PLoS One: Wnt /β-Catenin Jelzés Javítja a ciklooxigenáz-2 (COX2) transzkripciós aktivitást gyomorrákban Cells

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

fokozott expressziója a ciklooxigenáz-2 enzim (COX2) az egyik fő jellemzője a gyomorrák (GC), amely a világ egyik vezető halálok a világon, különösen Ázsiában és Dél-Amerikában. Bár a Wnt /β-catenin jelátviteli részt vett a transzkripciós aktiválása a COX2 gén, a pontos mechanizmus moduláló ezt a választ még nem ismert. Katalógusa

Módszertan /fő eredményei katalógusa

Itt tanult transzkripciós szabályozása a COX2 gén GC sejtvonalak és értékelte, hogy ez a jelenség által modulált Wnt /β-catenin jelátvitel. Mi először megvizsgálta a kifejezés a COX2 mRNS GC sejtekben, és megállapította, hogy van egy differenciális expressziós mintázata megfelel a magas szintű nukleáris lokalizált β-catenin. Farmakológiai páciensek vagy lítium vagy valproinsav és a molekuláris indukció tisztított kanonikus Wnt3a jelentősen továbbfejlesztett COX2-mRNS expresszióját a dózis- és időfüggő módon. Soros törlését egy 1,6 kbp COX2 promoter fragmenst és gain- vagy veszteség-of-function kísérletek tette számunkra, hogy azonosítani minimális Wnt /β-catenin reagáló régiót tartalmaz 0,8 kbp a COX2 promóter (pCOX2-0.8), amely azt mutatta, maximális válasz gén-riporter vizsgálatokban. A tevékenység e pCOX2-0.8 promoter régió alátámasztotta helyspecifikus mutagenezissel és DNS-fehérje kötési esszékben.

Következtetések /Jelentősége

arra a következtetésre jutunk, hogy a pCOX2-0.8 minimális promotert tartalmaz egy új funkcionális T-sejt-faktor /lymphoid fokozó faktor (TCF /LEF) -válasz elem (TBE webhelyről II; -689 /-684), amely közvetlenül reagál a továbbfejlesztett Wnt /β-catenin jelátvitel, és amely fontos lehet a kezdeti /progresszió GC. katalógusa

Citation: Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino M De Ferrari GV (2011) Wnt /β-catenin Jelzés Javítja a ciklooxigenáz-2 (COX2) transzkripciós aktivitást gyomorrákban Cells. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10,1371 /journal.pone.0018562 katalógusa

Szerkesztő: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: november 5, 2010; Elfogadva: március 11, 2011; Megjelent: április 6, 2011 katalógusa

Copyright: © 2011 Nuñez et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatott CTI-rák, Programa Bicentenario en Ciencia y Tecnología (PBCT) - Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT) támogatási szám PBCT-6 a chilei kormány (MM és GVD). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák (GC) multifaktoriális betegség, amelyre jellemző az igen malignus daganatok a gyomor nyálkahártyájának, illetve a második vezető daganatos halálok világszerte a legmagasabb előfordulási Ázsiában és Dél-Amerikában [1], [ ,,,0],2], [3]. Környezeti kapcsolódó kockázati tényezők közé tartozik a táplálkozás, tubák fogyasztás, az elhízás és a Helicobacter pylori fertőzés katalógusa [4]. Számos mutációk tumor-szuppresszor gének, beleértve a P53, adenomatózus polyposis coli (APC), E-cadherin és RUNX3 [3], [5], valamint a onkogének, mint a K-ras, HER2 és β-catenin, [3] [6], [7], dokumentálták GC. Ezen túlmenően, több mint különböző gének expresszióját leírták, beleértve WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], és a ciklooxigenáz 2 (COX2) enzim, amely katalizálja a döntő lépés a termelés a prosztaglandin E2, kulcsfontosságú közvetítő ízületi gyulladás [10], [11].

Azt is megfigyelték, hogy a kifejezés a COX2 gén jelentősen nőtt a humán gyomor adenokarcinóma szövetek, ha összehasonlítjuk a párosított gyomornyálkahártya példányok mentes a rákos sejtek [10 ]. Az ilyen fokozott expressziója javasolták, hogy befolyásolja az intenzitása invázió, méret, nyirokcsomó metasztázisok, a tumor fejlődését és a rossz prognózissal [4], [12], [13]. Ebben a tekintetben, nagy mennyiségű adat leírja kemo-megelőző és rákellenes aktivitása nem szteroid gyulladáscsökkentő szerek (NSAID), beleértve a szelektív COX2-gátlók, mint potenciális kezelések GC [10], [11], [14].

