PLOS ONE: Wnt /β-caténine Signaling Améliore Cyclooxygenase-2 (COX2) transcriptionnelle L'activité dans le cancer gastrique Cells

Résumé

Contexte

L'expression accrue de l'enzyme cyclo-oxygénase-2 (COX2) est l'une des principales caractéristiques du cancer gastrique (GC), qui est une cause majeure de décès dans le monde, en particulier en Asie et en Amérique du Sud. Bien que la voie de signalisation /β-caténine a été impliqué dans l'activation de la transcription du gène COX2, le mécanisme précis de modulation cette réponse est encore inconnue.

Méthodologie /Principales constatations

Ici, nous avons étudié la régulation de la transcription du gène de la COX-2 dans des lignées cellulaires GC et évaluer si ce phénomène est modulée par la signalisation Wnt /β-caténine. Nous avons examiné d'abord l'expression de COX2 ARNm dans les cellules de GC et constaté qu'il y a un modèle d'expression différentielle compatibles avec des niveaux élevés de β-caténine nucléaire localisée. Le traitement pharmacologique soit avec le lithium ou l'acide valproïque et l'induction moléculaire avec Wnt3a canonique de manière significative l'expression accrue de l'ARNm de la COX-2 purifié de la dose et dépendante du temps. suppression de série d'un kbp fragment de 1,6 promoteur COX2 et expériences intensité forte ou la perte de fonction nous a permis d'identifier une région sensible minimale Wnt /β-caténine constitué de 0,8 kpb du promoteur COX2 (pCOX2-0.8), qui a montré la réponse maximale dans des dosages de gènes rapporteurs. L'activité de cette région du promoteur de pCOX2-0.8 a été confirmée par mutagenèse et ADN-protéines des essais de liaison dirigée vers le site.

Conclusions /Importance

Nous concluons que le pCOX2-0.8 promoteur minimal contient un nouveau facteur T-cellule fonctionnelle /lymphoïde facteur activateur (TCF /LEF) Elément -response (TBE site II; -689 /-684) qui répond directement à l'amélioration de la signalisation Wnt /β-caténine et qui peut être important pour le début /progression GC

Citation:. Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino M, de Ferrari GV (2011) Wnt /β-caténine Signaling Améliore Cyclooxygenase-2 (COX2) transcriptionnelle activité dans les cellules du cancer gastrique. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10.1371 /journal.pone.0018562

Editeur: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Etats-Unis d'Amérique

reçues: 5 Novembre 2010; Accepté: 11 Mars 2011; Publié 6 Avril, 2011

Droit d'auteur: © 2011 Nuñez et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par CTI-Cáncer, Programa Bicentenario en Ciencia y Tecnología (PBCT) - Comisión Nacional de Investigación Cientifica y Tecnológica (CONICYT) numéro de subvention PBCT-6 du gouvernement chilien (MM et GVD). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique (GC) est une maladie multifactorielle, caractérisée par des néoplasmes très malignes dans la muqueuse gastrique, et représente la deuxième cause de décès par cancer dans le monde entier avec la plus forte prévalence en Asie et en Amérique du Sud [1], [ ,,,0],2], [3]. Les facteurs environnementaux de risque associés comprennent l'alimentation, la consommation de tabac, l'obésité et l'infection de Helicobacter pylori [4]. Plusieurs mutations dans les gènes suppresseurs de tumeurs, y compris P53, polypose adénomateuse familiale (APC), la E-cadhérine et RUNX3 [3], [5], ainsi que dans les oncogènes tels que k-ras, HER2 et de β-caténine [3], [6], [7], ont été documentés dans GC. En outre, sur l'expression de divers gènes a été documentée, y compris WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], et la cyclooxygénase 2 (COX2) enzyme qui catalyse l'étape cruciale dans la production de prostaglandine E2, un médiateur clé de l'inflammation articulaire [10], [11].

