Background VerfÜgung
erhéicht Ausdrock vun der cyclooxygenase-2 Aktivitéit (COX2) verbessert ass eent vun den Haapt Charakteristiken vun gastric Kriibs (GC), déi eng Virreiderroll Doudesursaach an der Welt ass, besonnesch an Asien an Lateinamerika. Obwuel d'Wnt /β-catenin sécher Passerelle huet an der transcriptional Aktivatioun vun der COX2 Gentherapie, déi genee Mechanismus modulating dës Äntwert ass nach onbekannt. VerfÜgung
Methodik /Principal effektiv VerfÜgung
Hei studéiert mir verwëckelt der transcriptional Regulatioun vun der COX2 Gentherapie am GC Zell Linnen an évaluéieren ob dëst Phänomen vun Wnt /β-catenin sécher modulated ass. Mir iwwerpréift éischt den Ausdrock vun COX2 mRNA am GC Zellen a fonnt, datt et eng Ausdrock Muster konsequent mat héijen Niveau vun nuklearem-en der β-catenin Ënnerscheed ass. Pharmacological Behandlung mat entweder Lithium oder valproic Seier an molekulare Aféierungs- mat stilvoller kanonesche Wnt3a bedeitend verstäerkt COX2 mRNA Ausdrock vun enger dose- an Zäit-ofhängeg täteg. Serial Läsche vun engem 1,6 Kbp COX2 Promoteur ofgesprengt an gain- oder Verloscht-vun-Funktioun Experimenter erlaabt eis eng minimal Wnt /β-catenin responsiven Regioun ze identifizéieren déi aus 0,8 Kbp vun der COX2 Promoteur (pCOX2-0.8), deen Bäschten Äntwert zougedréckt an der Gentherapie-reporter assays. Der Aktivitéit vun dëser pCOX2-0.8 Promoteur Regioun gouf weider vun Site-Direkter mutagenesis an DNA-FAQ bindend assays confirméiert. VerfÜgung
Konklusiounen /Grousses VerfÜgung
Mir schléissen, datt d'pCOX2-0.8 minimal Promoteur enthält eng Roman funktionell T-Zell Faktor /lymphoid enhancer Faktor (TCF /LEF) -response Element (TBE Site II; -689 /-684) déi direkt op verstäerkte Wnt /β-catenin sécher reagéiert an déi fir d'agesat /Werdegang wichteg kënnen vun GC VerfÜgung
Fro:. Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino M, de Ferrari hie (2011) Wnt /β-Catenin sécher verbessert Cyclooxygenase-2 (COX2) Transcriptional Aktivitéit zu Gastric Cancer BTS. PLoS NËMMEN 6 (4): e18562. Doi: 10.1371 /journal.pone.0018562 VerfÜgung
Redakter: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institut, Vereenegt Staate vun Amerika VerfÜgung
Arnaque: November 5, 2010; Akzeptéiert: 11. Mäerz 2011; Publizéiert: Abrëll 6, 2011 VerfÜgung
Copyright: © 2011 Nuñez et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung
Funding:. Dës Aarbecht Comisión nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT) heimat Zuel PBCT-6 aus der Bankreiber Regierung (MM an GVD) - war vun CTI-Kriibs, Programa Bicentenario en Ciencia y Tecnología (PBCT) ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung
Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung
Gastric Kriibs (GC) ass eng multifactorial Krankheet, déi héichgradeg malignant neoplasms an der gastric mucosa charakteriséiert, a stellt d'zweete Spëtzekandidat Ursaach vum Kriibs Doud weltwäit mat der héchster prevalence an Asien a Südamerika [1], [ ,,,0],2], [3]. Ëmweltpolitik verbonne Risiko Facteure gehéiert och Ernährung, Tubak Konsum, Obesitéit a Helicobacter pylori VerfÜgung Wonn [4]. Verschiddene Projet'en am entholl-suppressor Genen, adenomatous polyposis belaascht (APC), E-cadherin an RUNX3 [3], [5], souwéi am oncogenes wëll k-ras, HER2 an β-catenin dorënner P53, [3], [6], [7], hunn am GC dokumentéiert ginn. Doriwwer, iwwer Ausdrock vu verschiddene Genen huet dokumentéiert ginn, dorënner WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], an der cyclooxygenase 2 (COX2) Aktivitéit, déi den entscheedende Schrëtt an der Produktioun vun prostaglandin E2 catalyzes, e Schlëssel Vermëttler vu gemeinsame inflammation [10], [11]. VerfÜgung Et huet observéiert gouf, datt den Ausdrock vun der COX2 Gentherapie wiesentlech zu Mënsch gastric adenocarcinoma Stoffer fräi ass, wou mat vläit gastric mucosal uplanzen ouni Kriibs Zellen Verglach [10 ]. Esou fräi Meenungsäusserung ass d'Intensitéit vun Invasioun, Gréisst, lymph Node Investitiounen, entholl Entwécklung a schlecht hätt [4], [12], [13] zu