PLoS ONE: Wnt /β-Catenin Signaling Verstärkt Cyclooxygenase-2 (COX-2) Transkriptionsaktivität in Magenkrebszellen

Abstrakt

Hintergrund

Eine erhöhte Expression des Cyclooxygenase-2-Enzyms (COX2) ist eine der wichtigsten Eigenschaften von Magenkrebs ist (GC), die in die eine führende Ursache des Todes Welt, vor allem in Asien und Südamerika. Obwohl die Wnt /β-Catenin-Signalweg ist in der Transkriptionsaktivierung des COX2-Gens, der genaue Mechanismus modulieren diese Antwort ist noch unbekannt.

Methodik /wesentlichen Ergebnisse

Hier haben wir untersucht beteiligt die Transkriptionsregulation des COX2-Gens in GC-Zelllinien und beurteilt, ob dieses Phänomen durch Wnt /β-Catenin-Signalisierung moduliert wird. Wir untersuchten zunächst die Expression von COX2-mRNA in GC-Zellen und fanden heraus, dass es ein Expressionsmuster, die mit hohen Kern lokalisierte β-Catenin-Differential ist. Pharmakologische Behandlung mit entweder Lithium oder Valproinsäure und molekulare Induktion mit gereinigtem canonical Wnt3a signifikant verbessert COX2-mRNA-Expression in einer dosis- und zeitabhängigen Weise. Serielle Deletion eines 1,6 Kbp COX2-Promotorfragment und Verstärkungs- oder loss-of-function Experimenten konnten wir eine minimal Wnt /β-Catenin reagierende Region zu identifizieren, das aus 0,8 Kbp des COX2-Promotor (pCOX2-0.8), die maximale Reaktion zeigten in der Gen-Reporter-Assays. Die Aktivität dieses pCOX2-0.8 Promotorregion wurde durch ortsgerichtete Mutagenese und DNA-Protein-Bindungsassays bestätigt.

Schlussfolgerungen /Bedeutung

Wir schließen daraus, dass die pCOX2-0.8 Minimalpromotor enthält ein neuartige funktionelle T-Zell-Faktor /lymphatischen Enhancer-Faktor (TCF /LEF) -Antwort Element (TBE-Site II; -689 /-684), die direkt zu einer verbesserten Wnt /β-Catenin-Signalweg reagiert und die für den Beginn /Progression wichtig sein kann, GC

Citation. Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino M, De Ferrari GV (2011) Wnt /β-Catenin Signaling Verstärkt Cyclooxygenase-2 (COX-2) Transkriptionsaktivität in Magenkrebszellen. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10.1371 /journal.pone.0018562

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 5. November 2010; Akzeptiert: 11. März 2011; Veröffentlicht: 6. April 2011

© 2011 Nuñez et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT) Gewährungsnummer PBCT-6 von der chilenischen Regierung (MM und GVD) - wurde von CTI-Krebs-, Programa Bicentenario en für Wissenschaft und Technologie (PBCT) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist eine multifaktorielle Erkrankung, die von hoch-malignen Neoplasmen in der Magenschleimhaut gekennzeichnet und stellt die zweithäufigste Ursache für Krebstod weltweit mit der höchsten Prävalenz in Asien und Südamerika [1], [ ,,,0],2], [3]. Umweltrisikofaktoren gehören Ernährung, Schnupftabak Konsum, Übergewicht und Helicobacter pylori
Infektion [4]. Mehrere Mutationen in Tumorsuppressorgenen, adenomatösen Polyposis coli (APC), E-Cadherin und RUNX3 [3], [5], sowie in Onkogene wie k-ras, HER2 und β-Catenin einschließlich P53, [3], [6], [7], sind in GC dokumentiert. Zusätzlich über Expression verschiedener Gene wurde dokumentiert, einschließlich WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], und die Cyclooxygenase 2 (COX2) Enzym, das den entscheidenden Schritt bei der Produktion von Prostaglandin E2 katalysiert, ein Schlüsselmediator der Gelenkentzündung [10], [11].

