metástases (M). Mais importante, os níveis de expressão Rhoe foram um fator de risco independente e significativa para a sobrevivência no cancro gástrico. Além disso, a expressão regulada para cima de Rhoe poderia prever um resultado ruim em pacientes com câncer gástrico. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem fortemente que Rhoe poderia ter servido como um oncogene no cancro gástrico e desempenhou um papel positivo na progressão do cancro gástrico, especialmente na metástase do câncer. É formalmente possível que Rhoe poderia ser um novo fator prognóstico em pacientes com câncer gástrico. Assim, considerando que a metástase é uma das principais razões para a mortalidade por câncer gástrico, nossas descobertas podem fornecer uma nova pista ou novo alvo para inibir a metástase do tumor no câncer gástrico e pode, finalmente, contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para prolongar a sobrevida dos pacientes.

no entanto, o papel de Rhoe na metástase do cancro permanece parcialmente indeterminado. Em células de carcinoma hepatocelular e tumor de origem mesenquimal, aumento da expressão Rhoe correlaciona-se com a redução da capacidade metastática, enquanto que em células de melanoma, Rhoe promove a migração celular e invasão [10,12,25]. Para explorar o papel do Rhoe na metástase do cancro gástrico, que derrubado Rhoe na linha celular SGC7901-H, que tem um elevado potencial metastático e que induziu a sua expressão na célula da linha de SGC7901-nm, que é pobre em metástase . Posteriormente, in vitro
ensaios demonstraram que o aumento Rhoe promovido motilidade celular e invasão, enquanto diminuiu Rhoe levou a um personagem não-invasiva das células cancerosas gástricas. Estes resultados foram confirmados pela in vivo
ensaio. É bem conhecido que a migração de células de câncer avançado ea invasão são passos necessários para a formação final de metástases. Por isso, em células de cancro gástrico, Rhoe pode ser um gene promotor de metástases funcional. No entanto, notamos também que a morfologia celular mudou muito após a alteração da expressão Rhoe. Novas investigações verificaram que esta alteração morfológica pode ser causada por desaparecimento de fibras de stress (Figura S3B), em vez de mudança de proliferação celular.

Conforme relatado, Rhoe regula a metástase do câncer, e fá-lo principalmente por inibição da via ROCK /MYPT [26]. Esta secção foi investigada num outro estudo de investigação pelo nosso grupo (dados não mostrados). Neste estudo, aplicou-se análise de matriz de PCR para a identificação de outros genes a jusante de Rhoe em metástases do cancro gástrico, com o objectivo de determinar os mecanismos subjacentes da metástase do tumor. Consequentemente, obtivemos 6 genes relacionados a metástases diferencialmente expressos seguindo-regulação de Rhoe (CXCR4, VEGFA, CTSK, MMP7, CD82 e CTSL1). MMP7 (metaloproteinase de matriz-7) pertence à família MMP de proteínas, que estão envolvidas na quebra da matriz extracelular em ambos condição física e patológico [27].

Foi relatado que a expressão elevada de MMP7 melhorada a capacidade invasiva de células de cancro [28]. Em função matriz de análise PCR, MMP7 foi encontrado para ser regulada em células altamente invasivos SGC7901-NM-Rhoe, que era contraditória com relatórios anteriores. Assim, considerou-se MMP7 de menor importância em nosso estudo e não se verificar a sua expressão por Western Blot. Por motivo semelhante, nós não verificar a expressão dos CTSL1. Para nossa surpresa, entre os 4 genes detectados por análise de Western blot, apenas a expressão de CXCR4 foi encontrado de acordo com o resultado obtido por análise de PCR de matriz. Outras investigações mostraram que a regulação positiva de CXCR4 em células de câncer gástrico poderia restaurar parcialmente a capacidade invasiva, que foi suprimida por Rhoe knock-out. Por contraste, a regulação negativa dos receptores CXCR4 diminuiu a invasão de células de cancro gástrico, que foi induzida por Rhoe sobre-expresso. Assim, o CXCR4 pode ser um potencial efector a jusante de Rhoe na metástase do cancro gástrico.

CXCR4, em conjunto com o seu ligando CXCL12 (ou seja, a /CXCR4 eixo CXCL12), é bem conhecido por estar envolvido em muitos aspectos de a progressão do tumor, especialmente na metástase tumoral. foi anteriormente relatado que o eixo CXCL12 /CXCR4 foi essencial para células de cancro metastáticas para dispersar a órgãos e, assim, permitir que as células de tumor para aceder nichos celulares que favorecem a sobrevivência das células de tumor e o crescimento [29]. Além disso, o CXCR4 activado requer a ligação a proteínas G para transferir sinais extracelulares para dentro da célula e iniciar respostas divergentes [23]. Além disso, quando se considera que Rhoe é um membro da família da proteína G, que considera que Rhoe pode ampliar o repertório de sinais eixo CXCL12 /CXCR4 através do aumento da expressão do receptor CXCR4. Em contraste, Rhoe pode ligar-se a CXCR4 e medeiam a transdução de sinal a jusante, que pode, finalmente, resultar em metástases do cancro. Além disso, foi demonstrado previamente que Rhoe participa na hipóxia induzida EMT, um processo fundamental que contribui para a metástase do cancro, em que o CXCR4 também está envolvido. Estas ligações estreitas entre Rhoe e CXCR4 sugeriu fortemente que Rhoe reforçada metástases em up-regulação CXCR4 no câncer gástrico. As modalidades específicas responsáveis ​​por estas vias necessita de mais estudos.

Conclusão

Nosso estudo demonstrou que Rhoe foi overexpressed em câncer gástrico e correlacionados com a progressão do câncer.

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