PLoS ONE: Rhoe Fördert Metastasierung in Magenkrebs durch einen Mechanismus ab, über die verstärkte Expression von CXCR4

Abstrakt

Rhoe, ein neues Mitglied der Rho-Protein-Familie, ist ein wichtiger Regulator des Zytoskeletts und der Zellmigration. Unsere Gruppe hat bereits gezeigt, dass Rhoe als direktes Ziel für HIF-1α und vermittelt hypoxieinduzierten epitheliale zu mesenchymale Transition in Magenkrebszellen. Daher gingen wir davon aus, dass Rhoe könnte eine wichtige Rolle bei Magenkrebs Metastasen spielen. In der vorliegenden Studie haben wir die Rolle der Rhoe Expression in Magenkrebs, Zellinvasion und Metastasierung und dem Einfluss von Rhoe auf die Regulierung der potenziellen Expression von Down-Stream-Gene untersucht. Rhoe Expression wurde in Magenkrebsgewebe erhöht im Vergleich zu normalen Magen-Gewebe. Wir fanden auch eine enge Korrelation zwischen dem histologischen Grad und die Diagnose des Patienten. Hochregulation von Rhoe signifikant die Migrations-und invasive Fähigkeiten von Magenkrebszellen verstärkt sowohl In-vitro-
und in vivo
. Außerdem Herabregulierung von Rhoe vermindert das metastatische Potenzial von Krebszellen. PCR-Array und die anschließende Transwell-Test zeigte, dass die Regulation der Magenkrebsmetastasen durch Rhoe teilweise durch CXCR4 vermittelt wurde. Diese Beobachtung legte nahe, dass CXCR4 könnte ein nachgeschalteter Effektor für Rhoe sein. Zusammengefasst unserer Studie Rhoe als neuer prognostischer Biomarker und metastatischen fördernden Gen von Magenkrebs identifiziert

Citation:. Feng B, Li K, Zhong H, Ren G, Wang H, Shang Y, et al. (2013) Rhoe Fördert Metastasierung in Magenkrebs durch einen Mechanismus ab, über die verstärkte Expression von CXCR4. PLoS ONE 8 (11): e81709. doi: 10.1371 /journal.pone.0081709

Editor: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Received: 11. Januar 2013 beginnen; Akzeptiert: 24. Oktober 2013 beginnen; Veröffentlicht: 29. November 2013

Copyright: © 2013 Feng et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit unterstützt wurde von der National Grund Research Program of China (No: 2009CB521700), der National High Technology Research und Development Program von China (No: 2006AA02A253) und der National Science and Technology Program Unterstützung während des elften Fünf-Jahres-Plan Zeitraum (No: 2006BAI02A14). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in der Welt und Tumormetastasierung ist das größte Hindernis für ihre erfolgreiche Behandlung und die Hauptursache für die Patientensterblichkeit [1,2]. Seit Jahrzehnten haben zahlreiche Studien, die Prozesse und Mechanismen der Metastasierung bei Magenkrebs zu verstehen versucht. In den letzten Jahren wurde gefunden, dass epitheliale mesenchymale Transition (EMT) ist von entscheidender Bedeutung in diesem Prozess und trägt erheblich zur Invasion von Krebszellen und Metastasierung. Ein möglicher Grund ist, dass während der EMT, das Zytoskelett grundsätzlich moduliert wird, was zur Streuung von Tumorzellen [3].

Rhoe gehört zu einer Untergruppe der Rho-Proteine, die in Zellskeletts Bildung eine Schlüsselrolle spielen , Zellbewegung, Zellzyklus und Apoptose [4,5]. Im Gegensatz zu den typischen Rho-Proteine, die Zyklus zwischen einem aktiven GTP-gebundenen Zustand und einem ruhenden GDP-gebundenen Zustand fehlt Rhoe intrinsische GTPase-Aktivität und stellt immer als aktive GTP-gebundenen Form [6]. Dieses einzigartige Merkmal zeigt an, dass die Funktion der Rhoe wesentlichen durch ihre Expression reguliert wird und nicht durch seine Aktivität.

Vor kurzem fand mehrere Studien, dass abnormale Expression Rhoe mit Karzinogenese verbunden war und dass Rhoe könnte entweder als ein Tumorsuppressorgen oder ein Onkogen, je nach Herkunft des Tumors [7-9]. In ähnlicher Weise hat Rhoe variierende Einflüsse auf die Metastasierung in verschiedenen Krebsarten. In Melanomen unterstützt Rhoe die Migration und Invasivität von Tumorzellen durch das Aktin-Zytoskelett regulieren [10]. Doch in hepatozellulärem Karzinom stellt Rhoe sich als Suppressor-Protein von Tumormetastasen [11,12].