Afloss proposéiert. An dat wat, beschreiwen grouss Quantitéiten vun Donnéeën Chimio-präventive an anticancer Aktivitéit vun Net steroidal anti-demagogesch Drogen (NSAID) dorënner selektiv COX2 inhibitors wéi méiglech Traitementer fir GC [10], [11], [14]. VerfÜgung Transcriptional Kontroll vun der COX2 Gentherapie hänkt op der molekulare Maschinnen mat der COX2 Promoteur proposéiert, déi duerch d'Aktivitéit vun verschiddenen sécher Weeër [15], [16], [17] kontrolléiert gin schéngt. Iwwerhaapt, et war am Ufank etabléiert, datt CRE (-59 /-53), NF-IL6 (-132 /-124) an NF-κB (-233 /-214) Konsens Message vun der COX2 Promoteur fir den Ausdrock vun der néideg waren Gene [16]. Kierzunge funktionell Studien an der COX2 Promoteur identifizéiert enger Serie vun reglementaresche Elementer vun der Reunioun vun der Gentherapie deelhuelen, dorënner AP-1, AP-2, SP-1, C /EBPβ [18], [19], [20] an Proteinen gehéiert zu den T-Zell Faktor /Lymphoid enhancer Faktor (TCF /LEF) Famill vun Transkriptiouns Faktoren, déi fir Wnt /β-catenin Signal transduction entscheedende ginn [21]. VerfÜgung d'Wnt /β-catenin sécher Passerelle dicht unerkanntent eng grouss Roll am mënschleche Krankheet, besonnesch an der gezu goufen an Entwécklung vun Kriibs [22], [23], esou spillt [24] ass. Spannen, hu rezent Experimenter am GC ofgeleet Zellen eng Relatioun tëscht COX2 Ausdrock dës Distanz an der inhibition vun de Glycogène Synthase Kinase-3β (GSK3β) Aktivitéit [25], déi e Schlëssel Wnt Volet ass, datt β-catenin phosphorylates an ënnerstëtzt seng Kierzunge ofgeschnidden via proteasome [26]. Der Relatioun tëscht Wnt /β-catenin an COX2 Ausdrock vun verschidden Kriibs Zell Modeller ass wäit ewech vun den folgenden Studien ënnerstëtzt. Éischten, et gouf an der mammary epithelium datt Wnt /β-catenin Leeschtung onerwaart Effekt op COX2 Transkriptiouns observéiert, déi vun uewen-Regulatioun vun enger Tëschestatioun Faktor PEA3 [27] mediated ginn hätt. Zweet, an am Géigesaz zu enger indirekter Modus vun Aktiounen, Araki an Fort. [21] gemellt dass an Colon Kriibs Zellen et en Aféierungs- zu COX2 Ausdrock duerch eng β-catenin /TCF ofhängeg Mechanismus, an charakteriséiert deelweis e Konsens TCF /LEF bindend Site (TBE: Kär CTTTG) Miessstatiounen 1.079 BP Offloss vun der transcriptional ufänken Site vun der COX2 Promoteur. Drëtt, war et observéiert datt zu Colon Kriibs Patienten an ofgeleet Zell Zeilen do ass eng Associatioun tëscht overexpression vun der Wnt Passerelle-verbonne Proteinen LEF-1 an Pontin52 /TIP49a a weider-Regulatioun vun COX2 Ausdrock [28]. Endlech, mat chondrocytes, huet et gouf bewisen, dass LEF-1, zesumme mat β-catenin, regulariséiert COX2 Ausdrock vun direkter bindend vun der LEF-1 /β-catenin komplex fir d'3'UTR Regioun vun der COX2 Frankräich nët [29] . Dofir, am Moment ass et net eng kloer Bild wéi bis ob Wnt sécher an COX2 Gentherapie Ausdrock Équipe ass, oder well hir Roll am GC agesat /Werdegang. Hei géng mir ze verstoen ob et eng direkt Regulatioun vun der COX2 Gentherapie Ausdrock via Wnt /β-catenin sécher an zu Wnt /β-catenin reglementaresche Elementer an de Promoteur Regioun vun der COX2 Gentherapie identifizéieren déi COX2 Transkriptiouns am GC Zellen upregulate kann. VerfÜgung BTS an VerfÜgung Kultur Konditiounen Mënscherechter Zell-Linnen MKN45 (japanesch Collection vun Research Bioresources, Japan), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 an HEK293 (American Type Kultur Collection; Rockville, MD) waren an dëser Etude benotzt. MKN45, N87, SNU1 an KATOIII Zellen sech am RMPI Medien (Gibco) ugebaut; AGS zu F12K mëttelfristeg (Hyclone); WI38 zu EMEM (Gibco); an HEK293 zu DMEM (Gibco). Kultur Medien war mat 10% FBS (Gibco) (AGS mat 20%) an 1% penicillin /streptomycin ergänzt. Zell-Linnen waren um 37 ° C an 5% CO haten 2 an Boverie Loftfiichtegkeet. VerfÜgung Plasmids a Site-Direkter mutagenesis VerfÜgung D'SuperTOPFlash-luciferase an der Praxis-TkLanguage renilla- luciferase plasmids [30], de konstitutiven aktiv β-catenin (S33Y) [31] an den dominanten-negativ ΔTCF4 