Plos ONE: NT /β-Catenin signalizacijo Izboljša ciklooksigenaze-2 (COX2) transkripcijske aktivnosti želodčnega raka Cells

Povzetek

Ozadje

Povečano izražanje ciklooksigenaze-2 encima (COX2) je ena od glavnih značilnosti raka želodca (PK), ki je vodilni vzrok smrti v svetu, zlasti v Aziji in Južni Ameriki. Čeprav je bil /β-catenin signalizacijo pot NT vključeni v transkripcijske aktivacijo gena COX2, natančen mehanizem modulacijo ta odgovor še ni znan.

Metodologija /Glavne ugotovitve

Tu smo raziskovali transkripcijski ureditev gena COX2 v celičnih linijah GC in oceniti, ali je ta pojav modulirajo NT /β-catenin signalizacijo. Najprej smo preučila izražanje COX2 mRNA v GC celicah in ugotovila, da je razlika izraz vzorec v skladu z visokimi stopnjami jedrsko lokaliziran P-catenin. Farmakološko zdravljenje bodisi z litijem ali valprojske kisline in molekularne indukciji s prečiščenim kanonični Wnt3a bistveno izboljšano COX2 ekspresijo mRNA v od odmerka in časovno odvisni način. Serijska izbris 1,6 KBP COX2 fragmenta promotorja in gain- izid-of-funkcijo poskusih nam je omogočilo določiti minimalno NT /β-catenin odzivno regijo, sestavljeno iz 0,8 KBP promotorja COX2 (pCOX2-0.8), ki je pokazala maksimalni odziv v gen-reporterskih testih. Aktivnost tega pCOX2-0.8 promotorski regiji je nadalje potrdila kraja usmerjene mutageneze in DNA-vezave na beljakovine testih.

Sklepi /Pomen

sklepamo, da pCOX2-0.8 minimalno promotor vsebuje roman funkcionalno T-celični faktor /limfnega ojačevalec faktor (TCF /LEF) -response element (TBE stran II; -689 /-684), ki odgovarja neposredno k večji NT /β-catenin signalizacijo in ki so lahko pomembna za nastopom /napredovanje GC

Navedba. Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino M, De Ferrari GV (2011) NT /β-Catenin signalizacijo Izboljša ciklooksigenaze-2 (COX2) transkripcijske aktivnosti v želodcu rakavih celic. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10,1371 /journal.pone.0018562

Urednik: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Združene države Amerike

Prejeto: 5. november, 2010; Sprejeto: 11. marec 2011; Objavljeno: 6. april 2011

Copyright: © 2011 Nuñez et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je bil podprt s CTI raka, Programa Bicentenario en Ciencia y Tecnología (PBCT) - Comisión Nacional de Investigación CIENTIFICA y Tecnológica (CONICYT) številka nepovratna PBCT-6 od čilske vlade (MM in GVD). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je multifaktorska bolezen, značilna visoko malignih novotvorb v želodčni sluznici in predstavlja drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v svetu z največjo razširjenostjo v Aziji in Južni Ameriki [1], [ ,,,0],2] [3]. Okoljski povezani dejavniki tveganja so prehrana, uživanje snuff, debelost in Helicobacter pylori
okužba [4]. Več mutacije tumor-zaviralnih genov, vključno P53 adenomatozna polipoza coli (APC), E-kadherina in RUNX3 [3], [5], kot tudi v onkogeni kot k-ras, HER2 in beta-catenin [3], [6] [7], so bile dokumentirane v GC. Poleg tega, kot izražanja različnih genov je bila dokumentirana, vključno WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], in ciklooksigenazo 2 (COX2), encim, ki katalizira ključno korak v proizvodnji prostaglandina E2, ključni mediator skupnega vnetja [10], [11].

Prav tako je bilo ugotovljeno, da je izražanje gena COX2 v človeških adenokarcinomom želodca tkivu močno poveča, če ga primerjamo s parnih želodčnih osebkov sluzničnih brez rakavih celic [10 ]. Taka povečana izraz je predlagal, da vplivajo na intenzivnost invazije, velikost, bezgavkah, razvoj tumorjev in slabo prognozo [4], [12], [13]. V zvezi s tem velike količine podatkov, ki opisujejo kemo-preventivno in proti raku dejavnost nesteroidna protivnetna zdravila (NSAID), vključno s selektivnimi zaviralci COX2 kot potencialnih zdravil za zdravljenje GC [10] [11] [14].