transzkripciós szabályozása a COX2 gén függ a molekuláris gépezet kölcsönhatásban áll a COX2 promotert, amely úgy tűnik, hogy szabályozható tevékenysége révén különböző jelátviteli utak [15], [16], [17]. Valóban, ez eredetileg megállapították, hogy CRE (-59 /-53), az NF-IL6 (-132 /-124) és NF-kB (-233 /-214) konszenzus szekvenciák a COX2 promoter szükségesek voltak a kifejezés a gén [16]. Későbbi funkcionális vizsgálatok a COX2-promoter egy sor olyan szabályozó elemeket részt vevő a gén transzkripcióját, beleértve az AP-1, AP-2, Sp-1, C /EBPβ [18], [19], [20] és a fehérjék tartozó T-sejt faktor /lymphoid fokozó faktor (TCF /LEF) család a transzkripciós faktorok, melyek alapvető fontosságúak a Wnt /β-catenin jelátviteli [21]. katalógusa

a Wnt /β-catenin jelátviteli széles körben elfogadott, mint játszik jelentős szerepet emberi betegségekben, különösen a kezdeti és a rák kialakulása [22], [23], [24]. Érdekes, hogy a közelmúltban kísérleteket GC eredetű sejtek mutattak közötti kapcsolat COX2 expresszió és a gátlása a glikogén szintáz kináz-3β (GSK3p) enzim [25], ami kulcsfontosságú a Wnt komponens, amely foszforilezi a β-catenin és elősegíti annak későbbi lebomlás keresztül proteaszóma [26]. A kapcsolat a Wnt /β-catenin és COX2 expresszió különböző rákos sejt modell tovább támogatja az alábbi vizsgálatokat. Először is, azt figyeltük meg, az emiőepitéiium hogy Wnt /β-catenin játszanak közvetett hatással COX2 transzkripció, ami közvetítheti up-regulációját közvetítő tényező PEA3 [27]. Másodszor, és ellentétben a közvetett hatásmechanizmusát, Araki és oszlopok. [21] számolt be, hogy a vastagbél rákos sejtek van indukció COX2 kifejezés egy β-catenin /TCF függő mechanizmus, és részben azzal jellemezve konszenzus TCF /LEF kötőhely (TBE: core CTTTG) helyezkedik el 1079 bp upstream a transzkripció kezdő site a COX2 promoter. Harmadszor, megfigyelhető volt, hogy a vastagbél rákos betegek és az azokból származó sejtvonalak van között társulás overexpressziója a Wnt útvonal-asszociált proteinek LEF-1 és Pontin52 /TIP49a és up-regulációját COX2 expresszió [28]. Végül pedig, a kondrociták, bebizonyosodott, hogy a LEF-1, együtt β-catenin, szabályozott COX2 expresszió közvetlen kötődését a LEF-1 /β-catenin komplex a 3'UTR régiójában, a COX2 genomi lokusz [29] . Ezért jelenleg nincs olyan tiszta képet, hogy vajon a Wnt jelátvitel részt vesz a COX2 génexpresszió, vagy szerepét a GC kialakulását /progresszió. Itt törekedtünk, hogy megértsük, van-e közvetlen szabályozása a COX2 génexpresszió keresztül Wnt /β-catenin jelátvitel és azonosítani a Wnt /β-catenin szabályozó elemek a promoter régió a COX2-gén, amely képes felfele szabályozni COX2 transzkripciót GC sejtekben.

anyagok és módszerek katalógusa

Cells és tenyésztési körülmények katalógusa

az emberi sejtvonalak MKN45 (japán Collection of Research Bioresources, japán), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 és HEK293 (American Type Culture Collection; Rockville, MD) alkalmaztunk ebben a vizsgálatban. MKN45, N87, SNU1 és KATOIII sejteket RPMI táptalajban (Gibco); AGS F12K közepes (Hyclone); WI38 EMEM (Gibco); és HEK293 DMEM-ben (Gibco). Táptalajok volt egészítve 10% FBS-sel (Gibco) (AGS 20%) és 1% penicillin /sztreptomicint. Sejtvonalak tartottuk 37 ° C-on, 5% CO _{2 és telített nedvességtartalom mellett.}

Plazmidok és irányított mutagenezissel

A SuperTOPFlash-luciferáz és PRL-TK renilla- luciferáz plazmidok [30], a konstitutív aktív β-catenin (S33Y) [31] és a domináns-negatív ΔTCF4 expressziós plazmidok [32] korábban már leírták. Kiméra COX2 promóter-luciferáz-fragmenseket PCR-rel előállított humán genomi DNS alkalmazásával specifikus primerek restrikciós helyeket tartalmazó, és ezt követően behelyezzük a pGL3-Basic vektorba (Promega). A mutációk a TBE-II hely (-689 /-684) a COX2 promoter keletkezett primereket használva pCOX-0,8-TBEMUT a QuickChange helyspecifikus mutagesis (Stratagene). A szerkezeteket ellenőrzött közvetlen szekvenálással (ABI-3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Primerek szekvenciákat táblázatban ismertetett S1.