Es wurde beobachtet, dass die Expression des Gens signifikant COX2 in menschlichen Adenokarzinom des Magens Gewebe erhöht wird, wenn sie mit paarigen Magenschleimhaut Proben frei von Krebszellen im Vergleich [10 ]. Solche erhöhte Expression wurde die Intensität der Invasion, Größe, Lymphknoten-Metastasen, Tumorentwicklung und schlechte Prognose [4], [12], [13] beeinflussen vorgeschlagen. In diesem Zusammenhang beschreiben große Mengen von Daten chemo präventive und Anti-Krebs-Aktivität von nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR) einschließlich selektiver COX-2-Inhibitoren als mögliche Behandlungen für GC [10], [11], [14].

transkriptionellen Kontrolle des COX2-Gens hängt von der molekularen Maschinerie mit der COX2-Promotor in Wechselwirkung, die durch die Aktivität verschiedener Signalwege [15], [16], [17] gesteuert zu sein scheint. Tatsächlich war es zunächst festgestellt, dass CRE (-59 /-53), NF-IL6 (-132 /-124) und NF &kgr; B (-233 /-214) Konsensus-Sequenzen in der COX2-Promotor für die Expression des erforderlichen waren Gen [16]. Anschließende funktionelle Untersuchungen in der COX2-Promotor identifiziert eine Reihe von regulatorischen Elementen in der Transkription des Gens beteiligt ist, einschließlich AP-1, AP-2, Sp-1, C /EBPβ [18], [19], [20] und Proteine Zugehörigkeit zu der T-Zell-Faktor /Lymphoid Enhancer-Faktor (TCF /LEF) Familie von Transkriptionsfaktoren, die für die Wnt /β-Catenin-Signaltransduktion entscheidend sind [21].

der Wnt /β-Catenin-Signalweg allgemein anerkannt eine wichtige Rolle bei menschlichen Krankheiten, insbesondere bei der Entstehung und Entwicklung von Krebs [22], [23], wie spielen [24] ist. Interessanterweise haben die jüngsten Experimente in GC-abgeleiteten Zellen eine Beziehung zwischen COX2-Expression gezeigt und die Hemmung der Glykogen Synthase Kinase-3β (GSK3 &bgr;) Enzym [25], die ein Schlüssel Wnt Komponente ist, die β-Catenin-phosphoryliert und fördert die anschließende Abbau über Proteasom [26]. Die Beziehung zwischen Wnt /β-Catenin und COX2-Expression in verschiedenen Krebszellmodellen wird weiter aus den folgenden Studien unterstützt. Erstens, es wurde in der Brust Epithel, das Wnt /β-Catenin spielen eine indirekte Wirkung auf COX2 Transkription beobachtet, die durch Hochregulation eines intermediären Faktor PEA3 [27] vermittelt werden könnte. Zweitens, und im Gegensatz zu einer indirekten Wirkungsweise, Araki und cols. [21] berichtet, dass in Darmkrebszellen gibt es eine Induktion in COX2-Expression durch einen β-Catenin /TCF-abhängigen Mechanismus, und dadurch teilweise einen Konsens TCF /LEF-Bindungsstelle (TBE: Kern CTTTG) positioniert ist 1079 bp stromaufwärts von der Transkriptionsstart Standort in der COX2-Promotor. Drittens wurde beobachtet, dass in Patienten mit Dickdarmkrebs und abgeleitete Zelllinien gibt es einen Zusammenhang zwischen Überexpression der Wnt-Signalweg-assoziierten Proteinen LEF-1 und Pontin52 /TIP49a und Hochregulation von COX2 Ausdruck [28]. Schließlich verwenden Chondrozyten, wurde gezeigt, dass LEF-1 zusammen mit β-Catenin reguliert COX2-Expression durch direkte Bindung des LEF-1 /β-Catenin-Komplexes an die 3'-UTR-Region des genomischen Locus COX2 [29] . Daher wird derzeit gibt es kein klares Bild darüber, ob das Wnt-Signal in COX2 Genexpression beteiligt ist, oder als seine Rolle in der GC-Beginn /Progression. Hier haben wir versucht, zu verstehen, ob es eine direkte Regulierung des COX2 Genexpression über Wnt /β-Catenin-Signalisierung und Wnt /β-Catenin-regulatorische Elemente in der Promotorregion des COX2-Gens zu identifizieren, die COX2 Transkription in GC-Zellen hochreguliert werden.