transkripcijsko kontrolo gena COX2 odvisen od molekulske strojih stiku s promotorjem COX2, za katero se zdi, da je treba kontrolirati z delovanjem različnih signalnih poti [15], [16], [17]. Dejansko je bilo najprej ugotovljeno, da so CRE (-59 /-53), NF-IL6 (-132 /-124) in NF-κB (-233 /-214) konsenz sekvence v promotor COX2 potrebne za izražanje gen [16]. Kasnejše funkcionalne študije v promotor COX2 opredelil vrsto regulatornih elementov, ki sodelujejo v transkripcijo gena, vključno AP-1, AP-2, SP-1, C /EBPβ [18] [19] [20] in proteinov ki pripada faktor T-celic /limfatičnega ojačevalec faktor (TCF /LEF) družina transkripcijskih faktorjev, ki so ključnega pomena za NT /β-catenin signalov [21].

NT /β-catenin signalizacija pot je splošno priznana kot igrajo pomembno vlogo v človeški bolezni, zlasti na začetku in razvoju raka [22] [23] [24]. Zanimivo je, da so nedavne poskuse v GC pridobljene celice pokazale povezavo med COX2 izražanja in inhibicijo glikogen sintaza kinaza-3p (GSK3P) encimsko [25], ki je ključni NT komponento, ki fosforilira beta-catenin ter spodbuja njegovo kasnejšo razgradnjo prek proteasoma [26]. Razmerje med NT /P-catenin in COX2 izražanja v različnih modelih rakavih celic je podprto iz naslednjih študij. Najprej je bilo opaziti v mlečne epitela NT /β-catenin igrajo posreden učinek na COX2 prepisu, ki bi jih lahko posredovane s up-regulacijo posredniške faktorja PEA3 [27]. Drugič, v nasprotju s posrednim načinom delovanja, Araki in STOLPCEV. [21] poroča, da je v rakavih celicah debelega črevesa indukcijsko v COX2 izražanja skozi /vzdrževanega mehanizma β-catenin TCF, delno pa značilna za soglasje TCF /LEF vezno mesto (TBE: Jedro CTTTG) nameščen 1079 bp gorvodno od transkripcijske začetka mesto v promotor COX2. Tretjič je bilo ugotovljeno, da je pri bolnikih z rakom na debelem črevesu in pridobljenih celičnih linij povezava med prekomerno od NT-procesi, povezanih proteinov lef-1 in Pontin52 /TIP49a in up-regulacije COX2 izražanja [28]. Končno uporabo hondrocite, je bilo dokazano, da LEF-1, skupaj z beta-catenin, regulira COX2 izražanja ga direktno vezavo LEF-1 /β-catenin kompleksa v regiji 3'UTR genomski lokus COX2 [29] . Zato v tem trenutku ni jasno sliko o tem, ali je NT signalizacijo vključen v COX2 genske ekspresije, ali njegove vloge pri GC nastopom /napredovanje. Tukaj smo skušali razumeti, ali obstaja neposredna regulacija genskega izražanja COX2 preko NT /β-catenin signalizacijo in prepoznati regulatorne elemente NT /β-catenin v promotorski regiji COX2 gena, ki lahko upregulate COX2 transkripcijo v GC celicah.

materiali in metode

celice in pogoji kultiviranja

človekove celične linije MKN45 (japonski zbirka raziskovalnih BioResources, Japonska), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 in HEK293 (ameriški tip Culture Collection, Rockville, MD) so bile uporabljene v tej študiji. MKN45, N87, SNU1 in KATOIII celice gojimo v RMPI medijih (Gibco); AGS v F12K mediju (Hyclone); WI38 v EMEM (Gibco); in HEK293 v DMEM (Gipco). Gojišča je dopolnjen z 10% FBS (Gibco) (AGS z 20%) in 1% penicilina /streptomicina. Celične linije so se ohranili pri 37 ° C v 5% CO _{2 in nasičeno vlažnost.}

plazmidi in mestu usmerjena mutageneza

SuperTOPFlash-luciferaza in PRL-TK renilla- luciferazne plazmidi [30], sestavni aktivne β-catenin (S33Y) [31] in prevladujoč negativni ΔTCF4 izraz plazmidi [32] je bilo prej opisano. Himerno COX2 promotor-luciferazne fragmenti so bili ustvarjeni s PCR iz humane genomske DNA z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov, ki vsebujejo restrikcijska mesta in nato vstavijo v pGL3-Basic vektor (Promega). Mutacije v mestu TBE-II (-689 /-684) promotorja COX2 so bili ustvarjeni s pomočjo začetnih oligonukleotidov pCOX-0,8-TBEMUT s položajno usmerjeno mutagesis komplet QuickChange (Stratagene). Konstrukti so bili preverjeni z neposrednim sekvenciranje (ABI-3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Primerji sekvence so opisane v Tabeli S1.

