PLoS ONE: Wnt /β-catenine signalering Verbetert cyclooxygenase-2 (COX2) transcriptie-activiteit bij maagkanker Cellen

De abstracte

Achtergrond

verhoogde expressie van cyclooxygenase-2 enzym (COX2) is een van de belangrijkste kenmerken van maagkanker (GC), die een belangrijke doodsoorzaak in de wereld, met name in Azië en Zuid-Amerika. Hoewel de Wnt /β-catenine signaleringsroute is betrokken geweest bij de transcriptionele activering van de COX2-gen, het precieze mechanisme modulerende deze reactie is nog onbekend.

Methodologie /voornaamste bevindingen

Hier zijn we bestudeerden de transcriptionele regulatie van het COX2-gen in GC cellijnen en beoordeeld of dit fenomeen wordt gemoduleerd door Wnt /β-catenine signalering. Onderzochten we eerst de expressie van COX2-mRNA in cellen GC en vonden dat er een differentiële expressiepatroon in overeenstemming met een hoge-nucleair gelokaliseerde β-catenine. Farmacologische behandeling met lithium of valproïnezuur en moleculaire inductie met gezuiverde canonieke Wnt3a aanzienlijk verbeterd Cox2 mRNA expressie in een dosis- en tijdsafhankelijke manier. Serial deletie van een 1,6 Kbp COX2 promotorfragment en gain of loss-of-function experimenten lieten een minimale Wnt /β-catenine reagerende gebied bestaande uit 0,8 Kbp van het COX2 promoter (pCOX2-0.8), die de maximale respons vertoonden identificeren in gen reporter testen. De activiteit van dit pCOX2-0.8 promotorgebied werd verder bevestigd door plaatsgerichte mutagenese en DNA-eiwit bindingstesten.

Conclusies /Belang

We besluiten dat de pCOX2-0.8 minimale promotor bevat nieuwe functionele T-cel factor /lymfoïde enhancer factor (TCF /LEF) en respons element (TBE Site II; -689 /-684), die rechtstreeks reageert op verhoogde Wnt /β-catenine signalering en die belangrijk zijn voor het ontstaan ​​/progressie kan zijn GC

Visum:. Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino M, De Ferrari GV (2011) Wnt /β-catenine signalering Verbetert cyclooxygenase-2 (COX2) transcriptie-activiteit bij maagkanker Cells. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10.1371 /journal.pone.0018562

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 5 november 2010; Aanvaard: 11 maart 2011; Gepubliceerd: 6 april 2011

Copyright: © 2011 Nuñez et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door CTI-kanker, Programa Bicentenario en Ciencia y Tecnología (PBCT) - Comisión Nacional de Investigación y Científica Tecnológica (CONICYT) subsidie ​​nummer PBCT-6 van de Chileense overheid (MM en GVD). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is een multifactoriële ziekte, gekenmerkt door zeer kwaadaardige gezwellen in het maagslijmvlies, en vertegenwoordigt de tweede belangrijkste oorzaak van kankersterfte wereldwijd het meest voorkomt in Azië en Zuid-Amerika [1], [ ,,,0],2], [3]. Milieu-geassocieerde risicofactoren zijn dieet, snuif de consumptie, obesitas en Helicobacter pylori
infectie [4]. Verschillende mutaties in tumorsuppressorgenen, zoals p53, adenomateuze polyposis coli (APC), E-cadherine en RUNX3 [3], [5], alsook in oncogenen zoals K-ras, HER2 en β-catenine [3], [6], [7], zijn gedocumenteerd in GC. Bovendien overexpressie van verscheidene genen zijn beschreven, waaronder WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], en cyclooxygenase 2 (COX2) enzym dat de cruciale stap in de productie van prostaglandine E2 katalyseert, een sleutelmediator van gewrichtsontsteking [10], [11].

Er is waargenomen dat de expressie van het COX2-gen significant verhoogd in humane adenocarcinoom weefsels, in vergelijking met gepaarde maagslijmvlies specimens zonder kankercellen [10 ]. Zulke verhoogde expressie wordt voorgesteld om de intensiteit van invasie, grootte, metastasen, tumorontwikkeling en slechte prognose [4], [12], [13] beïnvloeden. In dit verband grote hoeveelheden gegevens beschrijven chemo-preventieve en antikanker activiteit van niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID) met selectieve COX2-remmers als mogelijke behandelingen voor GC [10], [11], [14].