Materialien und Methoden

Zellen und
Kulturbedingungen

Menschliche Zelllinien MKN45 (japanische Sammlung von Forschung Bioresources, Japan), N87, SNU1, SNU16, KatoIII, AGS, WI38 und HEK293 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden in dieser Studie verwendet. MKN45, N87, SNU1 und KatoIII-Zellen wurden in RPMI-Medien (Gibco) gezüchtet; AGS in F12K Medium (Hyclone); WI38 in EMEM (Gibco); und HEK293 in DMEM (Gibco). Kulturmedium wurde mit 10% FBS (Gibco) (AGS mit 20%) und 1% Penicillin /Streptomycin ergänzt. Zell-Linien wurden bei 37 ° C in 5% CO gehalten _{2 und gesättigter Feuchtigkeit.}

Die Plasmide und ortsgerichtete Mutagenese

Die SuperTOPFlash-Luciferase und die pRL-TK renilla- Luciferase-Plasmiden [30], die konstitutiv aktive β-Catenin (S33Y) [31] und die dominant-negative ΔTCF4 Expressionsplasmide [32] wurden zuvor beschrieben. Chimäres COX2-Promotor-Luciferase-Fragmente wurden durch PCR erzeugt aus humaner genomischer DNA unter Verwendung von spezifischen Primern Restriktionsstellen enthält, und anschließend in den pGL3-Basic Vektor (Promega) eingesetzt. Die Mutationen in der TBE-II-Stelle (-689 /-684) des COX2-Promotors erzeugt Primer PCOX-0,8-TBEMUT mit dem Quickchange site-directed mutagesis Kit (Stratagene) verwendet. Die Konstrukte wurden durch direkte Sequenzierung (ABI-3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems) verifiziert. Die Primer-Sequenzen sind in Tabelle S1 beschrieben.

Semi-quantitative und Echtzeit-RT-PCR

Gesamt-RNA wurde in RNAse freien Bedingungen unter Verwendung von Trizol (Invitrogen) und 2 ug RNA wurde revers transkribiert mit 200 extrahiert U Superscript II Reverse Transcriptase (RT) (Invitrogen) unter Verwendung von 500 ng Oligo (dT) Primern. Experimentelle Bestimmung der COX2, c-myc und CCND1-mRNA-Spiegel wurde gemß [33] durchgeführt. Kurz gesagt, wurden cDNAs zu Real-Time PCR in einem iCycler iQ-System (Bio-Rad Laboratories) unterzogen. Jede 25 &mgr; l Reaktionsvolumen enthielt 1 Einheit Platinum Taq DNA-Polymerase (Invitrogen), 1 × Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4, und 50 mM KCl), 1,5 mM MgCl _{2, 2,5 &mgr; g BSA, 0,01% Glycerol , 200 &mgr; M dNTPs, 0,3X SYBR Green-Lösung und 0,4 &mgr; M spezifische Primer (siehe Tabelle S1). PCR-Bedingungen wurden wie folgt eingestellt: 90 Sekunden bei 94 ° C und dann 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 ° C, 30 Sekunden bei 62 ° C und 30 Sekunden bei 72 ° C. Alle Reaktionen wurden in dreifacher Ausführung und die Ergebnisse mit denen parallel zu β-Actin erhalten wurde durchgeführt, für jedes Gen wurden normalisiert. Die Qualität der RNA und PCR-Produkte während der gesamten Experimente über Elektrophorese auf 1% Agarosegelen, mit Ethidiumbromid gefärbt wurde überwacht.}

Die Induktion des Wnt /β-Catenin-Signalweg

Wnt-Signal war in MKN45-Zellen ausgesät in 6-Well-Kulturplatten bei 80-90% Konfluenz pharmakologisch induziert (dh 1, 2, 4 und 8 h Inkubation) entweder mit 10-20 mM LiCl (Sigma) oder 5-10 mM von Valproinsäure (VA; Sigma), wie zuvor beschrieben [34], [35]. Dann wurden die Zellen für die mRNA-Extraktion und Echtzeit-PCR-Bestimmung wie oben beschrieben gesammelt. In ähnlicher Weise wurden MKN45-Zellen für 2 Stunden mit 200 und 400 ng /ml gereinigtem Wnt3a Protein stimuliert. Reinigung von Wnt3a wurde wie beschrieben durchgeführt [36].