szemikvantitatív és valós idejű RT-PCR-rel

Teljes RNS-t extraháltunk RNáz mentes körülmények TRIZOL (Invitrogen), és 2 ng RNS-t reverz transzkripcióval 200 U SuperScript II reverz transzkriptáz (RT) (Invitrogen) használva 500 ng oligo (dT) primereket. Kísérleti meghatározása COX2, c-myc és CCND1 mRNS szintek szerint végeztük [33]. Röviden, cDNS-eket vetettük alá Real-Time PCR egy iCycler iQ rendszer (Bio-Rad Laboratories). Minden egyes 25 ul reakció-térfogatban tartalmazott 1 egység Platinum Taq DNS-polimeráz (Invitrogen), 1x reakció puffer (20 mM Tris-HCI pH = 8,4, és 50 mM KCI), 1,5 mM MgCI _{2, 2,5 ug BSA-t, 0,01% Glicerin , 200 uM dNTP-k, 0.3X SYBR zöld oldatot és 0,4 uM specifikus primerek (lásd a táblázat S1). PCR körülményeket a következők: 90 másodperc 94 ° C hőmérsékleten, majd 30 ciklus: 30 másodperc 94 ° C-on, 30 másodperc 62 ° C-on és 30 másodperc 72 ° C-on. Minden reakciót végeztünk három párhuzamosban és a kapott eredményeket az egyes gén normalizáltuk azon kapott párhuzamosan β-aktin. A minőségi RNS és a PCR-termékek követtük egész kísérletek keresztül elektroforézissel 1% -os agaróz gélen, etidium-bromiddal festjük.}

indukciója a Wnt /β-catenin jelátviteli

Wnt jelátvitel volt farmakológiailag indukált MKN45 sejtekben oltottuk 6 lyukú tenyésztő lemezeken 80-90% összefolyás (azaz 1, 2, 4 és 8 órás inkubálás) vagy 10-20 mM LiCI-t (Sigma), vagy 5-10 mm valproinsav (VA; Sigma) a korábban leírtak [34], [35]. Ezután a sejteket összegyűjtjük, az mRNS extrakció és Real Time-PCR meghatározása a fent leírt módon. Hasonlóképpen, MKN45 sejteket 2 órán át 200 és 400 ng /ml tisztított Wnt3a fehérje. Tisztítása Wnt3a végeztük leírtak [36].

transzkripciós aktivitását COX2 promoter

Activity a COX2 promoter mértük 80-90% -ban összefolyt MKN45, AGS, WI38 és HEK293 sejteket oltottunk le 6 tartályos tenyésztő lemezeken. Röviden, a sejteket kotranszfektáltuk Fugene (Roche) 24 a pCOX2-luciferáz vagy a pSuperTOPFlash riporterek, és vagy konstitutív aktív β-catenin (S33Y) [31], vagy a domináns-negatív ΔTCF4 [32] konstrukciókat. PRL-TK Renilla luciferáz plazmidot használtuk belső kontrollként. Firefly és a Renilla luciferáz aktivitásokat alkalmazásával határoztuk meg a Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega), egy Victor-3 többtárcsás olvasó eszköz (Perkin-Elmer), a korábban leírtak szerint [30]. Relatív luciferáz tevékenységek fejeztük elosztjuk szentjánosbogár luciferáz aktivitást Renilla luciferáz aktivitást az egyes minták (N = 3, mindegyik három példányban).

A kromatin immunprecipitáció (chip) vizsgálatokban

ChIP vizsgálatokat végeztek MKN45 sejteket a korábban leírt módon [37]. A frakció nukleáris β-catenin köti sem a TBE Sites I, II, III vagy IV az emberi COX2 promotert immunoprecipitáltuk anti β-catenin ellenanyagok (Santa Cruz), és értékelik Real Time-PCR segítségével specifikus primerek (táblázat S1) . Továbbá, a frakció az RNS polimeráz II (Pol-II) és az acetilezett H3 és H4 hisztonok (H3ac és H4ac) köti sem, hogy a TBE-II régió (-793 /-594), vagy a proximális régióban (-118 /+ 62 ) a COX2 promoter hasonlóképpen értékelték (anti-Pol-II, santa Cruz, H3ac és H4ac, Upstate). Pozitív kontrollként használtuk az c-myc TBE site [38]. Antitest-specifitás mértük normál nyúl-IgG-t (Santa Cruz).