Transcriptionele controle van de COX2-gen afhankelijk van de moleculaire machinerie interactie met de COX2 promoter, die lijkt te worden gecontroleerd door de activiteit van verschillende signaalwegen [15], [16], [17]. Er werd aanvankelijk aangetoond dat CRE (-59 /-53), NF-IL6 (-132 /-124) en NF-KB (-233 /-214) consensus sequenties in de promoter COX2 noodzakelijk waren voor de expressie van de gen [16]. Daaropvolgende functionele studies in de COX2 promoter identificeerde een aantal regulerende elementen die deelnemen aan de transcriptie van het gen, zoals AP-1, AP-2, Sp-1, C /EBPB [18], [19], [20] en proteïnen die behoren tot de T-cel factor /lymfoïde enhancer factor (TCF /LEF) familie van transcriptiefactoren, die cruciaal zijn voor Wnt /β-catenine signaaltransductie [21] zijn.

de Wnt /β-catenine signaleringsroute wordt algemeen erkend als een belangrijke rol speelt bij menselijke ziekte, vooral bij het ontstaan ​​en de ontwikkeling van kanker [22], [23], [24]. Interessant is dat recente experimenten met GC afgeleide cellen een relatie tussen COX2-expressie en de remming van de glycogeensynthasekinase-3β getoond (GSK3ß) enzym [25], wat een belangrijk Wnt onderdeel dat β-catenine fosforyleert en bevordert de daaropvolgende afbraak via proteasoom [26]. De relatie tussen Wnt /β-catenine en COX2-expressie in verschillende kankercellijnen modellen wordt verder ondersteund door de volgende studies. Ten eerste is waargenomen in de mammaire epitheel Wnt /β-catenine spelen een indirect effect op COX2 transcriptie, die kunnen worden gemedieerd door opregulatie van tussenschakel factor PEA3 [27]. Ten tweede, en in tegenstelling tot een indirecte wijze van optreden, Araki en cols. [21] gemeld dat in darmkankercellen is er een inductie in COX2 expressie door middel van een β-catenine /TCF afhankelijk mechanisme, en gedeeltelijk een consensus TCF /LEF bindingsplaats gekarakteriseerd (TBE: kern CTTTG) gepositioneerd 1079 bp stroomopwaarts van de transcriptie start site Cox2 promoter. Ten derde, werd waargenomen dat bij colonkanker patiënten afgeleide cellijnen is er een verband tussen overexpressie van de Wnt-pathway geassocieerde eiwitten LEF-1 en Pontin52 /TIP49a en up-regulatie van COX2-expressie [28]. Bovendien zullen, met chondrocyten, is aangetoond dat LEF-1, samen met β-catenine, COX2 gereguleerde expressie door directe binding van de LEF-1 /β-catenine complex in de regio 3'UTR van het COX2 genomische locus [29] . Daarom is op dit moment is er geen duidelijk beeld over de vraag of Wnt-signalering betrokken is bij COX2 genexpressie, of zoals haar rol in GC onset /progressie. Hier zochten we begrijpen of er een directe regulering van de COX2 genexpressie via Wnt /β-catenine signalering en Wnt /β-catenine regulerende elementen te identificeren in het promotorgebied van het COX2-gen dat COX2 transcriptie reguleert in GC cellen.

Materialen en methoden

cellen en kweekomstandigheden

Human cellijnen MKN45 (Japanse Collection of Research Bioresources, Japan), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 en HEK293 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) werden gebruikt in deze studie. MKN45, N87, SNU1 en KATOIII cellen werden gekweekt in RMPI media (Gibco); AGS in F12K medium (Hyclone); WI38 in EMEM (Gibco); en HEK293 in DMEM (Gibco). Kweekmedium aangevuld met 10% FBS (Gibco) (AGS met 20%) en 1% penicilline /streptomycine. Cellijnen werden bij 37 ° C in 5% CO gehandhaafd _{2 en verzadigde luchtvochtigheid.}

Plasmiden en plaatsgerichte mutagenese

De SuperTOPFlash-luciferase en pRL-TK renilla- luciferase plasmiden [30], het constitutief actieve β-catenine (S33Y) [31] en de dominant-negatieve ΔTCF4 expressieplasmiden [32] zijn eerder beschreven. COX2 chimere promotor-luciferase fragmenten werden gegenereerd met PCR uit humaan genomisch DNA onder gebruikmaking van primers die restrictieplaatsen en vervolgens in de pGL3-Basic vector (Promega) toegevoegd. De mutaties in de TBE-II plaats (-689 /-684) van de COX2 promoter werden gegenereerd onder gebruikmaking van primers pCOX-0,8-TBEMUT de QuickChange plaatsgerichte mutagesis kit (Stratagene). Constructen werden geverifieerd door directe sequencing (ABI-3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Primers sequenties zijn beschreven in Tabel S1.