semikvantitivnimi in Real Time RT-PCR

Total RNA je bila vzeta v RNaze prosto pogojih z uporabo TRIzola (Invitrogen) in 2 ig RNA smo reverzno prepisana z 200 U nadpisano II reverzne transkriptaze (RT) (Invitrogen) z uporabo 500 ng oligo (dt) primerji. Eksperimentalno določanje COX2, c-myc in ravni CCND1 mRNA je bila izvedena v skladu s [33]. Na kratko, cDNA izpostavljeni PCR v realnem času v iCycler iQ sistema (Bio-Rad Laboratories). Vsaka 25 ul reakcijski volumen je vsebovala 1 enoto za platina Taq DNA polimeraze (Invitrogen), 1X reakcija varovalnem (20 mM Tris-HCI pH 8,4, in 50 mM KCl), 1,5 mM MgCl _{2, 2,5 ug BSA, 0,01% glicerol 200 LM od dNTP, 0.3X SYBR Green rešitev in 0,4 uM specifičnih oligonukleotidov (glej preglednico S1). Pogoji PCR so bili določeni takole: 90 sekund pri 94 ° C in nato 30 ciklov po 30 sekund pri 94 ° C, 30 sekund pri 62 ° C in 30 sekund pri 72 ° C. Vse reakcije smo izvedli v treh izvodih in dobljene rezultate za vsak gen smo normalizirali na tiste, pridobljene v vzporedno s P-aktina. Kakovost RNA in PCR izdelkov smo spremljali skozi poskuse z elektroforezo na 1% agaroznem gelu, obarvanega z etidijevim bromidom.}

Indukcija v /β-catenin signalne poti NT

NT signalizacija je bila farmakološko inducira v MKN45 nasajenih celic v kulturi ploščah 6 ter na 80-90% izliva (tj 1, 2, 4 in 8 h inkubacije) bodisi s 10-20 mm LiCl (Sigma) ali 5-10 mM valproinske kisline (VA, Sigma), kot je opisano predhodno [34], [35]. Nato smo celice zbrali za ekstrakcijo mRNA in realnega določanje časa PCR, kot je opisano zgoraj. Podobno so MKN45 celice stimulirane 2 uri pri 200 in 400 ng /ml očiščenega proteina Wnt3a. Čiščenje Wnt3a bila izvedena, kot je opisano v [36].

Transkripcijska dejavnost COX2 pobudnikom

aktivnost promotorja COX2 je bila izmerjena v 80-90% konfluentne MKN45, AGS, WI38 in HEK293 celice zasejemo v 6 dobro kulture plošč. Na kratko, je bilo sodelovanje transfekcijo FUGENE (Roche) za 24 s pCOX2-luciferaze ali pSuperTOPFlash novinarji in bodisi konstitutivni aktivno beta catenin (S33Y) [31] ali dominantno negativnih ΔTCF4 [32] konstrukte celice. PRL-TK renilla luciferazo plazmid je bil uporabljen kot notranje kontrole. Firefly in renilla luciferazne aktivnosti so bile določene z uporabo Dual-luciferaza Reporter testom (Promega) v Victor-3 bralnika večploščnimi instrumenta (Perkin Elmer), kot je bilo prej [30] opisano. Relativni luciferazne aktivnosti so izrazili tako, firefly luciferazno aktivnost z renilla luciferazne aktivnosti za vsak vzorec (N = 3, vsak v treh izvodih).

kromatina imuno (čip) teste

Raziskave čip so bile izvedene v MKN45 celice, kot je opisano zgoraj [37]. Frakcija jedrske beta catenin vezan bodisi TBE Sites I, II, III ali IV v promotorja humanega COX2 smo imunoprecipitirali z anti β-catenin protitelesa (Santa Cruz) in ocenili v realnem času PCR z uporabo specifičnih primerjev (tabela S1) . Poleg tega je frakcija RNA polimeraze II (Pol-II) in acetiliranih histones H3 in H4 (H3ac in H4ac) vezan bodisi regijo TBE-II (-793 /-594) ali proksimalnega regijo (-118 /+ 62 ) predlagatelja COX2 je podobno ocenil (anti-Pol-II, Santa Cruz; H3ac in H4ac, podeželju). Kot pozitivno kontrolo smo uporabili TBE mesto c-myc [38]. Protitelesa specifičnost smo testirali z normalnim kuncev-IgG (v Santa Cruz).

