PLoS ONE: Wnt /β-katenina Signalizacija Poboljšava ciklooksigenaze-2 (COX-2) transkripcijsku aktivnost u želudac stanica raka

Sažetak pregled

Pozadina pregled

Povećana ekspresija ciklooksigenaze-2 enzima (COX-2) jedna je od glavnih karakteristika rakom želuca (GC), koji je vodeći uzrok smrti u svijet, posebno u Aziji i Južnoj Americi. Iako je Wnt /β-katenina signalni put je bio uključen u aktivacije transkripcije gena COX-2, precizni mehanizam moduliranja ovaj odgovor je još uvijek nepoznat. Pregled

Metodologija /glavne nalaze

Ovdje smo proučavali regulaciji transkripcije gena COX-2 u staničnim linijama GC i procjenjuje da li je ova pojava modulira Wnt /β-katenina signalizaciju. Prvo smo ispitali na ekspresiju COX-2 mRNA u GC stanicama i utvrdili da postoji diferencijal ekspresije u skladu s visokim razinama nuklearne lokalizirani beta-katenina. Farmakološka terapija sa ili litijem ili valproična kiselina i molekularne indukcije s pročišćenom kanonske Wnt3a znatno poboljšane izražavanja CoX2 mRNA u dozi i vremenski ovisan način. Serijski brisanje KBP CoX2 fragment promotora 1.6 i koji stječu ili gubitak-of-funkcije pokusa nam je omogućilo da identificiraju područje minimalnom Wnt /β-katenina odgovarajući se sastoji od 0,8 KBP od COX-2 promotora (pCOX2-0.8), na kojoj je maksimalni odgovor u gen-reporter testovima. Aktivnost ovog pCOX2-0.8 promotorske regije dodatno je potvrđena mutageneze i DNA-protein vezivanja web-usmjerena. Pregled

Zaključci /Značaj pregled

zaključujemo da je pCOX2-0.8 minimalni promotor sadrži faktor novi funkcionalni T-stanica /limfoidna pojačivač faktor (TCF /LEF) -response element (FSME Site II; -689 /-684) koji reagira izravno na poboljšane Wnt /β-katenina signalizacije i koji može biti važna za početak /napredovanja GC pregled

Izvor:. Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino M, De Ferrari GV (2011) Wnt /β-katenina Signalizacija Poboljšava ciklooksigenaze-2 (COX-2) transkripcijsku aktivnost u želudac stanica raka. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10,1371 /journal.pone.0018562 pregled

Urednik: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, United States of America pregled

Primljeno: 5. studenoga 2010; Prihvaćeno: 11. ožujak 2011; Objavljeno: 6. travnja 2011 pregled

Copyright: © 2011 Nuñez et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo bio podržan od CTI raka, PROGRAMA Bicentenario en Ciencia y tecnologia (PBCT) - Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT) potporom broj PBCT-6 iz čileanske vlade (MM i GVD). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je multifaktorijalna bolest, karakterizirana vrlo malignih neoplazmi u sluznici želuca, te predstavlja drugi vodeći uzrok smrti od raka u svijetu s najvećom učestalosti u Aziji i Južnoj Americi [1], [ ,,,0],2], [3]. Ekološke povezani čimbenici rizika uključuju prehranu, potrošnja onjušiti, pretilost i Helicobacter pylori pregled infekcija [4]. Nekoliko mutacija u tumor-supresorskih gena, uključujući P53, adenomatozna polipoza coli (APC), E-kadherina i RUNX3 [3], [5], i u onkogenima kao K-ras, HER2 i P-katenina [3], [6], [7], su dokumentirani u GC. Osim toga, tijekom ekspresije različitih gena je dokumentirano, uključujući WNT2B [8], tC1 (C8orf4) [9] i ciklooksigenaze 2 (CoX2) enzim koji katalizira ključni korak u proizvodnji prostaglandina E2, ključni medijator upale zglobova [10], [11]. pregled

primijećeno je da je ekspresija COX-2 gena značajno povećana u humanim tkivima adenokarcinoma želuca, u usporedbi s uparenim želučane sluznice uzoraka bez stanica raka [10 ]. Kao povećana ekspresija je predloženo da utječe intenzitet invazije, veličini metastaza u limfnim čvorovima, razvoj tumora i loše prognoze [4], [12], [13]. U tom pogledu, velike količine podataka opisuju kemijsku preventivno i antitumornu aktivnost nesteroidnih protuupalnih lijekova (NSAID), uključujući selektivne inhibitore COX-2 kao potencijalni tretman za GC [10], [11], [14]. Pregled