Semikwantitatieve en Real Time RT-PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd in RNAse-vrije omstandigheden gebruikt TRIZOL (Invitrogen) en 2 ug RNA werd reverse getranscribeerd met 200 U SuperScript II Reverse Transcriptase (RT) (Invitrogen) onder toepassing van 500 ng oligo (dT) primers. Experimentele bepaling van COX2, c-myc en CCND1 mRNA niveaus werd uitgevoerd volgens [33]. In het kort werden cDNA onderworpen aan real-time PCR in een iCycler iQ System (Bio-Rad Laboratories). Elke 25 pl reactievolume bevatte 1 eenheid van Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen), 1X reactiebuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4 en 50 mM KCl), 1,5 mM MgCl _{2, 2,5 ug BSA, 0,01% Glycerol , 200 uM dNTPs, 0.3x SYBR Green oplossing en 0,4 uM van specifieke primers (zie Tabel S1). PCR-omstandigheden waren als volgt: 90 seconden bij 94 ° C en daarna 30 cycli van 30 seconden bij 94 ° C, 30 seconden bij 62 ° C en 30 seconden bij 72 ° C. Alle reacties werden uitgevoerd in triplo en resultaten voor elk gen werden genormaliseerd voor die verkregen in parallel met β-actine. De kwaliteit van RNA en PCR-producten werd gedurende de experimenten gevolgd via elektroforese op 1% agarose gels, gekleurd met ethidium bromide.}

Inductie van het Wnt /β-catenine signaleringsroute

Wnt signalering was farmacologisch geïnduceerd in MKN45 cellen geënt in 6 putjes bij 80-90% confluentie (bijvoorbeeld 1, 2, 4 en 8 uur incubatie) hetzij met 10-20 mM LiCl (Sigma) of 5-10 mM valproïnezuur (VA; Sigma) zoals eerder beschreven [34], [35]. Daarna werden de cellen verzameld voor mRNA extractie en real-time PCR-bepaling zoals hierboven beschreven. Zo werden MKN45 cellen gestimuleerd gedurende 2 uur met 200 en 400 ng /ml Wnt3a gezuiverd eiwit. Zuivering van Wnt3a werd uitgevoerd zoals beschreven [36].

transcriptionele activiteit van de COX2 promoter

De werking van de COX2 promoter werd gemeten in 80-90% confluent MKN45, AGS, WI38 en HEK293 cellen gezaaid in 6 putjes. In het kort cellen werden gecotransfecteerd met behulp FUGENE (Roche) voor 24 de pCOX2-luciferase of pSuperTOPFlash reporters en constitutief actief β-catenine (S33Y) [31] of dominant-negatieve ΔTCF4 [32] constructen. Het pRL-TK Renilla luciferase plasmide werd gebruikt als een interne controle. Vuurvlieg en Renilla luciferase activiteiten werden bepaald met de Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega) in een Victor-3 meervoudige instrument reader (Perkin Elmer), zoals eerder [30] beschreven. Relatieve luciferase activiteiten werden uitgedrukt door deling vuurvlieg luciferase activiteit Renilla luciferaseactiviteit voor elk monster (N = 3, elk in drievoud).

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assays

ChIP studies werden uitgevoerd in MKN45 cellen zoals eerder [37] beschreven. De fractie van nucleair β-catenine gebonden hetzij TBE Sites I, II, III of IV in het menselijke COX2 promoter werd immunogeprecipiteerd met anti β-catenine antilichamen (Santa Cruz) en geëvalueerd door real-time-PCR met behulp van specifieke primers (Tabel S1) . Bovendien is de fractie van de RNA-polymerase II (Pol II) en geacetyleerde histonen H3 en H4 (H3ac en H4ac) verbonden met de regio TBE-II (-793 /-594) of het proximale gebied (-118 /+ 62 ) van de COX2 promotor werd op dezelfde wijze beoordeeld (anti-Pol-II, Santa Cruz, H3ac en H4ac, Upstate). Als een positieve controle gebruikten we de c-myc TBE site [38]. Antilichaamspecificiteit werd getest met normale konijnen-IgG (Santa Cruz).

elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA)

EMSA werd uitgevoerd onder toepassing van oligonucleotiden die hetzij de wildtype COX2 TBE-II consensussequentie (zie tabel S1) of eerder gemeld mutant TBE sequenties [39]. Kortom, wild-type en gemuteerd ^{32P-gelabelde oligonucleotiden werden geïncubeerd in bindingsbuffer met nucleaire extracten van MKN-45 cellen gedurende 30 minuten bij 30 ° C. Vervolgens werden DNA-eiwitcomplexen gescheiden van vrije oligonucleotiden op een 5% niet denaturerende polyacrylamidegel. Na elektroforese werd de gel gedroogd en blootgesteld aan film gedurende 1 dag. De visualisatie van radioactieve banden werd geanalyseerd met autoradiografie. Bindingsspecificiteit werd gecontroleerd door het incuberen van de DNA-eiwitcomplexen in aanwezigheid van een overmaat van niet-gemerkte wild-type of gemuteerde oligonucleotiden [21], [39].}

Statistische analyse

Elk experiment werd ten minste driemaal herhaald met drie replicaten. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD. Multigroep vergelijkingen werden uitgevoerd door eenzijdige ANOVA met de STATISTICA 9,0 software. P
. ≪ 0,05 werd beschouwd als significant

Resultaten

Cox2 expressie correleert met nucleair β-catenine levels in GC cellen

We aanvankelijk de expressie bepaald niveaus van COX2-mRNA in humane GC cellijnen MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII en AGS [40], [41], [42], en WI38 fibroblasten hier als controle cellijn [43], onderzoekt of zij werden gecorreleerd met Wnt /β-catenine signalering. Zoals weergegeven in figuur 1, werden sterke niveaus van COX2-expressie reeds na 26 cycli van PCR amplificatie in metastatische cellijnen MKN45, SNU16 en KATOIII, en ook in de AGS cellijn die is afgeleid van een primaire tumor. Dit resultaat is in overeenstemming met Cox2 expressie niveaus eerder in MKN45, KATOIII en AGS cellen opgespoord [44], [45], [46]. Daarentegen COX2 mRNA niveaus waren ofwel zeer lage WI38 in fibroblasten of niet detecteerbaar in N87 en SNU1 cellen (figuur 1A), wat suggereert dat deze differentiële expressiepatroon niet gerelateerd is aan metastatische stadia of het niveau van celtransformatie. Opmerkelijk, werden nucleaire β-catenine niveaus nauw verbonden met COX2-expressie, aangezien hoge niveaus van het eiwit waargenomen in MKN45, AGS, SNU16 en KATOIII cellen, in vergelijking met N87, SNU1 en WI38 cellen (Figuur 1B), wat een rol voor Wnt signalering in COX2 mRNA expressie in GC cellen.

Verbetering van de COX2 expressie via Wnt /β-catenine signalering

om te onderzoeken of de Wnt cascade betrokken is bij COX2 expressie, MKN45 cellen waren farmacologisch gestimuleerd verschillende tijdsperioden (bijvoorbeeld 1, 2, 4 en 8 uur) met hetzij lithium (LiCl) of valproïnezuur (VA), aangezien beide geneesmiddelen eerder is aangetoond dat Wnt signalering via remming van GSK3-activiteit te moduleren en aldus meer nucleaire niveaus van β-catenine [34], [35]. Interessant zagen we een duidelijke verbetering van COX2-expressie geïnduceerd door 10-20 mM LiCl of 5-10 mM VA, die begon kort na incubatie met de verbindingen en een piek na twee uur behandeling (figuur 2A). Real time bepaling van COX2-mRNA in MKN45 cellen eveneens behandeld met LiCl of VA (2 h) aangegeven dat COX2 aanzienlijk opgereguleerd (figuur 2B) en dat dit effect werd parallel met die waargenomen op Wnt /β-catenine doelgenen c-myc [47] en cycline D1 [48]. Next, om uit te sluiten dat de waargenomen verschijnsel tot uiting niet-specifieke effecten van de drugs die op eiwitten van invloed zijn verschillende signaling cascades, we toegepast direct een volledig functionele gezuiverd Wnt3a eiwit aan MKN45 cellen (zie Methoden). Deze experimenten toonden duidelijk aan dat 200-400 ng /ml gezuiverd Wnt3a aanzienlijk verbeterd COX2 mRNA expressie na korte perioden van incubatie (figuur 2), gedeeltelijk snel effect van LiCI en VA verklaren en ondersteunen een directe correlatie tussen Wnt /β-catenine activering en stimulering van COX-2 transcriptie in cellen GC.