Ausdrock plasmids [32] gewiescht virdru beschriwwen. Chimeric COX2 Promoteur-luciferase Fragmenter sech vun Hinnen alleguer entsteet aus Mënsch Frankräich DNA mat spezifesche primers Restriktioun Siten wou an dono an de pGL3-Grondakommes Vecteure (Promega) gesaat. D'Projet'en am TBE-II Site (-689 /-684) vun der COX2 Promoteur sech generéiert primers pCOX-0,8-TBEMUT mat der QuickChange Site-Direkter mutagesis Kit (Stratagene) benotzt. Gesond goufen duerch direkt sequencing (ABI-3130 genetesch Organer, Obwuel Biosystems) ubelaangt. Primers Message sinn an Table S1 beschriwwen. VerfÜgung Semiquantitative a Real Time RT-Hinnen alleguer VerfÜgung Total RNS war zu RNAse gratis Konditiounen benotzt TRIZOL (Invitrogen) an 2 μg vun RNS war ëmgedréint ausserdeem mat 200 ofgebaut u vun SuperScript II Réckproduktioun Transcriptase (RT) (Invitrogen) mat 500 NG vun Oligo (DT) primers. Experimentell Determinatioun vun COX2, c-myc an CCND1 mRNA Niveauen war no [33] gesuergt. Kuerz, goufen cDNAs fir Real-Time Hinnen alleguer op en iCycler IQ System (Bio-Rad Laboratoiren) ënnerworf. All 25 μl Reaktioun Volumen enthale 1 Eenheet vun Platin Taq DNA polymerase (Invitrogen), 1x Reaktioun Prellbock (20 mm Tris-HCl pH 8.4, an 50 mm KCl), 1,5 mm MgCl 2, 2,5 μg BSA, 0,01% Glycerol , 200 μM vun dNTPs, 0.3X SYBR Green Léisung an 0,4 μM vun spezifesch primers (kuckt Table S1). Hinnen alleguer ware Set wéi follegt: 90 Sekonnen op 94 ° C an dann 30 Zykle vun 30 Sekonnen op 94 ° C, 30 Sekonnen an 62 ° C an 30 Sekonnen op 72 ° C. All Reaktioune waren am triplicate a Resultater zu deenen am parallel mat β-actin kritt kritt standing fir all Gentherapie sech normalized. D'Qualitéit vun den RNS an Hinnen alleguer Produiten uechter d'Experiment via electrophoresis op 1% agarose gels, Kierchefënster mat ethidium bromide iwwerwaacht gouf. VerfÜgung Schulung vun de Wnt /β-catenin sécher Passerelle VerfÜgung Wnt sécher war zu MKN45 Zellen rakommen zu 6 gutt Kultur Placke bei 80-90% vun Niewebaach pharmacologically entschlof (dh 1, 2, 4 an 8 h vu incubation) entweder mat 10-20 mm vun LiCl (Fläch) oder 5-10 mm vun valproic Seier (VA; Fläch) wéi virdru beschriwwen [34], [35]. Dunn, Zellen sech fir mRNA erauszéien an Echtzäit-Hinnen alleguer Determinatioun gesammelt wéi uewe beschriwwen. Den Zerfall, goufen MKN45 Zellen fir 2 Stonnen mat 200 an 400 Dummeldéng /ml vun sidd Wnt3a FAQ stimuléiert. Offäll vu Wnt3a war ëmschriwwen duerchgefouert [36]. VerfÜgung Transcriptional Aktivitéit vun der VerfÜgung COX2 Promoteur Aktivitéit vun der COX2 Promoteur war zu 80-90% a Spuenien wär MKN45, AGS, WI38 an HEK293 gemooss Zellen zu 6 gutt Kultur Placke rakommen. Kuerz, goufen Zellen mat FUGENE (Roche) fir 24 mat der pCOX2-luciferase oder der pSuperTOPFlash gemellt an entweder konstitutiven aktiv β-catenin (S33Y) [31] oder d'dominant-negativ ΔTCF4 Co-transfected [32] gesond. Der Praxis-TkLanguage renilla luciferase plasmid war wéi eng intern Kontroll benotzt. Liichtkäfer an renilla luciferase Aktivitéite sech mat der Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega) an engem Victor-3 multiplate Lieser Instrument (Perkin Elmer) determinéiert, wéi virdru beschriwwen [30]. Relativer luciferase Aktivitéite sech duerch Partitur Liichtkäfer luciferase Aktivitéit mat renilla luciferase Aktivitéit fir all Prouf (N = 3, all am triplicate) ausgedréckt. VerfÜgung Chromatin immunoprecipitation (Chip) assays VerfÜgung Chip Studien huet standing zu MKN45 Zellen wéi virdrun beschriwwen [37]. D'Ëmwandlung vun nuklearem β-catenin entweder ze TBE z'erwaarde I, II, III oder IV an der mënschlecher COX2 Promoteur gebonnen huet immunoprecipitated mat anti β-catenin antibodies (Santa Cruz) an déi richteg Zäit-Hinnen alleguer évaluéieren mat spezifesche primers (Table S1) . Ausserdeem, niewent der Ëmwandlung vun den RNS polymerase II (Pol-II) an acetylated histones H3 an H4 (H3ac an H4ac) entweder op der TBE-II Regioun (-793 /-594) oder déi proximal Regioun (-118 /+ 62 ) vun der COX2 Promoteur war ähnlech évaluéieren (anti-Pol-II, Santa Cruz; H3ac an H4ac, Upstate). Als positiv Kontroll benotzt mir d'c-myc TBE Site [38]. Antibody Spezifizitéit huet mat normal Kanéngchen-IgG (Santa Cruz) assayed. VerfÜgung Electrophoretic Mobilitéit Verréckelung assay (EMSA) VerfÜgung EMSA war mat oligonucleotides standing entweder d'Wildwest-Typ COX2 TBE-II Konsens Haaptrei wouvun (kuckt Table S1) oder virdrun gemellt Mann- TBE Message [39]. An dowéinst, wëll-Typ an mutated statistique Analyse VerfÜgung All Experimenter huet op d'mannst dräi mol mat dräi gefaart widderholl. Date sinn wéi déi heeschen ± Fils gewisen. Multiple Grupp Vergläicher sech duerch eent-Manéier standing ANOVA den 9.0 Software STATISTICA benotzt. P VerfÜgung &Si besteet;. 0,05 war bedeitendst als VerfÜgung COX2 Ausdrock deemolegt Weltbild mat nuklear β-catenin Niveauen am GC Zellen VerfÜgung Mir Ufank vum Ausdrock sech Niveau vun COX2 mRNA zu Mënsch GC Zell-Linnen MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII an AGS [40], [41], [42], souwéi WI38 hei esou eng Kontroll Zell Linn [43] benotzt Här iwert mech selwer, waat ob se sech mat Wnt /β-catenin sécher soll. Als zu Dorënner duergestallt 1, sech staark Niveau vun COX2 Ausdrock esou fréi wéi 26 Zykle vun Hinnen alleguer amplification zu metastatic Zell Linnen MKN45, SNU16 an KATOIII, observéiert a vun der AGS Zell Linn och, datt aus enger Primärschoul entholl ofgeleet ass. Dëst Resultat ass am Accord mat Niveauen COX2 Ausdrock fonnt virdrun zu MKN45, KATOIII an AGS Zellen [44], [45], [46]. Am Géigesaz, huet COX2 mRNA Niveau entweder Héich zu WI38 Här iwert mech selwer oder undetectable zu N87 an SNU1 Zellen (Dorënner 1A) suggeréiert datt dës Ënnerscheed Muster vun Ausdrock net ze metastatic Etappen oder den Niveau vun Zell Transformatioun Zesummenhang ass. Bemierkenswäert, huet nuklear β-catenin Niveau enk mat COX2 Ausdrock ze dinn, well héich Niveaue vun der FAQ observéiert goufen zu MKN45, AGS, SNU16 an KATOIII Zellen, am Verglach mat der N87, SNU1 an WI38 Zellen (Dorënner 1B), eng Roll fir Wnt zousätzlech zu COX2 mRNA Ausdrock am GC Zellen sécher. VerfÜgung Opléisung vun COX2 Ausdrock via Wnt /β-catenin sécher VerfÜgung fir ze iwwerpréifen, ob de Wnt CASCADE zu COX2 Ausdrock Équipe ass, waren MKN45 Zellen pharmacologically fir verschidden Zäitspann stimuléiert (dh 1, 2, 4 an 8 h) mat entweder Lithium (LiCl) oder valproic Seier (VA), well souwuel Drogen virdrun goufen Wnt sécher via inhibition vun GSK3β Aktivitéit dës Distanz bis well an domat nuklear waarden Niveau vun β-catenin [34], [35]. Spannen, observéiert mir eng schéi Opléisung vun Ausdrock COX2 entschlof vun 10-20 mm LiCl oder 5-10 mm VA, datt mat der awer kuerz nom incubation huet a wat erreecht no zwou Stonne vu Behandlung (Dorënner 2A). Real Zäit Determinatioun vun COX2 mRNA Niveauen am MKN45 Zellen selwecht behandelt mat LiCl oder VA (2 h) uginn, datt COX2 war vill weider-reegelen (Dorënner 2B) an datt dës Effekt war mat der een paralleled observéiert op Wnt /β-catenin Zil- Genen c-myc [47] an cyclin D1 [48]. Next, applizéiert d'Méiglechkeet ze ausschléissen, fir datt d'observéiert Phänomen Net-spezifesch Auswierkunge vun Drogen spigelt sech dauernd op Proteinen anescht wéi sécher CASCADES betrëfft, mir MKN45 Zellen e voll funktionell sidd Wnt3a FAQ fir direkt (kuckt Method). Dës Experimenter weisen kloer dass 200-400 /ml vun sidd Wnt3a bedeitend verstäerkt COX2 mRNA Ausdrock no kuerzer Zäitspann vun incubation NG (Dorënner 2), deelweis d'rapid Effet vun LiCl an VA kenneléieren an engem direkten Korrelatioun tëscht kanonesche Wnt /β-catenin ënnerstëtz Aktivéierung an Stimulatioun vun COX-2 Transkriptiouns am GC Zellen. VerfÜgung Umeldung vun Roman TBE Siten an de Promoteur vun der COX2 Gentherapie VerfÜgung virdrun Studien uginn datt e Wnt /β-catenin responsiven TBE Site ( Konsens Kär:; Dorënner 3A, gesinn och Dorënner S1) CTTTG) ass bei -1,079 /-1,074 BP Offloss vun der transcriptional Start Site (TSS) vun der mënschlecher COX2 Gentherapie [21] (Site IV wellkomm. Weider Scannen vun der 1.600 