transkriptionelle Aktivität des
COX2-Promotor

Die Aktivität des COX2-Promotor wurde in 80-90% konfluent MKN45, AGS, WI38 und HEK293 gemessen Zellen in 6-Well-Kulturplatten ausgesät. Kurz gesagt, wurden die Zellen unter Verwendung von FuGene (Roche) für 24 mit dem pCOX2-Luciferase oder die pSuperTOPFlash Reporter und entweder konstitutiv aktive β-Catenin (S33Y) [31] oder der dominant-negativen ΔTCF4 cotransfiziert [32] Konstrukte. Die pRL-TK Renilla-Luciferase-Plasmid wurde als interne Kontrolle verwendet. Firefly und Renilla-Luciferase-Aktivitäten wurden mit dem Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega) in einem Victor-3 Mehr Leser Instrument (Perkin Elmer) bestimmt, wie zuvor beschrieben [30]. Relative Luciferase-Aktivitäten wurden durch Dividieren Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität mit Renilla-Luciferase-Aktivität für jede Probe (N = 3, jeweils in dreifacher Ausführung) ausgedrückt.

Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -Assays

ChIP-Studien wurden durchgeführt, in MKN45-Zellen, wie zuvor beschrieben [37]. Der Anteil der Kern β-Catenin entweder TBE Seiten I, II, III oder IV im menschlichen COX2 Promotor gebunden wurde immunopräzipitiert mit anti β-Catenin-Antikörper (Santa Cruz) und durch Echtzeit-PCR untersucht unter Verwendung spezifischer Primer (Tabelle S1) . Zusätzlich gebunden die Fraktion der RNA-Polymerase II (Pol-II) und acetylierte Histone H3 und H4 (H3ac und H4ac) entweder dem TBE-II-Region (-793 /-594) oder der proximalen Region (-118 /+ 62 ) des COX2-Promotor wurde in ähnlicher Weise beurteilt (anti-Pol-II, Santa Cruz; H3ac und H4ac, Upstate). Als positive Kontrolle verwendeten wir die c-myc TBE site [38]. Antikörper-Spezifität wurde mit normalem Kaninchen-IgG (Santa Cruz) getestet.

Die elektrophoretische Mobilitätsanalyse (EMSA)

EMSA wurde unter Verwendung von Oligonukleotiden erfolgt entweder die Wildtyp-COX2 TBE-II-Konsensus-Sequenz enthält, (siehe Tabelle S1) oder zuvor berichtet mutierten TBE-Sequenzen [39]. Kurz gesagt, Wildtyp und mutierte ^{32P-markierte Oligonukleotide wurden in Bindungspuffer mit Kernextrakten von MKN-45-Zellen für 30 Minuten bei 30 ° C inkubiert. Anschließend wurden die DNA-Protein-Komplexe von freien Oligonucleotiden auf einem 5% nicht denaturierenden Polyacrylamidgel getrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und für 1 Tag auf Film belichtet. Die Visualisierung der radioaktiven Banden wurden durch Autoradiographie analysiert. Bindungsspezifität wurde geprüft, indem die DNA-Protein-Komplexe in Gegenwart eines Überschusses an nicht-markierten Wildtyp-Inkubation oder mutierten Oligonukleotiden [21], [39].}

Die statistische Analyse

Jeder Experiment wurde mindestens dreimal mit drei Wiederholungen wiederholt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Mehrere Gruppenvergleiche wurden durch Einweg-ANOVA durchgeführt, die 9.0 Software STATISTICA verwendet wird. P
. ≪ 0,05 wurde als signifikant angesehen

Ergebnisse

• PLoS ONE: MicroRNA Let-7f Hemmt Tumorinvasion und Metastasierung von MYH9 Targeting in menschlichen Magen Cancer
• PLoS ONE: Sonic Hedgehog-Signalweg ist unverzichtbar für die Pflege von Krebsstammzellen-ähnlichen Zellen in menschlichen Magen Cancer