Elektroforetikus mobilitás-eltolódásos vizsgálati eljárás (EMSA)

EMSA segítségével végeztük az oligonukleotidok, amelyek vagy a vad típusú COX2 TBE-II konszenzus szekvencia (lásd a táblázatot S1) vagy korábban jelentett mutáns TBE-szekvenciákat [39]. Röviden, a vad típusú és a mutáns ^{32P-vel jelzett oligonukleotidokkal inkubáljuk kötőpufferben nukleáris kivonatok MKN-45 sejteket 30 percen át 30 ° C-on. Ezt követően, a DNS-fehérje komplexeket elkülönítjük a szabad oligonukleotidokat egy 5% -os nem denaturáló poliakrilamid gélen. Az elektroforézis után a gélt megszárítjuk, és filmre exponáltuk 1 napig. A megjelenítés a radioaktív sávok elemeztük autoradiográfiával. Kötődési specifitás ellenőriztük inkubáljuk a DNS-fehérje komplexek jelenlétében feleslegben nem jelzett vad típusú vagy mutált oligonukleotidok [21], [39].}

Statisztikai analízis

Valamennyi kísérletet megismételjük legalább három alkalommal, három ismétlésben. Az adatokat mutatjuk, mint az átlag ± SD. Többszörös csoport összehasonlításokat végeztük egyutas ANOVA alkalmazásával végeztük Statistica 9.0 szoftvert. P katalógusa < 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

COX2 expressziója korrelál a nukleáris β-catenin szintjét GC sejtek katalógusa

Kezdetben meghatározni a kifejezést szintek COX2 mRNS humán GC-sejt-vonalak MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII és AGS [40], [41], [42], valamint a WI38 fibroblasztok itt használt, mint a kontroll-sejtvonal [43], vizsgáló hogy azok korrelált Wnt /β-catenin jelátvitel. Amint az 1. ábrán látható, az erős szintje COX2 expresszió volt megfigyelhető már 26 ciklus PCR-amplifikáció metasztatikus sejtvonalakban MKN45, SNU16 és KATOIII, és szintén a AGS sejtvonal, amely származó primer tumor. Ez az eredmény összhangban van azzal COX2 expressziós szintet észlelt korábban MKN45, KATOIII és AGS sejtek [44], [45], [46]. Ezzel ellentétben, a COX2 mRNS-szinteket vagy nagyon alacsony a WI38 fibroblasztok vagy kimutathatatlan N87 és SNU1 sejtek (1a ábra), ami arra utal, hogy ez a differenciális expressziós mintázata nem kapcsolódik metasztatikus szakaszaiban vagy szintjének sejt átalakulás. Figyelemre méltó, hogy a nukleáris β-catenin-szinteket szorosan összefügg COX2 kifejezés, mivel magas a fehérje észleltek MKN45, AGS, SNU16 és KATOIII sejteket, míg a N87, SNU1 és WI38 sejtek (1B), ami a szerepe Wnt jelátviteli COX2 mRNS expresszió GC sejtekben. katalógusa

Tartozékok COX2 expresszió keresztül Wnt /β-catenin jelátviteli katalógusa

Annak érdekében, hogy vizsgálja meg, Wnt kaszkád részt vesz COX2 expresszió MKN45 sejtek farmakológiai stimulált különböző ideig (azaz 1, 2, 4 és 8 óra) akár lítium (LiCl) vagy a valproinsav (VA), mivel mindkét gyógyszer már korábban kimutatták, hogy modulálják Wnt jelátvitel gátlása révén a GSK3p-aktivitás, és így növeli a nukleáris szinteket β-catenin [34], [35]. Érdekes módon azt tapasztaltuk, jelentős növelését COX2 expresszió által indukált 10-20 mM LiCI vagy 5-10 mm VA, hogy kezdődött hamarosan inkubáció után a vegyületeket, és amelyek tetőzött két óra elteltével a kezelés (2A ábra). Valós idejű meghatározására COX2 mRNS szintek MKN45 sejteket hasonlóképpen kezeltünk LiCI vagy VA (2 óra) jelezte, hogy a COX2 szignifikánsan felülszabályozott (2b ábra), és hogy ez a hatás párhuzamba egy megfigyelt Wnt /β-catenin célgének c-myc [47] és a cyclin D1 [48]. Továbbá annak érdekében, hogy zárja ki annak lehetőségét, hogy a megfigyelt jelenség tükröződik nem specifikus hatásai ható gyógyszerek fehérjéket érintő különböző jelátviteli kaszkád, azt, amelyet közvetlenül egy teljesen működőképes tisztított Wnt3a fehérje MKN45 sejtek (lásd Módszerek). Ezek a kísérletek világosan mutatták, hogy 200-400 ng /ml tisztított Wnt3a jelentősen megerősített COX2 mRNS expresszió után rövid ideig tartó inkubáció (2. ábra), részben megmagyarázza a gyors hatás LiCI és a VA és a támogató között közvetlen összefüggés kanonikus Wnt /β-catenin aktiválását és stimulálása COX-2 transzkripciót GC sejtekben.