BP Offloss entsteet aus dem TSS [49] Nodeems eis 3 Roman putative TBE Siten ze identifizéieren: -877 /-872 BP (Site III; Sënn Orientéierung), -689 /-684 BP an -318 /-313 BP (z'erwaarde II an ech, bzw.; souwuel zu antisense Orientéierung) (Dorënner 3A), déi tëscht dem Mënsch an murine COX2 Genen (Dorënner S1) conserved sinn net. Mir gekloonten also der 1.600 BP Segment vun de Mënscherechter COX2 Promoteur (pCOX2), inklusiv all véier TBE Siten, an déi pGL3-Basis Vecteure fir d'luciferase Gentherapie Äonen dono zu reporter assays (Dorënner 3A) benotzt ginn. Bemierkenswäert, paralleled transfection vun 10 NG vun dëser bauen an MKN-45 an HEK293 Zellen Teamchef pCOX2 e wesentleche héich (9-fantastesch) basal Promoteur Aktivitéit zu MKN45 Zellen (Dorënner 3B an C) ugewisen. Mir Hypothes, datt dat méi héich pCOX2 basal Promoteur Aktivitéit fir d'nik Inhalt vun nuklearem β-catenin an dëser GC Zell Linn (Dorënner 1B) Zesummenhang kéint. Dofir, goufen MKN45 an HEK293 Zellen mat pCOX2 an der Präsenz vun den ënneschten Dosis vun engem konstitutive aktiv β-catenin FAQ (S33Y) [31] Co-transfected. Als zu Dorënner observéiert 3, war pCOX2 Aktivitéit Exemplar vun béiden Zell Zorte gestäerkt, datt β-catenin suggeréiert festleeën kann an dann Faktoren TCF /LEF Transkriptiouns um funktionell TBE Siten am pCOX2 Promoteur aktivéieren. VerfÜgung Bäitrag vun TBE Promoteur Aktivitéit Siten zu COX2 am GC Zellen VerfÜgung de Bäitrag vun Wnt /β-catenin responsiven TBE Siten op der transcriptional Aktivitéit vun der COX2 Promoteur véier pCOX2 geläscht gesond generéiert goufen fir dissect: pCOX-1,2 (-1.123 /+ 35 BP); pCOX-0,8 (-741 /+ 35 BP); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 BP); an pCOX-0,4 (-371 /+ 35 BP) (Dorënner 4A). Dës gesond waren duerno fir hir Aktivitéit duerch flüchteg transfections zu MKN45 an AGS Zellen assayed, mat der WI38 Här iwert mech selwer als eng Kontroll Zell Linn. Konsequent mat der endogenous COX2 Ausdrock Niveauen an dës GC Zell Linnen (Dorënner 1A), erëmgewielt pCOX2 geläscht veschidden Nivo'en vun Aktivitéit zu MKN45 an AGS Zellen (Dorënner 4B an C). Am Géigesaz, war keen Promoteur Aktivitéit zu WI38 Här iwert mech selwer (Dorënner 4D) fonnt, och wann de transfection Schrëtt an dës Zellen 8 fantastesch eropzesetzen (i.e. vun 50 bis 400 NG) (Dorënner S2). Wichtegst, an am Accord mat virdrun Rapporten [50], ausgedréckt WI38 Zellen effizient engem luciferase-reporter bauen de Promoteur vun der p21 Gentherapie (Dorënner S2) mat, wat beweist, datt de molekulare Maschinnen responsabel fir Pinguin COX2 Transkriptiouns an dës Kontroll Zellen net aktiv ass . Weider Experimenter Teamchef transfection zu MKN45 an AGS Zellen mat der pCOX2-0.8 bauen, déi aus der 1,6 kb pCOX2 reporter (Dorënner 4A), e groussen Zouhuele vun de Promoteur Aktivitéit geläscht 859 BP huet wéi mat der pCOX2-1.2 reporter Verglach (Well 4A-C). Well keng grouss Ënnerscheeder tëscht der 1,6 kb pCOX2 an pCOX2-1.2 gesond (Dorënner S3) observéiert goufen, huet besser mir net Analysë weider mat de groussen bauen. Wichtegst, representéiert pCOX2-0.8 de Promoteur ofgesprengt minimal Gréisst vun de Maximum basal Aktivitéit suer-, well weider Läschen entweder 159 oder 370 BP aus der 5'-Enn, wéi et de Fall mat der pCOX2-0.65 oder pCOX2-0.4 gesond ass, bzw. , rofgaang ass méi wéi den Niveau vun pCOX2 basal Aktivitéit 2-fantastesch. Dës Resultater weisen, datt d'Regioun aus tëscht 0,8 an 0.65 Kbp Offloss vun der TSS vun der COX2 Gentherapie, an deem ënner anerem e Roman TBE Äntwert Element (TBE Site II; -689 /-684), kann e Schlësselelement während der Regelung vun der basal Niveau vun COX2 Gentherapie Ausdrock am GC Zellen. VerfÜgung Upregulation vun pCOX2-0.8 via Wnt /β-catenin sécher VerfÜgung Mir iwwerpréift nächst den Effet vun Wnt /β-catenin sécher am Roman TBE Site II. Mir transfected MKN45 Zellen mat der pCOX2-0.8 reporter bauen an de konstitutiven aktiv β-catenin S33Y FAQ Co-ausgedréckt Observatioun, datt et e wesentlechen (2-fantastesch) Opléisung vun der transcriptional Aktivitéit