kontrole transkripcije gena COX-2 ovisi o molekularnoj strojeva u interakciji s COX-2 promotora, koji izgleda kao da se kontrolira putem aktivnosti raznih signalnih putova [15], [16], [17]. Doista, u početku je utvrđeno da CRE (-59 /-53), NF-IL6 (-132 /-124) i NF-kB (-233 /-214) sljedove na COX-2 promotora su bili neophodni za ekspresiju gen [16]. Naknadne funkcionalne studije na COX-2 promotora identificirati niz regulatornih elemenata koji sudjeluju u transkripciju gena, uključujući i AP-1, AP-2, SP-1, C /EBPβ [18], [19], [20] i bjelančevina pripadnost faktor T-stanica /limfoidnih pojačivač faktor (TCF /LEF) obitelj transkripcijskih faktora, koji su ključni za Wnt /β-katenina prijenosa signala [21]. pregled

Wnt /β-katenina signalni put je široko priznat kao igra važnu ulogu u ljudskoj bolesti, osobito u razvoj i nastanak raka [22], [23], [24]. Novije pokusi GC izvedene stanice pokazuju odnos između ekspresije COX-2 i inhibicije glikogen sintetaze kinaze-3β (GSK3β) enzima [25], koji je ključni Wnt komponenta koja fosforilira P-katenina i potiče njegovu kasniju degradaciju putem proteasomalni [26]. Odnos između Wnt /beta-katenina i COX-2 izražavanja u različitim modelima stanice raka i dalje je podržan od sljedećih studija. Prvo, što je primijetio u mliječnoj epitela koji Wnt /β-katenina igrati neizravan utjecaj na COX-2 prepisivanje, koji bi mogao biti posredovan up-regulaciji posredničkog faktora PEA3 [27]. Drugo, i za razliku od indirektnog načina djelovanja, Araki i stupaca. [21] izvijestio da je u stanicama karcinoma debelog crijeva postoji indukcija u COX-2 izražavanja kroz β-katenina /TCF ovisnih mehanizma, a dijelom karakterizira konsenzus TCF /LEF vezanja (TBE: jezgra CTTTG) položen 1079 bp uzvodno od transkripcije početka stranica u COX-2 promotora. Treće, uočeno je da kod pacijenata oboljelih od raka debelog crijeva i izvedenih staničnih linija postoji povezanost između prekomjerne ekspresije u Wnt signalnog puta povezan s proteinima LEF-1 i Pontin52 /TIP49a i up-regulaciji COX-2 izražavanja [28]. Konačno, korištenje hondrociti, pokazano je da LEF-1, zajedno s P-katenina reguliranim COX-2 ekspresiju izravno vezanje na LEF-1 /β-katenina kompleksa u 3'UTR područja od COX-2 genomske lokusa [29] , Dakle, u ovom trenutku ne postoji jasna slika o tome da li Wnt signalni sudjeluje u ekspresiji COX-2 gena, ili kao njegove uloge u GC početak /progresije. Ovdje smo nastojali shvatiti da li postoji izravna regulacija ekspresije COX-2 gena preko Wnt /β-katenina signalizaciju i identificirati Wnt /β-katenina regulacijske elemente u promotorske regije COX-2 gena koji može poticati COX-2 transkripciju u GC stanicama. pregled

Materijali i metode pregled

Stanice i uvjeti uzgoja

ljudska staničnih linija MKN45 (japanski Zbornik istraživačkih Bioresources, Japan), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 i HEK293 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) su bili korišteni u ovom istraživanju. MKN45, N87, SNU1 i KATOIII stanice su uzgojene u RMPI mediju (Gibco); AGS u F12K medija (Hyclone); WI38 u EMEM (Gibco); i HEK293 u DMEM (Gibco). Medij kulture je nadopunjen s 10% FBS (Gibco) (AGS 20%) i 1% penicilina /streptomicina. Staničnih linija su održavane na 37 ° C u 5% CO _{2 i sa zasićenom vlazi. Pregled}

plazmidi i mutagenezom pregled

SuperTOPFlash-luciferaza i pRL-TK renilla- luciferaze plazmidi [30], konstitutivni aktivni β-katenina (S33Y) [31], a dominantno-negativnih ΔTCF4 izraz plazmidi [32] su prethodno opisano. Himerni COX2 fragmenti promoter-luciferaze se generira PCR-om iz ljudske genomske DNA pomoću specifičnih primera koji sadrže restrikcijska mjesta i nakon toga umetnut u pGL3-Basic vektor (Promega). Mutacije u mjestu TBE-II (-689 /-684) od COX-2 promotora su uporabom primera pCOX-0,8-TBEMUT s QuickChange mjesno usmjerenom mutagesis kit (Stratagene). Izvedene su potvrđena putem izravnog sekvenciranja (ABI-3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Sekvence primera su opisani u Tablici S1. Pregled