Identificatie van nieuwe TBE plaatsen in de promoter van het COX2-gen

Vorige studies aangegeven dat Wnt /β-catenine responsieve TBE ter ( consensus kern: CTTTG) zich op -1079 /-1074 bp stroomopwaarts van de transcriptionele startplaats (TSS) van de humane COX2-gen [21] (Site IV Figuur 3A, zie ook figuur S1). Verdere scannen van de 1600 bp stroomopwaartse sequentie van de TSS [49] liet ons toe om 3 nieuwe kandidaat TBE sites te identificeren: -877 /-872 bp (Site III; sense oriëntatie), -689 /-684 bp en -318 /-313 bp (sites II en I, respectievelijk, zowel in antisense oriëntatie) (figuur 3A), die niet geconserveerd zijn tussen de menselijke en murine COX2-genen (Figuur S1). Daarom gekloneerde het 1600 bp segment van de humane COX2 promoter (pCOX2), inclusief alle vier TBE locaties in de pGL3-basic vector gefuseerd aan het luciferasegen die vervolgens worden gebruikt reporter assays (figuur 3A). Opmerkelijk parallel transfectie van 10 ng van dit construct in MKN-45 en HEK293 cellen onthulde dat pCOX2 vertoonden een significant hoger (9-voudig) basale promotoractiviteit in MKN45 cellen (Figuur 3B en C). Onze hypothese was dat deze hogere pCOX2 basale promotoractiviteit kan worden gerelateerd aan het hoge gehalte van nucleair β-catenine in de GC cellijn (Figuur 1B). Vandaar MKN45 en HEK293 cellen werden gecotransfecteerd met pCOX2 in aanwezigheid van lagere doses van een constitutief actieve β-catenine eiwit (S33Y) [31]. Zoals in Figuur 3, werd pCOX2 activiteit inderdaad verhoogd in beide celtypes, wat suggereert dat β-catenine kan binden en activeren TCF /LEF transcriptiefactoren op functioneel TBE sites in het pCOX2 promoter.

Bijdrage van TBE sites om COX2 promoter activiteit in GC cellen

om de bijdrage van de Wnt /β-catenine responsieve TBE plaatsen ontleden op de transcriptie-activiteit van de COX2 promotor vier pCOX2 deleties constructen werden gegenereerd: pCOX-1.2 (-1123 /+ 35 bp); pCOX-0,8 (-741 /+ 35 bp); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 bp); en pCOX-0,4 (-371 /+ 35 bp) (figuur 4A). Deze constructen werden vervolgens getest op hun activiteiten door middel van voorbijgaande transfecties in MKN45 en AGS cellen, met behulp van de WI38 fibroblasten als een controle cellijn. Consistent met het endogene COX2 expressieniveaus in deze AV cellijnen (figuur 1A), pCOX2 deleties behield verschillende activiteiten in MKN45 en AGS cellen (Figuur 4B en C). Daarentegen werd geen promoteractiviteit gedetecteerd in WI38 fibroblasten (Figuur 4D), zelfs wanneer de transfectie doses in deze cellen verhoogd 8 maal (i.e. 50-400 ng) (figuur S2). Belangrijk, en in overeenstemming met eerdere rapporten [50], WI38 cellen efficiënte expressie van een luciferase-reporter-construct die de promoter van het p21 gen (Figuur S2), wat aangeeft dat in deze controlecellen het moleculaire mechanisme verantwoordelijk is voor het induceren van COX2 transcriptie niet actief . Verdere experimenten toonden dat transfectie in MKN45 en AGS cellen met het construct pCOX2-0.8, die 859 bp verwijderd uit de 1,6 kb pCOX2 reporter (figuur 4A) heeft geleid tot een aanzienlijke toename van de promotoractiviteit in vergelijking met de pCOX2-1.2 reporter (Figuur 4A-C). Aangezien er geen significante verschillen waargenomen tussen de 1,6 Kb pCOX2 en pCOX2-1.2 constructies (figuur S3), hebben we niet verder analyses uitvoeren met de grotere construct. Belangrijker pCOX2-0.8 vertegenwoordigd de minimale promoter fragment vertoont de maximale basale activiteit, aangezien opnieuw deletie van hetzij 159 of 370 bp van het 5'-uiteinde, zoals het geval is bij de pCOX2-0.65 of pCOX2-0.4 constructen, respectievelijk , daalde meer dan 2 maal de niveaus van pCOX2 basale activiteit. Deze resultaten geven aan dat het gebied omvat tussen 0,8 en 0,65 Kbp stroomopwaarts van de TSS van het COX2-gen, en die een nieuwe TBE responselement omvat (TBE Site II; -689 /-684), kan een belangrijke component in de regulering van zijn de basale niveau van COX2 genexpressie in GC cellen.