Il a été observé que l'expression du gène de la COX-2 est significativement augmentée dans les tissus d'adénocarcinome de l'estomac humain, par rapport aux paires des échantillons de la muqueuse gastrique dépourvu de cellules cancéreuses [10 ]. Une telle augmentation de l'expression a été proposé d'influer sur l'intensité de l'invasion, la taille des métastases des ganglions lymphatiques, le développement de la tumeur et de mauvais pronostic [4], [12], [13]. À cet égard, de grandes quantités de données décrivent l'activité chimio-préventive et anti-cancéreux de médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), y compris les inhibiteurs de COX-2 sélectifs comme des traitements potentiels pour GC [10], [11], [14].

contrôle transcriptionnel du gène COX2 dépend de la machinerie moléculaire interagissant avec le promoteur de COX2, qui semble être contrôlé par l'activité des différentes voies de signalisation [15], [16], [17]. En effet, il a d'abord été établi que la CRE (-59 /-53), NF-IL6 (-132 /-124) et NF-kB (-233 /-214) des séquences consensus dans le promoteur de COX2 étaient nécessaires pour l'expression de la gène [16]. Des études fonctionnelles ultérieures du promoteur de la COX-2 ont identifié une série d'éléments régulateurs participant à la transcription du gène, y compris l'AP-1, AP-2, Sp-1, C /EBPß [18], [19], [20] et des protéines appartenant au facteur T-Cell /lymphoïde facteur activateur (TCF /LEF) famille de facteurs de transcription, qui sont cruciales pour Wnt /signal β-caténine transduction [21].

la voie de signalisation /β-caténine est largement reconnu comme jouant un rôle majeur dans la maladie humaine, en particulier dans l'apparition et le développement d'un cancer [22], [23], [24]. Fait intéressant, des expériences récentes dans des cellules GC dérivées ont montré une relation entre l'expression de la COX-2 et l'inhibition de la glycogène synthase kinase-3β (GSK3ß) enzyme [25], qui est un composant Wnt clé qui phosphoryle la β-caténine et favorise sa dégradation ultérieure par protéasome [26]. La relation entre les Wnt /β-caténine et de l'expression de la COX-2 dans différents modèles de cellules cancéreuses est en outre supporté par les études suivantes. Tout d'abord, il a été observé dans l'épithélium mammaire qui Wnt /β-caténine joue un effet indirect sur la COX2 la transcription, ce qui pourrait être médié par la régulation d'un facteur PEA3 intermédiaire [27]. Deuxièmement, et contrairement à un mode d'action indirect, Araki et col. [21] ont rapporté que des cellules cancéreuses du côlon il y a une induction de l'expression de COX2 par une β-caténine /TCF mécanisme dépendant, et caractérisé partiellement un /le site de liaison DGC consensus (TCF TBE: Noyau CTTTG) positionnée 1079 pb en amont du début de transcription le site dans le promoteur de la COX2. Troisièmement, il a été observé que chez les patients atteints de cancer du côlon et des lignées cellulaires dérivées, il existe une association entre la surexpression des Wnt voie protéines associées LEF-1 et Pontin52 /TIP49a et up-régulation de l'expression COX2 [28]. Enfin, en utilisant les chondrocytes, il a été démontré que LEF-1, avec β-caténine, l'expression de la COX-2 régulée par la liaison directe du complexe DGC-1 /β-caténine dans la région 3'UTR du locus génomique de la COX-2 [29] . Par conséquent, à l'heure actuelle il n'y a pas une image claire quant à savoir si la signalisation Wnt est impliquée dans l'expression du gène COX2, ou son rôle dans la GC apparition /progression. Ici, nous avons cherché à comprendre s'il existe une réglementation directe de l'expression du gène COX2 via la signalisation Wnt /β-caténine et d'identifier les éléments régulateurs Wnt /β-caténine dans la région promotrice du gène COX2 qui peut upregulate COX2 transcription dans les cellules du GC.

Matériel et méthodes

cellules et conditions de culture

lignées cellulaires humaines MKN45 (Collection japonaise de bioressources recherche, Japon), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 et HEK293 (American type Culture Collection, Rockville, MD) ont été utilisés dans cette étude. cellules MKN45, N87, SNU1 et KATOIII ont été cultivées dans IPMB (Gibco); AGS en milieu F12K (Hyclone); WI38 dans EMEM (Gibco); et HEK293 dans un milieu DMEM (Gibco). Le milieu de culture a été supplémenté avec 10% de FBS (Gibco) (AGS à 20%) et 1% de pénicilline /streptomycine. Lignées cellulaires ont été maintenues à 37 ° C dans 5% de CO _{2 et de l'humidité saturée.}

Plasmides et mutagenèse dirigée

Le SuperTOPFlash-luciférase et l'renilla- pRL-TK plasmides luciférase [30], le β-caténine constitutive active (S33Y) [31] et les dominants négatifs des plasmides d'expression de ΔTCF4 [32] ont été décrits précédemment. les fragments promoteur-luciférase ont été générées COX2 chimériques par PCR à partir d'ADN génomique humain en utilisant des amorces spécifiques contenant des sites de restriction et ensuite insérés dans le vecteur pGL3-Basic (Promega). Les mutations dans le site TBE-II (-689 /-684) du promoteur de la COX-2 ont été générés en utilisant les amorces pCOX-0,8-TBEMUT avec le kit de mutagesis dirigée sur le site QuickChange (Stratagene). Constructs ont été vérifiées par séquençage direct (ABI-3130 analyseur génétique, Applied Biosystems). Amorces séquences sont décrites dans le tableau S1.