Semikvantitativna i RT-PCR pregled

Ukupna RNA se ekstrahira u RNA se free uvjeta upotrebom TRIZOL (Invitrogen) i 2 ug RNA je reverzibilno prepisana sa 200 u of Superscript II reverzna transkriptaza (RT) (Invitrogen), korištenjem 500 ng oligo (dT) primerima. Eksperimentalno određivanje CoX2, c-myc i razine mRNA CCND1 provedena je prema [33]. Ukratko, cDNA su bili podvrgnuti real-time PCR u iCycler iQ sustava (Bio-Rad Laboratories). Svaki volumen 25 ul reakcija je sadržavala 1 jedinica Platinum Taq DNA polimeraze (Invitrogen), 1 x reakcijskog pufera (20 mM Tris-HCl pH 8.4 i 50 mM KCl), 1,5 mM MgClz _{2, 2,5 ug BSA, 0,01% glicerola 200 uM dNTP, 0.3X SYBR Green rješenje i 0,4 uM specifičnih početnica (vidi Tablicu S1). PCR uvjeti su bili kako slijedi: 90 sekunda na 94 ° C, a zatim 30 ciklusa od 30 sekundi pri 94 ° C, 30 sekundi na 62 ° C i 30 sekundi na 72 ° C. Sve su reakcije izvedene u tri Rezultati dobiveni za svaki gen su normalizirani onima dobivenim paralelno s P-aktin. Kvaliteta RNA i PCR produkata se prati tijekom pokusa preko elektroforezom na 1% agaroznim gelovima, obojani s etidij bromidom, pregled}

indukcije Wnt /β-katenina signalnog puta pregled

Wnt signaliziranja je farmakološki inducirati u stanicama MKN45 nasađene kultivacijskih ploča 6 i na 80-90% konfluencije (tj 1, 2, 4 i 8 sati inkubacije) ili sa 10-20 mM LiCl (Sigma) ili 5-10 mM valproinske kiseline (VA, Sigma) kako je prethodno opisano [34], [35]. Zatim su prikupljeni za vađenje mRNA i Real Time PCR-određivanje kao što je gore opisano. Slično tome, MKN45 stanice stimulirane tijekom 2 sata sa 200 i 400 ng /mL pročišćenog Wnt3a proteina. Pročišćavanje Wnt3a provodi se kao što je opisano [36]. Pregled

transkripcijskom aktivnošću spomenute cox2 promotora pregled

Aktivnost COX-2 od promotora se mjeri u 80-90% konfluentne MKN45, AGS, WI38 i HEK293 stanice nasađene u 6 posuda za kulture. Ukratko, stanice su ko-transficirane koristeći Fugene (Roche) na 24 s pCOX2-luciferaza ili pSuperTOPFlash reportera i bilo konstitutivan aktivan beta-katenina (S33Y) [31] ili dominantnog negativnog-ΔTCF4 [32] konstruktima. PRL-TK Renilla luciferaze plazmid se rabi kao internom kontrolom. Krijesnice i aktivnosti Renilla luciferaze je određena korištenjem Dual-Luciferase reporter assay (Promega) u Victor-3 Multiplate čitača instrumenta (Perkin Elmer), kao što je prethodno opisano [30]. Relativni luciferaze aktivnosti su izražene dijeljenjem krijesnice aktivnosti luciferaze s aktivnošću Renilla luciferaze za svaki uzorak (N = 3, svaki po tri puta). Pregled

kromatina imunoprecipitacijski (chip) Testovi pregled

Studije Chip su provedeni u MKN45 stanicama kako je ranije opisano [37]. Udio nuklearne P-katenina vezan bilo za KME mjesta I, II, III ili IV u COX-2 promotora ljudskog bio imunoistaloži s anti β-katenina antitijela (Santa Cruz), a procjenjuje se u realnom vremenu-PCR pomoću specifičnih primera (Tablica S1) , Dodatno, frakcije RNA polimeraze II (Pol II) i acetiliranih histona H3 i H4 (H3ac i H4ac) vezan bilo na TBE-II regije (-793 /-594) ili proksimalnom području (-118 /+ 62 ) od COX-2 promotora sličan je ocijenjen (anti-Pol-II, Santa Cruz, H3ac i H4ac, na sjeveru države). Kao pozitivna kontrola, korištena FSME stranice c-myc [38]. Specifičnost antitijela ispitana je s normalnom zec-IgG (Santa Cruz). Pregled