Elektroforetskimi premik mobilnosti test (EMSA)

EMSA je bila izvedena z uporabo oligonukleotidov, ki vsebujejo bodisi TBE-II konsenzno sekvenco divjega tipa COX2 (glej preglednico S1) ali predhodno poročali mutant klopnemu meningoencefalitisu zaporedja [39]. V kratkem, divjega tipa in mutirani ^{32P-označenih oligonukleotidov inkubiramo v vezavnem pufru z jedrskimi ekstraktov MKN-45 celice 30 minut pri 30 ° C. Pozneje smo Kompleksi DNK-protein ločimo od prostih oligonukleotidov na 5% ne denaturirajočimi poliakrilamidnem gelu. Po elektroforezi je bil gel posušen in izpostavljena filmski 1 dan. Vizualizacija radioaktivnih pasov smo analizirali z avtoradiografijo. Vezavo specifičnost bila preverjena z inkubacijo DNA proteinske komplekse v prisotnosti prebitka neoznačenega divjega tipa ali mutirane oligonukleotidi [21], [39].}

Statistična analiza

Vsak poskus smo ponovili vsaj trikrat s tremi ponovitvami. Podatki so prikazani kot povprečje ± SD. primerjavo več skupin smo izvedli v enosmerno ANOVA s programom statistica 9.0. P
. ≪ 0.05 je zdelo pomembno

Rezultati

COX2 izraz povezana z ravnmi jedrskih β-catenin v GC celicah

Najprej smo določene izraz ravni COX2 mRNA v človeški GC celičnih linij MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII in AGS [40] [41] [42], kot tudi WI38 fibroblastov, ki se uporabljajo tukaj nadzor celične linije [43], pri čemer preučuje ali so povezana z NT /β-catenin signalizacijo. Kot je prikazano na sliki 1, smo opazili močan ravni COX2 izražanja že po 26 ciklih pomnoževanje v metastaznih celičnih linijah MKN45, SNU16 in KATOIII, in tudi v celični liniji AGS, ki izhaja iz primarnega tumorja. Ta rezultat je v skladu z ravnmi COX2 izražanja prej odkritih v MKN45, KATOIII in AGS celic [44] [45] [46]. V nasprotju s tem so bile vrednosti COX2 mRNA bodisi v WI38 fibroblastov zelo nizko ali nezaznavno v N87 in SNU1 celic (slika 1A), kar kaže, da je ta razlika vzorec izražanja ni povezana z metastatskim stopnje ali raven transformacije celic. Zanimivo je, da so bile stopnje jedrske β-catenin tesno povezana s COX2 izražanja, saj so bili v MKN45, AGS, SNU16 in KATOIII celic opazili visoke koncentracije proteina, v primerjavi z N87, SNU1 in WI38 celic (slika 1B), kar pomeni vlogo za NT signalizacijo v COX2 ekspresijo mRNA v GC celicah.

Krepitev COX2 izražanja prek NT /beta-catenin signalizacijo

da, da preuči, če je NT kaskadni vključeni v COX2 izražanja, so MKN45 celice farmakološko stimulirani za različna obdobja (tj 1, 2, 4 in 8 h) bodisi litija (LiCl) ali valproinske kisline (VA), saj sta bili obe zdravili prej pokazali, da modulira NT signalizacije preko inhibicije GSK3P aktivnosti in s tem povečuje jedrske raven beta-catenin [34], [35]. Zanimivo je, da smo opazili izrazito povečanje COX2 izražanja 10-20 mM LiCl ali 5-10 mM VA inducirano, ki se je začelo kmalu po inkubaciji z spojin, ki je bila največja po dveh urah zdravljenja (slika 2A). določitev realnem času ravni COX2 mRNA v MKN45 celic podobno, zdravljenih z LiCI ali VA (2 h), je pokazala, da je bil COX2 močno reguliran (slika 2B), in da je ta učinek se je vzporedno s tisto, ki velja na NT /β-catenin ciljnih genov c-myc [47] in ciklin D1 [48]. Dalje, da se izključi možnost, da je opaziti pojav kaže nespecifične učinke zdravil, ki delujejo na beljakovine, ki vplivajo na različne signalne kaskade, smo neposredno uporabljajo popolnoma funkcionalen očiščeno Wnt3a beljakovine MKN45 celic (glej metode). Ti poskusi so jasno pokazali, da je 200-400 ng /ml očiščenega Wnt3a bistveno izboljšano izražanje COX2 mRNA po kratkih obdobjih inkubacije (slika 2), delno pojasnjuje hiter učinek LiCI in VA in podporo neposredno povezavo med kanonične NT /P-catenin aktiviranje in spodbujanje COX-2 prepisu v GC celicah.