vun pCOX2-0.8. Dëst β-catenin-mediated Erhéijung war spezifesch zënter der pCOX2-0.4 bauen net an dësem β-catenin iwwer-Ausdrock Bedingung (Dorënner 5A an B) stimuléiert war. Ze kontrolléieren, fir Wnt /β-catenin sécher an MKN45 Zellen mir de Wnt /β-catenin responsiven SuperTOPFLASH (STF) reporter Droen 12 Kopien vun engem TBE zu zwee benotzt [32], déi sech eleng transfected oder an der Präsenz vun der plasmid coding fir d'Mann- β-catenin S33Y FAQ. Spannen, iwwerdeems Co-Ausdrock mat der Mann- β-catenin S33Y FAQ zu MKN45 Zellen revaloriséiert gebass a (1,9-fantastesch) d'Aktivitéit vun der STF Rapporteur, héije Niveau vun basal STF Aktivitéit sech an de Flichte vun de Mann- β-catenin fonnt (Well 5C). Dëst Resultat ass am Accord mat eiser leschter Conclusiounen vun héije Niveau vun endogenous nuklear β-catenin an dëser Zell-Typ (kuckt Dorënner 1B), a confirméiert, datt dës nuklear Faktor funktionell ass. Fir weider dat fannen confirméieren, standing mir identesch Experimenter zu HEK293 Zellen a kritt Fong ähnleche Resultater obwuel an dësem Fall eng kloer Portioun-Äntwert rop kritt huet, wann pCOX2-0.8 an der Präsenz transfected war vun Konzentratioune vun der constitutively aktiv β-catenin S33Y waarden FAQ (Dorënner S4). Zousätzlech fonnt mir dass STF Aktivitéit zu HEK293 Zellen zu den Niveau vun der exogenous Mann- β-catenin (Dorënner S4C) héich responsiven war. VerfÜgung beschen Fir weider d'Effekter vun der Wnt /β-catenin Passerelle op der Aktivitéit 30 Reschter vun sengem Aminosaier-Kappgare vun der pCOX2-0.8 duerchgefouert mir Verloscht-vun-Funktioun Experimenter mat engem dominante negativ TCF4 (ΔTCF) bauen eraus, déi Coden fir eng Transkriptiouns Faktor suivéiert an dat ass knapp β-catenin zu kruet [32] . Mir hu fonnt, datt op MKN45 Zellen ΔTCF Ausdrock den héije Niveau vun pCOX2-0.8 basal Transkriptiouns an enger Portioun-ofhängeg Manéier (Dorënner 5D) reduzéiert. Dëst Resultat dé d'Haaptroll vun TCF /LEF Transkriptiouns Facteuren ënnert d'Reglementatioun vun der Aktivitéit vun der pCOX2-0.8 Promoteur Haaptrei, an ënnerstëtzt weider d'Iddi, dass d'TBE Site II (-689 /-684) ass an der Äntwert op Wnt Équipe /β-catenin sécher. VerfÜgung Endlech, direkt d'Roll vun der TBE Site II zu Wnt /β-catenin-mediated Regulatioun vun der COX2 Promoteur ze Adress, agefouert mir duerch Site-Direkter mutagenesis engem Changement zu 2 Schlëssel nucleotides vun der Konsens Haaptrei vun der TBE Site II Kär (dh pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Dës Ännerunge gi virdru gewise Wnt /β-catenin-mediated Transkriptiouns [39] zu ofschafen. Flüchteg transfection Studien Teamchef stattfannen vun der TBE Site II ofgeholl vill (2-3 fantastesch) d'basal Aktivitéit vun pCOX2-0.8 bauen an MKN45 Zellen (Dorënner 5E) wann am Verglach mat der Show-Typ pCOX2-0.8 Promoteur bauen. Desweideren, an am Accord fir eis virdrun Resultater, stattfannen vun dëser TBE Site II bal komplett β-catenin-mediated Opléisung vun der pCOX2-0.8 bauen (Dorënner S4) gespaart. Geholl zesummen, weg dës Resultater datt d'TBE Site II (-689 /-684) ass eng funktionell Komponent an der COX2 Gentherapie transcriptional Regulatioun. VerfÜgung β-catenin Photo'en zu der COX2 Gentherapie Promoteur Regioun de TBE Site II mat VerfÜgung Well eng transcriptionally aktiv conformation vun chromatin Struktur vun enger nik Niveau vun histone acetylation spigelt ass [51], Preisen, mir Kräiz-Hausnummeren chromatin Fragmenter (Duerchschnëttsgréisst 300-500 BP) vom MKN45 Zellen mat polyclonal antibodies spezifesch fir acetylated histones H3 an H4. Zerfall fonnt mir vun RNS polymerase II (Pol II) als Parameter normalerweis mat transcriptional Aktivitéit verbonne obligatoresch. Mir iwwerpréift de Räichtum vun eisem precipitates vun zwee Promoteur Message: déi proximal Promoteur (PP) Regioun (-118 /+ 62 aus TSS) an der distal Regioun (-793 /-594) vun der COX2 Promoteur de Konsens TBE Site wouvun II ( -689 /-684). Besonnesch war de TBE Site II geziilte well virdrun Experimenter privilegiéierten bindend vun β-catenin