Electrophoretic pokus pokretljivost pomaka (EMSA) pregled

EMSA je izvedena pomoću oligonukleotida sadrže bilo divljeg tipa cox2 TBE-II konsenzus sekvencu (vidi Tablica S1) ili ranije izvijestili mutanta KME sekvence [39]. Ukratko, divljeg tipa i mutiranih ^{32P-obilježeni oligonukleotidi su inkubirani u puferu za vezanje s nuklearnim ekstrakata MKN-45 stanica kroz 30 min na 30 ° C. Nakon toga, DNA-protein kompleksi su razdvojeni od slobodnih nukleotida na 5% non denaturaciju poliakrilamidnom gelu. Nakon elektroforeze, gel se osuši i prenese na film, 1 dan. Vizualizaciju radioaktivnih vrpci analizirana autoradiografijom. Specifičnost vezanja je provjerena inkubacijom DNA-protein kompleksa u prisutnosti suviška neoznačenog divljeg tipa i mutiranih nukleotida [21], [39]. Pregled}

Statistička analiza pregled

Svaki pokus je ponovljen najmanje tri puta s tri ponavljanja. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD. Usporedbe Više grupe su izvedeni s jednosmjernim ANOVA pomoću softvera STATISTICA 9.0. P pregled. ≪ 0.05 je smatrana značajnom pregled

Rezultati

CoX2 izraz korelira s nuklearnim razine β-katenina u GC stanicama pregled

U početku smo odredili izraz razine COX-2 mRNA u ljudskim GC staničnih linija MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII i AGS [40], [41], [42], kao i WI38 fibroblasta ovdje koristi kao kontrola stanične linije [43], ispitivanje bilo da su u korelaciji s Wnt /β-katenina signalizaciju. Kako je prikazano na slici 1, visoka razina ekspresije COX-2 su promatrani kao što je ranije 26 ciklusa PCR amplifikacije na metastatskim stanicama MKN45, SNU16 i KATOIII, a također i u staničnoj liniji AGS, koji proizlazi iz primarnog tumora. Ovaj rezultat je u skladu s razinama CoX2 ekspresije prethodno otkrivenih u MKN45, KATOIII i AGS stanica [44], [45], [46]. Nasuprot tome, razine CoX2 mRNA ili vrlo niska u WI38 fibroblasta ili nedetektabilna u N87 i SNU1 stanica (Slika 1A), što ukazuje da ova diferencijal uzorak ekspresije nije povezan s metastatskim faze ili razine transformacije stanica. Izuzetno, razine nuklearnog β-katenina su usko povezani s COX-2 izražavanja, jer su uočeni visoke razine proteina u MKN45, AGS, SNU16 i KATOIII stanica, u usporedbi sa N87, SNU1 i WI38 stanica (Slika 1B), što podrazumijeva ulogu WNT signalizacije u izrazu CoX2 mRNA u GC stanicama. pregled

Poboljšanje COX-2 izražavanja putem Wnt /beta-katenina signalizaciju pregled

kako bi se ispitati ako je Wnt kaskada je uključen u COX-2 izražavanja, MKN45 stanice su farmakološki stimulira različite periode vremena (odnosno 1, 2, 4 i 8 sati) bilo sa litijem (LiCl) ili valproična kiselina (VA), budući da su obje droge su prethodno već pokazali da moduliraju Wnt signaliziranja putem inhibicije aktivnosti GSK3β, a time se povećava nuklearno razine beta-katenina [34], [35]. Zanimljivo, opazili smo značajno poboljšanje COX-2 ekspresije induciranu 10-20 mM LiCl ili 5-10 mM VA, koji je započeo ubrzo nakon inkubacije sa spojevima i maksimuma nakon dva sata tretiranja (slika 2A). Stvarnom vremenu određivanje razine CoX2 mRNA u MKN45 stanicama slično tretiranih LiCl ili VA (2 sata) pokazuje da CoX2 bila značajno je povećana (slika 2B) i da je taj učinak je paralelno s jednim promatrana Wnt /β-katenina ciljne gene c-myc [47] i ciklin D1 [48]. Dalje, kako bi se isključila mogućnost da je promatrana pojava ogleda nespecifične učinke lijekova koji djeluju na proteine ​​koji utječu na različite signalne kaskade, primjenjuju se neposredno potpuno funkcionalan pročišćeni Wnt3a proteina MKN45 stanica (vidi Metode). Ti pokusi jasno pokazali da 200-400 ng /ml pročišćene Wnt3a značajno poboljšanu ekspresiju mRNA CoX2 poslije kratkog razdoblja inkubacije (Slika 2), djelomično objašnjava brzi učinak LiCl i VA i podržavanje izravnu povezanost između kanonskog Wnt /beta-katenina aktivacija i stimulacija COX-2 transkripcije u GC stanicama. pregled