opregulatie van pCOX2-0.8 via Wnt /β-catenine signalering

We naast onderzocht het effect van de Wnt /β-catenine signalering op de roman TBE Site II. We MKN45 getransfecteerde cellen met de pCOX2-0.8 reporter construct en co-expressie constitutieve actieve β-catenine eiwit S33Y hebben opgemerkt dat er een significant (2-voudig) verhoging van de transcriptionele activiteit van pCOX2-0.8. Het β-catenine-gemedieerde toename was specifiek aangezien de pCOX2-0.4 construct niet gestimuleerd in deze β-catenine overexpressie toestand (figuur 5A en B). Te controleren voor Wnt /β-catenine signalering in MKN45 cellen gebruikten we de Wnt /β-catenine responsieve SuperTOPFLASH (STF) reporter dragen 12 exemplaren van een TBE in tandem [32], die alleen getransfecteerd of in aanwezigheid van het plasmide coderende de mutant β-catenine S33Y eiwit. Interessant, terwijl de co-expressie met het mutante β-catenine S33Y eiwit in MKN45 cellen kunnen verbeteren (1,9-voudig) de activiteit van het STF verslaggever, hoge basale STF activiteit werden waargenomen in afwezigheid van het mutante β-catenine (Figuur 5C). Dit resultaat is in overeenstemming met onze eerdere bevindingen van hoge niveaus van endogene nucleaire β-catenine in dit celtype (zie figuur 1B), en bevestigt dat nucleaire factor functioneel. Deze bevinding verder te bevestigen, voerden wij identieke experimenten in HEK293 cellen verkregen wezen vergelijkbare resultaten, hoewel in dit geval een duidelijke dosis-respons curve werd verkregen als pCOX2-0.8 werd getransfecteerd in de aanwezigheid van toenemende concentraties van de constitutief actieve β-catenine S33Y eiwit (Figuur S4). Bovendien vonden we dat STF activiteit in HEK293 cellen was sterk reageert op het niveau van het exogene mutant β-catenine (Fig S4C).

Om verder de effecten van het Wnt /β-catenine route verkennen de activiteit van de pCOX2-0.8 voerden we loss-of-function experimenten met een dominant negatieve TCF4 (ΔTCF) construct, dat codeert voor een transcriptiefactor ontbreekt 30 residu's van de aminoterminus en kan niet β-catenine binden [32] . We vonden dat in MKN45 cellen ΔTCF expressie verminderd de hoge pCOX2-0.8 basale transcriptie in een dosis-afhankelijke wijze (Figuur 5D). Dit resultaat bevestigt de belangrijke rol van de TCF /LEF transcriptiefactoren onder de regulatoren van de activiteit van de pCOX2-0.8 promotorsequentie, en ondersteunt verder het idee dat de TBE Site II (-689 /-684) is betrokken bij de reactie op Wnt /β-catenine signalering.

Tenslotte direct de rol van de TBE Site II Wnt /β-catenine-gemedieerde regulering van de promoter COX2 pakken, introduceerden we door plaatsgerichte mutagenese een verandering in 2 belangrijke nucleotiden van de consensus sequentie van de TBE Site II kern (dwz pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Deze veranderingen zijn eerder aangetoond dat Wnt /β-catenine bemiddelde transcriptie [39] schaffen. Transiënte transfectie studies aangetoond dat mutatie van de TBE Site II significant verlaagd (2-3 maal) van de basale activiteit van pCOX2-0.8 construeren MKN45 cellen (figuur 5E) in vergelijking met het wildtype pCOX2-0.8 promoter construct. Bovendien, en in overeenstemming met onze vorige resultaten, mutatie van deze TBE website II bijna volledig geblokkeerd β-catenine bemiddelde versterking van de pCOX2-0.8 construct (Figuur S4). Samengenomen geven deze resultaten aan dat de TBE Site II (-689 /-684) is een functionele component in het COX2-gen transcriptionele regulatie.