Bisher hat unsere Gruppe festgestellt, dass Rhoe bei Magenkrebs-Zellen durch die Induktion von HIF-1α Expression verstärkt wurde unter hypoxischen Bedingungen und gefördert EMT von Magenkrebszellen [13]. So nahmen wir an, dass Rhoe einen positiven Beitrag bei der Metastasierung von Magenkrebs haben kann. In der vorliegenden Studie untersuchten wir von Rhoe auf der Metastasierung von Magenkrebszellen und die zugrunde liegenden Mechanismen beeinflussen die.

Materialien und Methoden

Cell Culture

Der menschliche Adenokarzinom des Magens Zell-Linien SGC7901, MKN-45, MKN-28, KATO-III und die normalen GES Magenschleimhaut Zelllinie wurden in unserem Institut [14-16] erhalten. Zusätzlich ist der Magenkrebs-Zelllinie SGC7901-M, die einen hohen metastatischen Potential hat, und SGC7901-NM, die eine schlechte Metastasierungsfähigkeit hat, wurden eingerichtet und unterhalten in unserem Institut [17]. Alle wurden die Zellen gehalten in RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) und bei 37 ° C in einer vollständig befeuchteten Atmosphäre von 5% CO2.

Tissue Array

Für die Immunfärbung von Anwendungen, zwei Gewebearrays von menschlichen Magenkrebs wurden im Handel erworben von Outdo Biotech Co. Ltd (Shanghai, China). Eine Gewebearray 90 Tumorgewebe Flecken enthalten und angepasst benachbarten Nicht-Tumorgewebe Flecken, die von 90 Patienten gewonnen wurden (mit 5,3 bis 6,1 Jahren Follow-up). Der Hersteller zur Verfügung gestellt, das Geschlecht, das Alter und klinischen Parametern der Patienten. Die andere Anordnung enthielt 120 Spots mit 40 Grundflecken Tumorgewebe, 40 angepasst benachbarten Nicht-Tumorgewebe Flecken und 40 Spots Lymphknotenmetastasen angepasst Lymphe.

Immunhistochemie

Die Immunhistochemie wurde mit Histostain ™ Plus ausgeführt Kits (Zhongshan Goldenbridge Biotech, China) nach den Anweisungen des Herstellers. Der Maus-anti-Rhoe Antikörper (verdünnt 1: 100; Upstate, MA, USA) oder anti-CXCR4-Antikörper (verdünnt 1: 200; Sigma-Aldrich, MO, USA) wurden in dem IHC-Test als erster Antikörper verwendet. Maus-IgG anstelle des ersten Antikörper als negative Kontrolle in diesen Studien verwendet. Das erhaltene Ergebnis wurde semiquantitativ ausgewertet, indem Scores für die Intensität der Immunreaktivität und für den Anteil der Zellen positiv gefärbt, wie von anderen beschrieben zuweisen. Die Intensität der Immunreaktivität wurde in vier Kategorien unterteilt und hat als abwesend (-; score: 0), schwach (+; Stand: 1), mittel (++; Score: 2) oder stark (+++; Score: 3 entsprechend) zu der Färbungsintensität, die in der Mehrzahl von Magen-Epithelzellen beobachtet. Der Anteil der positiven Zellen wurde in vier Gruppen eingeteilt: (1), 0-25% der Tumorzellen zeigen Immunreaktivität; (2) 25-50% der Zellen; (3), 50-75 Prozentpunkte von Zellen; und (4), 75-100% der Zellen. Das Gesamtergebnis war das Produkt der beiden [18].