Identifikacija novih KME lokacija u promotoru gena Netlogu COX-2

Prethodne studije pokazale su da /β-katenina reagiraju tBE stranica Wnt ( konsenzus jezgra: CTTTG) nalazi se na -1079 /-1,074 bp uzvodno od početnog mjesta za transkripciju (TSS) ljudske COX-2 gena [21] (Site IV Slika 3A, vidi također sliku S1). Daljnje skeniranje uzvodne sekvence 1600 bp iz TSS [49] nam je omogućilo da identificiraju 3 nove navodne KME stranice: -877 /-872 bp (Site III, smislene orijentacije), -689 /-684 bp i -318 /-313 bp (Sites II i ja, odnosno, kako u suprotnom smjeru) (slika 3A), koji nisu konzervirane između čovjeka i glodavca COX-2 gena (Slika S1). stoga klonirana 1600 bp segment iz ljudske COX-2 promotora (pCOX2), uključujući sve četiri FSME mjestima, u pGL3-Basic vektor koji je spojen na gen luciferaze koja se koriste kasnije kod reporter analiza (slika 3A). Izvanredno, usporedo transfekciji 10 ng ovog konstrukta u MKN-45 i HEK293 stanica pokazala je da pCOX2 pokazale su značajno veći (9 puta), bazalnu promotorsku aktivnost MKN45 stanicama (slika 3b i C). Mi smo pretpostavili da je to veća aktivnost pCOX2 bazalni promotor može biti povezana s povišenim sadržajem nuklearnog beta-katenina u ovom GC stanične linije (Slika 1B). Stoga MKN45 i HEK293 stanice su kotransfektirane sa pCOX2 u prisutnosti nižih doza konstitutivni aktivnog β-katenina proteina (S33Y) [31]. Kao što je vidljivo i na slici 3, pCOX2 aktivnost zaista je pojačan u oba tipa stanica, što ukazuje da je P-katenina može vezati i aktivirati TCF /LEF transkripcijskih faktora na funkcionalne KME mjesta unutar pCOX2 promotora. Pregled

Doprinos KME stranice za CoX2 promotorske aktivnosti u GC stanicama pregled

Kako secirati doprinos Wnt /β-katenina reagiraju na KME stranica na transkripcije aktivnosti COX-2 promotora četiri pCOX2 brisanja konstrukti su generirani: pCOX-1.2 (-1123 /+ 35 bp); pCOX-0.8 (-741 /+ 35 bp); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 bp); i pCOX-0.4 (-371 /+ 35 bp) (Slika 4A). Ti konstrukti su zatim ispitani na njihovu aktivnost putem transfekcije u MKN45 i AGS stanice, koristeći WI38 fibroblaste kao kontrola stanične linije. U skladu s endogenim razinama CoX2 ekspresije u navedenim GC staničnih linija (Slika 1A), pCOX2 delecije zadržao različite razine aktivnosti u MKN45 i AGS stanica (Slika 4B i C). Nasuprot tome, nema promotora aktivnost otkrivena je u WI38 fibroblasta (Slika 4D), čak i kada su povećane doze transfekcije u tim stanicama 8 puta (tj od 50 do 400 ng) (Slika S2). Važno je, te u dogovoru s prethodnim izvješćima [50], WI38 stanice učinkovito izrazili luciferaza-reporter konstrukt sadrži promotor p21 gena (Slika S2), što znači da je u tim kontrolnim stanicama molekularna strojevi odgovorni za izazivanje COX-2 prepisivanje nije aktivan , Daljnji pokusi su pokazali da unos u MKN45 i AGS stanice s pCOX2-0.8 konstrukt, koji ima 859 bp izbrisana iz 1,6 kb pCOX2 reporter (slika 4a), rezultiralo značajnim povećanjem aktivnosti promotora u usporedbi s novinarom pCOX2-1.2 (Slika 4A-C). Kako nije bilo nikakvih značajnih razlika između 1,6 kb pCOX2 i pCOX2-1.2 konstrukata (Slika S3), nismo obaviti dodatno analizira s većim konstrukt. Važno je, pCOX2-0.8 zastupa minimalnu veličinu promoter fragment koji pokazuje maksimalnu bazalnu aktivnost, budući daljnje brisanja bilo 159 ili 370 bp iz 5'-kraju, kao što je to slučaj sa pCOX2-0.65 ili pCOX2-0.4 konstrukata, odnosno , smanjena više od dva puta razine pCOX2 bazalnom. Ovi rezultati pokazuju da je područje između 0,8 i 0,65 kbp uzvodno od TSS gena COX-2, a koji obuhvaća element za novi TBE odgovora (FSME Site II; -689 /-684), mogu biti ključna komponenta u regulaciji bazalna razina ekspresije COX-2 gena u GC stanicama. pregled