zu deem Promoteur Regioun (Dorënner S5) uginn. Als positiv Kontroll, évaluéiert mir an de Promoteur vun der c-myc Gentherapie (-1,447 /-1,144 aus TSS) bei der TBE Site bindend, déi virdrun am Colon Kriibs Zelle beschriwwen huet [38]. VerfÜgung Acetylated histones H3 an H4 an der Polimerase II Aktivitéit ware bannent de proximal Promoteur Regioun (Dorënner 6A) zu kruet fonnt, déi besot datt d'chromatin Struktur ronderëm d'COX2 Promoteur am MKN45 Zellen zu enger oppener conformation ass, also am Accord mat eiser leschter Resultater Musiktherapie- datt der COX2 Gentherapie ass transcribing aktiv. Virun allem, huet de β-catenin FAQ aus MKN45 Echantillon meeschtens zu Associatioun mat de Promoteur Regioun Rennsport -684 /-689 TBE Haaptrei am COX2 Gentherapie (Dorënner 6B) immunoprecipitated. Dëse Wëllen gouf bal undetectable um proximal Promoteur Regioun, wat beweist, datt endogenous nuklear β-catenin allem un der TBE Site II zu dës GC Zellen agestallt ass. Wéi erwaart, huet endogenous β-catenin ähnlech zu der c-myc Promoteur TBE Site, dass zu deene vun der COX2 Gentherapie Promoteur (Dorënner 6C). VerfÜgung Zesummen observéiert ähnlecher sinn um Niveau gebonnen, weg dës Experimenter datt de TBE Site II ass direkt Équipe an β-catenin-mediated transcriptional Aktivatioun vun der COX2 Promoteur. an nuklear dovu vun MKN45 Zellen ze confirméieren weider dës Resultater mir electrophoretic Mobilitéit Verréckelung assays (EMSA) gesuergt. Fir dësen Zweck bereet mir 34 baséiert-vläit oligonucleotides; een d'Wëld-Typ -689 /-684 TBE Site II Haaptrei (dh CTACAAAGA; Reschter fir't vertrëtt de Kär) mat, an zwee oligonucleotides wouvun missense kennen entweder de Kär vun der TBE Site II (dh CTACGAGGA: TBE-MUT1) oder an der Reliefsailen Haaptrei (dh CGCCAAAGA: TBE-MUT2), wéi virdrun gemellt [21], [39]. Als zu Dorënner 6D gewisen, huet d'radiolabeled Wildwest-Typ TBE Studiebäihëllefe kapabel gutt DNA-FAQ investéiert ze Form wéi mat nuklear dovu aus MKN45 Zellen incubated. Dës FAQ-DNA investéiert goufen spezifesch zënter der Aféierung vun enger iwwerschësseg vun kal Wildwest-Typ oligonucleotides (50-fantastesch) dramatesch der Opstellung vun der DNA-FAQ komplex (Dorënner 6D, Geschäftswelt 3 a 4, respektiv) inhibited. D'Mann- radiolabeled TBE-MUT1 Studiebäihëllefe war weder konnt DNA-FAQ investéiert op seng eegen ze Form, nach mat der Show-Typ oligonucleotide wann zu iwwerschësseg als kale Studiebäihëllefe (Dorënner 6D, Geschäftswelt 5 a 6, respektiv) notéiert ze rivaliséieren. Ähnlech Resultater kritt, wann déi zweet kal TBE-MUT2 Studiebäihëllefe als Konkurrent (Dorënner 6D, Geschäftswelt 7) benotzt gouf. Ofzeschafen, vermëttelt dës Resultater datt de Roman TBE Site II an der COX2 Promoteur am transcriptional Aktivatioun vun der COX2 Gentherapie responsabel duerch zousätzlech de Mechanisme fir transducing Wnt /β-catenin sécher (Dorënner 6E). VerfÜgung virdrun Studien hunn eng wichteg Roll fir Wnt /β-catenin sécher während der gezu goufen an /oder Entwécklung vu verschiddenen Zorte vu Kriibs via modulating den Ausdrock vun der COX2 Gentherapie [25] ugeholl. An dëser Aarbecht hunn mir staark Beweiser virgestallt engem direkten Roll fir Wnt /β-catenin sécher an der Kontroll vun COX2 Ausdrock am GC Zellen ënnerstëtzen. Éischten, hu mer gewisen, datt et enger knapper Korrelatioun tëschend COX2 Ausdrock an d'nuklear Inhalt vun β-catenin, déi vun entweder malignancy oder Transformatioun Staat CG Zellen onofhängeg ze sinn schéngt. Zweet, time- a Kribbelen-ofhängeg Opléisung vun COX2 Ausdrock war kuerz nom Aféierungs- observéiert (2 h) mat entweder pharmacological awer Wnt /β-catenin sécher Wäerr. Drëtt, Gentherapie reporter assays der COX2 Promoteur Aktivitéit an Äntwert Evaluéieren zu gain- a Verloscht-vun-Funktioun Experimenter, dorënner eng constitutively aktiv β-catenin FAQ an dominant negativ TCF4 Transkriptiouns Faktor, déi beweisen, datt Wnt /β-catenin Deeler vun der Équipe sinn transcriptional Regulatioun vun der COX2 Gentherapie VerfÜgung Mir hunn och hei gewisen, datt