Western Blot Analyse

Protein-Proben von Zellen oder Geweben durch Beschallung in einem Lysepuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris extrahiert wurden, -HCl (pH 8,8), 0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% NP40, 5 &mgr; g /ml Aprotinin, 1 &mgr; g /ml Leupeptin) auf Eis, dann bei 12.000 rpm für 10 min zentrifugiert. Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose elektrotransferiert Membranen (Bio-Rad, CA, USA). Nicht-spezifische Bindung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit 5% fettfreier Milch blockiert. Die Membran wurde dann separat mit anti-Rhoe Antikörper (verdünnt 1: 400; Upstate, MA, USA) inkubiert, anti-CXCR4-Antikörper (verdünnt 1: 1000; Sigma-Aldrich, MO, USA), Anti-VEGFA Antikörper (verdünnt 1 : 500; Abcam, MA, USA), Antikörper, anti-CD82 (verdünnt 1: 1000; Abcam, MA, USA), Antikörper anti-CTSK (verdünnt 1: 1000; Santa Cruz, Texas, USA) oder Antikörper-β-Actin ( verdünnt 1: 10000; Sigma-Aldrich, MO, USA) über Nacht bei 4 ° C. Nach vier Waschungen mit TBS-T-Puffer wurden die Membranen mit dem Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem sekundärem Antikörper inkubiert (Verdünnung 1: 2000; Santa Cruz, Texas, USA) für 1 h bei Raumtemperatur. Nach 4 Waschungen mit TBS-T-Puffer wurden die Bänder mit Supersignal Chemilumineszenter Substrat (Thermo Scientific, MA, USA) entwickelt, um die Proteine ​​sichtbar zu machen. Die Blots wurden dann analysiert Menge One®-Software (Version 4.2. Bio-Rad, CA, USA) nach der Bedienungsanleitung. Western-Blot für β-Actin-Expression wurde als interne Kontrolle verwendet.

ektopische Expression und siRNA-vermitteltes Silencing

Für die ektopische Expression von Zielgenen, wurden Magen-Krebszellen transduziert mit Lentiviren exprimierenden Vektor Rhoe oder CXCR4 (zur Verfügung gestellt von GeneChem, Shanghai, China). Kurz gesagt wurden die plattierten Zellen und ohne Antibiotika, wonach die lentiviralen Vektoren in die Zellen in Wachstumsmedium mit Polybren (2 ug /ml) bei einer MOI von 50 Weiter wurden zu 75-80% Konfluenz wachsen gelassen wurden die Zellen für eine weitere kultiviert 72 h und die Infektionseffizienz wurde durch Fluoreszenzmikroskopie und Western Blot-Analyse überprüft. Störungen des menschlichen Rhoe oder CXCR4-Expression wurde unter Verwendung eines RNA-Interferenz-Technik erreicht. siRNA-Duplexe wurden von Takara Biotechnologie (Liaoning, China) synthetisiert und die gezielte Sequenzen von Rhoe oder CXCR4 wurden so definiert:

Rhoe, 5'-GAACGUGAAAUGCAAGAUAUU-3 ';

CXCR4, 5'-UAAAAUCUUCCUGCCCACC-3 '.

Kontrolle siRNA-Duplexe wurden nach Abfrage der BLAST-Datenbank mit nicht-spezifischen Targeting-Sequenzen entwickelt. Zellen wurden mit Oligonucleotid-Duplexen transfiziert unter Verwendung LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, NY, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers, wonach sie weitere 48 h nach der Transfektion unterzogen wurden analysiert.

Wundheilungs Assay

Zellbeweglichkeit, exponentiellen Phase Zellen wurden in 6-Well-Platten zu erkennen. Nach dem Zusammenfluss als eine Monoschicht von Zellen auf dem Plattensubstrat, eine Kunststoff-Pipettenspitze erreicht Zellen wurde in der Mitte der Platte gezogen, um eine saubere 1 mm breite Wundbereich und das Medium zu erzeugen, ersetzt mit frischem RPMI1640 1% fötalem Rinderserum . Nach 48 h, Zellbewegung in den Wundbereich wurde mit einem Phasenkontrastmikroskop untersucht, wie zuvor beschrieben [19,20].

Invasion Assay

Zellinvasion Assays durchgeführt wurden, eine Transwell-Platte unter Verwendung von (Corning, NY, USA) beschichtet mit Matrigel (Becton Dickinson, NJ, USA). Kurz gesagt wurde Matrigel auf eine Konzentration von 2 verdünnt mg ​​/ml und 50 ul dieser Lösung in ein Polycarbonat-Filter und luftgetrocknet getätigt. Nach dem Spülen mit PBS wurden die Filter in die Vertiefungen gegeben und 700 &mgr; l RPMI-1640-Kulturmedium, ergänzt mit 10% FBS wurde in die untere Kammer gegeben. Zellen wurden in RPMI-1640, das 1% FBS und 1 × 105 Zellen in 0,2 ml definiertem Medium resuspendiert wurden in die obere Kammer plattiert. Zellen in den Invasionskammern wurden in einem befeuchteten Inkubator für 12-48 h inkubiert. Nach einer weiteren Inkubation wurden Zellen, die die Poren der Membran und verteilt an der unteren Oberfläche der Filter wurden gefärbt mit 5% Kristallviolett-Lösung zur Visualisierung eingedrungen. Als nächstes wurden bei einer Vergrößerung von × 200 von Visualisierung fünf zufälligen Feldern unter einem Lichtmikroskop (Olympus, Tokio, Japan) und quantifiziert die Invasion Zellen in jeder Vertiefung gezählt und gemittelt, wie durch Albini beschrieben [21]. Der Invasionsassay wurde 3 mal wiederholt. Der Wert der Balkendiagramm stellt die durchschnittliche Anzahl der Invasion Zellen aus drei getrennten Experimenten.