Identifikacija novih klopnega meningoencefalitisa mest v promotor COX2 gena

Prejšnje študije so pokazale, da je /β-catenin odziven TBE stran NT ( soglasje jedro: CTTTG) se nahaja na -1079 /-1,074 bp navzgor od transkripcijske začetnem mestu (TSS) človeškega COX2 gen [21] (stran IV, slika 3A, glej tudi sliko S1). Nadaljnje skeniranje zaporedja nabavnem 1600 bp iz TSS [49] nam je omogočilo, da prepoznajo 3 nove domnevna mesta klopnega meningoencefalitisa: -877 /-872 bp (Stran III; sense), -689 /-684 bp in -318 /-313 bp (Sites II in I, oziroma, tako v protismiselni usmeritvi) (slika 3A), ki niso ohranjeni med človeškimi in mišje COX2 genov (Slika S1). Zato smo klonirali v 1600 bp segment od COX2 promotor človeškega (pCOX2), vključno z vsemi štirimi TBE mestih, v pGL3-bazni vektor zlit na gen luciferaze, ki se nato uporabi v reporter testih (slika 3A). Zanimivo je, da vzporedno transfekciji 10 ng tega konstrukta v MKN-45 in HEK293 celice, je pokazala, da pCOX2 prikaže bistveno višje (9-krat) bazalno promotor dejavnost MKN45 celic (slika 3B in C). Domnevali smo, da bi se ta višja pCOX2 bazalnih aktivnost promotorja povezane s povišano vsebnostjo jedrskega beta catenin v tem GC celični liniji (slika 1B). Zato MKN45 in HEK293 celice smo sočasno transfektirali z pCOX2 v prisotnosti nižjih odmerkov konstitutivni aktivne β-catenin proteina (S33Y) [31]. Kot je opaziti na sliki 3, je pCOX2 dejavnost dejansko okrepila v obeh vrstah celic, kar kaže, da beta-catenin lahko veže in potem aktivirati TCF /lef transkripcijske faktorje na funkcionalnih klopnega meningoencefalitisa strani v promotorja pCOX2.

Prispevek klopnega meningoencefalitisa strani, na COX2 promotorja dejavnosti v GC celicah

Če želite razklati prispevek NT /β-catenin odziven klopnega meningoencefalitisa mestih na transkripcijske aktivnosti promotorja COX2 bili ustvarjeni štirje pCOX2 delecij konstrukti: pCOX-1.2 (-1123 /+ 35 bp); pCOX-0,8 (-741 /+ 35 bazičnih točk); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 bazičnih točk); in pCOX-0,4 (-371 /+ 35 bp) (slika 4A). Ti konstrukti so bili nato testirali na njihovo dejavnost prek prehodnih transfekcije v MKN45 in AGS celic, s pomočjo WI38 fibroblaste kot nadzor celične linije. V skladu z ravni endogenega COX2 izražanja v teh GC celičnih linij (slika 1A), pCOX2 izbrisi hranijo različne stopnje aktivnosti v MKN45 in AGS celic (slika 4B in C). V nasprotju s tem pa ni bila odkrita promotorsko aktivnostjo v WI38 fibroblastov (slika 4D), čeprav so bili transfekcijske doze v teh celicah poveča 8-krat (tj 50-400 ng) (Slika S2). Pomembno je, da v dogovoru s prejšnjih poročilih [50], WI38 celice učinkovito izrazili luciferaza-reporterski konstrukt, ki vsebuje promotor p21 gena (slika S2), kar kaže, da je molekulska stroji odgovoren za indukcijo COX2 prepis je v teh kontrolnih celicah ni aktiven . Nadaljnji poskusi pokazala, da transfekciji v MKN45 in AGS celice z pCOX2-0.8 konstrukt, ki ima 859 bp izbrisano iz 1,6 Kb pCOX2 reporter (slika 4A), povzročila znatno povečanje aktivnosti promotorja v primerjavi z pCOX2-1.2 reporter (Slika 4A-C). Kot je med 1,6 Kb pCOX2 in pCOX2-1.2 konstruktov (Slika S3) niso opazili bistvenih razlik, nismo izvajali dodatne analize z večjo konstrukt. Pomembno je, da pCOX2-0.8 predstavljala minimalno velikost promotor fragment ima tako najvišjo bazalne aktivnosti, saj nadaljnje izbrisa bodisi 159 ali 370 bp od 5'-konca, kot je to primer pri pCOX2-0.65 ali pCOX2-0.4 konstruktov, oziroma zmanjšal več kot 2-krat na ravni pCOX2 bazalne aktivnosti. Ti rezultati kažejo, da regija giblje med 0,8 in 0,65 KBP gorvodno od TSS gena COX2, in ki vključuje odzivni roman TBE element (TBE stran II; -689 /-684), je lahko ključni element pri urejanju bazalni nivo COX2 izražanja genov v GC celicah.