azonosítása újszerű TBE helyek a promoter a COX2 gén

Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy egy Wnt /β-catenin reagáló TBE helyén ( konszenzus mag: CTTTG) található -1079 /-1074 bp upstream a transzkripciós starthelyet (TSS) az emberi COX2-gén [21] (a webhelyről IV; a 3a ábrát, lásd még az ábra S1). További vizsgálati az 1600 bp upstream szekvencia a TSS [49] lehetővé tette számunkra, hogy azonosítsuk 3 újszerű feltételezett TBE oldalak: -877 /-872 bp (Oldal III értelemben orientáció), -689 /-684 bp és -318 /-313 bp (Sites II és I, illetőleg mindkét antiszensz orientációban) (3A), amelyek nem konzerváltak a humán és egér COX2 gén (ábra S1). Ezért a klónozott a 1600 bp-szegmens a humán COX2 promóter (pCOX2), beleértve mind a négy TBE oldalak, a pGL3-basic vektor fuzionált a luciferáz gén azután felhasználhatjuk az riporter assay (3A ábra). Figyelemre méltó, hogy párhuzamosan transzfekció 10 ng ilyen konstrukció MKN-45 és HEK293 sejtek kiderült, hogy pCOX2 megjelenített egy jelentősen magasabb (9-szeres) bazális promóter aktivitást MKN45 sejtek (3B és C). Feltételeztük, hogy ez a magasabb pCOX2 bazális promóter aktivitás összefüggésben lehet az emelkedett mennyiségét nukleáris β-catenin ebben a GC-sejtvonal (1b ábra). Ezért, MKN45 és HEK293 sejteket együtt transzfektáltunk pCOX2 jelenlétében alacsonyabb dózisok egy konstitutív aktív β-catenin fehérje (S33Y) [31]. Amint a 3. ábrán megfigyelhető, pCOX2 aktivitás valóban fokozott mindkét sejttípusban, ami arra utal, hogy a β-catenin kötődhetnek, majd aktiválja a TCF /LEF transzkripciós faktorok a funkcionális TBE oldalak belül pCOX2 promoter.

hozzájárulása TBE oldalak COX2 promoter aktivitását GC sejtekben katalógusa

boncolgatni hozzájárulása Wnt /β-catenin reagáló TBE oldalak a transzkripciós aktivitását COX2 promoter négy pCOX2 törléseket konstrukciókat állítottunk elő: pCOX-1,2 (-1123 /+ 35 bp); pCOX-0,8 (-741 /+ 35 bp); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 bp); és pCOX-0,4 (-371 /+ 35 bp) (4a ábra). Ezeket a szerkezeteket ezt követően megvizsgáltuk aktivitásuk révén tranziens transzfekció a MKN45 és AGS sejtek segítségével a WI38 fibroblasztok, mint a kontroll-sejtvonal. Összhangban az endogén COX2 expressziós szinteket ezekben a GC sejtvonalakban (1a ábra), pCOX2 deléciók megmarad különböző szintű aktivitás MKN45 és AGS sejtek (4b ábra és C). Ezzel szemben nem promotor aktivitás volt kimutatható WI38 fibroblasztok (ábra 4d), még akkor is, ha a transzfekció dózisok ezekben a sejtekben emelkedett 8 szorosára (azaz 50-400 ng) (ábra S2). Fontos, és összhangban van a korábbi jelentések [50], WI38 sejteket hatékonyan kifejezni luciferáz-riporter konstrukciót, amely a promoter a p21 gén (S2 kép), ami azt jelzi, hogy ezekben a kontroll sejtekben molekuláris gépezet felelős indukáló COX2 átírás nem aktív . További vizsgálatok feltárták, hogy a transzfekció MKN45 és AGS sejteket a pCOX2-0.8 konstrukcióval, amely 859 bp hagyni a 1,6 kb pCOX2 riporter (4a ábra), eredményezett jelentős növekedést a promoter aktivitását, ha összehasonlítjuk a pCOX2-1.2 riporter (ábra a 4A-C). Mivel nem volt szignifikáns különbség a 1,6 Kb pCOX2 és pCOX2-1.2 konstrukciók (ábra S3), nem végeztünk további elemzéseket a nagyobb konstrukció. Fontos, pCOX2-0.8 képviselte a minimális méret promoter fragmentumot mutató a maximális bazális aktivitás, mivel további deléciója vagy 159 vagy 370 bp az 5'-vég, mivel ez a helyzet a pCOX2-0.65 vagy pCOX2-0.4 konstrukciókat, illetőleg csökkent több mint 2-szerese a szintek pCOX2 bazális aktivitása. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a régió között van 0,8 és 0,65 kbp upstream a TSS a COX2-gén, és amely magában foglal egy újszerű TBE válasz elem (TBE webhelyről II; -689 /-684), lehet egy kulcsfontosságú eleme a szabályozás során a az alapszintű COX2 génexpresszió GC sejtekben. katalógusa