bannent 2 Kbp Offloss vun der mënschlecher COX2 Promoteur do si véier putative TBE Siten. (Kär: CTTTG), eent vun deenen déi Araki virdrun studéiert ginn an Fort [21], [28]. Duerch Gentherapie reporter assays mat verschiddene pCOX2 Läschen gesond zougedréckt mir dass pCOX2-0.8 der héchster basal transcriptional Aktivitéit am GC Zellen MKN45 an AGS ugewisen. Spannen, haten pCOX2-0.8 der TBE Site-II (-689 /-684) Integritéit seng Schlëssel Bäitrag zu der Regelung vun der transcriptional Aktivitéit vun der COX2 Gentherapie ugëtt. Virun allem, déi komplett pCOX2 TBE Site II Ënnerschrëft (i.e. 5'-WWCAAAGS-3 "; S = C /G; W = E /T), gläicht der optimal TCF Site vun van de Wetering an Fort beschriwwen. [52], déi duerno benotzt gouf éierleche Wnt-transcriptional Ziler vun der Villäicht sollte VerfÜgung Genen nkd VerfÜgung a CG6234 VerfÜgung [53] zu z'identifizéieren. VerfÜgung Funktionalitéit vun dëser TBE Site II war och vun eiser mutagenesis Studie confirméiert. Sou, wann mir d'TBE-Ënnerschrëft Haaptrei an der pCOX2-0.8 bauen (MpCOX2-0.8) mutated, war et fonnt dass basal COX2 Promoteur Aktivitéit vill an MKN45 Zelle betraff war. Zousätzlech Analysë eis Chip an EMSA confirméiert datt β-catenin zéien un der -689 /-684 COX2 Promoteur Regioun am GC Zellen agestallt ass, op engem Niveau, datt dat bei der c-myc Promoteur [38] fonnt gläicht. Esou Interaktioun existeiert zéien op dëser Regioun vun de Promoteur COX2 Gentherapie wéi keen β-catenin fonnt ass fir d'proximal Promoteur Regioun vun der COX2 Gentherapie zu kruet. Ofzeschafen weg dës Resultater datt d'TBE Site II ass eng funktionell Wnt /β-catenin responsiven Element bannent de Mënsch COX2 Promoteur. Eis Daten, trotzdem, ausschléissen net de Beitrag vun aneren Frankräich Regioune vun der mënschlecher COX2 Gentherapie [21]. Amplaz, mir proposéieren, eng komplex web vun Interaktioune am GC Zellen Moment ass wou d'TBE Site II fir mat anere Äntwert Elementer kooperéiert COX2 Ausdrock an-regléieren. VerfÜgung Als eis Resultater an GC Zellen am Accord mat deenen Untersuchungshaft sinn fir Zellen Colon Kriibs, ass et gewonnert dass Wnt /β-catenin sécher ze spekuléieren kéinten ähnlech zu COX2 Regulatioun vun anere erhéijen [21], Équipe ginn [28]. Iwwerhaapt, moderéiert ze staark FAQ Niveau vun β-catenin kann an ca. observéiert ginn 72% vun all de Mënscherechter Atlas Protein Otemschwieregkeeten Datebank analyséiert Cancers [54]. Den Zerfall, staark cytoplasmic COX2 staining an heiansdo membranous ofbaubar ze moderéiert ass zu 50% vun all Cancers observéiert, dorënner colorectal, Aarbecht, cervical, endometrial, urothelial, pancreatic, Liewer an an glandular Zellen aus gastric entholl Otemschwieregkeeten.
spontan a Methode VerfÜgung
Resultater VerfÜgung
Diskussioun bedeelegt ass VerfÜgung
Ongesond Darmmikrobiom reduzéiert de synaptesche Gehir vum Gehir,
Konnt mikroalgen ofgeleet antiviral Verbindunge géint SARS-CoV-2 an aner Virussen bekämpfen?
Mëttelmier Diät fördert e gesonde Alterung mat engem méi gesonde Darmmikrobiom
PENTAX Medical erhéicht $ 125,
D'Präsenz vu bestëmmte Darmbakterie bei Mammen kéint Puppelcher virun Nahrungsallergien schützen
Eng Zort vun Darmbakterien kann de Risiko vum Darmkriibs erhéijen
Verdauungsmanifestatiounen heefeg awer mëll ënner hospitaliséierten COVID-19 Patienten
Eng Equipe vun 121 Fuerscher aus den USA a Kanada bericht datt wärend Verdauungsmanifestatiounen üblech sinn ënner Leit hospitaliséiert mat Coronavirus Krankheet 2019 (COVID-19), dMajoritéit schéngt m
Wéi stäerkt Dir Ären Immunsystem fir de Coronavirus ze bekämpfen
Wéi dWelt mat der Coronavirus Pandemie kämpft, ëmmer méi Leit probéieren sech géint de Virus mat all méigleche Mëttelen ze schützen. Et ginn de Moment keng Impfungen géint e schwéieren akuten respirat
Nei Studie kéint hëllefen fatale Infektiounen bei Puppelcher ze vermeiden
Virzäiteg Puppelcher gebuer virum 28-30 Woche vum Liewen hunn e grousse Risiko fir vill Komplikatiounen, ënner deenen dChancen fir ze stierwen un enger Infektioun déi am Darm ufänkt ganz grouss sinn.