Schwanzvene Metastasiertem Assay

Die Schwanzvene metastasierendem Test bestimmt wurde, wie zuvor berichtet [22]. Dreißig männliche Nacktmäuse wurden mit besten humane Praktiken behandelt und wurden in Übereinstimmung mit NIH Animal Care und Use Committee Richtlinien betreut. Die Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin geerntet und dreimal mit PBS. Die Mäuse wurden dann mit 1 × 106 Zellen in 0,1 ml PBS durch Injektion in die Schwanzvene injiziert. Die Mäuse wurden dann für die allgemeine Gesundheit und die Gesamtkörpergewichts überwacht. Am 28. Tag nach der Injektion wurden die Mäuse getötet. Lungen- und Lebergewebe wurden mit dem bloßen Auge und die Anzahl der sichtbaren Tumoren auf der Lungen- und Leberoberfläche beobachtet quantifiziert. Lungen- und Lebergewebe wurden in serielle Abschnitte geschnitten, gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin, dann unter einem Lichtmikroskop beobachtet. Versuchs- und Kontrollgruppen enthielten jeweils 6 Mäusen. Alle experimentellen Verfahren wurden von der Versuchstierschutz und Tierethikkommission, der Vierten Military Medical University zugelassen. Tierversuche wurden mit Zustimmung des Institutionellen Ausschusses für Tierforschung, in Übereinstimmung mit den nationalen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

Tumormetastasierung PCR-Array

Die Expression von metastasis- gemäß den Anweisungen des Herstellers; assoziierten Gene wurden durch das Human Tumormetastasierung PCR Array (SuperArray Biosciences, Maryland, USA PAHS-028A) bestimmt. Zunächst wurde die Gesamt-RNA extrahiert aus Rhoe-lentviral infizierten SGC7901 Zellen und Standardprotokolle unter Verwendung von Kontrollzellen, die dann umgewandelt wurde cDNA des ersten Stranges. Die cDNA-Matrize wurde mit einem 2 × SuperArray PCR Master Mix kombiniert, hinzugefügt, um die Vertiefungen einer PCR-Arrayplatte (384er), die genspezifischen Primer-Sets enthält, und auf Echtzeit-PCR unterzogen. Die PCR-Zyklusbedingungen waren wie folgt: 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 s, 60 ° C für 1 min und 72 ° C für 30 s. Fünf Housekeeping-Gene wurden als interne Kontrollen verwendet. Die fold change in der Expression von Metastase-Genen durch die ΔΔCt Methode bestimmt.

Statistical Analysis

Die Datenanalyse unter Verwendung des SPSS 17.0 statistischen Analysesoftware (Chicago, IL durchgeführt wurde, USA). Der Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, die Signifikanz der Unterschiede in der Häufigkeit der Expression von Rhoe zwischen Magenkrebsgewebe und Lymphknotenmetastasen zu untersuchen. Der Kruskal-Wallis-H-Test für Multi-Gruppen, und der Mann-Whitney-U-Test für zwei Gruppenvergleiche wurden die Beziehung zwischen den beiden Rhoe Expressionsniveaus und verschiedenen klinisch-pathologischen Faktoren von Magenkrebs Proben zur Analyse verwendet. Kumulative Überlebenszeit wurde von der Log-Rank-Test mit der Kaplan-Meier-Überlebensmethode und analysiert berechnet. Univariate und multivariate Analysen wurden auf dem Proportional-Hazards-Regressionsmodell Cox basiert. Ein Vergleich der quantitativen Daten wurden durch den Student-t-Test zwischen zwei Gruppen analysiert. Die Korrelationsanalyse zwischen der Expression von Rhoe und CXCR4 wurde von Spearman-Rangkorrelationsverfahren geschätzt. Die Unterschiede wurden als statistisch signifikant bei P < 0,05.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Konvertieren eines Microarray-Signatur in einen Diagnosetest: Ein Versuch von benutzerdefinierten 74 Gene Array für Klärung und Vorhersage der Prognose von Magenkrebs
• PLoS ONE: Resveratrol das Wachstum von Magenkrebs Hemmt durch Induzierung G1 Phase Arrest und Seneszenz in einer Sirt1 Abhängiger Manner