felülszabályozása a pCOX2-0.8 keresztül Wnt /β-catenin jelátviteli katalógusa

a következőkben hatását vizsgálták Wnt /β-catenin jelátvitel a regény TBE Oldal II. Mi transzfektált MKN45 sejteket a pCOX2-0.8 riporter konstrukcióval és a társ-expresszált a konstitutív aktív β-catenin S33Y fehérje megfigyeljük, hogy nem volt szignifikáns (2-szeres) fokozása a transzkripciós aktivitását pCOX2-0.8. Ez a β-catenin-mediált növekedését specifikus volt, mivel a pCOX2-0.4 konstrukciót nem stimulált ebben β-catenin túlzott expressziója feltétel (5A ábra és B). Kontrollálására Wnt /β-catenin jelátvitel MKN45 sejtekben használtuk a Wnt /β-catenin reagáló SuperTOPFLASH (STF) riporter hordozó 12 példányban egy TBE tandem [32], melyet transzfektált önmagában vagy jelenlétében a plazmid kódoló a mutáns β-catenin S33Y fehérje. Érdekes módon, miközben együttes expressziója a mutáns β-catenin S33Y fehérje MKN45 sejtekben volt képes növelni (1,9-szeres) a tevékenység a STF riporter, a magas bazális STF aktivitás volt kimutatható a hiánya a mutáns β-catenin (5C). Ez az eredmény összhangban van azzal a korábbi megállapításaival magas szintű endogén nukleáris β-catenin ebben a sejt-típusú (lásd 1B ábrát), és megerősíti, hogy ez a nukleáris faktor funkcionális. Annak további igazolására, ezt a megállapítást, végeztünk azonos kísérleteket HEK293 sejtekben és szerzett alapvetően hasonló eredményeket, bár ebben az esetben egyértelmű dózis-válasz görbét kaptunk, amikor pCOX2-0.8 transzfektáltuk a növekvő koncentrációinak jelenlétében a konstitutívan aktív β-catenin S33Y fehérje (ábra S4). Továbbá, azt találtuk, hogy STF aktivitást HEK293 sejtek igen érzékenyek a szintje az exogén mutáns β-catenin (ábra S4C). Katalógusa

Ahhoz, hogy tovább vizsgálja a hatását a Wnt /β-catenin út a tevékenység a pCOX2-0.8 végeztünk veszteség-of-function kísérletet egy domináns negatív TCF4 (ΔTCF) építésére, amely kódol egy transzkripciós faktor hiányzik 30 maradék annak amino-terminális, és hogy nem képes kötődni β-catenin [32] . Azt találtuk, hogy a MKN45 sejtek ΔTCF expressziója csökkentette a magas szintű pCOX2-0.8 alap transzkripciós dózis-függő módon (5D ábra). Ez az eredmény megerősíti kulcsszerepét TCF /LEF transzkripciós faktorok között a szabályozók tevékenységének a pCOX2-0.8 promoter szekvencia, és még inkább alátámasztja azt az elképzelést, hogy a TBE Oldal II (-689 /-684) részt vesz a válasz Wnt /β-catenin jelátvitel. katalógusa

Végül, közvetlenül foglalkozik a szerepe a TBE Oldal II Wnt /β-catenin közvetítette szabályozása COX2 promoter, bevezettük helyspecifikus mutagenezis változás 2 kulcs nukleotidok a konszenzus szekvenciát a TBE Oldal II mag (azaz pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Ezek a változások már korábban kimutatták, hogy töröljék el Wnt /β-catenin közvetítette transzkripciós [39]. Tranziens transzfekció vizsgálatok kimutatták, hogy a mutáció a TBE Oldal II jelentősen csökkent (2-3-szoros) a bazális aktivitását pCOX2-0.8 konstrukció MKN45 sejtekben (5E ábra), összehasonlítva a vad típusú pCOX2-0.8 promoter konstrukciót. Továbbá, és a megállapodás a korábbi eredményeket, mutációja ez TBE hely II szinte teljesen blokkolta β-catenin által közvetített fokozásával a pCOX2-0.8 konstrukció (S4). Összefoglalva, ezek az eredmények azt jelzik, hogy a TBE Oldal II (-689 /-684) funkcionális eleme a COX2 gén transzkripciós szabályozása.