et semi-quantitative en temps réel RT-PCR

ARN total a été extrait en utilisant des conditions sans RNAse TRIZOL (Invitrogen) et 2 pg d'ARN a été transcrit de manière inverse avec 200 U de transcriptase inverse Superscript II (RT) (Invitrogen) en utilisant 500 ng d'oligo (dT) des amorces. Détermination expérimentale de la COX-2, c-myc et les niveaux d'ARNm CCND1 a été réalisée selon [33]. En bref, des ADNc ont été soumis à une PCR en temps réel dans un système iQ iCycler (Bio-Rad Laboratories). Chaque volume de réaction de 25 ul contenait une unité de platine Taq DNA polymerase (Invitrogen), 1 x tampon de réaction (Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, et KCl 50 mM), MgCl 1,5 mM _{2, 2,5 ug de BSA, 0,01% Glycérine , 200 uM de dNTP, 0.3X SYBR solution verte et 0,4 uM d'amorces spécifiques (voir tableau S1). Les conditions de PCR ont été établies comme suit: 90 secondes à 94 ° C, puis 30 cycles de 30 secondes à 94 ° C, 30 secondes à 62 ° C et 30 secondes à 72 ° C. Toutes les réactions ont été réalisées en triple exemplaire et les résultats obtenus pour chaque gène ont été normalisées à celles obtenues en parallèle avec β-actine. La qualité de l'ARN et des produits de PCR a été contrôlée au cours des expériences par électrophorèse sur des gels à 1% d'agarose, colorés avec du bromure d'éthidium.}

L'induction de la voie de signalisation /β-caténine

Wnt était induite sur le plan pharmacologique dans MKN45 cellules ensemencées dans des plaques de culture à 6 puits à raison de 80 à 90% de la confluence (à savoir 1, 2, 4 et 8 heures d'incubation), soit avec de 10 à 20 mM de LiCl (Sigma) ou de 5 à 10 mM d'acide valproïque (VA; Sigma) comme décrit précédemment [34], [35]. Ensuite, les cellules ont été recueillies pour l'extraction de l'ARNm et la détermination PCR en temps réel comme décrit ci-dessus. De même, MKN45 cellules ont été stimulées pendant 2 heures avec 200 et 400 ng /ml de protéine purifiée Wnt3a. Purification de Wnt3a a été réalisée comme décrit [36].

L'activité transcriptionnelle de

Activité de la COX2 promoteur du promoteur de COX2 a été mesurée dans 80-90% confluentes MKN45, AGS, WI38 et HEK293 les cellules ensemencées dans des plaques de culture à 6 puits. En bref, les cellules ont été co-transfectées en utilisant FUGENE (Roche) pour 24 avec le pCOX2-luciférase ou les reporters de pSuperTOPFlash et soit β-caténine actif constitutive (S33Y) [31] ou la dominante-négative ΔTCF4 [32] constructions. PRL-TK Renilla luciférase plasmide a été utilisé comme témoin interne. Luciole et de Renilla activités de luciférase ont été déterminées à l'aide du rapporteur Dual-Luciferase Assay (Promega) dans un instrument Victor-3 lecteur multidisques (Perkin Elmer) comme décrit précédemment [30]. les activités relatives de luciférase ont été exprimées en divisant l'activité de luciférase de luciole avec l'activité de la luciférase Renilla, pour chaque échantillon (N = 3, chaque produit en triple exemplaire).

immunoprécipitation de chromatine (ChIP) les essais

études ont été réalisées dans ChIP cellules MKN45 comme décrit précédemment [37]. La fraction de β-caténine nucléaire lié soit à des sites TBE I, II, III ou IV dans le promoteur de la COX-2 humaine a été immunoprécipité avec des anticorps anti β-caténine (Santa Cruz) et évalués par PCR en temps réel en utilisant des amorces spécifiques (tableau S1) . En outre, la fraction de l'ARN polymerase II (Pol II) et histones acétylées H3 et H4 (H3ac et H4ac) lié soit à la région TBE-II (-793 /-594) ou dans la région proximale (-118 /+ 62 ) du promoteur de COX2 a été similaire évalué (anti-Pol-II, Santa Cruz, H3ac et H4ac, Upstate). Comme témoin positif, nous avons utilisé le site TBE c-myc [38]. la spécificité des anticorps a été testé avec la normale de lapin IgG (Santa Cruz).