uravnavanjem pCOX2-0.8 preko NT /beta-catenin signalizacijo

Naslednja preučila vpliv NT /β-catenin signalizacijo na romana TBE Site II. transfekcije smo MKN45 celice pCOX2-0.8 novinar konstrukta in sodelovanje izrazil konstitutivno aktivne β-catenin S33Y protein je navedla, da je prišlo do znatnega (2-krat) krepitev transkripcijske aktivnosti pCOX2-0.8. Ta β-catenin posredovana povečanje je specifična saj pCOX2-0.4 konstrukt ni spodbudila tem beta catenin prekomerno ekspresijo naprava (slika 5A in B). Za nadzor za NT /β-catenin signalizacijo v MKN45 celic smo uporabili /β-catenin odziven SuperTOPFLASH (STF) novinar NT nosi 12 kopij klopnega meningoencefalitisa v tandemu [32], ki je bil transfektirali sam ali v prisotnosti plazmida kodiranja za mutant β-catenin S33Y beljakovin. Zanimivo je, da medtem ko je bila sočasno ekspresijo z mutiranim β-catenin S33Y proteina v MKN45 celic sposobna za izboljšanje (1,9-krat) dejavnost STF reporterja, so bile ugotovljene visoke vsebnosti bazalnih STF aktivnost v odsotnosti mutiranega P-catenin (slika 5C). Ta rezultat je v skladu z našimi prejšnjimi ugotovitvami visoke ravni endogenega jedrske beta catenin v tem celic tipa (glej sliko 1B), in potrjuje, da je ta jedrska dejavnik funkcionalna. Nadalje potrjujejo to ugotovitev, smo izvedli enake poskuse v HEK293 celicah in dobljene v bistvu podobne rezultate, čeprav je v tem primeru je jasno krivulja doza-odziv dobimo, če je pCOX2-0.8 transfektirali v prisotnosti rastočih koncentracij za konstitutivno aktivne beta-catenin S33Y proteina (slika S4). Poleg tega smo ugotovili, da je STF dejavnost HEK293 celicah zelo odziven na ravni eksogeno mutantov beta-catenin (slika S4C).

Da bi še dodatno raziskati učinke NT /β-catenin poti na dejavnost od pCOX2-0.8 smo izvedli za izgubo funkcije poskuse s prevladujočim negativnim TCF4 (ΔTCF) konstrukt, ki kodira transkripcijski faktor primanjkuje 30 ostanke svoje amino-terminalu in da ne more, da se veže beta-catenin [32] . Ugotovili smo, da v MKN45 celice ΔTCF izraz zmanjšala visoka stopnja pCOX2-0.8 bazalnih prepisu na način, ki je odvisen od (Slika 5D). Ta rezultat potrjuje ključno vlogo TCF /lef transkripcijskih faktorjev med regulatorji aktivnosti zaporedja pCOX2-0.8 promotorja, in še naprej podpira idejo, da se TBE stran II (-689 /-684) je vključen v odgovoru na NT /β-catenin signalizacijo.

na koncu bi neposredno obravnavala vlogo TBE strani II v NT /β-catenin posredovana uravnava promotor COX2, smo uvedli z usmerjeno mutagenezo spremembo v 2 ključa nukleotidov v soglasju zaporedje jedra TBE stran II (tj pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Te spremembe so se že pokazale, da odpravi NT /β-catenin povzročenega prepisa [39]. Prehodne študije transfekciji pokazala, da mutacija na KME strani II bistveno zmanjšal (2-3 krat) bazalni dejavnost pCOX2-0.8 gradnjo v MKN45 celic (slika 5e) v primerjavi z divjim tipom pCOX2-0.8 promotorja konstrukt. Poleg tega in v dogovoru z našimi prejšnjimi rezultati, mutacija tega KME mestu II skoraj popolnoma blokiran β-catenin posredovano krepitev pCOX2-0.8 konstrukta (slika S4). Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da je TBE stran II (-689 /-684) funkcionalna komponenta COX2 genov transkripcijske uredbe.