β-catenin kötődik a COX2 gén promoter régiójában, amely tartalmazza a TBE Oldal II

Mivel a transzkripció aktív konformációját kromatin struktúrát tükrözi egy emelt szintű hiszton acetilezés [51], azt kicsapjuk térhálósított kromatin-fragmensek (átlagos mérete 300-500 bázispár) izolálunk MKN45 sejtekből poliklonális antitestek specifikus az acetilezett H3 és H4 hisztonok. Hasonlóképpen, mi észlelt RNS-polimeráz kötődését a II (Pol II), mint a paraméter általában társított transzkripciós aktivitást. Megvizsgáltuk a dúsítás a csapadékot két promoter szekvencia: a proximális promoter (PP) régió (-118 /+ 62 TSS) és a távoli régió (-793 /-594) a COX2 promoter tartalmazó konszenzus TBE Oldal II ( -689 /-684). Különösen, a TBE Oldal II célzott volt, mivel a korábbi kísérletek azt mutatták, preferenciális kötődését β-catenin, hogy ez a promoter régió (ábra S5). Pozitív kontrollként értékeltük kötelező a TBE helyén a promoter a c-myc gén (-1447 /-1144 származó TSS), amelyet korábban leírt vastagbél rákos sejtekben [38].

Acetilezett H3 és H4 hisztonok, és a polimeráz II enzimet találtak, hogy kötődik a proximális promoter régió (6a ábra), jelezve, hogy a kromatin struktúráját körül a COX2 promoter MKN45 sejtekben egy nyitott konformációjú, így egyetértésben a korábbi eredmények bizonyítják, hogy a COX2 gén aktívan átírni. Nevezetesen, a β-catenin fehérje volt immunprecipitálható MKN45 mintákat többnyire együtt a promoter régió átívelő -684 /-689 TBE szekvencia a COX2 gén (6B). Ez a tényező szinte észrevehetetlen a proximális promoter régiót, jelezve, hogy az endogén nukleáris β-catenin elsősorban toborzott a TBE Oldal II ezekben GC sejtekben. Ahogy az várható volt, az endogén β-catenin hasonlóképpen kötődik a c-myc promoter TBE hely, olyan mértékben, amely összemérhető megfigyelhető a COX2 gén promoter (ábra a 6C).

Együttesen ezek a kísérletek azt mutatják, hogy a TBE Oldal II közvetlenül részt β-katenin által közvetített transzkripciós aktiválása a COX2 promoter. Annak további igazolására, ezeket az eredményeket végeztünk Elektroforetikus mobilitás eltolódását vizsgáló (EMSA), a nukleáris kivonatok MKN45 sejteket. Erre a célra készített 34 alapú párosított oligonukleotidok; egyikben a vad típusú -689 /-684 TBE Oldal II szekvencia (azaz CTACAAAGA; maradékok kiemelte képviselő mag), és két oligonukleotid tartalmazó missense mutáció sem a lényege a TBE Oldal II (azaz CTACGAGGA: TBE-MUT1) vagy a határoló szekvenciák (azaz CGCCAAAGA: TBE-MUT2), amint arról korábban [21], [39]. Ábrán látható a 6D, a radioaktívan jelölt vad típusú TBE szonda volt képes alkotnak retardált DNS-fehérje komplexek amikor inkubáltuk sejtmagkivonatokkal származó MKN45 sejteket. Ezek a DNS-fehérje komplexek voltak specifikusak, mivel az felesleg hozzáadása hideg vad típusú oligonukleotidok (50-szeres) drámaian gátolja az a DNS-fehérje komplex (ábra 6D, 3. sáv, illetve 4.). A mutáns radioaktívan jelzett TBE-MUT1 szonda volt sem képes formában DNS-fehérje komplexek a saját, sem a versenyt a vad típusú oligonukleotid adva feleslegben, mint a hideg szondát (ábra 6D, 5. sáv, illetve 6.). Hasonló eredményeket kaptunk, amikor a második hideg TBE-MUT2 próbát alkalmaztunk, mint a versenytárs (ábra 6D, 7. sáv). Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy az új TBE Oldal II a COX2 promoter vesz részt a transzkripciós aktiválása a COX2 gén felvételével a gép felelős transzdukáló Wnt /β-catenin jelátvitel (ábra 6E).