électrophorétique essai de décalage de mobilité (EMSA)

EMSA a été réalisée en utilisant des oligonucléotides contenant soit la séquence consensus TBE-II de type sauvage COX2 (voir le tableau S1) ou des séquences de TBE mutants précédemment rapportés [39]. Dans, de type sauvage bref et mutées oligonucléotides ^{32P marqués ont été incubés dans un tampon avec des extraits nucléaires de MKN-45 cellules de liaison pendant 30 min à 30 ° C. Par la suite, des complexes ADN-protéine ont été séparés des oligonucleotides libres sur un gel à 5% de Polyacrylamide non dénaturant. Après électrophorèse, le gel a été séché et exposé à un film pendant 1 jour. La visualisation des bandes radioactives ont été analysées par autoradiographie. oligonucléotides spécificité de liaison a été vérifiés par l'incubation des complexes de protéines-ADN en présence d'un excès de type sauvage non marqué ou muté [21], [39].}

L'analyse statistique

Chaque expérience a été répétée au moins trois fois avec trois répétitions. Les données sont montrées comme la moyenne ± écart-type. Des comparaisons multiples de groupes ont été effectuées par une ANOVA en utilisant le logiciel STATISTICA 9.0. P
<. 0,05 a été considérée comme significative

Résultats

expression de COX2 est en corrélation avec les niveaux β-caténine nucléaires dans les cellules du GC

Nous avons d'abord déterminé l'expression les niveaux de COX2 ARNm dans GC humaine lignées cellulaires MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII et AGS [40], [41], [42], ainsi que WI38 fibroblastes utilisés ici comme une lignée de cellules de contrôle [43], l'examen si elles étaient corrélées avec la signalisation Wnt /β-caténine. Comme cela est représenté sur la figure 1, de forts niveaux d'expression de la COX-2 ont été observées dès que 26 cycles d'amplification par PCR dans des lignées cellulaires métastatiques MKN45, et SNU16 KATOIII, ainsi que dans la lignée de cellules AGS qui est dérivée d'une tumeur primaire. Ce résultat est en accord avec les niveaux d'expression de COX2 détectés précédemment dans MKN45, KATOIII et les cellules AGS [44], [45], [46]. En revanche, les niveaux d'ARNm de la COX-2 ont été soit très faible dans les fibroblastes WI38 ou indétectable dans les cellules et N87 SNU1 (figure 1A), ce qui suggère que ce modèle différentiel d'expression ne sont pas en relation avec les stades métastatique ou au niveau de la transformation cellulaire. De manière remarquable, des niveaux β-caténine nucléaire étaient étroitement liées à l'expression de la COX-2, étant donné que des niveaux élevés de la protéine ont été observées dans les cellules MKN45, AGS, SNU16 et KATOIII, par rapport à la N87, SNU1 et WI38 cellules (figure 1B), ce qui implique un rôle de Wnt signalisation dans l'expression COX2 ARNm dans les cellules du GC.

Amélioration de l'expression COX2 via Wnt /β-caténine signalisation

afin d'examiner si la cascade Wnt est impliquée dans l'expression COX2, les cellules MKN45 étaient pharmacologiquement stimulées pendant différentes périodes de temps (par exemple 1, 2, 4 et 8 h) soit avec le lithium (LiCl) ou l'acide valproïque (VA), car les deux médicaments ont été précédemment montré pour moduler la signalisation Wnt via l'inhibition de l'activité de GSK3ß et donc l'augmentation nucléaire les niveaux de β-caténine [34], [35]. Chose intéressante, nous avons observé une amélioration marquée de l'expression de la COX-2 induite par mM LiCl 10 à 20 mM ou de 5 à 10 VA, qui a commencé peu de temps après l'incubation avec les composés, et qui a atteint un pic au bout de deux heures de traitement (figure 2A). détermination en temps réel des niveaux COX2 d'ARNm dans les cellules MKN45 traitées de manière similaire avec LiCl ou VA (2 h) indique que la COX-2 est significativement régulée vers le haut (figure 2B) et que cet effet a été mise en parallèle avec celle observée sur /β-caténine gènes cibles Wnt c-myc [47] et la cycline D1 [48]. Ensuite, afin d'exclure la possibilité que le phénomène observé reflète les effets non spécifiques des médicaments agissant sur les protéines affectant différentes cascades de signalisation, nous avons appliqué directement une protéine Wnt3a purifiée entièrement fonctionnelle à MKN45 cellules (voir Méthodes). Ces expériences montrent clairement que 2-400 ng /ml de Wnt3a significativement amélioré l'expression de COX2 d'ARNm purifié après une courte période d'incubation (Figure 2), ce qui explique en partie l'effet rapide de LiCl et VA et supportant une corrélation directe entre canonique Wnt /β-caténine l'activation et la stimulation de la transcription de COX-2 dans des cellules GC.