β-catenin veže na COX2 gen promotorja regiji, ki vsebuje TBE Site II

Ker je transkripcijsko aktivno konformacijo kromatina strukture odražajo zvišane ravni histon acetiliranjem [51], smo oborili premreženih kromatina fragmente (povprečna velikost 300-500 bp) izolirane iz MKN45 celic z uporabo poliklonalna protitelesa specifična za acetiliranega histones H3 in H4. Podobno smo ugotovili vezavo RNA polimeraze II (Pol II) kot parameter običajno povezujemo z transkripcijsko aktivnostjo. Proučili smo bogati z naših izločkov dveh promotorja sekvenc: na proksimalni promotor (PP) regijo (-118 /+ 62 od TSS) in distalni regiji (-793 /-594) o COX2 promotorja, ki vsebuje soglasje TBE stran II ( -689 /-684). Zlasti je TBE strani II usmerjena od prejšnjih poskusov navedeno preferenčno vezave beta catenin te promotorsko regijo (slika S5). Kot pozitivno kontrolo smo ocenili vezavo na mestu TBE v promotor c-myc gena (-1447 /-1,144 iz TSS), ki je bil prej opisanem v rakavih celicah debelega črevesa [38].

Acetiliran histona H3 in H4 in encim polimerazo II je bilo ugotovljeno, da se veže v proksimalnega promotorja regiji (slika 6A), kar kaže, da je kromatin struktura okoli promotor COX2 v MKN45 celic v odprtem zgradbe, tako v dogovoru z našimi prejšnjimi rezultati dokazujejo, da gen COX2 aktivno prepisovanja. Predvsem je β-catenin protein imunoprecipitirali iz MKN45 vzorcev predvsem v povezavi z promotorski regiji segajo na -684 /-689 TBE sekvenco v COX2 gena (slika 6B). Ta dejavnik je bil skoraj nezaznavno na proksimalnem promotorja regiji, kar pomeni, da je endogeni jedrska β-catenin predvsem zaposlili na TBE stran II v teh GC celicah. Kot je bilo pričakovati, je endogeni β-catenin podobno vezan na c-myc promotor KME mestu, na ravneh, ki so primerljiva s tistimi v COX2 promotor gena (slika 6c).

Kolektivno, ti poskusi kažejo, da je TBE Site II je neposredno vključen v β-catenin posredovana transkripcijske aktivacijo promotorja COX2. Da bi še dodatno potrditev teh rezultatov smo opravili elektroforetske premik mobilnost teste (EMSA) v jedrskih izvlečki MKN45 celic. V ta namen smo pripravili 34-temeljijo seznanjene oligonukleotide; ena, ki vsebuje divjim tipom -689 /-684 TBE stran II zaporedja (tj CTACAAAGA; ostanki poudarjeno, ki predstavlja jedro), in dva oligonukleotidi, ki vsebujejo missense mutacij niti v jedru TBE strani II (tj CTACGAGGA: KME-MUT1) ali v spremljajočih zaporedju (npr CGCCAAAGA: TBE-MUT2), kot je bilo že poročali [21], [39]. Kot je prikazano na sliki 6D je radioaktivno sonda TBE divjega tipa sposoben, da se tvori retardirane DNA-proteinskih kompleksov, ko so inkubirani z jedrskimi izvlečki iz MKN45 celic. Ta protein-DNA kompleksi so bili specifično ker dodatek prebitka hladnih oligonukleotidov divjega tipa (50-kratnih) drastično inhibiramo tvorbo DNA-proteinskega kompleksa (Slika 6D, liniji 3 in 4, v tem zaporedju) o. Mutant radioaktivno označenega TBE-MUT1 sonda ni bila niti sposobna oblikovati DNA-proteinskih kompleksov sama, niti tekmovati z divjim tipom oligonukleotida je, kadar so dodani presegajo kot hladno sondo (slika 6d, lane 5 in 6, v tem zaporedju). Podobne rezultate smo dobili, ko je bila druga hladno TBE-MUT2 sonda uporablja kot konkurent (Slika 6D, proga 7). Skupaj, ti rezultati kažejo, da je roman TBE Stran II v promotor COX2 vključeni v transkripcijske aktivacijo gena COX2 z zaposlitvijo strojev, odgovoren za transdukcijo NT /β-catenin signalizacijo (slika 6E).