reguliranje prema pCOX2-0.8 preko Wnt /beta-katenina signalizaciju pregled

Zatim smo ispitali učinak Wnt /β-katenina signalizacije na roman TBE Site II. transfektirane smo MKN45 stanica s pCOX2-0.8 reporter konstrukta i co-izrazio konstitutivni aktivni β-katenina S33Y protein promatrajući kako postoji značajna (2-struki), povećanje transkripcije aktivnosti pCOX2-0.8. To β-katenina posredovano povećanje bilo je specifično jer nije pCOX2-0.4 konstrukt stimulirana u ovom P-katenina prekomjerna ekspresija uređaj (slika 5A i B). Kontrola za Wnt /β-katenina signalizacija u MKN45 stanica koristili smo Wnt /β-katenina reagiraju SuperTOPFLASH (StF) reportera koji nosi 12 kopija KME u tandemu [32], koji je transfektiran sam ili u prisutnosti plazmida kodiranje za mutant β-katenina S33Y proteina. Zanimljivo, a ko-ekspresija s mutiranim β-katenina S33Y proteina MKN45 stanicama je u mogućnosti povećati (1,9-puta) aktivnost StF reportera, visoke razine bazalni STF aktivnosti su otkrivene u odsutnosti mutiranog P-katenina (Slika 5C). Ovaj rezultat je u skladu s našim prethodnim nalazima visoke razine endogenog nuklearnog beta-katenina u ovom tipu stanice (vidi Slika 1B), te potvrđuje da je ovaj nuklearni faktor je funkcionalan. Kako bi se dodatno potvrdili ovaj zaključak, izveli smo identične eksperimente u HEK293 stanica dobivenih uglavnom isti rezultati, iako u ovom slučaju se ne dobije bistra krivulja doza-odgovor kada pCOX2-0.8 je transfektiran u prisutnosti rastućih koncentracija od tvorbene aktivne beta-katenina S33Y protein (Slika S4). Osim toga, otkrili smo da STF aktivnost u HEK293 stanica bila je vrlo osjetljiv na razinama egzogenog mutanta P-katenina (Slika S4C). Pregled

Kako bi se dodatno istražiti učinke Wnt /β-katenina put na aktivnost od pCOX2-0.8 proveli smo gubitak-funkcije pokusa s dominantnog negativnog TCF4 (ΔTCF) konstrukt koji kodira transkripcijski faktor nedostaje 30 ostataka iz svog amino-kraju, a da se ne može vezati P-katenina [32] , Našli smo da se u MKN45 stanice ΔTCF izraz smanjio visoke razine pCOX2-0.8 bazalnog transkripcija na način koji ovisi o dozi (Slika 5D). Ovaj rezultat potvrđuje ključnu ulogu TCF /LEF transkripcijskih faktora među regulatorima aktivnošću pCOX2-0.8 sekvenca promotora i dalje podupire ideju da je TBE Site II (-689 /-684) uključen je u odgovoru na WNT /β-katenina signalizacije. pregled

na kraju, da se izravno obratite ulogu KME Mjesta II u Wnt /β-katenina posredovanu regulacije COX-2 promotora, uveli smo po ciljanom mutagenezom promjenu u 2 ključa nukleotidi konsenzusne sekvencije TBE Site II jezgre (tj pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Te promjene su već pokazala da se ukine Wnt /β-katenina-posredovanu transkripciju [39]. Prolazne transfekcije studije su pokazale da mutacija FSME Mjesta II značajno smanjen (2-3 puta) bazalna aktivnost pCOX2-0.8 konstrukt u MKN45 stanicama (slika 5e) u usporedbi s divljim tipom pCOX2-0.8 promotora konstrukt. Osim toga, te u dogovoru s našim prethodnim rezultatima, mutacija ovog KME stranicama II gotovo u potpunosti blokirana β-katenina posredovane unapređenje pCOX2-0.8 konstrukta (Slika S4). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da TBE Site II (-689 /-684) je funkcionalna komponenta u CoX2 gena regulaciji transkripcije. Pregled