identification de nouveaux sites de TBE dans le promoteur du gène de la COX-2

des études antérieures ont indiqué qu'une /β-caténine site TBE sensible Wnt ( consensus de base: CTTTG) est situé à -1079 /-1074 pb en amont du site de début de transcription (TSS) du gène de la COX2 humaine [21] (site IV; la figure 3A, voir aussi la figure S1). En outre le balayage de la séquence en amont de 1600 pb du TSS [49] nous a permis d'identifier 3 nouveaux sites de TBE putatifs: -877 /-872 pb (site III; orientation sens), -689 /-684 pb et -318 /-313 pb (sites II et I, respectivement, à la fois dans une orientation anti-sens) (figure 3A), qui ne sont pas conservés entre des gènes de la COX-2 de souris (figure S1) et l'être humain. Nous avons donc clone le segment de 1600 pb du promoteur humain de la COX-2 (à pCOX2), y compris les quatre sites TBE, dans le vecteur pGL3-basic fusionné au gène de la luciférase pour être utilisés ultérieurement dans des dosages de rapporteur (figure 3A). De manière remarquable, en parallèle avec la transfection de 10 ng de cet assemblage dans MKN-45 et des cellules HEK293 ont révélé que pCOX2 affiche un (9 fois) l'activité significativement plus élevée de promoteur basale dans les cellules MKN45 (figure 3B et C). Nous avons émis l'hypothèse que cette plus grande activité de promoteur basal pCOX2 pourrait être liée à la teneur élevée en β-caténine nucléaire dans cette lignée cellulaire GC (figure 1B). Par conséquent, les cellules MKN45 et HEK293 ont été co-transfectées avec pCOX2 en présence de doses plus faibles d'une protéine active constitutive β-caténine (S33Y) [31]. Comme observé sur la figure 3, l'activité pCOX2 a en effet été renforcée dans les deux types de cellules, ce qui suggère que β-caténine peut se lier et activer des facteurs de transcription TCF /LEF sur les sites de TBE fonctionnels au sein du promoteur pCOX2.

Contribution de TBE des sites à activité promotrice de la COX-2 dans des cellules GC

Pour disséquer la contribution des Wnt /β-caténine sites TBE réagissant à l'activité de transcription du promoteur de la COX2 quatre suppressions pCOX2 constructions ont été générés: pCOX-1,2 (-1123 /+ 35 pb); pCOX-0,8 (-741 /+ 35 pb); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 pb); et pCOX-0.4 (-371 /+ 35 pb) (figure 4A). Ces constructions ont ensuite été analysés pour déterminer leur activité par des transfections transitoires dans les cellules AGS et MKN45, en utilisant les fibroblastes WI38 en tant que lignée cellulaire témoin. En accord avec les niveaux d'expression de la COX-2 endogène dans ces lignées de cellules GC (figure 1A), les suppressions de pCOX2 retenues différents niveaux d'activité dans les cellules AGS et MKN45 (figure 4B et C). En revanche, aucune activité de promoteur a été détectée dans les fibroblastes WI38 (figure 4D), même lorsque les doses de transfection dans ces cellules ont été augmentées 8 fois (à savoir entre 50 et 400 ng) (figure S2). Fait important, et en accord avec des rapports antérieurs [50], les cellules WI38 exprimés efficacement une construction luciférase rapporteur contenant le promoteur du gène p21 (figure S2), ce qui indique que dans ces cellules de contrôle le mécanisme moléculaire responsable de l'induction de la COX-2 transcription est inactive . D'autres expériences ont montré que la transfection dans les cellules AGS MKN45 et avec la construction pCOX2-0.8, qui a 859 pb supprimé du 1,6 Kb pCOX2 rapporteur (figure 4A), a entraîné une augmentation significative de l'activité du promoteur par rapport au rapporteur pCOX2-1.2 (figure 4A-C). Comme on a observé aucune différence significative entre le 1,6 Kb pCOX2 et constructions pCOX2-1.2 (Figure S3), on n'a pas d'effectuer des analyses à la plus grande construction plus loin. Surtout, pCOX2-0.8 représente le fragment de promoteur taille minimale présentant l'activité maximale de la base, étant donné en outre la suppression de l'une ou de 159 370 pb de l'extrémité 5 ', comme cela est le cas avec les constructions pCOX2-0.4 pCOX2-0.65 ou, respectivement , a diminué de plus de 2 fois les niveaux de pCOX2 activité basale. Ces résultats indiquent que la région comprise entre 0,8 et 0,65 kbp en amont du TSS du gène de la COX-2, et qui comprend un élément de réponse à nouveau TBE (TBE Site II, -689 /-684), peut être un élément clé au cours de la régulation de le niveau de base de l'expression du gène COX2 dans les cellules du GC.