β-catenine bindt aan het COX2-gen promotergebied bevat de TBE Site II

Omdat een transcriptioneel actieve conformatie van chromatinestructuur wordt gereflecteerd door een verhoogd niveau van histonacetylering [51], we neergeslagen verknoopt chromatine fragmenten (gemiddelde grootte bp 300-500) geïsoleerd uit MKN45 cellen met behulp van specifieke polyklonale antilichamen voor geacetyleerde histonen H3 en H4. Evenzo, detecteerden we binding van RNA polymerase II (Pol II) als een parameter die normaal zijn voor transcriptionele activiteit. Onderzochten we de verrijking in onze neerslagen van twee promoter sequenties: de proximale promotor (PP) gebied (-118 /+ 62 van TSS) en de distale gebied (-793 /-594) van de COX2 promotor met de consensus TBE Site II ( -689 /-684). Met name werd de TBE Site II gerichte sinds vorige experimenten gaven preferentiële binding van β-catenine dit promotorgebied (Figuur S5). Als positieve controle evalueerden wij binding bij de TBE locatie in de promotor van het c-myc gen (-1447 /-1144 van TSS), die eerder in darmkankercellen werd beschreven [38].

Geacetyleerd histonen H3 en H4 en de Polimerase II enzym gevonden binnen de proximale promoter regio (figuur 6A) te binden, wat aangeeft dat de chromatine structuur rond de Cox2 promotor in MKN45 cellen in een open conformatie, dus in overeenstemming met onze eerdere resultaten laten zien dat de COX2-gen is actief transcriberen. Met name werd de β-catenine eiwit immunologisch neergeslagen uit monsters MKN45 meestal in combinatie met de promoter regio die het -684 /-689 TBE sequentie in het COX2-gen (Figuur 6B). Deze factor is bijna niet detecteerbaar aan het proximale promotorgebied, wat aangeeft dat endogene nucleaire β-catenine primair aangeworven om de TBE Site II in deze AV cellen. Zoals verwacht, was endogene β-catenine in gelijke mate aan de c-myc promoter TBE site op niveaus die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in de COX2-gen promoter (Figuur 6C) zijn.

Tezamen zijn deze experimenten geven aan dat de TBE Site II direct betrokken bij-β-catenine bemiddelde transcriptie activatie van de COX2 promoter. Om deze resultaten voerden we elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA) in de nucleaire extracten van MKN45 cellen verder te bevestigen. Voor dit doel opgesteld we 34-gebaseerde gepaarde oligonucleotiden; een met het wildtype -689 /-684 TBE Site II sequentie (dwz CTACAAAGA; onderstreepte residuen die de kern), en twee oligonucleotiden bevatten missense mutaties in ofwel de kern van de TBE Site II (bijv CTACGAGGA: TBE-Mut1) of in de flankerende sequentie (bijv CGCCAAAGA: TBE-Mut2), zoals eerder gerapporteerd [21], [39]. Zoals getoond in figuur 6D, het radioactief gemerkte wildtype TBE probe staat om achtergebleven DNA-eiwitcomplexen vormen indien geïncubeerd met nucleaire extracten uit cellen MKN45. Deze eiwit-DNA-complexen werden bepaald omdat de toevoeging van een overmaat koud wildtype oligonucleotiden (50-voudig) aanzienlijk remde de vorming van het DNA-eiwitcomplex (figuur 6D, laan 3 en 4, respectievelijk). De radioactief gemerkte mutant TBE-Mut1 probe was niet in staat om DNA-eiwitcomplexen vormen op zich, noch te concurreren met de wild-type oligonucleotide als in overmaat toegevoegd koude probe (Figuur 6D, laan 5 en 6 respectievelijk). Vergelijkbare resultaten werden verkregen wanneer de tweede koude TBE-Mut2 probe werd gebruikt als een concurrent (figuur 6D, laan 7). Alles bij elkaar tonen deze resultaten aan dat de nieuwe TBE Site II in de COX2 promotor betrokken bij de transcriptionele activering van het COX2-gen door het aantrekken van de machine belast transduceren Wnt /β-catenine signalering (figuur 6E).