Megbeszélés

Korábbi vizsgálatok arra utaltak, szerepe Wnt /β-catenin jelátvitel során a kialakulása és /vagy a fejlődés különböző típusú rák keresztül expressziójának modulálására a COX2-gén [25]. Ebben a munkában már bemutatott erős bizonyítékokat közvetlen szerepét Wnt /β-catenin jelátvitel a kontroll COX2 expresszió GC sejtekben. Először is azt mutatják, hogy van egy szoros összefüggést mutat COX2 expresszió és a nukleáris tartalma β-catenin, amely úgy tűnik, hogy független vagy rosszindulatú daganat vagy átalakulás állapotában CG sejtekben. Másodszor, idő- és dózisfüggő növelését COX2 expresszió volt megfigyelhető hamarosan az indukció után (2 óra) akár farmakológiai vegyületek utánozva Wnt /β-catenin jelátvitel. Harmadszor, a gén riporter assay értékelésére COX2 promoter aktivitását válaszul gain- és a veszteség-of-function kísérletek, beleértve egy konstitutívan aktív β-catenin fehérje és domináns negatív TCF4 transzkripciós faktor, azt bizonyítják, hogy a Wnt /β-catenin komponensek részt vesznek a transzkripciós szabályozása a COX2-gént.

azt is kimutatták, hogy itt belül 2 kbp upstream a humán COX2 promoter van négy feltételezett TBE oldalak (mag: CTTTG), amelyek közül az egyik már korábban tanulmányozták Araki és cols [21], [28]. Gén- riporter vizsgálatok különböző pCOX2 deléciós konstrukciók azt mutatta, hogy pCOX2-0.8 megjelenített legmagasabb bazális transzkripciós aktivitást a GC sejtek MKN45 és AGS. Érdekes, pCOX2-0.8 fenntartotta a TBE Mezei-II (-689 /-684) integritását jelző legfontosabb hozzájárulása a szabályozás a transzkripciós aktivitását COX2 gént. Figyelemre méltó, hogy a teljes pCOX2 TBE Oldal II aláírás (azaz 5'-WWCAAAGS-3 '; S = C /G, W /T), hasonlít az optimális TCF oldalon leírt van de Wetering és oszlopok. [52], amelyet később azonosítására használt valódi Wnt-transzkripciós célokat az Drosophila katalógusa gének NKD katalógusa és CG6234 katalógusa [53]. Katalógusa

funkcionalitás e TBE Oldal II-vizsgálat is megerősítette a mutagenezis vizsgálatok. Amikor tehát a mutáns a TBE-signature szekvencia a pCOX2-0.8 konstrukcióval (MpCOX2-0.8), azt találtuk, hogy a bazális COX2 promoter aktivitását lényegesen befolyásolta volna a MKN45 sejtekben. Ezen túlmenően a chip és az EMSA elemzések megerősítették, hogy β-catenin célszerűen toborzott a -689 /-684 COX2 promoter régió GC sejtekben, olyan szinten, amely hasonlít megtalálható a c-myc-promoter [38]. Az ilyen kölcsönhatás preferenciálisan előfordul ebben a régióban a COX2 gén promoter, mivel nem β-catenin találták, hogy kötődnek a proximális promoter régióját a COX2 gént. Összességében ezek az eredmények azt jelzik, hogy a TBE Oldal II egy funkcionális Wnt /β-catenin reszponzív elem a humán COX2 promóter. Adataink ugyanakkor nem zárja ki a hozzájárulást a másik genomi régiók humán COX2 gén [21]. Ehelyett azt javasoljuk, hogy a GC-sejtek egy komplex webes interakciók van jelen, ahol a TBE Oldal II együttműködik más válasz elemekkel erősítő szabályozása COX2 expressziót. Katalógusa

Mivel eredményeink GC sejtek megegyeznek azokkal, amelyeket jelentettek vastagbélrák sejtek, csábító a feltételezés, hogy Wnt /β-catenin jelátvitel lehetne hasonlóan részt vesz a COX2 szabályozás más daganatok, [21] [28]. Valóban, a mérsékelt-erős protein szinteket β-catenin figyelhető ca. 72% -a az összes rák elemezte az Emberi Atlas Protein szövet adatbázis [54]. Hasonlóképpen, erős vagy közepesen citoplazmatikus COX2-festéssel és alkalmi hártyás reaktivitás megfigyelhető 50% -a az összes rákos megbetegedések, beleértve a vastagbél-, prosztata-, méhnyak-, endometrium, urothelialis, hasnyálmirigy, a máj és a mirigyes sejtek gyomor tumorszövetben.

• PLoS One: a mikro-RNS-Let 7f gátolja a tumor invázió és metasztázis által célzás MYH9 az emberi gyomorban Cancer
• PLoS One: Sonic Hedgehog útvonal létfontosságú karbantartása Cancer Stem-szerű sejtek emberi gyomorban Cancer