la régulation positive de pCOX2-0.8 via Wnt /β-caténine signalisation

Nous avons ensuite examiné l'effet de la signalisation Wnt /β-caténine dans le roman site II TBE. Nous transfectées MKN45 cellules avec la construction pCOX2-0.8 rapporteur et co-exprimé la protéine β-caténine S33Y actif constitutive observer qu'il y avait une augmentation significative (2 fois) l'amélioration de l'activité transcriptionnelle de pCOX2-0.8. Cette augmentation de β-caténine à médiation était spécifique étant donné que la construction de pCOX2-0.4 n'a pas été stimulée en ce β-caténine surexpression état (figure 5A et B). Afin de contrôler la signalisation Wnt /β-caténine dans MKN45 cellules, nous avons utilisé le /β-caténine SuperTOPFLASH sensible (FTS) reporter Wnt transportant 12 copies d'un TBE en tandem [32], qui a été transfecté seul ou en présence du plasmide codant pour le mutant β-caténine protéine S33Y. Fait intéressant, tandis que la co-expression de la protéine mutante β-caténine S33Y dans les cellules MKN45 a pu mettre en valeur (1,9 fois) de l'activité du rapporteur STF, des niveaux élevés d'activité de STF de base ont été détectées en l'absence de la β-caténine mutante (figure 5C). Ce résultat est en accord avec nos résultats précédents de niveaux élevés de β-caténine nucléaire endogène dans ce type de cellule (voir la figure 1B), et confirme que ce facteur nucléaire est fonctionnel. Pour confirmer davantage cette constatation, nous avons effectué des expériences identiques dans les cellules HEK293 et ​​ont obtenu des résultats essentiellement similaires, bien que dans ce cas, on obtient une courbe dose-réponse claire quand pCOX2-0.8 a été transfecté en présence de concentrations croissantes de l'constitutivement active β-caténine S33Y protéine (figure S4). En outre, nous avons constaté que l'activité STF dans les cellules HEK293 a été très sensible aux niveaux du mutant de β-caténine exogène (figure S4C).

Pour explorer davantage les effets de la voie /β-caténine sur l'activité du pCOX2-0.8, nous avons réalisé des expériences de perte de fonction, avec une TCF4 dominante négative (ΔTCF) construire, qui code pour un facteur de transcription manque 30 résidus à partir de son extrémité amino-terminale et qui est incapable de se lier β-caténine [32] . Nous avons constaté que, dans les cellules MKN45 ΔTCF expression réduit les niveaux élevés de transcription de base pCOX2-0.8 d'une manière dépendante de la dose (figure 5D). Ce résultat confirme le rôle clé des facteurs de transcription TCF /LEF parmi les régulateurs de l'activité de la séquence promotrice de pCOX2-0.8, et plus favorable à l'idée que le TBE Site II (-689 /-684) est impliqué dans la réponse à Wnt /signalisation β-caténine.

Enfin, pour aborder directement le rôle du TBE site II en Wnt régulation /β-caténine médiée du promoteur COX2, nous avons introduit par mutagenèse dirigée d'un changement de 2 clés nucléotides de la séquence consensus du noyau TBE site II (c.-à-pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Ces changements ont été montré précédemment pour abolir la transcription Wnt /β-caténine médiée [39]. Des études de transfection transitoire ont révélé que la mutation du TBE Site II a diminué de manière significative (2-3 fois) l'activité basale de pCOX2-0.8 construire dans MKN45 cellules (Figure 5E) en comparaison avec le type sauvage promoteur pCOX2-0.8 construction. En outre, et en accord à nos résultats précédents, la mutation de ce site TBE II presque complètement bloqué β-caténine médiée par l'amélioration de l'pCOX2-0.8 construction (figure S4). Pris ensemble, ces résultats indiquent que le site II TBE (-689 /-684) est un élément fonctionnel dans le gène COX2 régulation de la transcription.