β-katenina veže za gen promotorske regije COX-2 koji sadrži FMSE Mjesta II pregled

Zbog transkripcijski aktivna konformacija kromatina strukture očituje povišenom razinom acetilacije histona [51], istaloži se umreženih kromatina fragmenata (prosječna veličina 300-500 bp) su izolirane iz MKN45 stanica korištenjem poliklonskih antitijela specifična za acetiliranih histona H3 i H4. Slično tome, otkrili smo vezanje RNA polimeraze II (Pol II) kao parametar se obično povezuje s transkripcijskom aktivnošću. Ispitali smo obogaćivanje u našim taloga dvije promotorske sekvencije: proksimalnog promotora (PP) područje (-118 /+ 62 iz TSS) i distalni kraj (-793 /-594) od COX-2 promotora sadrži konsenzus KME Site II ( -689 /-684). Posebno, TBE Site II ciljano dok prethodni eksperimenti pokazuju preferencijalnog vezivanja P-katenina ovom području promotora (Slika S5). Kao pozitivna kontrola, istražili smo vezivanje na FSME lokaciji na promotor gena c-myc (-1447 /-1,144 od TSS), koji je prethodno opisan u stanicama raka debelog crijeva [38]. Pregled

acetiliziranih histoni H3 i H4 i enzim polimeraza II nađeno je da se vežu u regiji proksimalnog promotora (Slika 6A), što ukazuje da je struktura kromatina oko COX-2 promotor MKN45 stanicama u otvorenom konformaciji, čime se u skladu s prethodnim rezultatima koji pokazuju da je CoX2 gen aktivno prepisivanje. Posebice, β-katenina protein je imunoistaloži od MKN45 uzoraka govore u suradnji s promotorske regije prostire na KME slijed -684 /-689 u COX-2 gena (Slika 6b). Ovaj faktor bio je gotovo neprimjetan u regiji proksimalnog promotora, što ukazuje na to da endogena nuklearna β-katenina primarno privučeni na FSME Mjesta II u tim GC stanicama. Kao što se očekivalo, endogene β-katenina na sličan vezan na c-myc promotor FSME stranice, pri razinama koje su usporedive s onima koje su primijećene u genskom promotoru COX-2 (slika 6C). Pregled

Zajedno, ovi eksperimenti pokazuju da je TBE Site II je izravno uključen u β-katenina posredovane transkripcije aktivacije COX-2 promotora. Kako bi se dodatno potvrditi ove rezultate koje izvode elektroforetskih eseji mobilnost pomak (EMSA) iz nuklearnih ekstraktima MKN45 stanica. U tu svrhu smo pripremili 34 na temelju združena oligonukleotida; jedan sadrži divlji tip -689 /-684 TBE Site II sekvenca (tj CTACAAAGA, ostaci podcrtana predstavlja jezgru), a dva nukleotida koji sadrže misscnsc mutacije u obje jezgre KME Mjesta II (tj CTACGAGGA: KME-MUT1) ili u bočnih sekvencija (tj CGCCAAAGA: FSME-Mut2), kao što je prethodno opisano [21], [39]. Kao što je prikazano na Slici 6D, radiološki divljeg tipa TBE proba sposobna za formiranje zaostale DNA-protein komplekse i kada se inkubira sa ekstrakti jezgre od MKN45 stanica. Te protein-DNA kompleksima su specifični jer dodavanje suviška hladnog oligonukleotida divljeg tipa (50 puta) značajno inhibira nastajanje DNA-protein kompleksa (Slika 6D, linija 3 i 4, redom). Mutant Radio-obilježeni TBE-MUT1 sonda ne mogu tvoriti DNA-protein kompleksa po sebi, niti da se natječe sa divljim tipom oligonukleotid, kad se doda u suvišku kao hladnog probe (Slika 6D, linija 5 i 6, redom). Slični rezultati su dobiveni kada je druga hladna TBE-Mut2 sonda upotrijebiti kao konkurenti (Slika 6D, stupac 7). Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da je roman TBE Site II u COX-2 promotora koji su uključeni u aktivacije transkripcije gena COX-2 zapošljavanjem mašineriju odgovoran za prenošenje Wnt /β-katenina signalizaciju (Slika 6e). Pregled