Discussie

Eerdere studies hebben een rol voor Wnt /β-catenine signalering tijdens het ontstaan ​​en /of de ontwikkeling van verschillende kankersoorten gesuggereerd via modulatie van de expressie van het COX2-gen [25]. In dit onderzoek hebben wij sterk bewijs een directe rol voor Wnt /β-catenine signalering in de controle van COX2-expressie in cellen GC gepresenteerd. Ten eerste hebben wij aangetoond dat er een nauwe correlatie tussen COX2-expressie en nucleaire inhoud van β-catenine, die lijkt onafhankelijk van of maligniteit of transformatie staat CG cellen. Ten tweede, werd tijd- en dosisafhankelijke versterking van COX2-expressie snel waargenomen na inductie (2 uur) met hetzij farmacologische samenstelling nabootsen Wnt /β-catenine signalering. Derde gen reporter testen evalueren van de COX2 promoteractiviteit in reactie op gain en loss-of-function experimenten, waaronder een constitutief actief β-catenine eiwit en dominant negatieve TCF4 transcriptiefactor, tonen dat Wnt /β-catenine componenten zijn betrokken bij de transcriptionele regulatie van het COX2-gen

We hebben hier ook aangetoond dat binnen 2 Kbp stroomopwaarts van de menselijke promoter COX2 er vier vermeende TBE sites. (kern: CTTTG), waarvan eerder door Araki en onderzocht cols [21], [28]. Door middel van genetische reporter assays met verschillende pCOX2 deletieconstructen hebben we laten zien dat pCOX2-0.8 verschijnt de hoogste basale transcriptie-activiteit in het GC cellen MKN45 en AGS. Interessant pCOX2-0.8 handhaafde de TBE Site-II (-689 /-684) integriteit aangeeft de belangrijkste bijdrage aan de regulering van de transcriptie activiteit van het COX2-gen. Met name de volledige pCOX2 TBE Site II handtekening (d.w.z. 5'-WWCAAAGS-3 '; S = C /G, W = A /T), lijkt de optimale TCF site beschreven door van de Wetering en cols. [52], die vervolgens werd gebruikt om echte Wnt-transcriptie-targets te identificeren in de Drosophila
genen NKD Kopen en CG6234
[53].

functionaliteit van deze TBE Site II werd ook bevestigd door onze mutagenese studies. Als we dus de TBE-signatuursequentie in de pCOX2-0.8 construct (MpCOX2-0.8) gemuteerd, werd vastgesteld dat basale COX2 promoteractiviteit aanzienlijk werd beïnvloed MKN45 cellen. Naast onze chip en EMSA analyses bevestigden dat β-catenine voorkeur wordt aangetrokken om de -689 /-684 COX2 promotorgebied in GC cellen, op een niveau dat lijkt op die gevonden op de c-myc promoter [38]. Dergelijke interactie treedt met voorkeur op dit gebied van de COX2 genpromotor als geen β-catenine blijkt te binden aan het proximale promotorgebied van het COX2-gen. Al met al geven deze resultaten aan dat de TBE Site II is een functioneel Wnt /β-catenine responsief element in het menselijk Cox2 promoter. Onze gegevens, echter, sluit niet uit dat de bijdrage van andere genomische regio's in het menselijke Cox2 gen [21]. In plaats daarvan, stellen wij voor dat een complex web van interacties in GC cellen aanwezig is waar de TBE Site II samen met andere respons elementen om up-reguleren Cox2 expressie.

Als onze resultaten in GC cellen in overeenstemming zijn met die gerapporteerd voor darmkankercellen, is het verleidelijk om te speculeren dat Wnt /β-catenine signalering op dezelfde manier kunnen worden betrokken bij Cox2 regelgeving in andere tumoren [21], [28]. Inderdaad, matige tot sterke eiwitniveaus van β-catenine kan worden waargenomen in ca. 72% van alle kankers bij de mens Atlas Protein databank weefsel [54] geanalyseerd. Ook sterke tot matige cytoplasmatische kleuring COX2 en matige membraanreactiviteit waargenomen in 50% van alle kankers, zoals colorectale, prostaatkanker, baarmoederhalskanker, endometriumkanker, urotheel, pancreas, lever en kliercellen aan maag- tumorweefsel.

• PLoS ONE: MicroRNA Laat-7F Remt tumorinvasie en metastase door zich te richten MYH9 in Human Gastric Cancer
• PLoS ONE: Sonic Hedgehog Pathway is essentieel voor het onderhoud of Cancer Stem-achtige cellen in Menselijke Maag Cancer