β-caténine se lie à la région promoteur du gène de la COX-2 contenant le Site II TBE

Parce qu'une conformation transcriptionnellement active de la structure de la chromatine se traduit par un niveau élevé d'acétylation des histones [51], nous avons précipités des fragments de chromatine réticulé (taille moyenne de 300 à 500 pb) a été isolé à partir de cellules MKN45 en utilisant des anticorps polyclonaux spécifiques pour les histones acétylées H3 et H4. De même, on a détecté la liaison de l'ARN polymerase II (Pol II) en tant que paramètre normalement associé à l'activité transcriptionnelle. Nous avons examiné l'enrichissement en les précipités de deux séquences de promoteur: la région promoteur proximale (PP) (-118 /+ 62 du TSS) et la région distale (-793 /-594) du promoteur de la COX-2 contenant le site consensus TBE II ( -689 /-684). En particulier, le TBE Site II a été la cible depuis les expériences précédentes ont indiqué une liaison préférentielle de β-caténine dans cette région de promoteur (Figure S5). Comme témoin positif, on a évalué la liaison au niveau du site TBE dans le promoteur du gène c-myc (-1447 /-1144 de TSS), qui a été précédemment décrite dans les cellules cancéreuses du côlon [38].

acétylée histones H3 et H4 et l'enzyme polymérase II se sont avérés se lier à l'intérieur de la région promoteur proximale (figure 6A), ce qui indique que la structure de la chromatine dans le promoteur de la COX2 dans MKN45 cellules se trouve dans une conformation ouverte, donc en accord avec nos résultats précédents montrant que le gène COX2 est transcrivait activement. En particulier, la protéine β-caténine a été immunoprécipitée à partir des échantillons MKN45 principalement en association avec la région promotrice de la séquence couvrant TBE -684 /-689 du gène COX2 (figure 6B). Ce facteur est pratiquement indétectable à la région du promoteur proximal, ce qui indique que la β-caténine endogène nucléaire est principalement recrutée pour le Site II TBE dans ces cellules GC. Comme prévu, le β-caténine endogène était similaire lié au site promoteur TBE c-myc, à des niveaux comparables à ceux observés dans le promoteur du gène COX2 (figure 6C).

Collectivement, ces expériences montrent que la TBE site II est directement impliqué dans la β-caténine médiée par l'activation transcriptionnelle du promoteur de COX2. Pour confirmer davantage ces résultats que nous avons effectués des essais de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) dans des extraits nucléaires de cellules MKN45. A cet effet, nous avons préparé 34 oligonucléotides à base de paires; un contenant de type sauvage -689 /-684 séquence TBE Site II (c.-à-CTACAAAGA; résidus soulignés représentant le noyau), et deux oligonucléotides contenant des mutations faux-sens soit dans le noyau de la TBE Site II (c.-à-CTACGAGGA: TBE-Mut1) ou dans la séquence flanquant (ie CGCCAAAGA: TBE-Mut2), tel que rapporté précédemment [21], [39]. Comme on le voit sur la figure 6D, la sonde de TBE de type sauvage radiomarquée était capable de former des complexes de protéines-ADN retardé lors d'une incubation avec des extraits nucléaires de cellules MKN45. Ces complexes protéine-ADN sont spécifiques puisque l'addition d'un excès d'oligonucléotides de type sauvage à froid (50 fois) considérablement inhibé la formation du complexe ADN-protéine (figure 6D, la piste 3 et 4, respectivement). La sonde radiomarquée mutant TBE-Mut1 était ni en mesure de former des complexes ADN-protéines sur son propre, ni de rivaliser avec l'oligonucléotide de type sauvage lorsqu'il est ajouté en excès comme une sonde froide (Figure 6D, couloir 5 et 6, respectivement). Des résultats similaires ont été obtenus lorsque la deuxième sonde TBE-Mut2 froid a été utilisé en tant que compétiteur (figure 6D, piste 7). Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que le nouveau site TBE II dans le promoteur de la COX-2 est impliquée dans l'activation de la transcription du gène de la COX-2 par le recrutement de la machinerie responsable de la transduction de la signalisation Wnt /β-caténine (figure 6E).