Pogovor

Predhodne študije so predlagale vlogo NT /β-catenin signalizacijo med začetkom in /ali razvoj različnih vrst raka z moduliranjem ekspresije gena COX2 [25]. V tem delu smo predstavili močne dokaze, ki podpirajo neposredno vlogo NT /β-catenin signalizacijo pri nadzoru COX2 izražanja v GC celicah. Najprej smo pokazali, da obstaja tesna korelacija med COX2 izražanja in jedrsko vsebnosti beta-catenin, za katero se zdi, da je neodvisen od bodisi maligne bolezni ali stanja transformacije CG celic. Drugič, je kmalu opazili časovno in od odmerka odvisno povečanje COX2 izražanja po indukciji (2 h) bodisi z farmakološkimi spojinami posnemanjem NT /β-catenin signalizacijo. Tretjič, reporterski gen testi vrednotenje dejavnosti COX2 promotor v odgovor na gain- in izpadu funkcijo poskusi, tudi konstitutivno aktivne β-catenin beljakovin in prevladujočega negativnega TCF4 transkripcijski faktor, dokazati, da so NT /β-catenin deli sodelujejo pri transkripcije regulacija gena COX2

pokazali smo, tudi tukaj, da so v 2 KBP pred promotor človeškega COX2 štirje domnevni strani klopnemu meningoencefalitisu. (core: CTTTG), od katerih je ena je bila že raziskovali s Araki in Zbirke [21], [28]. Skozi reporterski gen preizkuse z različnimi pCOX2 izbrisa konstruktov smo pokazali, da pCOX2-0.8 prikaže najvišjo bazalno transkripcijske aktivnosti v GC celicah MKN45 in AGS. Zanimivo je, da pCOX2-0.8 ohranila TBE Site-II (-689 /-684) integritete kaže svojo ključno prispeval k ureditvi transkripcijske aktivnosti gena COX2. Predvsem je popolna pCOX2 TBE stran II podpis (tj 5'-WWCAAAGS-3 '; S = C /G, W = A /T), spominja optimalno TCF mesto, ki ga van de Wetering in STOLPCEV opisan. [52], ki je bila kasneje uporabljena za identifikacijo resničnih NT-transkripcijske cilje v Drosophila
genov NKD
in CG6234
[53].

funkcionalnost tega KME strani II je bila potrjena tudi z našimi mutageneze študij. Tako, ko smo mutirana zaporedja TBE-podpisa v pCOX2-0.8 konstrukta (MpCOX2-0.8), je bilo ugotovljeno, da je bazalna COX2 promotorsko aktivnostjo znatno vplivala na MKN45 celicah. Poleg analize naš čip in EMSA je potrdil, da je β-catenin prednostno zaposli na -689 /-684 COX2 promotorja regiji GC celicah, na ravni, ki spominja, da je na voljo na promotor c-myc [38]. Kot interakcija prednostno poteka na tem območju promotor gena COX2 saj ne najde β-catenin da se veže na proksimalnem promotorski regiji gena COX2. Skupaj ti rezultati kažejo, da je TBE stran II funkcionalna NT /β-catenin odziven element v promotor človeškega COX2. Naši podatki kljub temu ne izključuje prispevek drugih genomskih regij v COX2 gena prehrano [21]. Namesto tega predlagamo, da se v GC celicah kompleksen preplet interakcij prisotna, kadar TBE stran II sodeluje z drugimi elementi za odzivanje na up-urejanje COX2 izraz.

Ker so naši rezultati v GC celic v soglasju s tistim za raka debelega črevesa celic je skušnjava, da špekulirajo, da bi lahko NT /β-catenin signalizacijo podobno sodeluje pri regulaciji COX2 v drugih tumorjev [21], [28]. Dejansko lahko zmerne do močne koncentracije proteina beta-catenin treba upoštevati v ca. 72% vseh rakov analiziranih v bazi beljakovin tkiva Human Atlas [54]. Prav tako močno do zmerno citoplazemske COX2 madeže in občasno membranskih odzivnost so opazili pri 50% vseh, vključno z rakom debelega črevesa, prostate, materničnega vratu, endometrija, urotelijskim, trebušne slinavke, jeter in žleznih celic iz želodca tumorsko tkivo.

• Plos ONE: MicroRNA Naj-7f zavira Tumor Invasion in metastaz z usmerjanjem MYH9 v človeške želodčne raku
• Plos ONE: Sonic Hedgehog Pathway je bistvenega pomena za vzdrževanje rakavih matičnih-Like celice v humani Rak želodca