Rasprava pregled

Prethodne studije ukazuje na ulogu Wnt /β-katenina signalizacije tijekom početka i /ili razvoj različitih vrsta raka preko modulaciji ekspresiju COX-2 gena [25]. U ovom radu smo predstavili jake dokaze izravnu ulogu za Wnt /β-katenina signalizaciju u kontroli COX-2 izražavanja u GC stanicama. Prvo, mi smo pokazali da postoji široka korelacija između ekspresije COX-2 i nuklearnu sadržaj beta-katenina, što se čini da je neovisan od bilo malignosti ili transformacije stanja CG stanica. Drugo, vremenski i dozno-ovisnog poboljšanje COX-2 ekspresije uočeno brzo nakon indukcije (2 h), s dodatkom farmakoloških spojeva oponaša Wnt /β-katenina signalizaciju. Treće, reporter testovi gena ocjenjuje CoX2 aktivnost promotora kao odgovor na koji stječu i gubitak-of-funkcije eksperimenti, uključujući i konstitutivno aktivnog β-katenina proteina i dominantnog negativnog faktora TCF4 transkripcije, pokazuju da su Wnt /β-katenina dijelovi uključeni u regulaciji transkripcije gena COX-2 pregled

Mi smo i ovdje pokazala da u roku od 2 kBP uzvodno od COX-2 promotora ljudskog postoje četiri navodni KME mjesta. (jezgra: CTTTG), od kojih je jedan je prethodno pozabaviti Araki i Stupci [21], [28]. Preko reporterskog gena testova s ​​različitim pCOX2 brisanje konstrukata smo pokazali da pCOX2-0.8 prikazan najveću bazalnu transkripcijsku aktivnost u GC stanicama MKN45 i AGS. Zanimljivo, pCOX2-0.8 zadržala KME Site-II (-689 /-684) integritet ukazuje na svoj ključni doprinos regulaciji transkripcije aktivnosti gena COX-2. Osobito, kompletan pCOX2 TBE Site II signature (tj 5'-WWCAAAGS-3 ', S = C /G, W = A /T), nalik na optimalan TCF stranice su opisali van de Wetering i stupaca. [52], koji je kasnije koristi za prepoznavanje prave Wnt-transkripcije ciljeve u Drosophila pregled gena NKD pregled i CG6234 pregled [53]. Pregled

funkcionalnost ovog KME mjesta II je potvrdio naše mutageneze studija. Dakle, kad smo mutirali u TBE-potpis slijeda u pCOX2-0.8 konstrukta (MpCOX2-0.8), utvrđeno je da je aktivnost bazalnih CoX2 promotora je značajno utjecalo na MKN45 stanica. Osim toga naš čip i EMSA analize potvrdili su da β-katenina prioritetno regrutirao do -689 /-684 COX-2 promotorske regije u GC stanicama, na razini koja sliči onoj na c-myc promotora [38]. Tu interakciju prvenstveno pojavljuje na tom području promotora gena COX-2 kao što je bez β-katenina je pronađeno da se vežu na regiju proksimalnog promotora gena COX-2. Zajedno ovi rezultati pokazuju da TBE Site II funkcionalna Wnt /β-katenina koji reagira u COX-2 promotora ljudskog. Naši podaci, međutim, ne isključuje doprinos ostalih genomskih regija u ljudskom COX-2 gena [21]. Umjesto toga, predlažemo da se u GC stanicama prisutan kompleks web interakcija gdje TBE Site II surađuje s drugim elementima kao odgovor na gore regulira ekspresiju COX-2. Pregled

Kako su naši rezultati u GC stanice su u skladu s onima prijavio za stanice raka debelog crijeva, to je primamljiva da nagađati da Wnt /β-katenina signalizacije mogu se isto tako su uključeni u COX-2 regulacije u drugim tumorima [21], [28]. Doista, umjerena do visoka razina proteina P-katenina može se promatrati u ca. 72% svih slučajeva raka analiziranih u ljudskom Atlas bazi proteina tkiva [54]. Isto tako, jaka do umjeren citoplazmatski COX-2 bojanja i povremene Membranozni reaktivnost je promatrana u 50% svih vrsta raka, uključujući i debelog crijeva, prostate, grlića maternice, endometrija, urothelial, gušterače, jetre i žljezdane stanice iz želuca tumorskog tkiva.

• PLoS ONE: mikrornk Let-7f Sprječava Invazija tumora i metastaze ciljajući MYH9 u ljudske želučane Cancer
• PLoS ONE: Sonic jež Put je bitno za održavanje raka matične stanice nalik na ljudskog želuca Cancer