Discussion

des études antérieures ont suggéré un rôle pour la signalisation Wnt /β-caténine lors de l'apparition et /ou le développement de différents types de cancer par la modulation de l'expression du gène de la COX-2 [25]. Dans ce travail, nous avons présenté des preuves solides soutenant un rôle direct pour la signalisation Wnt /β-caténine dans le contrôle de l'expression COX2 dans les cellules du GC. Tout d'abord, nous avons montré qu'il existe une corrélation étroite entre l'expression de la COX-2 et la teneur nucléaire de β-caténine, qui semble être indépendante de l'une tumeur maligne ou d'un état des cellules CG de transformation. En second lieu, l'amélioration du temps et dose-dépendante de l'expression de COX2 a été observée juste après l'induction (2 h), soit avec des composés pharmacologiques mimant la signalisation Wnt /β-caténine. Troisièmement, les gènes des dosages de rapporteur évaluant l'activité du promoteur de la COX-2 en réponse à une intensité forte et la perte de fonction des expériences, comprenant une protéine β-caténine constitutivement actif et dominant négatif facteur TCF4 de transcription, démontrent que Wnt composants /β-caténine sont impliqués dans la régulation de la transcription du gène COX2

Nous avons également montré ici que dans les 2 kbp en amont du promoteur de COX2 humain, il existe quatre sites putatifs TBE. (core: CTTTG), dont l'un a été préalablement étudiées par Araki et cols [21], [28]. Grâce géniques des dosages de rapporteur avec les différentes constructions de deletion pCOX2 nous avons montré que pCOX2-0.8 affiche la plus forte activité de transcription basale dans les cellules AGS et GC MKN45. Fait intéressant, pCOX2-0.8 a maintenu le TBE Site-II (-689 /-684) l'intégrité indiquant sa contribution essentielle à la régulation de l'activité transcriptionnelle du gène COX2. Notamment, la pCOX2 complète TBE Site II signature (par exemple 5'-WWCAAAGS-3 '; S = C /G; W = A /T), ressemble au site de TCF optimal décrit par van de Wetering et cols. [52], qui a ensuite été utilisé pour identifier des cibles Wnt-transcriptionnel authentiques dans les gènes de la Drosophila nkd
et CG6234
[53].

Fonctionnalité de ce site TBE II a également été confirmée par nos études de mutagenèse. Ainsi, quand on muté la séquence de signature TBE dans la construction pCOX2-0.8 (MpCOX2-0.8), il a été constaté que l'activité du promoteur de la COX2 base a été affectée de manière significative dans les cellules MKN45. En outre, notre ChIP et EMSA analyses ont confirmé que β-caténine est préférentiellement recruté pour la région du promoteur -689 /-684 de COX2 dans les cellules du GC, à un niveau qui ressemble à celui trouvé au niveau du promoteur c-myc [38]. Cette interaction se produit préférentiellement sur cette région du promoteur du gène de la COX-2 comme aucune β-caténine se trouve à se lier à la région proximale du promoteur du gène de la COX-2. Au total, ces résultats indiquent que le site TBE II est un Wnt /β-caténine élément sensible fonctionnelle au sein du promoteur de la COX-2 humaine. Nos données, cependant, ne permet pas d'exclure la contribution des autres régions génomiques du gène COX2 humaine [21]. Au lieu de cela, nous proposons que dans les cellules GC un réseau complexe d'interactions est présent où le TBE Site II coopère avec d'autres éléments de réponse à réguler à la hausse l'expression de COX2.

Comme nos résultats dans les cellules du GC sont en accord avec ceux rapportés pour les cellules cancéreuses du côlon, il est tentant de spéculer que la signalisation Wnt /β-caténine pourrait être impliquée dans la régulation de la COX-2 est similaire dans d'autres tumeurs [21], [28]. En effet, modérée à taux de protéines forts de β-caténine peut être observé dans ca. 72% de tous les cancers analysés dans la base de données de tissus Protein Atlas humain [54]. De même, une forte coloration cytoplasmique à modérée de la COX2 et une réactivité membraneuse occasionnelle est observée dans 50% de tous les cancers, notamment colorectaux, de la prostate, du col utérin, de l'endomètre, urothélial, du pancréas, du foie et des cellules ganglionnaires provenant d'un tissu de tumeur gastrique.

• PLOS ONE: microARN Laissez-7f inhibitions Invasion tumorale et les métastases en ciblant MYH9 dans le cancer gastrique humain
• PLOS ONE: Sonic Hedgehog Pathway est essentielle pour le maintien du cancer des cellules souches-Like dans le cancer gastrique humain